JPH11187883A

JPH11187883A - ヒト由来ａｐｓキナーゼ／ａｔｐスルフリラーゼ遺伝子

Info

Publication number: JPH11187883A
Application number: JP9360387A
Authority: JP
Inventors: Katsuhiko Takayanagi; 勝彦高柳; Hiroshi Nakajima; 中島　　宏; Masahito Suiko; 正仁水光
Original assignee: HUMAN SCIENCE SHINKO ZAIDAN; Unitika Ltd
Current assignee: HUMAN SCIENCE SHINKO ZAIDAN; Unitika Ltd
Priority date: 1997-12-26
Filing date: 1997-12-26
Publication date: 1999-07-13

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒト由来のＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスルフリ
ラーゼを遺伝子工学的に大量製造するための遺伝子操作
材料と、この材料を用いたＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスル
フリラーゼの製造方法を提供する。【解決手段】配列番号２の塩基配列を有し、配列番号
１で表されるアミノ酸配列からなるＡＰＳキナーゼ／Ａ
ＴＰスルフリラーゼをコードするヒト由来の遺伝子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願の発明は、ヒト由来
ＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスルフリラーゼ（ＡＰＳキナー
ゼとＡＴＰスルフリラーゼの両方の活性を有するヒト由
来の酵素）をコードする遺伝子と、この遺伝子を含有す
る組換えベクターおよびその形質転換体、並びにこの形
質転換体によるＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスルフリラーゼ
の製造法に関するものである。

【０００２】さらには、この形質転換体を用いた上記製
造法により得られた組換えＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスル
フリラーゼによる３’−ホスホアデノシン５’−ホス
ホ硫酸（ＰＡＰＳ）の製造法に関するものである。

【０００３】

【従来の技術】生体内の脂質はリン酸化、硫酸化などの
種々の修飾を受けていることが知られており、その多く
は生命現象に必須である。中でも糖鎖・脂質の硫酸化は
種々の疾患にも関与していることが指摘されており、例
えば、それら疾患の予防や診断・治療法等の向上にとっ
てそのメカニズムの解明は重要な課題である。

【０００４】生体内の全ての硫酸化反応の硫酸供与体は
３’−ホスホアデノシン５’−ホスホ硫酸（ＰＡＰ
Ｓ）であり、これは活性硫酸とも呼ばれる。ＰＡＰＳは
ＡＴＰスルフリラーゼとＡＰＳ（アデノシン５’ホスホ
硫酸）キナーゼの二段階反応によってＡＴＰからＡＰＳ
を経由して生合成される。ＡＴＰスルフリラーゼとＡＰ
Ｓキナーゼの活性低下は疾患と関係しており、例えば短
形奇形マウスであるブラキーモルフィクマウスではＡＴ
ＰスルフリラーゼとＡＰＳキナーゼの活性が低下してい
るため、ＰＡＰＳの生合成が抑えられ、軟骨の重要構成
物であるプロテオグリカンの糖鎖が適切に硫酸化されな
いことから奇形が生じている（Proc. Natl. Acad. Sc
i., 76, 6615-6618, 1979 ）。このように、ある種の疾
病は糖鎖の硫酸化と密接に関わっており、ヒトにおいて
もＰＡＰＳの産生調節と疾患とが相関している可能性が
示唆されている。

【０００５】以上のとおり、生体におけるＰＡＰＳの合
成とその転移反応の重要性が認識されつつあり、ＰＡＰ
Ｓの合成に関与する酵素およびその遺伝子に関しても、
微生物（酵母：Mol. Gen. Genet., 229, 96-108, 199
1）、動物（ラット：Biochemistry, 33, 5920-5925, 19
94）、植物（アラビドプシス：Biochem. Biophys. Act
a., 1218, 447-452, 1994）等で酵素が精製、あるいは
遺伝子が同定されてきている。しかしながら、これまで
ヒトに由来するＰＡＰＳ合成酵素の遺伝子は同定されて
いなかった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ヒトのＡＴＰスルフリ
ラーゼとＡＰＳキナーゼの遺伝子の同定はヒトの疾患と
糖鎖の硫酸化との関わりを解明する上で極めて重要であ
る。またＡＴＰスルフリラーゼとＡＰＳキナーゼによる
硫酸基の活性化、その後の硫酸基の転移反応（ホスホト
ランスフェラーゼにより触媒される）と疾患の関わりを
解明するにはＰＡＰＳが必須であり、効率的で安価な生
産系が必要であった。

