KR20240024237A - 바이글리칸 펩타이드 및 항체 - Google Patents

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안데르스 린달
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에스지피티에이치 라이프 사이언스 에이비
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Abstract

아미노산 서열 N-말단-GLGHN(서열번호 1)을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 제공되며, 여기서 항체는 서열 N-말단-GLGHN(서열번호 1)에 결합한다. 항체는, 예를 들어, 골 경화증, 골절, 관절의 박리 골절, 견열 골절, 골 타박상, 골다공증, 골 타박상, 골다공증 또는 암의 진단에 사용될 수 있다.

Description

바이글리칸 펩타이드 및 항체
본 발명은 펩타이드 및 펩타이드에 대한 항체, 및 진단, 특히 골절, 골 경화증 및 관련 질환의 진단에서의 이들의 용도에 관한 것이다.
골(bone)의 리모델링(remodeling) 및 연골의 생성은 2개의 분리되고 주의 깊게 제어되는 물리적 현상이다. 2개의 과정은 상이한 신호전달 메커니즘에 의해 조절되고, 상이한 세포 타입에 의해 제어된다. 예를 들어, 연골세포는 연골의 리모델링을 담당하는 반면, 골모세포 및 파골세포는 골 리모델링 및 모델링을 제어한다. 리모델링 및 모델링으로 기술되는 골 변화는 신체의 많은 위치에서 동시에 나타난다. 골은 일생 동안 대사적으로 활성적이고, 모든 골의 대략 20%가 매년 교체된다.
골 모델링은 생리학적 및 기계적 힘에 반응하여 골의 형상 및 크기를 변화시킨다. 이것은 성장하는 동물에서 가장 두드러진다. 성체 동물에서 골 리모델링은 오래된 골 기질(bone matrix)을 교체 및 재생하고 이의 강도 및 미네랄 항상성을 유지할 것이다. 골은 혈관이 잘 발달되어 있으며, 혈관형성은 골 활성에 관여한다.
반면, 연골은 혈관이 발달되지 않고, 매우 낮은 재생 능력으로 매우 느린 전환율(turnover)을 갖는다.
골 기질은 콜라겐 타입 I 및 베르시칸과 같은 유기 성분 및 무기 골 염, 주로 하이드록시아파타이트로 구성된다. 연골에서, 콜라겐 타입 II 및 아그레칸은 주요 기질 분자이다. 바이글리칸(biglycan)은 골의 미네랄화에서 역할을 하는 것으로 여겨진, 연골 및 골 결합 조직 둘 모두에서 발현되는 작은 류신-풍부 반복 프로테오글리칸이다.
골의 리모델링은, 예를 들어, 격렬한 신체 훈련, 골절 및 또한 골관절염과 같은 상이한 환경(setting)설정에서 및 또한 골관절염에서 일어날 수 있다.
골관절염(OA)은 관절 연골 및 기저 골(underlying bone)의 파괴에 기인하는 저-등급 만성 전신 염증성 질환이다. 질환은 염증 및 영향을 받은 관절에서 기질 단백질의 시작되는 분해를 특징으로 하는 초기 단계로부터 기저 골에 손상을 주는 보다 심각한 단계로 진행된다. 주요 증상은 관절의 통증이다. 골관절염은 인간 인구의 대략 3.8%에 영향을 미치기 때문에 주요 임상 문제이다. NSAID 진통제 처방의 50%가 OA와 관련이 있는 것으로 추정된다.
관절 통증으로 인해 의사는 종종 OA를 의심하게 되지만, 특히 환자가 고령인 경우, 오늘날에는 OA의 초기 단계를 진단하기는 어렵다. 오늘날 진단은 종종 방사선학을 이용한 OA의 말기 단계에 통상적인 비가역적 구조적 손상의 확인을 기반으로 한다. 그러나, 구조적 손상이 아직 보이지 않기 때문에, X-선 또는 MRI는 초기 단계의 OA를 진단하는 데 사용될 수 없다. 또한, X-선 및 MRI 검사는 고가의 장비를 필요로 하고, 방사선과 전문의와 약속을 잡는다.
말(horse)의 골관절염은 말 소유자에게 큰 문제이다. 말을 갖는 주된 이유는 말을 사용할 수 있고, 종종 대회에서 말을 사용하기 위함이다. OA는 절름발이(lameness)로 인해 말을 사용할 수 없는 가장 흔한 이유이며, OA는 말 산업에서 가장 큰 단일 경제적 손실을 차지한다.
OA의 맥락 이외에, 골의 리모델링은 골절의 치유 동안 및 운동 후에 일어난다. 운동은 특정 수준에서 생리학적인 연골하 골 경화증을 초래하는 골의 리모델링을 야기할 것이다. 그러나, 비-병리적 골 경화증은 병리학적 수준으로 넘어갈 수 있고, 이는 골과 연골의 계면에서 미세 골절을 초래할 것이다.
골 경화증은 운동선수 또는 말에서 훈련 동안 골 세포가 기계적 부하에 반응함에 따라 골의 경화 및 증가된 밀도를 특징으로 하는 병태이다.
미세골절은 골에 가해지는 힘이 그러한 골의 강도를 초과할 때 유발되는 골의 작은 골절이다. 이것은 달리기, 댄스, 군사 훈련 또는 체조와 같은 격렬한 활동을 통해 달성될 수 있다. 따라서, 미세골절은 기계적 부하로 인해 발생할 수 있다. 미세골절은 골과 연골의 일부가 분리되는 소위 박리 골절(chip fracture)을 유발할 수 있다. 박리 골절은 특히 박리 골절이 말의 수근 관절(carpal joint)에서 발생하는 경우 매우 문제가 된다. 많은 경우에, 말은 이러한 손상으로부터 회복될 수 없으며, 추가적으로 박리 골절은 치명적인 손상(catastrophic injury)으로 진행될 수 있으며, 말은 안락사될 필요가 있다. 또한, 기수(jockey)는 질주 경주마(gallop race horse)가 경주 중에 수근 골절을 입을 때 심하게 다칠 수 있다. 박리 골절은 또한 견열 골절(avulsion fracture)로 지칭된다.
골에 대한 외상으로 인한 골 부종은 골 경화증으로 발전할 수 있다. 운동선수는 종종, 운동선수가 골에서 통증, 예를 들어, 골 타박상으로 인한 통증을 느끼더라도 훈련하고 경쟁하려는 충동을 느낀다. 예를 들어, 축구 선수는 종종 축구 선수의 다리에 이러한 통증을 갖는다. 이러한 통증을 갖는 상태로 훈련하면 나중에 골 경화증 또는 박리 골절과 같은 합병증이 일어날 수 있다. 따라서, 추후 합병증을 예방하기 위해 운동 선수가 얼마나 오래 휴식을 취해야 하는 지를 알 수 있도록 이러한 상태를 모니터링할 수 있는 것이 매우 바람직할 것이다.
생리학적 골 경화증은 훈련 동안 경주마에서 발생하며, 이는 결국 박리 골절 및 급성 치명적 관절내 골절을 초래하는 미세 골절이 존재하는 병리학으로 진행될 수 있다(Diab et al. J Vet Diagn Invest. 2017;29(4):405-413).
OA-영향을 받은 관절에서 골의 리모델링은 또한 골에서 미세 골절을 유발할 수 있다. 이러한 미세 골절은 또한, 골의 일부와 연골이 분리되는 소위 박리 골절을 유발할 수 있다. 박리 골절은 특히 박리 골절이 말의 수근 관절에서 발생하는 경우 매우 문제가 된다. 많은 경우에, 말은 이러한 손상으로부터 회복될 수 없으며, 추가로 박리 골절은 치명적인 손상으로 진행될 수 있으며, 말은 안락사될 필요가 있다.
