CN117897615A - 双聚糖肽和抗体 - Google Patents

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Abstract

所提供的是一种特异性地结合肽的抗体，所述肽包含氨基酸序列N末端‑GLGHN(如SEQ ID NO：1所示)，其中所述抗体结合到所述N末端‑GLGHN(如SEQ ID NO：1所示)序列。所述抗体可被用于诊断例如骨硬化、骨折、关节碎裂性骨折、撕脱性骨折、骨挫伤、骨质疏松症、骨挫伤、骨质疏松症或癌症。

Description

双聚糖肽和抗体
技术领域
本发明涉及一种肽和抗肽的抗体，以及它们在诊断中的用途，特别是诊断骨折、骨硬化和相关疾病。
背景技术
骨骼的重建和软骨的生成是两个独立且严格控制的物理现象。这两个过程由不同的信号机制调节，并由不同的细胞类型控制。例如，软骨细胞负责软骨的重塑，而成骨细胞和破骨细胞则控制骨骼的重建和构塑。骨骼的变化，被描述为重建和构塑，在身体的许多部位同时发生。骨骼在整个生命过程中都处于活跃的代谢状态，每年大约有20％的骨骼被更换。
骨构塑根据生理和机械力改变骨骼的形状和大小。这在成长中的动物中最为突出。成年动物的骨构塑将替换并更新旧的骨基质并维持其强度和矿物质稳态。骨骼血管化良好，并且血管生成与骨骼活性有关。
另一方面，软骨没有血管化，转换速度非常慢，更新能力也非常低。
所述骨基质包括：有机成分例如I型胶原蛋白和蛋白聚糖，以及无机骨盐(主要是羟基磷灰石)。在软骨中，II型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖是主要的基质分子。双糖链蛋白聚糖是一种富含亮氨酸的重复蛋白聚糖，在软骨和骨结缔组织中表达，被认为在骨的矿化中发挥作用。
骨骼的构塑可能发生在不同的情况下，例如剧烈的体育训练、骨折以及骨关节炎。
骨关节炎(OA)是一种由关节软骨和下层的骨骼破坏引起的低度慢性全身炎症性疾病。所述疾病从以炎症和受影响关节中基质蛋白开始瓦解表征的早期阶段发展到以下层骨骼受损表征的更严重的阶段。主要症状是关节疼痛。骨关节炎是一个主要的临床问题，其影响着大约3.8％的人群。据估计，50％的NSAID止痛药处方与OA有关。
尽管关节疼痛常常导致医生怀疑是OA，特别是如果患者年龄较大，但目前很难诊断OA的早期阶段。如今，诊断通常基于使用放射学对OA晚期典型的不可逆结构损伤进行识别。然而，因为结构损伤尚不可见，X射线或MRI不能用于诊断早期OA。此外，X射线和MRI检查需要昂贵的设备，并且需要与放射科医生预约。
马的骨关节炎对马主来说是一个大问题。拥有马的主要原因是能够使用它，并且经常在比赛中使用马。OA是马匹因跛行而无法使用的最常见原因，并且OA是马业最大的单一经济损失。
除本发明上下文所述的OA之外，骨骼重建发生在骨折愈合期间和锻炼后。运动会引起骨骼重建，并在一定程度上生理性的导致软骨下骨硬化。然而，非病理性的骨硬化可能会跨越到病理性水平，从而导致骨和软骨界面出现微裂纹。
骨硬化是一种以骨骼硬化和密度增加为特征的疾病，因为在运动员或马的训练过程中骨细胞对机械负荷做出反应。
微裂纹是当施加到骨头上的力超过该骨头的强度时导致的骨头上的微小骨折。这可以通过例如跑步、舞蹈、军事训练或体操等剧烈活动来实现。因此，机械负载可能会产生微裂纹。
微裂纹可能会导致所谓的碎裂性骨折，其中一部分骨骼和软骨分离。碎裂性骨折是非常有问题的，特别是如果它们发生在马的腕关节。在许多情况下，马无法从这种伤害中恢复，此外，碎裂性骨折可能会发展成灾难性伤害，并且马需要被安乐死。此外，当疾驰的赛马在比赛中发生腕骨骨折时，骑师可能会受到严重性伤害。碎裂性骨折也称为撕脱性骨折。
由骨骼创伤引起的骨水肿可能发展为骨硬化。运动员经常感到训练和比赛的冲动，即使他们感到骨骼疼痛，例如骨挫伤引起的疼痛。例如，足球运动员的腿部经常出现这种疼痛。带着这种疼痛进行训练可能会导致以后出现并发症，例如骨质硬化或碎裂性骨折。因此，有很强的需求能够监测这些状况，以便能够知道运动员应该休息多长时间，以防止以后出现并发症。
赛马在训练过程中会出现生理性骨硬化，最终会发展为病理性微裂纹，导致碎裂性骨折和急性灾难性关节内骨折(Diab et al.J Vet Diagn Invest.2017；29(4):405-413)。
受OA影响的关节中的骨重建也可能导致骨骼中的微裂纹。这些微裂纹反过来可能会导致所谓的碎裂性骨折，其中一部分骨头和软骨分离。碎裂性骨折是非常有问题的，特别是当它们发生在马的腕关节时。在许多情况下，马无法从这种伤害中恢复，此外，所述碎裂性骨折可能会导致灾难性伤害，并且马需要被安乐死。
马和人类中的骨关节炎是由相似的机制引起的。在人类和马中，OA以炎症为特征的早期阶段经过数月和数年发展到具有广泛组织损伤的后期阶段(Goldring,M.B.andOtero M.Current Opinion in Rheumatology(2011)23(5):471)。人类和马的OA疾病机制在分子水平上也非常相似(Stenberg J,U,/>E,/>J,Lindahl A.Proteome Sci.(2013)Oct4；11(1):43)(Svala E,/>M,Sihlbom C,Rüetschi U,Lindahl A,Ekman S,/>E.Connect Tissue Res.(2015)；56(4):315-25)。软骨下骨(SCB)微环境中与疲劳相关的变化是骨关节炎形成因素的一部分(Hu etal Bone Res.2021；9(1):20)。这通常发生在OA期间软骨产生损伤之前。WO 2017216289公开了COMP片段在诊断OA的用途。COMP片段是软骨退化的生物标志物。