【０００７】しかしながら、利用可能な市販品ＰＡＰＳ
は極めて高価であり、その大量使用による大規模な試験
研究には限界がある。また生体における硫酸基の転移反
応を追跡するには放射線標識したＰＡＰＳが必要となる
が、これは市販されておらず、放射線標識された化合物
から各研究機関で独自に合成されるのが一般的である。

【０００８】代表的なＰＡＰＳ製造法としては、アデノ
シン２’，３’−サイクリックホスフェイト５’−リン
酸から酵素反応によりＰＡＰＳを産生する方法（Bioche
m. Biophys. Acta, 480, 376-381, 1967）が知られてい
る。これは市販品ＰＡＰＳの製造にも用いられている方
法であるが、原料であるアデノシン２’，３’−サイク
リックホスフェイト５’−リン酸そのものが高価である
ために、市販品を購入して用いることに比較して顕著に
有効であるとは言い難い。

【０００９】また、好熱性細菌より抽出、精製したＡＴ
ＰスルフリラーゼとＡＰＳキナーゼとを用いてＡＴＰか
ら合成する方法も報告されている（Biosci. Biotech. B
iochem., 57, 1974-1975, 1993）。しかしながら、この
方法の場合には２種類の酵素を精製せねばならず、効率
的であるとはいえない。このように従来のＰＡＰＳの合
成方法は、合成用の基質が高価であったり、用いる酵素
の精製に多くの時間と労力を要することもあり、効率的
であるとは言えなかった。

【００１０】この出願の発明は、以上のとおりの事情に
鑑みてなされたものであって、従来技術の問題点を解消
し、ＡＰＳキナーゼとＡＴＰスルフリラーゼの両方の活
性を有するヒト由来酵素（ＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスル
フリラーゼ）を遺伝子工学的に大量製造するための遺伝
子操作材料と、この材料を用いたＡＰＳキナーゼ／ＡＴ
Ｐスルフリラーゼの製造方法を提供することを目的とし
ている。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】この発明は、上記の課
題を解決するものとして、配列番号１で表されるアミノ
酸配列からなるヒト由来ＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスルフ
リラーゼをコードする遺伝子（請求項１）を提供する。
またこの発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列に
おける１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または
付加されたアミノ酸配列からなるヒト由来ＡＰＳキナー
ゼ／ＡＴＰスルフリラーゼをコードする遺伝子（請求項
２）を提供する。

【００１２】さらにこの発明は、配列番号２の塩基配列
を有するヒト由来ＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスルフリラー
ゼ遺伝子（請求項３）を提供する。さらにまたこの発明
は、配列番号２の塩基配列における１もしくは複数の塩
基が欠失、置換または付加された塩基配列を有するヒト
由来ＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子（請
求項４）を提供する。

【００１３】なお、以上の請求項１〜４の各遺伝子にお
いては、その起源がヒトのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡライ
ブラリーであること（請求項５）を好ましい態様として
もいる。さらにこの発明は、上記遺伝子をベクターＤＮ
Ａに連結した組換えベクター（請求項６）を提供する。

【００１４】この請求項６の組換えベクターにおいて
は、ベクターＤＮＡがエッシェリヒア・コリを宿主とす
るプラスミドであること（請求項７）、さらにこのプラ
スミドがｐＲＳＥＴＡであること（請求項８）を好まし
い態様としている。この発明は、さらに、上記請求項６
〜８の組換えベクターを含む形質転換体（請求項９）
と、その１態様であるエッシェリヒア・コリの形質転換
体（請求項１０）を提供する。

【００１５】この発明は、さらにまた、上記請求項９ま
たは１０の形質転換体を培地中で培養し、培養物からＡ
ＰＳキナーゼ／ＡＴＰスルフリラーゼを採取することを
特徴とするＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスルフリラーゼの製
造法（請求項１１）を提供する。この発明は、さらにま
た、上記請求項１１の製造法により得られたＡＰＳキナ
ーゼ／ＡＴＰスルフリラーゼを用いることを特徴とする
３’−ホスホアデノシン５’−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）
の製造法（請求項１２）を提供する。

【００１６】

【発明の実施の形態】この発明に係るヒト由来ＡＰＳキ
ナーゼ／ＡＴＰスルフリラーゼは、配列番号１に表した
アミノ酸配列を有するタンパク質であり、あるいは、配
列番号１のアミノ酸配列における１もしくは複数個のア
ミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有
するタンパク質である。