말과 인간의 OA는 유사한 메커니즘에 의해 유발된다. 인간과 말 둘 모두에서, OA는 수개월 및 수년에 걸친 염증을 특징으로 하는 초기 단계로부터 광범위한 조직 손상을 갖는 후기 단계로 진행된다(Goldring, M.B. and Otero M. Current Opinion in Rheumatology (2011) 23(5):471). 인간과 말에서 OA 질환 기전은 또한 분자 수준에서 매우 유사하다(Stenberg J, Rueetschi U, Skioeldebrand E, Kaerrholm J, Lindahl A. Proteome Sci. (2013) Oct 4;11(1):43)(Svala E, Loefgren M, Sihlbom C, Rueetschi U, Lindahl A, Ekman S, Skioeldebrand E. Connect Tissue Res. (2015);56(4):315-25). 연골하 골(SCB) 미세환경에서의 피로-관련 변화는 골관절염 과정의 한 부분이다(Hu et al Bone Res. 2021;9(1):20). 이는 통상적으로 OA 동안 연골 손상이 시작되기 전에 발생한다. WO 2017216289호에는 OA의 진단을 위한 COMP의 단편의 용도가 개시된다. COMP의 단편은 연골 분해의 바이오마커이다.
OA를 진단하고 스테이징(staging)하는 보다 편리한 방법이 있다면 유용할 것이다. OA에 대한 초기 마커의 부족은 비가역적인 조직 손상으로 나타나기 전에 질환을 제어하는 데 사용될 수 있는 약물의 개발을 방해한다. 따라서, OA에 대한 개선된 바이오마커가 여전히 필요하다.
현재, 말에서 통증 및 후속 절름발이를 유발하는 미세 골절로 이어지는 골 리모델링의 초기 단계를 식별할 수 있는 진단 도구는 없다.
미세골절 및 골 경화증 및 과잉 훈련 및 관련 병태를 예방 및 진단 및 예방하는 것이 필요하다. 또한, 암, 특히 결장암을 진단하기 위한 개선된 방법이 필요하다.
진단은 종종 혈액 샘플을 사용하여 수행된다. 이는 불편함을 유발할 수 있고, 정맥으로부터 혈액 샘플을 채취하는 것을 포함하기 때문에 환자에게 완전히 위험이 없는 것은 아니다. 그러한 진단이 보다 편리한 방식으로 수행될 수 있다면 유용할 것이다.
승마 경기장을 위한 지면 물질(소위 "풋팅(footing)")은 말의 건강에 매우 중요하다. 예를 들어, 너무 단단한 풋팅은 연골하 골 및 골절을 증가시킬 수 있다. 최근에 새로운 풋팅이 개발되었다. 예를 들어, 모래와 폴리머 섬유의 혼합물이 최근에 도입되었다. 말의 건강에 대한 새로운 풋팅의 효과에 대해서는 약간의 불확실성이 있다. 이러한 풋팅을 조사하기 위한 더 나은 방법이 필요하다.
본 발명은 이들 및 다른 문제를 해결한다.
본 발명자들은 놀랍게도 바이글리칸(BGN262)(N-말단-GLGHN(서열번호 1))의 절단 단편이 골 파괴 및 연골하 골 경화증, 및 다른 질환에서 탁월하다는 것을 발견하였다.
본 발명의 제1 양태에서, 아미노산 서열 N-말단-GLGHN(서열번호 1)을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.
항체는 N-말단을 노출시키는 바이글리칸의 단백질분해 단편의 검출에 사용될 수 있다.
본 발명의 제2 양태에서, 진단에 사용하기 위한 본 발명의 제1 양태에 따른 항체가 제공된다. 진단은 대상체에서 골관절염, 골 경화증, 골절, 관절의 박리 골절, 견열 골절, 골 타박상, 골다공증, 암, 죽상경화판, 대동맥 판막 협착증, 카신-베크병, 건염, 눈 장애, 피부 장애, 섬유증, 류마티스 관절염, 루푸스 신염, 당뇨병, 석회화된 대동맥 판막 질환, 심막심근염, 제1형 인슐린-의존성 진성 당뇨병, 또는 크론병의 진단일 수 있다.
특히, 진단은 골관절염, 골 경화증, 골절, 견열 골절, 관절의 박리 골절, 골 타박상 또는 골다공증의 진단일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 항체는 대상체로부터의 샘플에서 아미노산 서열 N-말단-GLGHN을 포함하는 펩타이드의 양을 검출하기 위해 사용된다. 샘플은 임의의 적합한 샘플, 예를 들어, 활액, 척수액(액체), 혈청, 혈액, 혈장, 소변 또는 타액의 샘플일 수 있다.
본 발명의 제3 양태에서, 대상체로부터 샘플을 단리하는 단계, 및 샘플에서 아미노산 서열 N-말단-GLGHN을 포함하는 펩타이드의 존재에 대해 샘플을 분석하는 단계를 포함하는 진단 방법이 제공된다.
본 발명의 제4 양태에서, 골 경화증, 골절, 관절의 박리 골절, 견열 골절, 골 타박상, 골다공증, 암, 죽상경화반, 대동맥 판막 협착증, 카신-베크병, 건염, 눈 장애, 피부 장애, 섬유증, 류마티스 관절염, 루푸스 신염, 당뇨병, 석회화된 대동맥 판막 질환, 심막심근염, 제1형 인슐린-의존성 진성 당뇨병, 또는 크론병으로부터 선택된 질환을 진단하는 방법으로서, 대상체로부터 이전에 단리된 샘플을 제공하는 단계, 및 샘플에서 아미노산 서열 N-말단-GLGHN을 포함하는 펩타이드의 존재에 대해 샘플을 분석하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
바람직한 구현예에서, 질환은 골 경화증, 골절, 관절의 박리 골절, 견열 골절, 골 타박상, 골다공증 또는 암, 특히 골 경화증, 골절, 관절의 박리 골절, 견열 골절, 골 타박상 또는 골다공증 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 질환은 암, 특히 결장암이다.
샘플은 활액, 척수액(액체), 혈청, 혈액, 혈장, 소변 또는 타액 중 하나, 특히 타액일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 대상체에서 골관절염, 골 경화증, 골절, 관절의 박리 골절, 견열 골절, 골 타박상, 골다공증을 예방하기 위한 방법으로서,
a) 대상체로부터 샘플을 수득하고, 샘플에서 아미노산 서열 N-말단-GLGHN(서열번호 1)을 포함하는 펩타이드의 존재를 분석하는 단계,
b) 샘플에서 대상체에서의 펩타이드의 수준이 미리 결정된 수준을 초과하는 경우, 대상체가 치료되어야 하는 것으로 결정하는 단계로서, 여기서 치료는 대상체를 쉬도록 하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양태에서, 대상체에서 골관절염, 골 경화증, 골절 또는 관절의 박리 골절을 예방하기 위한 방법으로서,
a) 반복적으로 대상체로부터 샘플을 수득하고, 샘플에서 아미노산 서열 N-말단-GLGHN(서열번호 1)을 포함하는 펩타이드의 존재를 분석하는 단계,
b) 샘플에서 대상체에서의 펩타이드의 수준이 미리 결정된 수준을 초과하는경우, 대상체가 치료되어야 하는 것으로 결정하는 단계로서, 여기서 치료는 대상체를 쉬게 하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 제1 양태에 따른 항체를 포함하는 키트가 제공된다. 항체는 단일 사용을 위한 진단 디바이스에 포함될 수 있으며, 여기서 키트는 타액 샘플링 디바이스를 추가로 포함한다. 진단 디바이스는 측방 유동 디바이스일 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 아미노산 서열 N-말단-GLGHN(서열번호 1)을 포함하는 펩타이드가 제공된다.
본 발명의 다른 양태에서, 항체의 생산을 위한, 아미노산 서열 N-말단-GLGHN(서열번호 1)을 포함하는 펩타이드의 용도가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 말 경기장용 풋팅의 특성을 결정하는 방법으로서, 풋팅 상에서 운동한 말로부터 샘플을 수득하는 단계, 및 샘플에서 아미노산 서열 N-말단-GLGHN을 포함하는 펩타이드의 존재에 대해 샘플을 분석하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
도 1은 항체의 특이성을 나타내는 ELISA 데이터를 나타내는 다이아그램이다.
도 2는 말의 수근 관절로부터 연골 및 골 절편의 바이글리칸 네오-에피토프의 면역조직화학 염색의 이미지이다.