如果有更方便的方法来诊断和分期OA将会是很有用的。OA早期标志物的缺乏阻碍了药物的开发，这些药物可用于在疾病表现为不可逆的组织损伤之前控制该疾病。因此，仍然需要改进的OA生物标志物。
目前还没有可以识别最终导致微裂纹，从而导致马匹疼痛和随后的跛行的骨骼重建的早期阶段的诊断工具。
需要预防、诊断和防止微裂纹和骨硬化以及过度训练和相关病症。此外，需要改进的方法来诊断癌症，特别是结肠癌。
诊断通常使用血液样本进行。这可能会引起患者不适，并且对患者来说并非完全没有风险，因为它涉及从静脉抽取血样。如果能够以更方便的方式进行这样的诊断是有用的。
马术场地的地面材料(所谓的“地基”)对于马匹的健康非常重要。例如，太硬的地基可能会导致如软骨下骨增加和骨折。最近开发了新的地基。例如，近年来引入了沙子和聚合物纤维的混合物。新的地基对马匹健康的影响存在一些不确定性。需要更好的方法来研究此类地基。
本发明解决了这些和其他问题。
发明内容
本发明人惊奇地发现本发明表明了双糖链蛋白多糖(BGN262)(N-末端-GLGHN(SEQID NO 1))的切割片段在骨破坏和软骨下骨硬化以及其他疾病中是显著的。
本发明第一方面提供了一种与包含N末端-GLGHN(SEQ ID NO 1)的氨基酸序列的肽特异性地结合的抗体。
所述抗体可用于检测暴露N-末端的双糖链蛋白多糖的蛋白水解片段。
本发明第二方面提供了一种根据本发明第一方面所述的抗体在诊断中的用途。所述诊断可能是受试者的骨关节炎、骨硬化、骨折、关节碎裂性骨折、撕脱性骨折、骨挫伤、骨质疏松症、癌症、动脉粥样硬化斑块、主动脉瓣狭窄、大骨节病(Kashin-Beck disease)、肌腱炎、眼科疾病、皮肤病、纤维化、类风湿性关节炎、狼疮性肾炎、糖尿病、钙化主动脉瓣疾病、心包心肌炎、1型胰岛素依赖型糖尿病或克罗恩病的诊断。
特别地，所述诊断可以是骨关节炎、骨硬化、骨折、撕脱性骨折、关节碎裂性骨折、骨挫伤或骨质疏松症的诊断。
在一种优选的实施例中，所述抗体用于检测在一个受试者的样本中包含N-末端-GLGHN氨基酸序列的肽的量。所述样品可以是任何合适的样品，例如滑液、脊髓液(液体)、血清、血液、血浆、尿液或唾液的样品。
本发明第三方面提供了一种诊断方法，包括从受试者分离样品并分析该样品中是否存在包含N-末端-GLGHN氨基酸序列的肽。
本发明第四方面提供了用于诊断疾病的方法，所述疾病选自骨硬化、骨折、关节碎裂性骨折、撕脱性骨折、骨挫伤、骨质疏松症、癌症、动脉粥样硬化斑块、主动脉瓣狭窄、克汀病、肌腱炎、眼科疾病、皮肤病、纤维化、类风湿性关节炎、狼疮性肾炎、糖尿病、钙化主动脉瓣疾病、心包心肌炎、1型胰岛素依赖性糖尿病或克罗恩病，所述方法包括提供先前从受试者分离的样本并分析样本中是否存在包含N-末端-GLGHN氨基酸序列的肽。
在优选的实施例中，所述疾病选自骨硬化、骨折、关节碎裂性骨折、撕脱性骨折、骨挫伤、骨质疏松症或癌症中的一种或多种，特别是骨硬化、骨折、关节碎裂性骨折、撕脱性骨折、骨挫伤或骨质疏松症。在一个实施例中，所述疾病是癌症，特别是结肠癌。
样品可以是滑液、脊髓液(液体)、血清、血液、血浆、尿液或唾液中的一种，特别是唾液。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于预防受试者的骨关节炎、骨硬化、骨折、关节碎裂性骨折、撕脱性骨折、骨挫伤、骨质疏松症的方法，包括以下步骤：
a)从受试者获得样品并分析样品中是否存在包含N-末端-GLGHN氨基酸序列(SEQID NO 1)的肽，
b)如果受试者的样品中的肽水平高于预期水平，则确定该受试者应该接受治疗，其中该治疗是让该受试者休息。
在本发明的另一方面，提供了一种用于预防受试者的骨关节炎、骨硬化、骨折或关节碎裂性骨折的方法，包括以下步骤：
a)重复地从受试者获取样品并分析在样品中包含N末端-GLGHN(SEQ ID NO 1)氨基酸序列的肽的存在，
b)如果受试者样品中的肽水平高于预期水平，则确定该受试者应该接受治疗，其中，所述治疗是让该受试者休息。
在本发明的另一方面，提供了一种包含本发明第一方面所述的抗体的试剂盒。所述抗体可以包含在一次性使用的诊断装置中，其中，所述试剂盒还包含唾液采样装置。所述诊断装置可以是侧流装置。
在本发明的另一方面，提供了一种包含N-末端-GLGHN(SEQ ID NO 1)氨基酸序列的肽。
在本发明的另一方面，提供了包含氨基酸序列N-末端-GLGHN的肽的用途(SEQ IDNO 1)用于抗体的生产。
在本发明的另一方面，提供了一种用于确定赛马场的地基特性的方法，包括从已经在该地基上锻炼的马获得样品并分析该样品中是否存在包含N-末端-GLGHN氨基酸序列的肽。
附图说明
图1是显示ELISA数据的图谱，显示了所述抗体的特异性。
图2是马腕关节软骨和骨切片的双糖链蛋白聚糖新抗原表位的免疫组织化学染色图。
图3是显示来自马的滑液的ELISA数据的图谱。
图4是显示来自滑液的ELISA数据的图谱。