【００１７】複数個のアミノ酸の欠失とは例えば３０ア
ミノ酸以内をいい、好ましくは１０アミノ酸以内の欠失
を意味する。また、複数個のアミノ酸の置換とは例えば
２５アミノ酸以内をいい、好ましくは１０アミノ酸以内
の置換を意味する。さらに、複数個のアミノ酸の付加と
は例えば４０アミノ酸以内をいい、好ましくは２０アミ
ノ酸以内の付加を意味する。

【００１８】この発明の遺伝子は上記アミノ酸配列をコ
ードする遺伝子であって、具体的には、配列番号２の塩
基配列を有する遺伝子であり、あるいは配列番号２にお
ける塩基配列の１もしくは複数の塩基が欠失、置換また
は付加された塩基配列を有する遺伝子である。このよう
な遺伝子は、例えば、配列番号２の一部配列を合成し、
この合成ＤＮＡをプローブとしてヒトのｃＤＮＡライブ
ラリーから単離することができる。ヒトｃＤＮＡライブ
ラリーとしては市販されている各種のヒト由来ｃＤＮＡ
ライブラリー、例えばクロンテック社より販売されてい
るヒトの各種臓器由来のｃＤＮＡライブラリー等が利用
できる。

【００１９】また配列番号２の両端部分の合成ＤＮＡを
プライマーとし、ｍＲＮＡを鋳型とする逆転写ＰＣＲ法
（ＲＴーＰＣＲ）によって目的遺伝子を増幅する方法等
によっても取得することができる。このときのｍＲＮＡ
としては各種臓器由来のｍＲＮＡ、例えば肝臓由来のｍ
ＲＮＡ画分を用いることができる。なお、上記のヒトｃ
ＤＮＡライブラリー、あるいはｍＲＮＡからのＡＰＳキ
ナーゼ／ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子の単離、この遺伝
子を含有する組換えベクターおよび組換えベクターによ
る形質転換体の作成、並びに形質転換体の培養等は公知
の方法、例えばMolecular Cloning（Sambrook, J., et
al., Cold Spring Harbor Laboratory Presss, Cold Sp
ring Harbor, 1989）に記載されている方法を組み合わ
せて行なうことができる。また各種の市販キットを用い
ることもできる。

【００２０】単離された遺伝子はベクターＤＮＡに連結
することにより各種の宿主ーベクター系に保持させるこ
とができる。宿主としては微生物、昆虫細胞、培養細胞
等、種々のものを用いることができる。微生物、例えば
大腸菌を用いた場合にはＥＫ１系、酵母を用いた場合に
はＳＣ１系などを使用することができる。微生物を宿主
として用いた場合、ベクターとしては菌体内に安定に保
持されるものであれば市販のいかなるプラスミドをも使
用可能である。例えば宿主として大腸菌を用いた場合に
はｐＲＳＥＴＡ（インビトロジェン）といったプラスミ
ドの使用が好ましい。また宿主としては組換えベクター
を安定に保持しうるものであれば市販のいかなる宿主も
使用可能であるが、プラスミドとの相性の良いもの、例
えばベクターとしてｐＲＳＥＴＡを用いた場合には大腸
菌ＤＥ３株を使用することができる。

【００２１】単離された遺伝子は特定のプロモーター配
列の下流に連結することによりＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰ
スルフリラーゼを発現させることができる。例えばｐＲ
ＳＥＴＡはバクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラー
ゼにより、その下流に位置する遺伝子が転写されるよう
設計されている。宿主にＤＥ３のようなイソプロピルー
βーＤーチオガラクトピラノシド（宝酒造、以下ＩＰＴ
Ｇと記す）の培地への添加によりＴ７のＲＮＡポリメラ
ーゼが誘導発現されるような菌株を用い、培養の過程で
Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼを誘導発現させれば容易にＡ
ＰＳキナーゼ／ＡＴＰスルフリラーゼを大量に発現させ
ることができる。

【００２２】ＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスルフリラーゼ
は、集菌した形質転換体の菌体を超音波あるいはリゾチ
ーム等で溶菌し遠心分離した後、遠心上清を市販のイオ
ン交換樹脂、アフィニティー樹脂等を用いて分取するこ
とにより製造できる。イオン交換樹脂としては、例えば
フェニルセファロースＣＬ４Ｂ（ファルマシア社）等を
用いることができる。アフィニティー樹脂としてはマト
リックスゲルブルーＡ（ファルマシア社）を用いること
ができる。