도 3은 말 활액으로부터의 ELISA 데이터를 나타내는 다이아그램이다.
도 4는 활액으로부터의 ELISA 데이터를 보여주는 다이아그램이다.
도 5는 말 혈청으로부터의 ELISA 데이터를 나타내는 다이아그램이다.
도 6은 말의 타액에서 바이글리칸 네오에피토프의 존재를 나타내는 다이아그램이다.
도 7은 훈련을 받는 건강한 말에서 바이글리칸 네오에피토프의 존재를 나타내는 다이아그램이다.
도 8은 암 환자에서 바이글리칸 네오에피토프의 존재를 나타내는 다이아그램이다.
도 9 및 도 10은 말의 타액에서 바이글리칸 네오에피토프의 존재를 보여준다.
도 11 및 도 12는 인간의 타액에서 바이글리칸 네오-에피토프의 존재를 보여준다.
본 발명은 바이글리칸, 특히 서열 N-말단-GLGHN(서열 번호 1)("바이글리칸 네오에피토프")의 절단 단편을 포함하는 펩타이드, 이러한 펩타이드에 대한 항체 및 진단에서의 이러한 항체의 용도에 관한 것이다.
펩타이드는 N-말단이 서열 GLGHN을 갖는 한, 5 내지 100개, 바람직하게는 5 내지 30개, 더욱 바람직하게는 5 내지 20개 아미노산, 더욱 바람직하게는 5 내지 9개 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 따라서, 펩타이드의 이러한 서열의 제1 글리신 잔기는 펩타이드의 NH2 기를 갖는다. 펩타이드는 적어도 5개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 적어도 6개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 적어도 7개의 아미노산 잔기 및 가장 바람직하게는 적어도 8개의 아미노산 잔기의 길이를 가질 수 있다.
일 구현예에서, 펩타이드는 면역화에 사용될 수 있는 길이를 갖는다.
펩타이드는 단리된 펩타이드일 수 있다. 펩타이드는, 예를 들어, 활액, 혈액, 혈장 또는 혈청으로부터 단리될 수 있다. 펩타이드는 또한 당 분야에 공지된 방법, 예를 들어, 문헌[R. B. Merrifield (1963). "Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide". J. Am. Chem. Soc. 85 (14): 2149-2154 및 Schnolzer, M. A., P.; Jones, A.; Alewood, D.; Kent, S.B.H. (2007). "In Situ Neutralization in Boc-chemistry Solid Phase Peptide Synthesis". Int. J. Peptide Res. Therap. 13 (1-2): 31-44]에 공지된 방법을 이용하여, 합성될 수 있다.
펩타이드는 항체의 생산 및 단리에 사용될 수 있다. 항체는 아미노산 서열 N-말단-GLGHN을 포함하거나 이로 구성된 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 용어 "항체"는 또한 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 및 단일-사슬 항체 및 높은 특이성으로 에피토프에 결합하는 유사한 타입의 단백질, 특히, 항체로부터 유래되거나 항체로부터의 단편을 포함하는 단백질, 특히, N-말단 GLGHN에 결합하는 항체로부터의 가변 사슬을 포함하는 단백질을 포함한다. 펩타이드에 대한 항체를 생산하는 방법은 잘 알려져 있다. 펩타이드는 펩타이드에 결합하는 항체에 대한 스크리닝 및 또한 항체 정제에 사용될 수 있다.
바람직하게는, 항체는 펩타이드에 대해 높은 친화성을 갖는다. 친화성은 해리 상수(Kd)를 사용하여 표현될 수 있다. 바람직한 결합 친화성은 10-6 M 미만, 더욱 바람직하게는 5×10-7 M, 더욱 바람직하게는 10-7 M, 더욱 바람직하게는 5×10-8 M, 더욱 바람직하게는 10-8 M, 더욱 바람직하게는 5×10-9 M, 더욱 바람직하게는 10-9 M, 더욱 바람직하게는 5×10-10 M, 더욱 바람직하게는 10-10 M, 더욱 바람직하게는 5×10-11 M, 더욱 바람직하게는 10-11 M, 더욱 바람직하게는 5×10-12 M, 더욱 바람직하게는 10-12 M, 더욱더 바람직하게는 5×10-13 M, 또는 가장 바람직하게는 10-13 M 미만의 해리 상수(Kd)를 갖는 것들을 포함한다. 바람직하게는 항체는 단리된 항체이다. 항체는 정제된 항체일 수 있다.
바람직하게는 항체는 서열 N-말단-GLGHN(서열번호 1), 특히 N-말단 -GLGHNQ(서열번호 2), 더욱 바람직하게는 N-말단 GLGHNQI(서열번호 3) 및 가장 바람직하게는 N-말단 GLGHNQIR(서열번호 4), N-말단-GLGHNQIRM(서열번호 5), N-말단-GLGHNQIRMI(서열번호 6), N-말단-GLGHNQIRMIE(서열번호 7), N-말단-GLGHNQIRMIEN(서열번호 8), N-말단-GLGHNQIRMIENG(서열번호 9), N-말단-GLGHNQIRMIENGS(서열번호 10) 또는 N-말단-GLGHNQIRMIENGSC(서열번호 11)를 포함하거나 이로 구성된 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 항체를 생성하기 위해, N-말단-GLGHN보다 긴 펩타이드, 예를 들어, 면역화 펩타이드 GLGHNQIRMIE(서열번호 7)로 면역화하는 것이 적합할 수 있다.
본 발명의 다양한 구현예에서, 바이글리칸 절단 부위의 상류의 서열이 사용된다. 이러한 펩타이드 및 이러한 펩타이드에 대한 항체는 본원에 기재된 다른 펩타이드와 동일한 방식으로 사용된다. 특히, 서열 KLYRL-C-말단(서열번호 14), 더욱 바람직하게는 SKLYRL-C-말단(서열번호 15), 더욱 바람직하게는 YSKLYRL-C-말단(서열번호 16), 더욱 바람직하게는 RYSKLYRL-C-말단(서열번호 17), 더욱 바람직하게는 LRYSKLYRL-C-말단(서열번호 18), 더욱 바람직하게는 LLRYSKLYRL-C-말단(서열번호 19), 더욱 바람직하게는 DLLRYSKLYRL-C-말단(서열번호 20), 및 가장 바람직하게는 EDLLRYSKLYRL-C-말단(서열번호 21)이 검출될 수 있다.
항체는 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 염소, 말 또는 닭 등과 같은 포유동물로부터 유래된 임의의 항체일 수 있으며, 이들 중에서 마우스가 바람직하다. 항체의 이소타입은 IgG, IgM, IgE, IgA, IgY 등 중 임의의 것일 수 있다.
항체는 당 분야에 공지된 바와 같이 동물, 예를 들어, 토끼의 면역화에 의해 생산된 폴리클로날 항체일 수 있다. 그러나, 바람직하게는 항체는 모노클로날 항체이다. 바람직하게는 모노클로날 항체는 마우스 또는 토끼 모노클로날 항체이다.
항체를 생산, 정제 및 단리하고 이들의 결합 능력을 결정하기 위한 잘 알려진 방법이 있다. 항원의 존재를 결정하기 위해 항체를 사용하는 널리 공지된 방법이 또한 존재한다. 자세한 내용은 "Current Protocols in Immunology" 및 "Current Protocols in Molecular Biology"를 참조한다.
펩타이드에 대한 모노클로날 항체는 잘 알려진 하이브리도마 기술을 사용하여 생성될 수 있다(Kohler and Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). 단일 클론은 제한 희석 분석, 소프트 아가 검정, 형광 활성화된 세포 분류기를 사용하는 방법 등에 의해 단리될 수 있다. 제한 희석 분석에서, 예를 들어, 하이브리도마의 콜로니는 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 단리하기 위해 배양 전에 배지에서 대략 1개의 세포/웰로 연속 희석된다. 항체는 키메라 항체 또는 인간화 항체일 수 있다.