图5是显示来自马的血清的ELISA数据的图谱。
图6是显示马的唾液中双糖链蛋白聚糖新抗原表位的存在的图谱。
图7是显示在接受训练的健康马中存在双糖链蛋白聚糖新抗原表位的图谱。
图8是显示癌症患者中存在双糖链蛋白聚糖新抗原表位的图谱。
图9-10显示了马的唾液中存在双糖链蛋白聚糖新抗原表位。
图11-12显示了人类唾液中存在双糖链蛋白聚糖新抗原表位。
具体实施方式
本发明涉及一种包含双糖链蛋白聚糖切割片段的肽，特别是N-末端-GLGHN序列(SEQ ID NO 1)(“双糖链蛋白聚糖新抗原表位”)，针对该肽的抗体以及此类抗体在诊断中的用途。
所述肽可以具有5-100的氨基酸的长度，优选地，5-30个氨基酸的长度，更为优选地，5-20个氨基酸的长度，更为优选地，5-9个氨基酸的长度，只要所述N-末端具有GLGHN序列即可。因此，所述肽的序列的第一个甘氨酸残基具有肽的NH2基团。所述肽可具有至少5个氨基酸残基，更为优选地，至少6个氨基酸残基，更为优选地，至少7个氨基酸残基且最优选地至少8个氨基酸残基的长度。
在一个实施例中，所述肽具有使其可用于免疫的长度。
所述肽可以是分离的肽。所述肽可以从例如滑液、血液、血浆或血清中分离。所述肽还可以使用本领域已知的方法合成，例如R.B.Merrifield(1963)."Solid PhasePeptide Synthesis.I.The Synthesis of a Tetrapeptide".J.Am.Chem.Soc.85(14):2149–2154and Schnolzer,M.A.,P.；Jones,A.；Alewood,D.；Kent,S.B.H.(2007)."In SituNeutralization in Boc-chemistry Solid Phase Peptide Synthesis".Int.J.PeptideRes.Therap.13(1–2):31–44所述。
所述肽可用于生产和分离抗体。所述抗体特异性地结合包含N-末端-GLGHN氨基酸序列的肽或由N-末端-GLGHN氨基酸序列组成的肽。术语“抗体”还包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和单链抗体以及高特异性结合表位的相似类型的蛋白质，特别是衍生自或包含来自抗体的片段的蛋白质，特别是包含与N-末端GLGHN结合的抗体的可变链的蛋白质。生产针对肽的抗体的方法是众所周知的。所述肽可用于筛选与所述肽结合的抗体，也可用于纯化该抗体。
优选地，所述抗体对肽具有高亲和力。亲和力可以用解离常数(Kd)来表示。优选地，结合亲和力包括小于10-6M的解离常数(Kd)，更为优选地，5×10-7M，更为优选地，10-7M，更为优选地，5×10-8M，更为优选地，10-8M，更为优选地，5×10-9M，更为优选地，10-9M，更为优选地，5×10-10M，更为优选地，10-10M，更为优选地，5×10-11M，更为优选地，10-11M，更为优选地，5×10-12M，更为优选地10-12M，甚至更为优选地5×10-13M，或最为优选地，小于10-13M。优选地，所述抗体是分离的抗体。所述抗体可以是纯化的抗体。
优选地，所述抗体特异性地结合一种肽，所述肽包含N-末端-GLGHN序列或由N-末端-GLGHN序列组成(SEQ ID NO 1)，特别是N-末端-GLGHNQ(SEQ ID NO 2)，更为优选地，N-末端GLGHNQI(SEQ ID NO 3)并且最为优选地N-末端GLGHNQIR(SEQ ID NO 4)，N-末端-GLGHNQIRM(SEQ ID NO 5)、N-末端-GLGHNQIRMI(SEQ ID NO 6)、N-末端-GLGHNQIRMIE(SEQID NO 7)、N-末端-GLGHNQIRMIEN(SEQ ID NO 8)、N-末端-GLGHNQIRMIENG(SEQ ID NO 9)、N-末端-GLGHNQIRMIENGS(SEQ ID NO 10)或N-末端-GLGHNQIRMIENGSC(SEQ ID NO 11)。为了产生抗体，可能适合用比N-末端-GLGHN更长的肽进行免疫，例如免疫肽GLGHNQIRMIE(SEQID NO 7)。
在本发明的各种实施例中，使用双糖链蛋白聚糖切割位点上游的序列。这些肽和针对这些肽的抗体以与本发明描述的其他肽相同的方式使用。具体地，具有KLYRL-C-末端序列(SEQ ID NO 14)的肽，更为优选地SKLYRL-C-末端(SEQ ID NO 15)的肽，更为优选地，YSKLYRL-C-末端(SEQ ID NO 16)的肽，更为优选地，RYSKLYRL-C-末端(SEQ ID NO 17)的肽，更为优选地，LRYSKLYRL-C-末端(SEQ ID NO 18)的肽，更为优选地，LLRYSKLYRL-C-末端(SEQ ID NO 19)的肽，更为优选地，DLLRYSKLYRL-C-末端(SEQ ID NO 19)的肽，更为优选地，DLLRYSKLYRL-C-末端(SEQ ID NO 20)的肽，并且最为优选地EDLLRYSKLYRL-C-末端(SEQID NO 21)的肽可以被检测到。
所述抗体可以是源自哺乳动物的任何抗体，例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔子、山羊、马或鸡诸如此类，其中优选为小鼠。所述抗体的亚型可以是IgG、IgM、IgE、IgA、IgY诸如此类中的任意一种。
