ES2635494T3 - Ensayo de biomarcador de fibrosis - Google Patents

Abstract

Un método de inmunoensayo para medir fragmentos de proteína que contienen neo-epítopos naturalmente presentes en la muestra de fluido corporal, en donde dicho inmunoensayo se lleva a cabo mediante un método que comprende: contactar fragmentos de proteína naturalmente presentes en dicha muestra con una pareja de unión inmunológica reactiva con un neo-epítopo N-terminal formado por escisión de una proteína por una proteinasa o un neo-epítopo C-terminal formado por escisión de una proteína por una proteinasa, cuya pareja de unión inmunológica es no reactiva con la proteína intacta a partir de la cual se deriva el epítopo y es no reactiva con una versión prolongada de la secuencia del neo-epítopo en la que la secuencia del neo-epítopo se prolonga más allá del sitio de escisión, y medir la extensión de la unión de los fragmentos de péptidos a dicha pareja de unión inmunológica para medir fragmentos de proteína que comprende dicho neo-epítopo, en donde dicha pareja de unión inmunológica se une específicamente a un neo-epítopo constituido por una secuencia de aminoácido N-terminal presente en los péptidos producidos por escisión de colágeno tipo I, dichos péptidos comprenden una secuencia N-terminal seleccionada del grupo que consiste en:**Tabla** en donde dicha pareja de unión inmunológica se une específicamente a un neo-epítopo constituido por una secuencia de aminoácidos C-terminal presente en los péptidos que se producen por escisión del colágeno tipo III, dichos péptidos comprenden una secuencia C-terminal que se selecciona del grupo que consiste en:**Tabla**

Description

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DESCRIPCION

Ensayo de biomarcador de fibrosis

La presente invencion se refiere a ensayos de biomarcadores utiles en el diagnostico de la enfermedad de la fibrosis y en el pronostico de su desarrollo, incluyendo biomarcadores que indican el riesgo de desarrollar fibrosis despues de una lesion cronica.

Las enfermedades fibroticas (incluidas las que se enumeran en la Tabla 1) son la principal causa de morbilidad y mortalidad, por ejemplo, la cirrosis con 800,000 muertes por ano en el mundo1.

Tabla 1.Diferentes enfermedades fibroticas2

Tejido

Ejemplos de Causas

Hlgado

Hepatitis virales

Esquistosomiasis

Esteatohepatitis (alcoholica o no alcoholica)

Pulmon

Fibrosis pulmonar idiopatica (IPF)

Esclerosis sistemica (Esclerodermia)

Rinon

Fibrosis sistemica nefrogenica (NSF)

Diabetes

Hipertension no tratada

Corazon

Infarto

Hipertension

Ateroesclerosis

Restenosis

Ojos

Degeneracion macular, retinopatla vltrea y retinal

Piel

Esclerosis sistemica y esclerodermia, queloides, cicatrices hipertroficas, quemaduras, factores geneticos NFS

Pancreas

Causas autoinmunes/hereditarias

Intestino

Enfermedad de Crohn/enfermedad intestinal inflamatoria

Cerebro

Enfermedad de Alzheimer, SIDA

Medula osea

Cancer, envejecimiento

Multi- organos

Complicaciones quirurgicas, fibrosis que se induce por farmacos quimioterapeuticos, fibrosis que se induce por radiacion,

fibrosis

lesiones mecanicas

Una "enfermedad fibrotica" es cualquier enfermedad que da lugar a la fibrosis, ya sea como slntoma principal o secundario.

La fibrosis es el resultado final de las reacciones inflamatorias cronicas que se inducen por una variedad de estlmulos que incluyen las infecciones persistentes, las reacciones autoinmunes, las respuestas alergicas, los danos qulmicos, la radiacion y la lesion tisular. La fibrosis se caracteriza por la acumulacion y la reorganizacion de la matriz extracelular (ECM).A pesar de tener distinciones etiologicas y cllnicas evidentes, la mayorla de los trastornos fibroticos cronicos tienen en comun una irritacion persistente que sustenta la produccion de factores de crecimiento, enzimas proteollticas, factores angiogenicos y citocinas fibrogenicas, que en conjunto estimulan la deposicion de elementos del tejido conectivo, especialmente de colagenos y proteoglicanos, que remodelan progresivamente y destruyen la arquitectura normal del tejido 3 4.A pesar de su enorme impacto en la salud humana, actualmente no existen tratamientos aprobados que se destinen directamente a los mecanismos de la fibrosis 5

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El mediador celular clave de la fibrosis es el miofibroblasto, que al activarse sirve como celula primaria productora de colageno.