항체 클론은 또한, 예를 들어, 파지 디스플레이와 같은 다른 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
항체가 뮤린 IgG인 경우, 항체는 단백질 A-컨쥬게이션된 담체 또는 항-마우스 면역글로불린-컨쥬게이션된 담체를 사용하여 친화성 크로마토그래피로 정제될 수 있다.
항체는 상이한 방식으로 진단에 사용될 수 있다. 항체는 인간 또는 동물일 수 있는 대상체로부터의 샘플에서 펩타이드의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 데 사용될 수 있다. 항체는 대상체로부터의 샘플과 접촉될 수 있다. 샘플은 임의의 타입의 생물학적 샘플, 예를 들어, 활액, 혈액, 타액, 혈장, 혈청, 척수액(액체) 또는 소변, 복수, 또는 조직학적 섹션에서 사용되는 생물학적 조직일 수 있다. 섹션에 유용한 조직의 예는 골, 연골 힘줄, 눈, 췌장, 대동맥, 신장 및 피부를 포함한다. 바람직하게는 샘플은 액체 샘플이다. 바람직한 구현예에서, 샘플은 혈청 샘플, 혈액 샘플, 혈장 샘플 또는 활액의 샘플이다. 더욱 바람직한 하나의 구현예에서, 샘플은 활액의 샘플이다. 하나의 바람직한 구현예에서, 샘플은 소변 샘플 또는 타액 샘플, 특히 타액 샘플이다. 적합한 부피의 샘플이 수집된다. 샘플이 액체 형태, 특히 타액 샘플 또는 활액 샘플일 때, 샘플은 예를 들어, 50 ㎕ 내지 2000 ㎕의 부피를 가질 수 있다. 타액 샘플은 적어도 300 ㎕, 더욱 바람직하게는 적어도 500 ㎕가 적합하다. 샘플이 타액 샘플인 경우, 샘플을 채취하기 전에 대상체를 쉬게 하는 것이 유용할 수 있다. 휴식 기간은, 예를 들어, 적어도 30분, 더욱 바람직하게는 적어도 1시간일 수 있다. 휴식 시 측정된 펩타이드 수준을 운동 직후의 펩타이드 수준과 비교하는 것이 또한 유용할 수 있다.
샘플은 대상체로부터 단리될 수 있다. 샘플은 결합 단계가 수행되기 전에 대상체로부터 단리될 수 있다. 따라서, 진단 방법은 대상체로부터 이전에 단리된 샘플을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 진단 방법은 시험관내에서 수행될 수 있다.
항체로 샘플에서 펩타이드의 농도를 측정하는 편리한 방식은 ELISA이다. ELISA(효소-결합 면역흡착 검정)의 설계 및 사용은 진단 분야에 잘 알려져 있다. 항체는 또한, 예를 들어, 면역조직화학에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 조직의 얇은 섹션, 예를 들어, 동결, 파라핀-처리 또는 고정된 조직은 조직병리학 분야에 공지된 바와 같이 항체를 사용하여 염색될 수 있다. 항체는 또한 웨스턴 블롯 또는 Wes 또는 Simple Western 시스템에서 사용될 수 있다.
항체는 다양한 방식으로 검출될 수 있다. 자주 사용되는 방법은 검출될 수 있는 물질(마커 또는 표지), 예를 들어, 효소(예컨대, HRP), 형광단 또는 방사성표지와 컨쥬게이션된 이차 항체를 사용하는 것이다. 예를 들어, 일차 항체가 마우스 항체인 경우, 이차 항체는 염소 항-마우스 항체일 수 있다. 마커의 존재는 당 분야에 공지된 방법으로 검출될 수 있다: 효소는 칼라 또는 빛을 생성하는 시약으로 검출될 수 있고, 방사성표지는 신틸레이터(scintillator) 또는 사진 필름으로 검출될 수 있고, 형광단은 형광 검출기로 검출되거나 형광 현미경으로 볼 수 있다.
대안적으로, 일차 항체(항-N-말단-GLGHN-항체)는 마커/표지와 직접 컨쥬게이션될 수 있다.
ELISA 또는 면역조직화학과 같은 다양한 절차에서 사용될 때 항체의 적합한 작업 농도는 항체의 친화성에 의존하고, 우수한 신호 대 노이즈 비율을 제공하는 제공하는 농도를 확인하기 위해 상이한 농도의 항체를 시험함으로써 결정될 수 있다. 예로서, 1 mg/ml의 농도를 갖는 항체 스톡은 적합한 작업 농도를 시험하기 위해 1/100, 1/200, 1/1000 및 1/5000으로 희석될 수 있다. 이러한 절차에서 항체의 작업 농도는 일반적으로 ㎍/ml의 범위, 예를 들어, 1 ng 내지 10 ㎍/ml이다. 항체는 가능하게는 BSA와 같은 추가적인 단백질 및 소듐 아지드와 같은 보존제를 사용하여 PBS 중에 희석되는 것이 적합하다.
항체는 대상체, 특히 인간 또는 말에서 질환의 진단에 사용될 수 있다. 그러나, 대상체는 또한 소, 개, 고양이, 양, 돼지, 래트 또는 마우스 또는 임의의 다른 포유동물일 수 있다. 예를 들어, 샘플에서 펩타이드의 농도는 표준 방법, 예를 들어, ELISA를 사용하여 결정될 수 있다. 이렇게 결정된 농도는 표준 값(기준 값) 또는 컷-오프 수준과 비교될 수 있다. 표준 값으로부터의 편차는 특정 질환 또는 질환의 단계를 나타낼 수 있다.
다양한 구현예에서, 병태가 발병할 위험이 결정된다. 대상체는 병태를 갖는 것으로 의심될 수 있다. 샘플에서 펩타이드의 존재는 병태 또는 병태에 대한 위험을 나타낼 수 있다.
진단은 전신 염증, 특히 전신 저등급 만성 염증과 관련된 질환의 진단일 수 있다. 펩타이드의 존재는 질환을 나타낸다. 따라서, 진단은 대상체에서 골관절염, 골 경화증, 골절, 견열 골절, 관절의 박리 골절, 골 타박상, 골다공증, 암, 죽상경화판, 대동맥 판막 협착증, 카신-베크병, 건염, 눈 장애, 피부 장애, 섬유증, 류마티스 관절염, 루푸스 신염, 당뇨병, 석회화된 대동맥 판막 질환, 심막심근염, 제1형 인슐린-의존성 진성 당뇨병, 또는 크론병의 진단일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 진단은 골관절염, 골 경화증, 골절, 견열 골절 또는 관절의 박리 골절, 또는 골 타박상 또는 골다공증의 진단이다.
다양한 구현예에서, 진단은 암, 특히 결장암의 진단이다. 진단될 수 있는 다른 암은 폐암, 간암, 신장암, 방광암, 췌장암, 위암, 신장암, 유방암, 자궁경부암, 피부암, 전립선암 및 자궁내막암을 포함한다. 펩타이드 N-말단-GLGHN의 존재는 종양의 침습 특성과 상관관계가 있다.
다양한 바람직한 구현예에서, 진단은 골 경화증, 골절, 견열 골절, 관절의 박리 골절 중 하나 이상의 진단이다. 펩타이드의 존재는 생리학적에서 병리학적 골 경화증으로의 진행, 미세 골절로의 진행, 박리 골절 또는 견열 골절로의 진행 및 치명적인 손상(관절내 골절)으로의 진행을 모니터링하는 데 사용될 수 있다.
항체는 포유동물, 특히 인간 또는 말에서 OA의 진단에서 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 활액 또는 다른 샘플에서 높은 농도의 펩타이드는 초기 OA, 예를 들어, 초기 골연골 병변, 연골하 리모델링, 또는 골연골 분할을 갖는 OA를 나타낼 수 있다. 낮은 농도의 펩타이드는 OA가 없음을 나타낼 수 있다. 펩타이드의 존재는 생리학적에서 병리학적 골 경화증으로의 진행, 미세 골절로의 진행, 박리 골절로의 진행 및 치명적인 손상(관절내 골절)으로의 진행을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 펩타이드는 또한 특히 말에서 급성 절름발이/초기 OA 내지 만성 절름발이/만성 OA를 모니터링하는 데 사용될 수 있다.