所述抗体可以是多克隆抗体，如本领域已知的，所述抗体通过动物的免疫产生，例如兔子。但优选地，所述抗体是单克隆抗体。优选地，所述单克隆抗体是小鼠或兔子的单克隆抗体。
存在用于生产、纯化和分离抗体以及测定其结合能力的公知方法。还存在使用抗体来检测抗原的存在的公知方法。详细内容请参见Current Protocols in Immunology和Current Protocols in Molecular Biology。
针对肽的单克隆抗体可以使用众所周知的杂交瘤技术产生(Kohler和Milstein,Nature,256,495-497,1975)。可以通过有限稀释分析、软琼脂浓度实验、使用荧光激活细胞分选仪等方法来分离单个克隆。例如，在有限稀释分析中，在培养之前将杂交瘤的克隆细胞在培养基中连续稀释至约1个细胞/孔，以分离产生所需抗体的杂交瘤。所述抗体可以是嵌合抗体或人源化抗体。
抗体克隆也可以使用其他方法产生，例如噬菌体展示。
当所述抗体是小鼠的IgG时，所述抗体可以使用蛋白A-缀合载体或抗-小鼠免疫球蛋白-缀合载体通过亲和层析来纯化。
所述抗体可以以不同方式用于诊断。所述抗体可用于测量来自受试者的样品中肽的存在、肽的含量或浓度，所述受试者可以是人或动物。所述抗体可以与来自受试者的样品接触。所述样品可以是任何类型的生物样品，例如滑液、血液、唾液、血浆、血清、脊髓液(液体)或尿液、腹水或组织切片中使用的生物组织。用于切片的有用组织的例子包括骨骼、软骨腱、眼睛、胰腺、主动脉、肾脏和皮肤。优选地，所述样品是液体样品。在一种优选的实施例中，所述样品是血清样品、血液样品、血浆样品或滑液样品。在一个甚至更为优选的实施例中，所述样品是滑液样品。在一个优选实施例中，所述样品是尿液样品或唾液样品，特别是唾液样品。收集合适体积的样品。当所述样品是液体形式时，特别是唾液样品或滑液样品，所述样品可以具有例如50μL-2000μL的体积。唾液样品适合至少300μL，更为优选地，至少500μL。当样本是唾液样本时，在采集样本之前让受试者休息可能是有用的。休息时间可以是例如至少30分钟，更为优选地，至少1小时。将休息时的肽水平测量值与运动后立即测定的肽水平测量值进行比较也可能有用。
所述样品可以从受试者分离。可以在进行结合步骤之前，将样品从受试者中分离出来。因此，诊断方法可以包括提供先前已从受试者分离的样品的步骤。所述诊断方法可以在体外进行。
使用抗体测量样品中肽浓度的一种便捷方法是ELISA。ELISA(酶联免疫吸附测定)的设计和使用在诊断领域是众所周知的。所述抗体还可用于例如免疫组织化学。例如，可以使用组织病理学领域已知的抗体对组织的薄切片，例如冷冻、石蜡处理或固定的组织进行染色。所述抗体还可用于蛋白质印迹(western blot)或Wes或简单蛋白质印迹(Western)系统。
可以以多种方式检测所述抗体。常用的方法是使用与可检测的物质(标记或标标签)缀合的二抗，例如酶(如HRP)、荧光团或放射性标记。例如，如果一抗是小鼠抗体，则二抗可以是山羊抗小鼠抗体。可以用本领域已知的方法检测标记物的存在：可以用产生颜色或光的试剂检测酶，可以用荧光材料或胶片检测放射性标记，并且可以用荧光检测器或在荧光显微镜中观察荧光基团。
或者，所述一抗(抗N-末端GLGHN抗体)可以直接与标记物/标签缀合。
当抗体用于各种方法(例如ELISA或免疫组织化学)时，其合适的工作浓度取决于抗体的亲和力，并且可以通过测试不同浓度的抗体来确定，以便找到给出良好信噪比的浓度比率。例如，浓度为1mg/mL的抗体原液可以按1/100、1/200、1/1000和1/5000稀释，用于测试合适的工作浓度。这些方法中抗体的工作浓度通常在μg/mL范围内，例如1ng-10μg/mL。所述抗体在PBS中被适当稀释，可能使用额外的蛋白质(例如BSA)和防腐剂(例如叠氮化钠)。
所述抗体可用于诊断受试者的疾病，特别是人或马的疾病。然而，所述受试者也可以是牛、狗、猫、羊、猪、大鼠或小鼠或任何其他哺乳动物。例如，可以使用标准方法例如ELISA来测定样品中肽的浓度。可以将由此确定的浓度与标准值(参考值)或截断值进行比较。与标准值的偏差可以表明特定疾病或疾病的阶段。
在各种实施例中，发生病症的风险已被测定。所述受试者可能被怀疑患有某种病症。样品中肽的存在可以指示病症或病症的风险。
所述诊断可以是与全身性炎症、特别是低度慢性全身性炎症相关的疾病的诊断。肽的存在表明患有疾病。因此，所述诊断可以是受试者的骨关节炎、骨硬化、骨折、撕脱性骨折、关节碎裂性骨折、骨挫伤、骨质疏松症、癌症、动脉粥样硬化斑块、主动脉瓣狭窄、大骨节病(Kashin-Beck disease)、肌腱炎、眼科疾病、皮肤病、纤维化、类风湿性关节炎、狼疮性肾炎、糖尿病、钙化主动脉瓣疾病、心包心肌炎、1型胰岛素依赖性糖尿病或克罗恩病的诊断。在一种优选的实施例中，所述诊断是骨关节炎、骨硬化、骨折、关节撕脱性骨折或碎裂性骨折、或者骨挫伤或骨质疏松症的诊断。
在各种实施例中，所述诊断是癌症、特别是结肠癌的诊断。其他可诊断的癌症包括肺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、乳腺癌、宫颈癌、皮肤癌、前列腺癌和子宫内膜癌。N-末端GLGHN肽的存在与肿瘤的侵袭特性相关。