Matriz Extracelular (ECM)

La fibrogenesis es un proceso dinamico que implica mecanismos celulares y moleculares complejos que generalmente se originan en la lesion tisular 6.La fibrogenesis es el resultado de un desequilibrio en la regulacion normal de la ECM que altera la concentracion de las macromoleculas lo que conduce a un aumento del tamano y de la densidad del tejido, con deterioro progresivo de su funcion. Estas macromoleculas son principalmente protelnas fibrosas con funciones adhesivas y estructurales, tales como colagenos y proteoglicanos.

Colageno

Los colagenos se distribuyen de manera amplia en el cuerpo humano, es decir ~30% de la masa de protelnas en el cuerpo humano se compone de colagenos. Los colagenos son responsables de la integridad estructural de la ECM de la mayorla de los tejidos conectivos. El contenido de la ECM resulta a partir de un fino equilibrio entre la slntesis y la degradacion que se controla estrechamente mediante la regulacion de la expresion genica y la secrecion de protelnas, pero tambien a traves de la inhibicion endogena de las proteasas y la degradacion de las proteinas por las metaloproteinasas y las proteasas de cisteina 7 . En la Tabla 2 se enumeran los principales tipos de colageno con su principal distribucion tisular.

Tabla 2. Principales tipos de colageno y su distribucion en los tejidos.

Tipo de colageno

Distribucion tisular

I

Mayoria de los tejidos conectivos

II

Cartilago, humor vitreo

III

Tejidos conectivos extensibles, por ejemplo, higado, piel, pulmon, sistema vascular

IV

Membranas basales

V

Tejidos que contienen colageno I

VI

Mayoria de los tejidos conectivos

VII

Piel, vejiga, mucosa oral, cordon umbilical, amnios

VIII

Muchos tejidos, especialmente el endotelio

XIII

Celulas endoteliales, piel, ojos, corazon, musculo esqueletico

XIV

Vasos, hueso, piel, cartilago, ojos, nervios, tendones, utero

XXI

Vasos, corazon, estomago, rinones, musculo esqueletico, placenta

El colageno tipo I es el colageno mas abundante y se encuentra en la mayoria de los tejidos conectivos. Es especialmente importante para la estructura de los huesos y de la piel donde los principales componentes de colageno son los colagenos de tipo I y III 10

El colageno tipo I y III son los principales componentes del higado y del pulmon en una relacion 1:1 en los tejidos sanos. Adicionalmente, los colagenos tipo IV y VI se encuentran en las membranas basales en la mayoria de los tejidos. La localizacion mas frecuente del colageno de tipo V es dentro de las fibrillas de colageno caracteristicas, en asociacion con los colagenos de tipo I y III 10

Algunos colagenos tienen una distribucion tisular restringida: por ejemplo, el de tipo II, que se encuentra casi exclusivamente en el cartilago 11.

Durante la fibrogenesis la cantidad neta de colagenos aumenta 12-14. La Tabla 3 muestra, en forma de ejemplo, el aumento de colageno durante la fibrosis hepatica.

Tabla 3. Cambios de la composition de colageno entre el higado humano normal y el cirrotico 15

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Tipo de colageno

Cadenas Colageno del higado normal (mg/g) Colageno del higado cirrotico (mg/g) Veces que aumento Distribucion en el higado normal (%) Distribucion en el higado cirrotico (%)

I

a1 (I) 16 8 37 42

a2 (I) 2

III

a1 (III) 2 8 4 37 21

IV

a1 (IV) 0.5 7 14 9 18

a2 (IV)

V

a1 (V) 0.9 7 8 17 18

a2 (V)

a3 (V)

VI

a1 (VI) 0.01 0.1 10 0.2 0.3

a2 (VI)

Elastina

La elastina es una protelna presente en muchos tejidos conectivos, fundamentalmente en los que son elasticos. Tiene un muy alto contenido de los aminoacidos glicina, valina, alanina y prolina, y tiene un peso molecular de 64 a 66 kDa. Se organiza en una conformacion helicoidal irregular o al azar compuesta por 830 aminoacidos. La elastina se elabora mediante el enlace de muchas moleculas solubles de la protelna tropoelastina, en una reaccion que se cataliza por la lisil oxidasa, para elaborar una matriz reticulada durable, insoluble masiva.