컷-오프 수준은 사용된 방법에 의존할 수 있고, 표준 실험 및 적절한 대조군을 사용하여 확립될 수 있다. 예를 들어, 질환을 갖는 대상체의 샘플에서 펩타이드의 수준(여기서 질환은 펩타이드를 사용하는 것과 상이한 방식으로 결정됨)은 건강한 대상체의 그룹에서 펩타이드의 수준과 비교된다. 따라서, 컷-오프 값은 미리 결정될 수 있다. 컷-오프 값은, 예를 들어, 건강한 대상체에 대한 평균 수준의 150%, 더욱 바람직하게는 200%, 및 가장 바람직하게는 300%일 수 있다. 혈청 또는 활액에 대한 컷-오프 값은 300 ng/ml, 더욱 바람직하게는 500 ng/ml, 더욱 바람직하게는 600 ng/ml, 더욱 바람직하게는 800 ng/ml 및 가장 바람직하게는 1000 ng/ml일 수 있다. 타액에 대한 컷-오프 값은 20 ng/ml, 더욱 바람직하게는 100 ng/ml 및 더욱 바람직하게는 500 ng/ml 및 가장 바람직하게는 1000 ng/ml일 수 있다. 그러나, 적합한 컷-오프 값은 진단되는 상태, 대상체의 종 및 샘플의 타입에 따라 선택되어야 한다.
방법이 골관절염, 골 경화증, 관절의 골절 또는 박리 골절, 또는 이러한 병태의 발병 위험을 진단하는 데 사용되었을 때, 대상체는 치료될 수 있다.
특히 말에 대한 한 가지 형태의 치료는 대상체를 쉬게 하는 것이다. 예를 들어, 훈련의 양을 감소시킨다. 또한, 대상체가 인간, 특히 운동선수인 경우, 치료는 훈련을 감소시키고 쉬게 하는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 대상체는 다량의 펩타이드에 대해 스크리닝된다. 예를 들어, 샘플은 적어도 3일, 더욱 바람직하게는 적어도 7일, 더욱 바람직하게는 적어도 1개월 및 가장 바람직하게는 적어도 3개월일 수 있는 시간 간격으로 반복적으로 수집되고 분석된다. 시간 간격은 상한, 예를 들어, 7일 내지 6개월을 가질 수 있다. 예를 들어, 예방 조치로서, 펩타이드는 훈련 대상인 말의 타액, 혈청 또는 활액에서 검출될 수 있다. 말, 특히 비-절름발이 말에서 증가된 농도의 펩타이드의 경우, 한 가지 치료 옵션은 훈련량을 감소시키는 것이다. 훈련은 활액 및 혈청에서 펩타이드 수준이 다시 낮아질 때까지 일정 기간 동안 낮은 강도로 유지될 수 있다. 기준선 펩타이드 수준은 대상체가 건강할 때 대상체에 대해 결정될 수 있다. 컷-오프 값이 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 대상체에 대한 최적의 훈련량이 확립될 수 있다.
추가 단계로서, 혈청 또는 활액에서 고농도의 바이글리칸 단편을 갖는 절름발이 말의 경우, 관절경검사가 추가 진단 양식으로 사용될 수 있다. 이는 적절한 치료가 뒤따를 수 있다. 약리학적 치료, 예를 들어, WO 2020/084113호에 기재된 치료(실데나필 치료). 박리 골절이 있는 경우, 관절경검사 동안 단편이 제거될 수 있다. 재활 동안, 바이오마커는 허용되는 훈련의 양을 결정하기 위해 모니터링될 수 있다.
항체 및 필요한 시약은 샘플에서 펩타이드를 검출하기 위한 키트에 포함될 수 있다. 키트는 ELISA, 예를 들어, 경쟁적 ELISA에 기반할 수 있다. 키트는 정지상(예컨대, 웰을 갖는 플레이트), 이차 항체, 펩타이드, 완충제, 및 마커 또는 표지를 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 키트는 샘플 수집 디바이스, 특히 타액 수집 디바이스, 예를 들어, 말을 위한 타액 수집 디바이스를 포함한다. 인간 대상체를 위한 타액 수집 디바이스는 대상체가 타액 샘플을 뱉도록 하기 위한 깔때기를 갖는 시험관을 포함할 수 있다. 말 또는 다른 동물을 위한 타액 수집 디바이스는 면봉에 연결된 디바이스를 잡기 위한 핸들을 포함할 수 있다. 사용자는 핸들을 잡고 면봉을 말일 수 있는 대상체의 입에 삽입한다. 면봉은 이후 타액 샘플을 흡수한다. 수집 후, 면봉은 추후 분석을 위해 샘플 튜브에 삽입될 수 있다. 예는 Austin Davies Biologics Ltd.에 의한 EquiSal 타액 수집 면봉을 포함한다. 샘플 수집 디바이스는 샘플을 보존하기 위한 완충제를 포함할 수 있다.
키트는 단일 사용을 위한 진단 디바이스, 예를 들어, 항체를 도입하는 측방 유동 디바이스(lateral flow device)를 포함할 수 있다. 이러한 측방 유동 디바이스는 공지되어 있고, 통상적으로 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 및 검출 수단, 예를 들어, 항체가 항원에 결합하는 경우, 칼라 또는 형광 신호 또는 다른 신호를 발생시키는 시약을 포함한다. 칼라 또는 형광 신호의 존재는 샘플에서 항원의 존재를 나타낸다. 측방 유동 디바이스는 통상적으로 샘플에서 대조군 물질의 존재를 결정하기 위한 수단(양성 대조군)을 포함한다. 적합한 측방 유동 시험의 예는 US6,485,982호 및 US9,034,657호 및 이에 인용된 참고문헌에 개시된 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원(이러한 경우에 펩타이드)의 양은, 예를 들어, 측방 유동 디바이스로부터 비색 또는 형광 신호를 판독함으로써 정량화될 수 있다. 판독기는 비색 또는 형광 신호를 판독하고 신호를 정량화하도록 배열될 수 있다. 이러한 방식으로 샘플에서 펩타이드의 수준이 결정되고 컷-오프 값과 비교될 수 있다. 진단 디바이스에 적합한 판독기는 Lumos Diagnostics Ltd.로부터의 Reusuable Reader일 수 있다.
진단은 또한 항체 이외의 다른 수단에 의해 본원에 기재된 펩타이드, 예컨대, N-말단-GLGHN 및 KLYRL-C-말단을 검출함으로써 수행될 수 있다. 적합한 방법은 질량 분광법에 의한 펩타이드의 시퀀싱 및 Edman 분해에 의한 펩타이드 시퀀싱을 포함한다.
펩타이드 또는 항체는 또한 말 경기장에 대한 풋팅의 특성을 결정하는 데 사용될 수 있다. 더 부드러운 풋팅은 말의 관절에 더 적은 스트레스를 발생시킬 것이고, 말로부터의 샘플에서 더 적은 양의 펩타이드를 야기할 것이다. 따라서, 말 경기장용 풋팅의 특성을 결정하는 방법은 풋팅에서 운동한 말로부터 샘플을 수득하는 단계, 및 샘플에서 펩타이드를 포함하는 펩타이드의 존재에 대해 샘플을 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 상이한 풋팅으로부터의 결과는 이러한 방식으로 비교될 수 있다. 바람직하게는, 다수의 건강한 말, 예를 들어, 3 내지 10마리의 말이 미리 결정된 시간 동안 선택된 풋팅에서 운동하도록 허용되고 샘플, 예를 들어, 혈청 샘플 또는 타액 샘플이 미리 결정된 기간 후에 각 말로부터 수집된다. 바람직하게는, 펩타이드 수준이 다음 시험 전에 휴식 수준으로 되돌아오도록, 각각의 말은 2개의 상이한 풋팅을 시험하는 사이에서 쉬도록 한다. 말이 쉬고 있을 때 각각의 말에 대한 기준선 수준이 결정될 수 있다.
실시예 1
바이글리칸 절단 부위 RYSKLYRL*GLGHNQIRMIENGSC(서열번호 12)(여기서, *는 절단 부위가 천연 말 바이글리칸의 N-말단으로부터 258개 아미노산에 위치함을 나타냄(UniProtKB/Swiss-Prot: O46403.1)).