在各种优选实施例中，所述诊断是关节的骨硬化、骨折、撕脱性骨折、碎裂性骨折中的一种或多种的诊断。肽的存在可用于监测病症从生理性骨硬化到病理性骨硬化的发展、到微裂纹的发展、到碎裂性骨折或撕脱性骨折的发展以及到灾难性伤害(关节内骨折)的发展。
所述抗体可用于诊断哺乳动物、特别是人类或马的OA。在一个优选的实施例中，滑液或其他样品中高浓度的肽可以指示早期OA，例如具有早期骨软骨损伤、软骨下骨重建或骨软骨分裂症状的OA。低浓度的肽可能表明没有患OA。肽的存在可用于监测从生理性骨硬化到病理性骨硬化的发展、到微裂纹的发展、到碎裂性骨折的发展和到灾难性伤害(关节内骨折)的发展。所述肽还可用于监测急性跛行/早期OA至慢性跛行/慢性OA，特别是马的症状。
截断值可以取决于所使用的方法并且可以使用标准实验和适当的对照来设立。例如，将患有疾病的受试者(其中以与使用肽不同的方式确定疾病)样品中的肽水平与一组健康受试者中的肽水平进行比较。因此，可以预先确定截断值。所述截断值可以是例如健康受试者的平均水平的150％，更为优选为200％，并且最为优选为300％。血清或滑液的截断值可以是300ng/mL，更为优选为500ng/mL，更为优选为600ng/mL，更为优选为800ng/mL，并且最为优选为1000ng/mL。唾液的截断值可以是20ng/mL，更为优选为100ng/mL，更为优选为500ng/mL，最优选为1000ng/mL。然而，应根据所诊断的病症、受试者的物种和样本类型来选择合适的截断值。
当所述方法已用于诊断骨关节炎、骨硬化、关节的骨折或碎裂性骨折或发生此类病症的风险时，可以治疗所述受试者。
一种治疗方式，特别是对于马来说，是让受试者休息。例如，减少训练量。此外，当受试者是人类，特别是运动员时，所述治疗可以是减少训练或休息。
在一个实施例中，筛选携带大量肽的受试者。例如，以至少3天、更为优选地至少7天、更为优选地至少1个月并且最为优选地至少3个月的时间间隔重复收集和分析样品。该时间间隔可以有上限，例如7天至6个月。例如，作为预防措施，可以在接受训练的马作为受试者的唾液、血清或滑液中检测肽的存在。如果马，特别是非跛马的肽浓度增加，一种治疗选择是减少训练量。训练可以在低强度下保持一段时间，直到滑液和血清中的肽水平再次下降。当受试者健康时，可以测定受试者的肽的基线水平。可以使用截断值。通过这种方式，可以确定受试者的最佳训练量。
作为额外的步骤，如果跛马的血清或滑液中双糖链蛋白聚糖片段浓度高，关节镜检查可用作额外的诊断方式。随后可以进行适当的治疗。药物治疗例如WO 2020/084113中所述的治疗(西地那非治疗)。如果存在碎裂性骨折，可以在关节镜检查期间移除碎片。在康复期间，可以监测生物标志物来决定允许的训练量。
抗体和必要的试剂可以包含在用于检测样品中的肽的试剂盒中。所述试剂盒可以基于ELISA，例如竞争性ELISA。所述试剂盒可以包括固定相(例如带有孔的板)、二抗、肽、缓冲液和用于检测标记物或标签的试剂。
在一种优选实施例中，所述试剂盒包括样品收集装置，特别是唾液收集装置，例如用于马的唾液收集装置。用于人类受试者的唾液收集装置可以包括带有漏斗的试管，供受试者将唾液样本吐入其中。用于马或其他动物的唾液收集装置可包括用于保持装置连接至拭子的手柄。使用者握住手柄并将拭子插入对象(可以是马)的嘴中。然后拭子吸收唾液样本。采集后，可以将所述拭子插入样品管中以供后续分析。例子包括Austin DaviesBiologics Ltd提供的EquiSal唾液收集拭子。所述样品收集装置可以包括用于保存样品的缓冲液。
所述试剂盒可以包括一次性使用的诊断装置，例如包含抗体的侧流装置。此类侧流装置是已知的并且通常包含特异性地结合目的抗原的抗体和检测工具，例如如果抗体结合抗原，则产生颜色或荧光信号或其他信号的试剂。颜色或荧光信号的存在表明样品中存在抗原。侧流装置通常包括用于测定样品中对照物质(阳性对照)的存在的装置。合适的侧流测试的例子包括US6,485,982和US9,034,657及其引用的参考文献中公开的那些。
在一些实施例中，可以通过读取例如来自侧流装置的比色或荧光信号来定量抗原(在这种情况下为肽)的量。读取器可以被安排用于读取比色或荧光信号并且量化该信号。通过这种方式，可以测定样品中肽的水平并与截断值进行比较。适用于诊断设备的读取器可以是Lumos Diagnostics Ltd提供的Reusable Reader。
诊断还可以通过用抗体以外的其他方式检测本发明所述的肽来进行，所述的肽包括例如N-末端-GLGHN和KLYRL-C-末端。合适的方法包括通过质谱法对肽进行测序和通过Edman降解进行肽测序。
所述肽或抗体还可用于测定赛马场的地基的特性。较软的地基会对马的关节产生较小的压力，并且会导致马样本中所述肽的含量较低。因此，用于测定赛马场的地基特性的方法可以包括从已经在该地基上锻炼的马获得样品并分析该样品中是否存在所述包含该多肽的肽。可以用这种方式比较不同地基的结果。优选地，选取一定数量的健康的马，例如3-10匹马，允许在选定的地基上锻炼预定的时间，并且在预定的时间段之后从每匹马收集样品，所述样品例如血清样品或唾液样品。优选地，允许每匹马在测试两个不同的地基期间休息，以便允许肽水平在下一次试验之前恢复到休息水平。当马休息时，可以测定每匹马的基线水平。