La elastina cumple una importante funcion en las arterias como un medio para la propagacion de la onda de presion para ayudar al flujo sangulneo y es particularmente abundante en los grandes vasos sangulneos elasticos tales como la aorta. La elastina es tambien muy importante en los pulmones, los ligamentos elasticos y la piel. A pesar de muchos esfuerzos que se dedican a la comprension de la slntesis y de la facturacion de la elastina, los neo-epltopos procedentes del escision proteolltico de estas moleculas de la matriz no se asocian hasta ahora con el desarrollo de la enfermedad en la fibrosis.

Vimentina

La vimentina es un miembro de la familia de protelnas de filamentos intermedios. Los filamentos intermedios son una importante caracterlstica estructural de las celulas eucariotas. Estos, junto con los microtubulos y microfilamentos de actina, constituyen el citoesqueleto. Aunque la mayorla de los filamentos intermedios son estructuras estables, en los fibroblastos, la vimentina existe como una estructura dinamica. Este filamento se utiliza como una marcador de los tejidos que se derivan del mesodermo, y como tal se utiliza como un marcador inmunohistoqulmico para los sarcomas.

Hertig y colaboradores (Hertig y otros, J Am Soc Nephrol.2008 agosto;19(8):1584-91) investigaron si la transicion epitelial-a-mesenquimal en las celulas epiteliales tubulares renales de pacientes con nefropatla cronica del aloinjerto podia predecir la progresion de la fibrosis en el aloinjerto y midieron la expresion de vimentina en 83 biopsias de estos. Estos encontraron una asociacion entre la expresion elevada de la vimentina y la puntuacion de la fibrosis intestinal a 1 ano despues de la cirugla.

En otro estudio de la fibrosis hepatica, Meriden y colegas (Meriden y otros, Clin Gastro Hepatol 2010; 8:289-296) encontraron una asociacion significativa entre la expresion de la vimentina (en biopsias que se obtuvieron en la etapa F0) y la progresion de la fibrosis, donde los niveles elevados predijeron la rapida progresion de la fibrosis hepatica.

En consecuencia, quisimos investigar si los fragmentos de vimentina circulantes podrlan servir como biomarcadores sensibles y especlficos de la fibrosis.

Proteoglicanos

Los proteoglicanos son un grupo diverso de macromoleculas, que unen covalentemente un numero variable de cadenas laterales de glicosaminoglicanos (GAG) a una protelna nucleo 16.Estos GAGs son polimeros de repeticiones de disacaridos (por ejemplo, N-acetil glucosamina o N-acetil galactosamina), que son acidicos (cargados negativamente) debido a los grupos laterales sulfatados y carboxilados, e hidroxilo en las unidades de disacarido. Esto los hace

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altamente hidrofllicos, ayudando as! a la difusion del agua y de los iones positivos (por ejemplo, el sodio de los fluidos extracelulares) 17 Ademas, los GAGs tienen la capacidad de formar enlaces no covalentes por ejemplo con las cadenas de acido hialuronico para formar complejos moleculares aun mayores 16 La Tabla 4 enumera los proteoglicanos mas estudiados que se asocian con el tejido conectivo.

Tabla 4. Proteoglicanos de la matriz extracelular del tejido conectivo

Grupo

Proteoglicanos Origen Funcion

Proteoglicanos extracelulares grandes (mediante la agregacion y la union de hialuronano)

Agrecano 18 Condrocitos del cartllago articular, disco intervertebral, cartllago nasal Estabilidad de la matriz extracelular (union de hialuronano)

Versicano 19, 20

Tejido conectivo: fibroblastos, queratinocitos, celulas de musculo liso, celulas mesangiales Interacciones celula-celula y celula-matriz Union de azucares en forma Ca- dependiente

Neurocano 21

Tejido nervioso Se une a las moleculas de adhesion de las celulas neuronales

Brevicano 22

Tejido nervioso Extracelular

Estabilidad en la matriz

Proteoglicanos pequenos ricos en leucina (colageno- aglutinante)

Decorina 23 Tejido conectivo, cartllago, hueso Se une a y conecta las moleculas de colageno (estabilizacion de la matriz y grosor) Union en la organogenesis de TGFp

Biglicanos 24 Endotelio capilar, piel (queratinocitos), epitelio del rinon La diferenciacion celular une y conecta las fibras de colageno