【００２３】ＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスルフリラーゼを
用いることによりＡＴＰからＰＡＰＳを産生することが
できる。この合成反応はｐＨが６．５から９．５で行う
ことが可能であり、好ましくは８．０から９．０で行う
ことが望ましい。緩衝液は上記ｐＨを緩衝範囲とし、生
化学的反応に用いられる一般的な緩衝液を一般的な濃
度、即ち１０ｍＭから５００ｍＭの範囲で使用すること
ができるが、２５〜２５０ｍＭで行うことが好ましい。
例えばｐＨ８．５の１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（同
仁化学）中で行うことができる。本反応は２０℃から５
０℃で行うことが可能であるが、３０℃から４０℃が望
ましく、さらに望ましくは３７℃での反応が効率的であ
る。

【００２４】以下、実施例を示してこの発明をさらに詳
細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例によっ
て限定されるものではない。

【００２５】

【実施例】実施例１：ＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスルフリ
ラーゼ遺伝子の同定ヒト白血球由来λｇｔｃＤＮＡライブラリー（クロンテ
ック）を酵母由来ＡＰＳキナーゼ遺伝子の一部配列 [AA
(AG)GGN(TC)TNTA(TC)AA(AG)AA(AG)GC ：ただし（）内は
そのいずれかの塩基を、N はGATCのいずれかを表す] を
プローブとしてプラークハイブリダイゼーションを行っ
た。その結果、106 個のプラークよりプローブに対して
ポジティブなファージクローンが２つ得られた。このｃ
ＤＮＡの塩基配列を決定し、ホモロジー検索を行ったと
ころ、酵母由来のＡＰＳキナーゼのＮ末端側との相同性
が認められた。このファージクローンを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ消化し、ＡＰＳキナーゼ相同性領域をｐＵＣ１９
（東洋紡）にクローニングし、ｐＭＭ６３ｃと名付け
た。

【００２６】ｐＭＭ６３ｃの３’末端側の配列を用いて
ＲＴーＰＣＲにより全長のＡＰＳキナーゼのクローニン
グを行った。ヒトの肝臓由来のｍＲＮＡ（クロンテック
社製）から耐熱性の逆転写酵素を用いたポリメラーゼ連
鎖反応（ＲＴーＰＣＲ）でｃＤＮＡを合成した後、二本
鎖に特異的なＲＮａｓｅＨを作用させてｃＤＮＡを作製
した。このＲＴーＰＣＲ反応にはクロンテック社製のア
ンプリファインダーＲＡＣＥキットを用いた。

【００２７】得られたｃＤＮＡより異なる２種類の５’
−プライマー（ＲＤＲー１、ＲＤＲー４）と３’−アン
カープライマー（5'- CTGGTTCGGCCCACCTCTGAAGGTTCCAGA
ATCGATAG-3' ）により目的遺伝子の３’側を２段階に分
けて増幅した。１回目の増幅は３’−アンカープライマ
ーとＲＤＲ−１プライマー（5'- TATGAGGGCCGCCGTGTGGC
CATTCTT-3'）により、９４℃で４５秒、６０℃で４５
秒、７２℃で２分の反応を２５回繰り返した後、９４℃
で４５秒、６０℃で４５秒、７２℃で７分の反応を１回
行って増幅した。また２回目の増幅には３’−アンカー
プライマーとＲＤＲ−４プライマー（5'- GAGTTTTTTGAG
CACAGGAAAGAGGAG-3'）を用いて１回目のＰＣＲ増幅産物
を更に増幅した。

【００２８】２回のＰＣＲ増幅反応液をアガロースゲル
に展開したところ、１．４Ｋｂｐのバンドが特異的に増
幅されていた。この断片をアガロースゲルにより分離精
製した後、ｐＣＲIIベクター（インビトロジェン社）に
クローニングした。上記増幅断片の塩基配列を決定し、
ｐＭＭ６３ＣにクローニングされているヒトＡＰＳキナ
ーゼと推定されるＤＮＡ部分配列と照らし合せたとこ
ろ、ＲＴーＰＣＲに用いたＤＮＡ配列を介して前記の配
列と今回取得した配列とが結ばれ、翻訳開始部分（ＡＴ
Ｇ）からポリＡまでの配列が決定された。

【００２９】このＤＮＡ配列をアミノ酸配列に翻訳し、
遺伝子解析プログラムであるＧＥＮＥＴＹＸを用いて相
同性検索をしたところ、いくつかのＡＰＳキナーゼまた
はＡＴＰスルフリラーゼ、例えば酵母（サッカロミセス
・セレビシエ）由来のＡＰＳキナーゼ、ＡＴＰスルフリ
ラーゼとの相同性が示された。注目すべき点として、酵
母の場合はＡＰＳキナーゼとＡＴＰスルフリラーゼは別
々の遺伝子によりコードされ、それぞれ別個の蛋白質分
子であるが、今回得られたものは両遺伝子が単一の転写
産物によりコードされ、蛋白質分子としても同一のポリ
ペプチド上にあった。