实施例1
双糖链蛋白聚糖切割位点RYSKLYRL*GLGHNQIRMIENGSC(SEQ ID NO 12)，其中*表示切割位点位于距离天然马双糖链蛋白聚糖的N端258个氨基酸处(UniProtKB/Swiss-Prot：O46403.1)。
抗氨基酸肽GLGHNQIRMIE(SEQ ID NO 7)的单克隆抗体在兔子中产生(Genescript)。此外，在兔子中产生了针对GLGHNQIRMIE肽的特异性多克隆抗体。
生物信息学分析显示，切割位点(RYSKLYRL*GLGHNQIRMIENGSC)周围的氨基酸序列在所有分析的哺乳动物物种(人、马、牛、猪、小鼠、大鼠、羊、兔子、狗和家猫)中完全保守(数据未显示)。因此，可以预测该抗体将可用于检测所有哺乳动物中的新抗原表位。
实施例2
使用肽GLGHNQIRMIENGSC(Big Neo)(SEQ ID NO 11)(也称为BGN262或“双糖链蛋白聚糖新抗原表位”)开发并评估了一种抑制性的ELISA，该抑制性的ELISA还用于检测马血清中的双糖链蛋白聚糖新抗原表位。冻干肽根据购自Genscript肽溶解度试剂盒说明书进行了重构。简而言之，所述Big Neo肽通过在蒸馏水中复溶至浓度为1mg/mL重构，然后等分、冷冻并储存在-80℃中直至使用。
抑制性的ELISA从用Big Neo包被平板开始。使用Nunc MaxiSorpTM透明平底96孔板(Invitrogen)并添加Big Neo(100μL/孔，Genscript)在pH为9.6的100mM碳酸盐缓冲液中稀释至1μg/mL，将所述肽在4℃下包被过夜，称为ELISA板。
校准标准品由Big Neo肽储备液(1mg/mL)制备。首先，使用MultiBooster(Kemente)稀释，将最高标准点设置为2000ng/mL，然后使用11步-1：2系列(1mL肽+1mLMultiBooster)进行稀释，校准标准品的范围从0(第11个没有肽)至2000ng/mL。
利用Multibooster(Kementec)按1：20稀释血清样品并按1：4稀释滑液样品。分析正常血清的系列稀释液后测定血清的稀释度，其中一抗在1：20稀释度中发现最多肽。作为血清对照，我们使用Equidae血清(lot.2109875,Gibco)。
使用实施例1的单克隆抗体(0.681mg/mL)作为一抗。所述一抗在MultiBooster中稀释至浓度为30ng/mL。
将每个浓度的100μL校准标准品和样品(一式两份)添加到ThermoScientificTMSterilinTMClear MicrotiterTM板(Fisher Scientific)中。将30ng/mL稀释的一抗(100μL/孔)添加到每个标准品和样品中，然后在旋转培养箱(39rpm)内的湿度箱中预孵育过夜，温度设定为37℃。
过夜，17小时后，使用Tecan Hydro洗涤液在洗涤缓冲液(10mM PBS，含0.05％Tween，pH 7.4)中洗涤包被的ELISA板4次，然后用合成封闭剂(Kementec)在37℃下封闭0.5小时。封闭后，将预孵育的标准品和样品(50μL/孔)转移至ELISA板，并在设定为600rpm的ELISA板摇床上室温孵育1小时。孵育1小时后，将带有一抗、标准品和样品的ELISA板在洗涤缓冲液中洗涤4次。将山羊抗兔(IgG)二级多克隆HRP 1mg/mL(Abcam)在含有0.05％Tween和0.1％ BSA(pH 7.4)的10mM PBS中以1：50000稀释。然后，将50μL/孔的二抗添加到ELISA板中的标准品孔和样品孔中，并在ELISA摇床上以600rpm的转速在黑暗中孵育30分钟。此后再次洗涤ELISA板，这次在洗涤缓冲液中洗涤8次。接下来添加TMB(50μL/孔)，并在室温下在黑暗中孵育，并在20-30分钟后用0.18M的H2SO4终止。在450nm处测定吸光度，并使用Magellan软件(Tecan)在SPARK多功能读板机中进行扫描。
为了评估一抗的特异性，我们使用具有KLYRLGLGHNQIRMIENGS(SEQ ID NO 13)序列的重叠对照肽(OL)作为包被肽并作为预孵育中的抗原，我们进行了一系列稀释，例如校准标准品稀释。
OL对照肽：KLYRLGLGHNQIRMIENGS(SEQ ID NO 13)
Big Neo肽：GLGHNQIRMIENGSC(SEQ ID NO 11)
利用抑制性Big Neo ELISA研究了内部分析精确度。马科动物对照血清重复使用了6次。还测试了马科动物对照血清的测定间差异，在不同情况下的总共3次测定中进行了6次重复。在一个ELISA过程中，用标准曲线点的n＝6个重复来研究最低和最高检测水平，并且将低于20％的重复的CV计算被视为可检测值。还使用5个不同的样品进行了加标和回收率测定，其中加标125ng/mL的培养基并以1：20稀释或使用普通多重增强剂按1：20稀释。然后根据加标中获得的浓度减去1：20稀释样品的浓度来计算回收率。
测试了针对Big Neo和重叠肽(OL)的一抗的特异性。两种肽均作为校准标准品进行连续稀释，浓度范围为0-2000ng/mL。所述单克隆抗体对Big Neo显示出高度特异性。在血清中可检测到所述表位。我们证实了单克隆抗体无法检测到OL肽(图1)。这表明表位的N-末端对于抗体结合至关重要。