Fibromodulina 17 Tejido conectivo, hueso, cartllago Orientacion regulada de las fibras de colageno

Lumicano 23 Cornea, musculo, cartllago, rinon, pulmon, intestino Controla el espaciado y el espesor de las fibras de colageno

Proteoglicanos asociados a celulas

Serglicinas 25 Se distribuye de manera amplia a los compartimientos intercelulares del endotelio Diferenciacion de las celulas hematopoyeticas Adhesion y activacion de las celulas linfoides

Sindecanos 26 Se distribuye de manera amplia - frecuentemente se une a la membrana celular Une colagenos, fibronectina, trombospondina, tenascina y bFGF

Betaglicano 27 Se distribuye de manera amplia Receptor de TGFp y senalizacion Posible reservorio de TGFp

Proteoglicanos de la membrana basal

Perlecano 28 Todas las membranas basales Barrera selectiva para macromoleculas

Adhesion celular

Protelna C-reactiva

La protelna C-reactiva (CPR) es una protelna de suero de la fase aguda que se produce por el hlgado en respuesta a diferentes condiciones cllnicas tales como, inflamacion, infeccion o trauma29.La produccion de CRP se induce por

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citocinas tales como la IL-6, que se libera de los tejidos afectados o danados. El papel fisiologico de la CRP se desconoce aun y discusiones sobre su accion pro- o anti-inflamatoria estan en curso.

Proteasas

El desequilibrio entre la slntesis y la degradacion de la ECM durante la fibrogenesis, resulta de la conversion de la matriz subendotelial de baja densidad en la matriz rica en colagenos intersticiales. El aumento de colageno y proteoglicanos puede deberse a uno o ambos de (1) una disminucion en la production de la protelna y (2) la alteration de la degradacion de protelnas, y por tanto menos degradacion de la matriz. La disminucion de la degradacion de protelnas recibe recientemente mayor atencion. En la regulation de este proceso las metaloproteinasas de la matriz (MMPs) y sus inhibidores tisulares (TIMPs) desempenan funcionan importantes, as! como tambien otras proteasas y sus inhibidores, tales como las cistelna proteasas y las cistatinas.

MMPs

Las MMPs son un grupo grande de endopeptidasas, capaces de degradar la mayorla sino todos los componentes de la ECM. Actualmente, se encontraron mas de 25 MMPs. Las MMPs se caracterizan por un sitio activo que contiene un atomo de metal, tlpicamente zinc, y se secretan como zimogenos. Diferentes MMPs se expresan en diferentes tejidos. En la Tabla 5 se muestran MMPs en el hlgado.

Tabla 5. MMPs en el hlgado30-32

Familia

Proteasa Fuente Sustrato

Colagenasas

MMP-1 HSC I, II, III, VII, VIII, X, gelatina

MMP-8 Neutrofilos I, II, III, V, VII, X, gelatina

MMP-13 HSC, MFB, KC I, II, III, VII, X, gelatina

Estromelisinas

MMP-3 HSC III, IV, V, IX, X, XI, gelatina, laminina, fibronectina, proteoglicanos, glicoprotelnas, elastina, pro-MMP- 1/13

MMP-10 HSC III, IV, V, gelatina, elastina, agrecano

MMP-11 HC PAI-1, actividad semanal frente a las protelnas de la matriz

Gelatinasas

MMP-2 HSC, MBF I, II, III, IV, V, VII, X, XI, gelagina, elastina, laminina

MMP-9 KC, HSC, HC I, II, III, IV, V, VII, X, XI, gelagina, elastina, laminina

MMP-7 HSC Entactina, gelatina, elastina, fibronectina, vitronectina, laminina, fibrinogeno

Metaloelastasa

MMP-12 Macrofagos Elastina, gelatinas, IV, laminina, fibronectina, entactina, vitronectina, proteoglicano, protelna basica de mielina, a1-antitripsina

MT-MMP

MMP-14 HSC, MFB, KC I, II, III, gelatina, fibronectina, vitronectina, laminina, fibrinogeno, pro-MMP-2, pro-MMP-13

MMP-15 HC, BDEC Pro-MMP-2, fibronectina, tenascina, laminina, agrecano, perlecano

Los TIMPs bloquean la actividad proteolltica de las MMPs mediante la union a la MMP en una manera sustrato -y tejido- especlfica y a las metaloproteinasas tipo membrana 1 en un complejo trimolecular (Tabla 6).Durante la fibrosis los niveles TIMP aumentan dramaticamente, y los niveles de MMP aumentan modestamente o se mantienen relativamente estaticos (excepto los de la MMP-2), lo que de conjunto da una disminucion de la degradacion de los colagenos.