아미노산 펩타이드 GLGHNQIRMIE(서열번호 7)에 대한 모노클로날 항체를 토끼에서 생산하였다(Genescript). 또한, 펩타이드 GLGHNQIRMIE에 대한 특정 폴리클로날 항체를 토끼에서 생산하였다.
생물정보학 분석은 절단 부위 주변의 아미노산 서열(RYSKLYRL*GLGHNQIRMIENGSC)이 분석된 모든 포유동물 종(인간, 말, 소, 돼지, 마우스, 래트, 양, 토끼, 개 및 집 고양이)에서 완전히 보존됨을 보여주었다(데이터는 제시되지 않음). 따라서, 항체는 모든 포유동물에서 네오에피토프를 검출하는데 유용할 것으로 예상될 수 있다.
실시예 2
BGN262 또는 "바이글리칸 네오에피토프"로도 지칭되는 펩타이드 GLGHNQIRMIENGSC(Big Neo)(서열번호 11)를 사용하여 말 혈청에서 바이글리칸 네오에피토프의 검출을 위해 억제성 ELISA를 개발하고 평가하였다. Genscript 펩타이드 용해도 지침에 따라 냉동-건조된 펩타이드를 재구성하였다. 요컨대, Big Neo 펩타이드를 1 mg/mL의 농도로 증류수에서 재구성한 후, 분취하고, 냉동시키고, 사용할 때까지 -80℃에 저장하였다.
억제성 ELISA는 플레이트를 Big Neo로 코팅하는 것으로 시작하였다. Nunc MaxiSorp™ Clear Flat-Bottom 96-Well Plates(Invitrogen)를 사용하고 pH 9.6의 100 mM 카보네이트 완충액에서 1 ㎍/mL로 희석된 Big Neo(100 ㎕/웰, Genscript)를 첨가하여, 펩타이드를 4℃에서 밤새 코팅하고, ELISA-플레이트로 표시하였다.
보정 표준물을 Big Neo 펩타이드의 스톡(1 mg/mL)으로부터 제조하였다. 먼저 가장 높은 표준점을 MultiBooster(Kementec)에서의 희석액으로 2000 ng/mL로 설정한 후, 11 단계-1:2 연속 희석액(1 mL 펩타이드 + 1 mL MultiBooster)을 사용하여 보정 표준물을 0(펩타이드 없음 11번째) 내지 2000 ng/mL의 범위를 제조하였다.
혈청 샘플을 또한 Multibooster(Kementec)에서 1:20 희석에 의해 제조하였고, 활액을 1:4 희석에 의해 제조하였다. 일차 항체가 1:20 희석액에서 가장 많은 펩타이드를 발견한 정상 혈청의 연속 희석액을 분석한 후 혈청 희석을 결정하였다. 혈청 대조군으로서 본 발명자들은 Equidae 혈청(lot.2109875, Gibco)을 사용하였다.
실시예 1의 모노클로날 항체(0.681 mg/mL)를 일차 항체로 사용하였다. 일차 항체를 MultiBooster에서 30 ng/mL의 농도로 희석하였다.
100 ㎕의 각 농도의 보정 표준물 및 샘플(이중)을 Thermo Scientific™ Sterilin™ Clear Microtiter™ 플레이트(Fisher Scientific)에 첨가하였다. 30 ng/mL의 희석된 일차 항체(100 ㎕/웰)를 샘플 뿐만 아니라 각 표준물에 첨가한 후, 37℃로 설정된 온도로 회전 인큐베이터(39 rpm) 내의 습한 챔버에서 밤새 사전-인큐베이션하였다.
밤새, 17시간 후, 코팅된 ELISA-플레이트를 Tecan Hydro 세척을 사용하여 세척 완충제(0.05% Tween을 갖는 10 mM PBS, pH 7.4)에서 4회 세척한 후, 37℃에서 0.5시간 동안 합성 차단제(Kementec)로 차단하였다. 차단 후, 사전-인큐베이션된 표준물 및 샘플(50 ㎕/웰)을 ELISA-플레이트에 옮기고, 600 rpm으로 설정된 ELISA-플레이트 진탕기 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 인큐베이션 후, 일차 항체, 표준물 및 샘플을 갖는 ELISA-플레이트를 세척 완충제에서 4회 세척하였다. 이차 폴리클로날 염소 항 토끼(IgG) HRP 1 mg/mL(Abcam)를 0.05% Tween 및 0.1% BSA, pH 7.4를 갖는 10 mM PBS에서 1:50,000으로 희석하였다. 이후, 50 ㎕/웰의 이차 항체를 ELISA-플레이트의 표준물 및 샘플 웰에 첨가하고, 600 rpm으로 설정된 ELISA-진탕기 상에서 암소에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, ELISA-플레이트를 다시 세척하고, 이번에는 세척 완충액에서 8회 세척하였다. 다음으로 TMB를 50 ㎕/웰로 첨가하고, 암실에서 실온에서 인큐베이션하고, 0.18 M H2SO4로 20 내지 30분 후에 중단하였다. 450 nm에서 흡광도를 평가하고, Magellan 소프트웨어(Tecan)를 사용하여 SPARK 다기능 플레이트 판독기에서 스캔하였다.
일차 항체의 특이성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 코팅 펩타이드로서 서열 KLYRLGLGHNQIRMIENGS(서열번호 13)를 갖는 중첩 대조군 펩타이드(OL)를 사용하고, 사전인큐베이션에서 항원으로서 보정 표준물과 같은 연속 희석을 수행하였다.
OL 대조군 펩타이드: KLYRLGLGHNQIRMIENGS(서열번호 13)
Big Neo 펩타이드: GLGHNQIRMIENGSC(서열번호 11)
검정내 정밀도를 억제성 Big Neo ELISA 내에서 조사하였다. Equidae 대조군 혈청을 6회 반복하여 사용하였다. 검정간 변화를 또한 상이한 경우에 총 3개의 검정에서 6개의 복제물로서 Equidae 대조군 혈청에 대해 시험하였다. 최저 및 최고 검출 수준을 표준 곡선 점의 n=6 반복으로 1회의 ELISA 동안 조사하고, 20% 미만의 복제물의 CV 계산을 검출 가능한 값으로 허용하였다. 스파이크(spike) 및 회복(recovery)의 검정을 또한 희석 1:20의 경우 스파이크된 125 ng/mL 배지 또는 희석 1:20의 경우 정상 멀티부스터(multibooster)를 갖는 5개의 상이한 샘플을 사용하여 수행하였다. 이후, 회복을 스파이크에서 수득된 농도에서 1:20 희석된 샘플의 농도를 뺀 값으로부터 계산하였다.
Big Neo 및 중첩 펩타이드(OL)에 대한 일차 항체의 특이성을 시험하였다. 둘 모두의 펩타이드를 0 내지 2000 ng/mL 범위의 보정 표준물로서 연속 희석하였다. 모노클로날 항체는 Big Neo에 대해 높은 특이성을 나타내었다. 에피토프는 혈청에서 검출가능하였다. 본 발명자들은 모노클로날 항체가 OL 펩타이드를 검출할 수 없음을 확인하였다(도 1). 이는 에피토프의 N-말단이 항체 결합에 결정적이었다는 것을 보여준다.
Big Neo의 최저 및 최고 검출 수준은 1.95 및 2000 ng/mL이었으며, 하나의 검정 내 CV(%), 검정내(intra-assay) CV는 5.5%이었으며, 검정간 CV는 4.3%였다.
5명의 상이한 개체로부터의 125 ng/mL 스파이킹된 혈청으로 본 발명자들은 평균 120 ng/mL 및 12% CV를 회복하였다.