Big Neo的最低和最高检出水平分别为1.95和2000ng/mL，一次测定内的CV(％)、内部分析CV为5.5％，内部分析间CV为4.3％。
使用来自5个不同个体的125ng/mL加标血清，我们的平均回收率为120ng/mL，并且CV为12％。
实施例3
来自第三腕骨的骨软骨样品立即(屠宰后1小时内)浸入10％中性缓冲福尔马林中。用带锯(Exact 312Diamond Band Saw，Exact Technologies,Inc.Oklahoma City,USA)将组织切割成5mm厚的片，脱水，包埋在石蜡中，在3.4％(w/v)甲酸钠和15.1％(v/v)甲酸中脱钙，切成4-5μm的切片并用苏木精和伊红(H&E)染色用于显微镜检查。切片也经过脱蜡、再水合并准备用于免疫染色。非特异性染色用pH为7.4的10mM PBS(含0.05％ Tween)中的含3％ H2O2在RT中封闭5分钟。使用稀释度为1：750的兔子的多克隆抗马双糖链蛋白聚糖抗体(批号A117664，Invitrogen)和稀释度为1：4000稀释的抗马双糖链蛋白聚糖新抗原表位的多克隆抗体(0.mg/mL)，溶于10mM PBS(含0.05％Tween，pH 7.4)在4℃下过夜，进行天然双糖链蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖抗原新表位的免疫染色。
将旨在显现天然双糖链蛋白聚糖的切片用透明质酸酶(1mg/mL，溶于PBS)在37℃下预处理1小时，并直接用软骨素酶(0.05U/mL)在37℃下孵育1小时。
作为对照，使用天然双糖链蛋白聚糖的兔免疫球蛋白组分(#X0903 Lot:20066518Dako Denmark A/S)和新的重组兔IgG用于抗原新表位的单克隆([EPR25A]–isotype control#ab 172730Lot GR3235749-24(Abcam,United states)，代替一抗。亚型使用与一抗相同的蛋白质浓度。
使用HRP缀合的抗兔EnVision(DAKO)和显色剂3,3-二氨基联苯胺(DAB)使染色显色30分钟。
使用推荐的马OA评估方法对骨软骨样本进行显微镜评估(McIlwraith等，2010)。评分包括关节软骨、软骨骨界面和软骨下骨。关节软骨(0-16)的显微镜评估为：软骨细胞坏死(0-4)、簇形成(0-4)、裂隙(0-4)、局灶细胞损失(0-4)和骨软骨面积(0-10)作为骨软骨损伤(0-4)、软骨下骨重建(0-3)和骨软骨分裂(0-3)，如先前Mcllwraith等人.2010所述，使用苏木精和伊红(H&E)染色。
使用明视野显微镜在200倍放大倍数下对天然和双糖链蛋白聚糖新抗原表位染色的组织进行成像。使用Fiji Image J程序(ImageJ,National Institute of healthBethsada,MD)对显微照片中的染色区域进行量化(非负荷区域软骨、桡骨小面骨+软骨、负荷区域-骨+软骨)。数据表示为与对照组相比的倍数变化。
使用抗双糖链蛋白聚糖天然分子的多克隆抗体对软骨和骨骼进行免疫组织化学染色，显示软骨和骨基质的大部分细胞外染色。然而，用针对双糖链蛋白聚糖新抗原表位的多克隆抗体对软骨和骨骼进行免疫组织化学染色，显示软骨和骨骼中细胞的细胞内染色。
正常马的软骨骨组织切片中存在天然双糖链蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖新抗原表位。轻度、中度和重度软骨和骨损伤与OA相关(图2)。
实施例4
使用实施例2中的ELISA评估马血清、滑液和软骨骨组织中双糖链蛋白聚糖新抗原表位(N-末端-GLGHN)的存在。
腕关节OA的马的滑液中的双糖链蛋白聚糖的新抗原表位浓度与第三腕骨的放射学软骨下骨硬化(SCBS)增加相关(图3)。
实施例5
与正常关节相比，在有碎裂性骨折的中腕关节滑液中发现双糖链蛋白聚糖新抗原表位显著增加(图4)。
实施例6
血清中双糖链蛋白聚糖新抗原表位的浓度表明患有骨关节炎的马与健康马相比双糖链蛋白聚糖新抗原表位的浓度升高(图5)。
实施例7
使用Equisal唾液收集试剂盒(购自：Austindavis biologics ltd)从马身上收集唾液，将拭子插入马舌头上的齿间空间，直到体积指示器改变颜色。使用该装置采集了大约500μL的粗唾液样品。将样品在2mL防腐缓冲液(1×PBS(氯化钠137mM、氯化钾2.7mM、磷酸二钠11.9mM)、0.05％吐温20、0.05％溴硝基二恶烷和0.05％叠氮化钠)中稳定，在解冻前暂时保存在-20℃并以3000g离心5分钟。所有样品均以最小体积500pi等分，并在分析前储存于-80℃。
使用上述常规制作的ELISA测定唾液样品中双糖链蛋白聚糖新抗原表位的存在。结果如图6所示。与对照组的马相比(t检验时p＝0.01962，Wilcoxon时p＝0.0196)，OA马中BGN262的浓度升高并且放射图像发生改变。
实施例8
健康的马进行20分钟的热身(慢跑)和20分钟的锻炼(剧烈训练)。在以下时间点从马身上采集唾液样本。
时间点1＝锻炼开始前1小时(在稳定状态下采样)
时间点2＝热身20分钟后
时间点3＝锻炼20分钟后
时间点4＝放松10分钟后
时间点5＝锻炼后1小时(在稳定状态下采样)
使用如上所述的ELISA测定双糖链蛋白聚糖新抗原表位的存在。