【００３０】クローニングにより得られた遺伝子はＡＰ
Ｓキナーゼ／ＡＴＰスルフリラーゼの３’側であり、ｐ
ＭＭ６３ｃにクローニングされた５’側とは分断されて
いたため、両遺伝子断片をＥｃｏ４７III 制限酵素部位
を用いて融合することにより、全長のＡＰＳキナーゼ／
ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子を得た。得られたＡＰＳキ
ナーゼ／ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子は翻訳時に正しい
フレームで発現するよう、発現ベクター（ｐＲＳＥＴ
Ａ）の制限酵素部位に導入された。発現ベクター（ｐｃ
ＲＡＰＳ）構築の詳細は図１に示したとおりである。実施例２：組換え菌でのＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスルフ
リラーゼ遺伝子の発現上記発現ベクターを大腸菌ＤＥ３
株に導入し、ＩＰＴＧ存在化で遺伝子を誘導発現させ
た。

【００３１】ｐｃＲＡＰＳまたはｐＲＳＥＴＡプラスミ
ドを持つ大腸菌ＤＥ３のオーバーナイト培養液１ｍＬを
２００ｍＬのアンピシリン含有ＬＢ培地に殖菌し、３７
℃で培養し、ＯＤ６００ｎｍが０．３になった時点でＩ
ＰＴＧを終濃度１ｍＭになるように加え、プラトーにな
るまで培養した。集めた菌は超音波による破砕、遠心し
た上清を酵素液として用い、３’−ホスホアデノシン
５’−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）合成反応を行った。

【００３２】最終濃度がそれぞれ、１００ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭ硫酸
マグネシウムとなる反応混液に酵素液を加え、最終容量
５００μＬとし、３７℃で１０分間反応させた後、１分
間煮沸して反応を止めた。反応液中に生成したＰＡＰＳ
はＨＰＬＣにより定量した。ＨＰＬＣはＬＣモジュール
１（ウオターズ社）を用い、カラムはノバパックＣ１８
（ウオターズ社）を使用した。移動相は３ｍＭテトラブ
チルアンモニウムコーレート、３０ｍＭリン酸１カリウ
ム、１５％（V／V）メタノールを含む、ｐＨ７．０の溶
液である。検出は２５４ｎｍで行った。その結果、粗酵
素抽出液において、２２．７ｎｍｏｌ／ｍｇータンパク
質のＰＡＰＳが合成されていた。比較例１：大腸菌におけるＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスル
フリラーゼ遺伝子の発現ヒト由来のＡＰＳキナーゼ／Ａ
ＴＰスルフリラーゼ遺伝子を持たないプラスミドである
ｐＲＳＥＴＡを大腸菌ＤＥ３に導入した菌株を実施例２
と同様にして培養し、菌体破砕液のＰＡＰＳ合成活性を
調べたところ、２．５４ｎｍｏｌ／ｍｇータンパク質の
ＰＡＰＳが合成されていた。

【００３３】実施例２および比較例１の結果は表１に示
したとおりである。組換え菌は粗酵素抽出液の段階で既
に比較例１の９倍近いＰＡＰＳを合成していた。しかも
この組換え菌からはＰＡＰＳの合成に必要とされるＡＰ
Ｓキナーゼ／ＡＴＰスルフリラーゼが単一の酵素として
発現されるため、これまでのように両酵素を別々に精製
する手間も省けることになる。

【００３４】

【表１】実施例３：ＰＡＰＳの合成ＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスルフリラーゼをグルタチオン
−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパクとし
て発現させた後、精製してＰＡＰＳ合成反応に用いた。

【００３５】すなわち、実施例１で同定したＡＰＳキナ
ーゼ／ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子の翻訳領域をｐＧＥ
Ｘ−２ＴＫ（ファルマシア社製）にサブクローニング
し、この組換えプラスミドを大腸菌ＢＬ−２１に導入し
た。この菌体をＬ培地でＯＤ600 _nmが０．３になるまで
３７℃で培養した後、ＩＰＴＧを最終濃度で０．１ｍＭ
になるように添加し、以後２０℃で一昼夜培養した。培
養終了後、遠心分離により回収した菌体は、破砕バッフ
ァー［10mM Tris-HCl(pH8.0), 150mM NaCl, 1mMEDTA, 2
mM DTT, 1mM PMSF ］に懸濁後、破砕し、上清を遠心分
離により回収した。