실시예 3
세 번째 수근골로부터의 골연골 샘플을 즉시(도살 후 1시간 이내) 10% 중성 완충된 포르말린에 침지시켰다. 조직을 밴드 쏘(band saw)(Exact 312 Diamond Band Saw, Exact Technologies, Inc. Oklahoma City, USA)로 5 mm 두께의 슬래브로 트리밍하고, 탈수시키고, 파라핀에 포매하고, 3.4%(w/v) 소듐 포르메이트 및 15.1% (v/v) 포름산에서 탈석회화시키고, 4 내지 5 ㎛ 섹션으로 절단하고, 현미경 검사를 위해 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 섹션을 또한 탈파라핀화하고, 재수화시키고, 면역염색을 위해 준비하였다. 비특이적 염색을 0.05% Tween, pH 7.4를 갖는 10 mM PBS 중 3% H2O2로 실온에서 5분 동안 차단하였다. 천연 바이글리칸 및 바이글리칸 네오-에피토프에 대한 면역염색을 4℃에서 밤새 0.05% Tween, pH 7.4 중에서 희석 1:750으로 토끼 폴리클로날 항-말 바이글리칸 항체(Lot. A117664, Invitrogen)로 및 1:4000의 희석으로 말 바이글리칸 네오-에피토프에 대한 폴리클로날 항체(0. mg/mL)로 수행하였다.
천연 바이글리칸을 시각화하기 위한 섹션을 37℃에서 1시간 동안 히알루로니다제(PBS 중 1 mg/mL)로 전처리하고, 바로 37℃에서 1시간 동안 콘드로티나제(0.05 U/mL)와 함께 인큐베이션하였다.
대조군으로서, 천연 바이글리칸에 대한 토끼 면역글로불린 분획(# X0903 Lot: 20066518 Dako Denmark A/S) 및 네오-에피토프에 대한 재조합 토끼 IgG, 모노클로날([EPR25A] - 이소형 대조군 # ab 172730 Lot GR3235749-24(Abcam, United States))을 일차 항체 대신에 사용하였다. 이소형에 대해 일차 항체와 동일한 단백질 농도를 사용하였다.
염색을 30분 동안 HRP 컨쥬게이션된 항 토끼 EnVision(DAKO) 및 발색제 3,3-디아미노벤지딘, DAB를 사용하여 시각화하였다.
골연골 샘플을 말에서 OA에 대한 권장 평가를 사용하여 현미경으로 평가하였다(McIlwraith et al 2010). 스코어링은 관절 연골, 연골 골 계면 및 밑에 있는 연골하 골을 포함한다. 연골세포 괴사(0-4), 클러스터 형성(0-4), 균열(fissuring)(0-4), 및 국소 세포 손실(0-4)로서 관절 연골(0-16); 및 골연골 병변(0-4), 연골하 리모델링(0-3) 및 골연골 분할(0-3)로서 골연골 면적(0-10)의 현미경 평가를 이전에 문헌[McIlwraith et al. 2010]에 기재된 바와 같이 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 사용하여 수행하였다.
천연 및 바이글리칸 네오에피토프 염색된 조직을 명시야 현미경을 사용하여 200X 배율로 영상화하였다. Fiji Image J 프로그램(ImageJ, National Institute of health Bethsada, MD)을 사용하여 현미경사진(비부하 영역 연골, 요골면 골(radial facet bone) + 연골(cartilage), 부하 영역 - 골 + 연골)에서 염색된 영역을 정량화하였다. 데이터는 대조군과 비교하여 배수 변화로 표현된다.
바이글리칸의 천연 분자에 대한 폴리클로날 항체를 사용한 연골 및 뼈의 면역조직화학 염색은 대부분 연골 및 골 기질의 세포외 염색을 나타낸다. 그러나, 바이글리칸 네오-에피토프에 대한 폴리클로날 항체을 사용한 연골 및 골의 면역조직화학 염색은 연골 및 골에서 세포의 세포내 염색을 나타낸다.
정상, OA와 관련된 경도, 중등도 및 중증 연골 및 골 병변을 갖는 말의 연골 골 조직 섹션에서 천연 바이글리칸 및 바이글리칸 네오에피토프의 존재(도 2).
실시예 4
바이글리칸의 네오에피토프(N-말단-GLGHN)의 존재를 실시예 2로부터의 ELISA를 사용하여 말 혈청, 활액 및 연골-골 조직에서 평가하였다.
수근 관절에서 OA를 갖는 말의 활액에서 바이글리칸 네오피토프의 농도는 제3 수근골의 증가된 방사선학적 연골하 골 경화증(SCBS)과 상관관계가 있었다(도 3).
실시예 5
바이글리칸 네오에피토프의 극적인 증가는 정상 관절과 비교하여 박리 골절이 있는 중간 수근 관절로부터의 활액에서 발견되었다(도 4).
실시예 6
혈청에서 바이글리칸 네오-에피토프의 농도는 건강한 말과 비교하여 골관절염을 갖는 말에서 바이글리칸 네오에피토프의 증가된 농도를 나타낸다(도 5).
실시예 7
Equisal 타액 수집 키트(Purchased: Austindavis biologics ltd)를 사용하여 말로부터 타액을 수집하고, 부피 표시기(volume indicator)가 칼라을 변경할 때까지 면봉을 말 혀의 치간 공간을 통해 삽입하였다. 대략 500 ㎕의 미정제 타액을 디바이스로 샘플링하였다. 샘플을 2 ml의 보존제 완충제(1xPBS(소듐 클로라이드 137 mM, 칼륨 클로라이드 2.7 mM, 디소듐 포스페이트 11.9 mM), 0.05% 트윈 20, 0.05% 브로모니트로디옥산 및 0.05% 소듐 아지드)에서 안정화시키고, 임시로 -20℃에서 저장하고, 이후에 해동시키고, 3000 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 모든 샘플을 500 ㎕의 최소 부피로 분취하고, 분석 전에 -80℃에서 저장하였다.
타액 샘플에서 바이글리칸 네오에피토프의 존재를 상기 기재된 맞춤형 ELISA를 사용하여 결정하였다. 결과는 도 6에 도시되어 있다. BGN262의 농도는 대조군 말에 비해 방사선학적 변화가 있는 OA 말에서 증가하였다(t-테스트의 경우 p=0.01962 및 Wilcoxon의 경우 p=0.0196).
실시예 8
건강한 말을 20분 동안 워밍업(조깅 트로트(jogging trot))시키고, 20분 동안 운동(격렬한 훈련)하도록 하였다. 타액을 하기 시점에 말로부터 샘플링하였다.
시점 1 = 운동 전 1시간(안정한 상태에서 샘플링됨)
시점 2 = 20분의 워밍업 후
시점 3 = 운동 20분 후
시점 4 = 10분의 쿨 다운(cool down) 후
시점 5 = 운동 후 1시간(안정한 상태에서 샘플링됨)
바이글리칸 네오에피토프의 존재를 상기 기재된 바와 같이 ELISA를 사용하여 결정하였다.
결과는 도 7에 도시되어 있다. BGN262의 농도는 휴식 시점(TP) 1의 시점과 비교하여 운동을 한 말(시점 3, (T3))로부터의 타액의 유의한 증가를 나타낸다(p=0.001).
실시예 9
원발성 종양의 제거 전 및 후에 결장암 환자로부터의 혈청 샘플에서 바이글리칸 네오-에피토프의 존재를 상기 기재된 맞춤형 ELISA를 사용하여 결정하였다.
결과는 도 8에 도시되어 있다. BGN262 펩타이드의 농도는 환자에서 결장암 수술 후 혈청에서 유의한 감소를 나타내었다(p=0.001). 데이터는 원발성 종양의 제거 후 바이글리칸 네오에피토프의 수준이 감소함을 보여주며, 이는 원발성 종양이 바이글리칸의 분해를 유발할 수 있음을 시사한다. 바이글리칸 네오에피토프 수준은 종양의 침습성을 추적하는 데 사용될 수 있다.
실시예 10
단면 연구에서, 크로스오버 설계에서 2개의 상이한 풋팅에서 운동된 9마리의 말에서 타액을 샘플링하였다. 시점 3에서 BGN262 수준의 통계적으로 유의한 증가는 섬유-모래 풋팅에서 운동한 말에서 발견되었다(도 9). 말을 모래 위에서 운동시켰을 때 수준은 변화하지 않았다(도 10).