结果如图7所示。经过锻炼的马(时间点3(T3)与休息时间点(TP)1的相比)的唾液中BGN262的浓度显示出显著增加(p＝0.001)。
实施例9
使用上述常规制作的ELISA测定在切除原发性肿瘤之前和之后来自结肠癌患者的血清样品中双糖链蛋白聚糖新抗原表位的存在。
结果如图8所示。结肠癌手术后患者血清中BGN262肽的浓度显著降低(p＝0.001)。数据表明，原发性肿瘤切除后双糖链蛋白聚糖新抗原表位水平下降，表明原发性肿瘤可能导致双糖链蛋白聚糖降解。双糖链蛋白聚糖新抗原表位水平可用于追踪肿瘤的侵袭性。
实施例10
在一项横断面研究中，从九匹锻炼过的马中采集唾液作为样本，这些马在交叉设计的两种不同的地基上进行了锻炼。在时间点3发现在纤维沙基础上锻炼的马中，BGN262水平出现统计学上的显著增加(图9)。当马在沙子上锻炼时，该水平没有变化(图10)。
实施例11
进行锻炼的人的唾液中的BGN262的浓度增加(时间点4(T4)与休息时间点相比(TP))。在时间点5和6浓度降低，因为关节不再暴露于升高的动态压缩下。
时间点1＝运动前1小时，时间点2＝运动前，时间点3＝步行10分钟后，时间点4＝在跑步机上跑步10分钟后，时间点5＝10分钟放松后(步行)，时间点6＝运动后1小时后。
图11显示了不习惯跑步的老年人唾液中的BGN262。该图显示了跑步后T4处的峰值。在T6处观察到第二个峰值，这是运动期间产生的分解代谢活动的结果。图12显示了习惯跑步的年轻人唾液中的BGN262水平，并且在T3和T4观察到与受过训练的马的相似。没有发现额外的峰，可能是由于双糖链蛋白聚糖没有分解代谢降解。

Claims (18)

1.一种诊断疾病的方法，所述疾病选自：骨硬化、骨折、关节碎裂性骨折、撕脱性骨折、骨挫伤、骨质疏松症、癌症、动脉粥样硬化斑块、主动脉瓣狭窄、大骨节病(Kashin-Beckdisease)、肌腱炎、眼科疾病、皮肤病、纤维化、类风湿性关节炎、狼疮性肾炎、糖尿病、钙化主动脉瓣疾病、心包心肌炎、1型胰岛素依赖性糖尿病或克罗恩病，所述方法包括提供先前从受试者分离的样品并分析所述样品中是否存在包含N-末端-GLGHN氨基酸序列的肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述疾病为骨硬化、骨折、关节碎裂性骨折、撕脱性骨折、骨挫伤、骨质疏松症、骨挫伤、骨质疏松症或癌症。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述疾病为骨硬化、骨折、关节碎裂性骨折、撕脱性骨折、骨挫伤或骨质疏松症。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述癌症为结肠癌。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，所述样品为滑液、脊髓液(液体)、血清、血液、血浆、尿液或唾液的样品。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述样品为唾液样品。
7.一种特异性地结合肽的抗体，所述肽包含N末端-GLGHN(如SEQ ID NO：1所示)的氨基酸序列。
8.根据权利要求7所述的抗体，在诊断受试者的疾病中的用途，所述疾病包括：骨硬化、骨折、关节碎裂性骨折、撕脱性骨折、骨挫伤、骨质疏松症、癌症、动脉粥样硬化斑块、主动脉瓣狭窄、克汀病、肌腱炎、眼科疾病、皮肤病、纤维化、类风湿性关节炎、狼疮性肾炎、糖尿病、钙化主动脉瓣疾病、心包心肌炎、1型胰岛素依赖性糖尿病或克罗恩病。
9.根据权利要求7所述的抗体的用途，其中，所述诊断为骨硬化、骨折、关节碎裂性骨折、撕脱性骨折、骨挫伤或骨质疏松症疾病的诊断。
10.根据权利要求7-9中任意一项所述的抗体的用途，其中，所述抗体用于检测来源于受试者的样本中的包含N-末端-GLGHN氨基酸序列的肽的量。
11.根据权利要求10所述的抗体的用途，其中，所述样品为滑液、脊髓液(液体)、血清、血液、血浆、尿液或唾液的样品。
12.一种预防受试者患骨关节炎、骨硬化、骨折、关节碎裂性骨折或撕脱性骨折的方法，包括以下步骤：
1)重复地从受试者获取样品并分析样品中是否存在包含N末端-GLGHN(如SEQ ID NO：1所示)氨基酸序列的肽，
2)如果受试者样品中的肽水平高于预期水平，则确定该受试者应该接受治疗，其中，所述治疗是让该受试者休息。
13.一种包含权利要求7所述的抗体的试剂盒。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中，所述抗体被包含于一次性使用的诊断装置中，其中，所述试剂盒另外包含唾液取样装置。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中，所述诊断装置为侧流装置。
16.一种包含N末端-GLGHN(SEQ ID NO：1)氨基酸序列的肽。
17.包含N末端-GLGHN(SEQ ID NO：1)氨基酸序列的肽在生产抗体中的用途。
18.一种用于测定赛马场的地基特性的方法，包括从已经在该地基上锻炼的马获得样品并分析该样品是否存在包含N末端-GLGHN氨基酸序列的肽。
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