【００３６】菌体破砕液からのＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰ
スルフリラーゼはＧＳＴ Gene Fusion System （ファル
マシア社製）により精製した後、酵素液としてＰＡＰＳ
合成反応に用いた。１０μｌの酵素液は等量のＰＡＰＳ
反応バッファー［1.25mM Na₂SO₄(0.5mCi/ml の放射性硫
酸基を含む), 25mM ATP, 50mM MgCl₂, 62.5mM Tris-HCl
(pH8.0) ］と混合し、３７℃で１５分間反応させた後、
５分間の煮沸で反応を停止させた。反応停止後、遠心分
離により変性タンパクを除き、１０μｌの上清を薄相ク
ロマトグラフ（ＴＬＣ）により展開（展開溶媒は、0.75
M Tris/0.45M HCl/0.5M LiCl）し、生成したＰＡＰＳを
オートラジオグラフにより検出した。放射性ＰＡＰＳ由
来のスポットを、濃度既知の放射性硫酸スタンダード由
来のスポットと比較したところ、無機リン酸の７８％
（ｎ＝５の平均）がＰＡＰＳに変換されていることが確
認された。

【００３７】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、ヒト由来のＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスルフリラ
ーゼを遺伝子工学的に大量製造するための遺伝子操作材
料と、この材料を用いたＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスルフ
リラーゼの製造方法が提供される。これにより、ＰＡＰ
Ｓを簡便な方法で大量に、しかも低コストで製造するこ
とが可能となる。

【００３８】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：624 配列の型：アミノ酸配列の種類：タンパク質起源：生物名：ホモサピエンス配列 Met Glu Ile Pro Gly Ser Leu Cys Lys Lys Val Lys Leu Ser Asn Asn 5 10 15 Ala Gln Asn Trp Gly Met Gln Arg Ala Thr Asn Val Thr Tyr Gln Ala 20 25 30 His His Val Ser Arg Asn Lys Arg Gly Gln Val Val Gly Thr Arg Gly 35 40 45 Gly Phe Arg Gly Cys Thr Val Trp Leu Thr Gly Leu Ser Gly Ala Gly 50 55 60 Lys Thr Thr Val Ser Met Ala Leu Glu Glu Tyr Leu Val Cys His Gly 65 70 75 80 Ile Pro Cys Tyr Thr Leu Asp Gly Asp Asn Ile Arg Gln Gly Leu Asn 85 90 95 Lys Asn Leu Gly Phe Ser Pro Glu Asp Arg Glu Glu Asn Val Arg Arg 100 105 110 Ile Ala Glu Val Ala Lys Leu Phe Ala Asp Ala Gly Leu Val Cys Ile 115 120 125 Thr Ser Phe Ile Ser Pro Tyr Thr Gln Asp Arg Asn Asn Ala Arg Gln 130 135 140 Ile His Glu Gly Ala Ser Leu Pro Phe Phe Glu Val Phe Val Asp Ala 145 150 155 160 Pro Leu His Val Cys Glu Gln Arg Asp Val Lys Gly Leu Tyr Lys Lys 165 170 175 Ala Arg Ala Gly Glu Ile Lys Gly Phe Thr Gly Ile Asp Ser Glu Tyr 180 185 190 Glu Lys Pro Glu Ala Pro Glu Leu Val Leu Lys Thr Asp Ser Cys Asp 195 200 205 Val Asn Asp Cys Val Gln Gln Val Val Glu Leu Leu Gln Glu Arg Asp 210 215 220 Ile Val Pro Val Asp Ala Ser Tyr Glu Val Lys Glu Leu Tyr Val Pro 225 230 235 240 Glu Asn Lys Leu His Leu Ala Lys Thr Asp Ala Glu Thr Leu Pro Ala 245 250 255 Leu Lys Ile Asn Lys Val Asp Met Gln Trp Val Gln Val Leu Ala Glu 260 265 270 Gly Trp Ala Thr Pro Leu Asn Gly Phe Met Arg Glu Arg Glu Tyr Leu 275 280 285 Gln Cys Leu His Phe Asp Cys Leu Leu Asp Gly Gly Val Ile Asn Leu 290 295 300 Ser Val Pro Ile Val Leu Thr Ala Thr His Glu Asp Lys Glu Arg Leu 305 310 315 320 Asp Gly Cys Thr Ala Phe Ala Leu Met Tyr Glu Gly Arg Arg Val Ala 325 330 335 Ile Leu Arg Asn Pro Glu Phe Phe Glu His Arg Lys Glu Glu Arg Cys 340 345 350 Ala Arg Gln Trp Gly Thr Thr Cys Lys Asn His Pro Tyr Ile Lys Met 355 360 365 Val Met Glu Gln Gly Asp Trp Leu Ile Gly Gly Asp Leu Gln Val Leu 370 375 380 Asp Arg Val Tyr Trp Asn Asp Gly Leu Asp Gln Tyr Arg Leu Thr Pro 385 390 395 400 Thr Glu Leu Lys Gln Lys Phe Lys Asp Met Asn Ala Asp Ala Val Phe 405 410 415 Ala Phe Gln Leu Arg Asn Pro Val His Asn Gly His Ala Leu Leu Met 420 425 430 Gln Asp Thr His Lys Gln Leu Leu Glu Arg Gly Tyr Arg Arg Pro Val 435 440 445 Leu Leu Leu His Pro Leu Gly Gly Trp Thr Lys Asp Asp Asp Val Pro 450 455 460 Leu Met Trp Arg Met Lys Gln His Ala Ala Val Leu Glu Glu Gly Val 465 470 475 480 Leu Asn Pro Glu Thr Thr Val Val Ala Ile Phe Pro Ser Pro Met Met 485 490 495 Tyr Ala Gly Pro Thr Glu Val Gln Trp His Cys Arg Ala Arg Met Val 500 505 510 Ala Gly Ala Asn Phe Tyr Ile Val Gly Arg Asp Pro Ala Gly Met Pro 515 520 525 His Pro Glu Thr Gly Lys Asp Leu Tyr Glu Pro Ser His Gly Ala Lys 530 535 540 Val Leu Thr Met Ala Pro Gly Leu Ile Thr Leu Glu Ile Val Pro Phe 545 550 555 560 Arg Val Ala Ala Tyr Asn Lys Lys Lys Lys Arg Met Asp Tyr Tyr Asp 565 570 575 Ser Glu His His Glu Asp Phe Glu Phe Ile Ser Gly Thr Arg Met Arg 580 585 590 Lys Leu Ala Arg Glu Gly Gln Lys Pro Pro Glu Gly Phe Met Ala Pro 595 600 605 Lys Ala Trp Thr Val Leu Thr Glu Tyr Tyr Lys Ser Leu Glu Lys Ala 610 615 620 624