실시예 11
운동을 한 인간(시점 4, (T4))의 타액에서 BGN262의 농도는 휴식 시점(TP)에 비해 증가하였다. 시점 5 및 6에서, 관절이 상승된 동적 압축에 더 이상 노출되지 않기 때문에 농도가 감소한다.
시점 1 = 운동 전 1시간, 시점 2 = 운동 직전, 시점 3 = 걷기 10분 후, 시점 4 = 트레드밀(treadmill)에서 10분 달리기 후, 시점 5 = 10분 쿨 다운 후(걷기), 시점 6 = 운동 후 1시간.
도 11은 달리기에 익숙하지 않은 노인의 타액에서 BGN262를 나타낸 것이다. 그래프는 달리기 후 T4에서 피크를 보여준다. T6에서, 운동 동안 생성된 이화 활성으로부터 기인하는 제2 피크가 관찰된다. 도 12는 달리기에 익숙한 젊은 사람의 타액에서 BGN262를 나타내고, T3 및 T4에서 이미 관찰된 상승은 훈련된 말과 유사하다는 것을 나타낸다. 가능하게는 바이글리칸의 이화 분해가 없기 때문에 추가적인 피크는 발견되지 않았다.
SEQUENCE LISTING <110> SGPTH AB <120> Biglycan neoepitope <130> 210015SE <160> 21 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mammalia <400> 1 Gly Leu Gly His Asn 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Mammalia <400> 2 Gly Leu Gly His Asn Gln 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Mammalia <400> 3 Gly Leu Gly His Asn Gln Ile 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Mammalia <400> 4 Gly Leu Gly His Asn Gln Ile Arg 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Mammalia <400> 5 Gly Leu Gly His Asn Gln Ile Arg Met 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Mammalia <400> 6 Gly Leu Gly His Asn Gln Ile Arg Met Ile 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Mammalia <400> 7 Gly Leu Gly His Asn Gln Ile Arg Met Ile Glu 1 5 10 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Mammalia <400> 8 Gly Leu Gly His Asn Gln Ile Arg Met Ile Glu Asn 1 5 10 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Mammalia <400> 9 Gly Leu Gly His Asn Gln Ile Arg Met Ile Glu Asn Gly 1 5 10 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Mammalia <400> 10 Gly Leu Gly His Asn Gln Ile Arg Met Ile Glu Asn Gly Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Mammalia <400> 11 Gly Leu Gly His Asn Gln Ile Arg Met Ile Glu Asn Gly Ser Cys 1 5 10 15 <210> 12 <211> 23 <212> PRT <213> Mammalia <220> <223> Cleavage site is at <400> 12 Arg Tyr Ser Lys Leu Tyr Arg Leu Gly Leu Gly His Asn Gln Ile Arg 1 5 10 15 Met Ile Glu Asn Gly Ser Cys 20 <210> 13 <211> 19 <212> PRT <213> Mammalia <400> 13 Lys Leu Tyr Arg Leu Gly Leu Gly His Asn Gln Ile Arg Met Ile Glu 1 5 10 15 Asn Gly Ser <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Mammalia <400> 14 Lys Leu Tyr Arg Leu 1 5 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Mammalia <400> 15 Ser Lys Leu Tyr Arg Leu 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Mammalia <400> 16 Tyr Ser Lys Leu Tyr Arg Leu 1 5 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Mammalia <400> 17 Arg Tyr Ser Lys Leu Tyr Arg Leu 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Mammalia <400> 18 Leu Arg Tyr Ser Lys Leu Tyr Arg Leu 1 5 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Mammalia <400> 19 Leu Leu Arg Tyr Ser Lys Leu Tyr Arg Leu 1 5 10 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Mammalia <400> 20 Asp Leu Leu Arg Tyr Ser Lys Leu Tyr Arg Leu 1 5 10 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Mammalia <400> 21 Glu Asp Leu Leu Arg Tyr Ser Lys Leu Tyr Arg Leu 1 5 10

Claims (18)

  1. 골 경화증(bone sclerosis), 골절(fracture), 관절의 박리 골절(chip fracture), 견열 골절(avulsion fracture), 골 타박상(bone bruise), 골다공증(osteoporosis), 암, 죽상경화반(atherosclerotic plaque), 대동맥 판막 협착증(aortic valve stenosis), 카신-베크병(Kashin-Beck disease), 건염(tendinitis), 눈 장애(eye disorder), 피부 장애, 섬유증(fibrosis), 류마티스 관절염, 루푸스 신염(lupus nephritis), 당뇨병, 석회화된 대동맥 판막 질환, 심막심근염(perimyocarditis), 제1형 인슐린-의존성 진성 당뇨병, 또는 크론병으로부터 선택된 질환을 진단하는 방법으로서, 대상체로부터 이전에 단리된 샘플을 제공하는 단계, 및 샘플에서의 아미노산 서열 N-말단-GLGHN을 포함하는 펩타이드의 존재에 대해 샘플을 분석하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 질환이 골 경화증, 골절, 관절의 박리 골절, 견열 골절, 골 타박상, 골다공증, 골 타박상, 골다공증 또는 암인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 질환이 골 경화증, 골절, 관절의 박리 골절, 견열 골절, 골 타박상 또는 골다공증인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 암이 결장암인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 활액, 척수액(액체), 혈청, 혈액, 혈장, 소변 또는 타액의 샘플인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 샘플이 타액의 샘플인 방법.
  7. 아미노산 서열 N-말단-GLGHN(서열번호 1)을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체.
  8. 제7항에 있어서, 대상체에서 골 경화증, 골절, 관절의 박리 골절, 견열 골절, 골 타박상, 골다공증, 암, 죽상경화판, 대동맥 판막 협착증, 카신-베크병, 건염, 눈 장애, 피부 장애, 섬유증, 류마티스 관절염, 루푸스 신염, 당뇨병, 석회화된 대동맥 판막 질환, 심막심근염, 제1형 인슐린-의존성 진성 당뇨병, 또는 크론병의 진단에서 사용하기 위한 항체.
  9. 제7항에 있어서, 진단이 골 경화증, 골절, 관절의 박리 골절, 견열 골절, 골 타박상 또는 골다공증의 진단인 항체.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 대상체로부터의 샘플에서 아미노산 서열 N-말단-GLGHN을 포함하는 펩타이드의 양을 검출하기 위해 사용되는 항체.
  11. 제10항에 있어서, 샘플이 활액, 척수액(액체), 혈청, 혈액, 혈장, 소변 또는 타액의 샘플인 항체.
  12. 대상체에서 골관절염, 골 경화증, 골절, 관절의 박리 골절 또는 견열 골절을 예방하는 방법으로서,
    a) 반복적으로, 대상체로부터 샘플을 수득하고, 샘플에서 아미노산 서열 N-말단-GLGHN(서열번호 1)을 포함하는 펩타이드의 존재를 분석하는 단계,
    b) 샘플에서 대상체에서의 펩타이드의 수준이 미리 결정된 수준을 초과하는 경우, 대상체가 치료되어야 하는 것으로 결정하는 단계로서, 치료는 대상체를 쉬게 하는(resting) 단계
    를 포함하는 방법.
  13. 제7항에 따른 항체를 포함하는 키트.
  14. 제13항에 있어서, 항체가 단일 사용을 위한 진단 디바이스에 포함되며, 키트는 타액 샘플링 디바이스를 추가로 포함하는 키트.
  15. 제14항에 있어서, 진단 디바이스가 측방 유동 디바이스(lateral flow device)인 키트.
  16. 아미노산 서열 N-말단-GLGHN(서열번호 1)을 포함하는 펩타이드.
  17. 항체의 생산을 위한, 아미노산 서열 N-말단-GLGHN(서열번호 1)을 포함하는 펩타이드의 용도.
  18. 말 경기장(horse arena)용 풋팅(footing)의 특성을 결정하는 방법으로서, 풋팅 상에서 운동한 말로부터 샘플을 수득하는 단계, 및 샘플에서 아미노산 서열 N-말단-GLGHN을 포함하는 펩타이드의 존재에 대해 샘플을 분석하는 단계를 포함하는 방법.
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