【００３９】

【配列表】配列番号：2 配列の長さ：1875 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：ホモサピエンス配列 ATGGAGATCC CCGGGAGCTT GTGCAAGAAA GTCAAGCTGA GCAATAACGC GCAGAACTGG 60 GGAATGCAGA GAGCAACCAA TGTCACCTAC CAAGCCCATC ATGTCAGCAG GAACAAGAGA 120 GGTCAGGTGG TGGGGACCAG AGGTGGCTTT CGTGGTTGCA CAGTTTGGCT AACAGGCTTG 180 TCTGGAGCGG GAAAGACTAC TGTGAGCATG GCCTTGGAGG AGTACCTGGT TTGTCATGGT 240 ATTCCATGCT ACACTCTGGA TGGTGACAAT ATTCGTCAAG GTCTCAATAA AAATCTTGGC 300 TTTAGTCCTG AAGACAGAGA AGAGAATGTT CGACGCATCG CAGAAGTTGC TAAACTGTTT 360 GCAGATGCTG GCTTAGTGTG CATCACAAGT TTCATATCAC CTTACACTCA GGATCGCAAC 420 AATGCAAGGC AAATTCATGA AGGTGCAAGT TTACCGTTTT TTGAAGTATT TGTTGATGCT 480 CCTCTGCATG TTTGTGAACA GAGGGATGTC AAAGGACTCT ACAAAAAAGC CCGGGCAGGA 540 GAAATTAAAG GTTTCACTGG GATCGATTCT GAATATGAAA AGCCAGAGGC CCCTGAGTTG 600 GTGCTGAAAA CAGACTCCTG TGATGTAAAT GACTGTGTCC AGCAAGTTGT GGAACTTCTA 660 CAGGAACGGG ATATTGTACC TGTGGATGCA TCTTATGAAG TAAAAGAACT ATATGTGCCA 720 GAAAATAAAC TTCATTTGGC AAAAACAGAT GCGGAAACAT TACCAGCACT GAAAATTAAT 780 AAAGTGGATA TGCAGTGGGT GCAGGTTTTG GCAGAAGGTT GGGCAACCCC ATTGAATGGC 840 TTTATGAGAG AGAGGGAGTA CTTGCAGTGC CTTCATTTTG ATTGTCTTCT GGATGGAGGT 900 GTCATTAACT TGTCAGTACC TATAGTTCTG ACTGCGACTC ATGAAGATAA AGAGAGGCTG 960 GACGGCTGTA CAGCATTTGC TCTGATGTAT GAGGGCCGCC GTGTGGCCAT TCTTCGCAAT 1020 CCAGAGTTTT TTGAGCACAG GAAAGAGGAG CGCTGTGCCA GACAGTGGGG AACGACATGC 1080 AAGAACCACC CCTATATTAA GATGGTGATG GAACAAGGAG ATTGGCTGAT TGGAGGAGAT 1140 CTTCAAGTCT TGGATCGAGT TTATTGGAAT GATGGTCTTG ATCAGTATCG TCTTACTCCT 1200 ACTGAGCTAA AGCAGAAATT TAAAGATATG AATGCTGATG CTGTCTTTGC ATTTCAACTA 1260 CGCAACCCAG TGCACAATGG ACATGCCCTG TTAATGCAGG ATACCCATAA GCAACTTCTA 1320 GAGAGGGGCT ACCGGCGCCC TGTCCTCCTC CTCCACCCTC TGGGTGGCTG GACAAAGGAT 1380 GACGATGTTC CTTTGATGTG GCGTATGAAG CAGCATGCTG CAGTGTTGGA GGAAGGAGTT 1440 CTGAATCCTG AGACGACAGT GGTGGCCATC TTCCCATCTC CCATGATGTA TGCTGGACCA 1500 ACTGAGGTCC AGTGGCATTG CAGAGCACGG ATGGTTGCAG GAGCCAACTT TTACATTGTT 1560 GGACGAGACC CTGCTGGCAT GCCTCATCCA GAAACAGGGA AGGATCTTTA TGAGCCAAGT 1620 CATGGTGCCA AAGTGCTGAC GATGGCCCCT GGTTTAATCA CTTTGGAAAT AGTTCCCTTT 1680 CGAGTTGCAG CTTACAACAA GAAAAAGAAG CGTATGGACT ACTATGACTC TGAACACCAT 1740 GAAGACTTTG AATTTATTTC AGGAACACGA ATGCGCAAAC TTGCTCGAGA AGGCCAGAAA 1800 CCACCTGAAG GTTTCATGGC TCCCAAGGCT TGGACCGTGC TGACAGAATA CTACAAATCC 1860 TTGGAGAAAG CTTAG 1875

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明の組換えベクターの一実施例であるｐ
ｃＲＡＰＳの作成概要図である。図中、EcoRI 、Eco47I
II、BamHI 、SalIは制限酵素部位を、ＡＴＧは転写開始
部位を、Ｔ７はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ結合部位をそれ
ぞれ示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者水光正仁宮崎県宮崎郡清武町池田台41番地１

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１で表されるアミノ酸配列から
なるヒト由来ＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスルフリラーゼを
コードする遺伝子。
【請求項２】配列番号１で表されるアミノ酸配列にお
ける１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付
加されたアミノ酸配列からなるヒト由来ＡＰＳキナーゼ
／ＡＴＰスルフリラーゼをコードする遺伝子。
【請求項３】配列番号２の塩基配列を有するヒト由来
ＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子。
【請求項４】配列番号２の塩基配列における１もしく
は複数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列
を有するヒト由来ＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスルフリラー
ゼ遺伝子。
【請求項５】遺伝子の起源がヒト由来のｍＲＮＡまた
はｃＤＮＡライブラリーである請求項１ないし４の遺伝
子。
【請求項６】請求項１ないし４の遺伝子をベクターＤ
ＮＡに連結した組換えベクター。
【請求項７】ベクターＤＮＡがエッシェリヒア・コリ
を宿主とするプラスミドである請求項６の組換えベクタ
ー。
【請求項８】プラスミドがｐＲＳＥＴＡである請求項
７の組換えベクター。
【請求項９】請求項６ないし８の組換えベクターを含
む形質転換体。
【請求項１０】請求項７または８の組換えベクターを
含むエッシェリヒア・コリの形質転換体。
【請求項１１】請求項９または１０の形質転換体を培
地中で培養し、培養物からヒト由来ＡＰＳキナーゼ／Ａ
ＴＰスルフリラーゼを採取することを特徴とするヒト由
来ＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスルフリラーゼの製造法。
【請求項１２】請求項１１の製造法により得られたヒ
ト由来ＡＰＳキナーゼ／ＡＴＰスルフリラーゼを使用す
ることを特徴とする３’−ホスホアデノシン５’−ホス
ホ硫酸（ＰＡＰＳ）の製造法。