Tabla 6. TIMPs en el hlgado31

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Nombre

Fuentes Metaloproteinasa inhibida

TIMP-1

HSC, MFB, KC, HC Pro-MMP-9, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-13

TIMP-2

KC, HSC MT-MMP-1, MT-MMP-2, proMMP-2, MMP-3, MMP-13, MMP-7

TIMP-3

HC MT-MMP-1, MT-MMP-2, TACE, MMP-13

Protelna activadora de fibroblastos

La subunidad alfa de la Protelna de Activacion de los Fibroblastos (FAPa o FAP, alfa) es una gelatinasa integral de membrana que pertenece a la familia de las serina proteasas. La FAPa es la subunidad alfa y la DPP4 (CD26) la subunidad beta de un complejo de proteinasa heterodimerico unido a la membrana que se conoce ademas como Gelatinasa de Membrana de Melanoma 170kDa, Serina Proteinasa Integral de Membrana y Seprasa. Algunas celulas solo elaboran homodlmeros de FAPa , algunas solo homodlmeros de DPP4.El monomero es inactivo. La FAP, alfa se expresa de manera selectiva en los fibroblastos del estroma reactivos de los canceres epiteliales, el tejido de granulacion de la cicatrizacion de heridas, y las celulas malignas de los sarcomas de los huesos y de los tejidos blandos33.Esta protelna se cree que participa en el control del crecimiento de los fibroblastos o en las interacciones mesenquimales-epiteliales durante el desarrollo, la reparation de tejidos, y la carcinogenesis epitelial. Se demostro que la expresion de fAp aumenta con el estadio de la fibrosis34, 35

Biomarcadores de la fibrosis

Se sugirio un numero de marcadores bioqulmicos para las enfermedades fibroticas, aunque el producto no es especlfico de la enfermedad. En la Tabla 7 se muestra un ejemplo de los marcadores bioqulmicos de la fibrosis hepatica utilizados en ensayos cllnicos. Adicionalmente hay numerosos ejemplos de biomarcadores de otras enfermedades fibroticas12, 36-

La Tabla 7 resume algunos de los marcadores de la fibrosis hepatica que se conocen.

Biomarcadores

Parametros Enfermedad cronica del hfgado Referencia

Un parametro

CRP

NASH 43

Hialuronano

HCV 44-47

IGF-I

HCV 48

Leptina

HCV 49

PIIIP

HCV 50

Varios parametros

Parametros Enfermedad cronica del hfgado Referencias

MP3

PIIINP, MMP1 HCV 51, 52

En el Indice Zheng y otros

HA, PIIICP, PIIINP, Laminina, C-IV Hepatitis cronica 53

En el Indice Lebensztjen y otros

Laminina-2, C-IV, MMP2, Indice de MMP9-TIMP1 HBV 54

Tenascina, hialuronano, Colageno VI, TIMP-1 HBV 55

En el Indice Tsochatzis y otros

Leptina, adiponectina, resistina HCV, HBC, NASH 56

En el Indice Patel y otros

Hialuronano, TIMP-1, a2- macroglobulina HCV 57

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Indice de Forns (76, 77)

Edad, conteo de plaquetas, yGT, colesterol HCV HIV/HCV 51, 59-62

FibroTest (76, 78)

Haptoglobina, a2-macroglobulina, HCV HIV/HCV 45, 51, 60, 61, 6375

apolipoprotelna A1, yGT, bilirrubina NAFLD NAFLD en pacientes de diabetes

Actitest

FibroTest + ALT HCV 65, 76-78

APRI (Indice de Wai)

AST, conteo de plaquetas HIV/HCV HCV NAFLD 45, 51, 60, 61, 64, 66, 79-87

Hepascore

Bilirubina, yGT, hialuronano, a2- macroglobulina, edad, genero HCV HIV/HCV 51, 61, 64, 66, 88

FIB-4

Conteo de plaquetas, AST, ALT, edad hiv/hcv 61, 83

SHASTA

Hialuronano, albumina, AST hiv/hcv 61

Fibroindex

FORN+APRI HCV 89

Prueba con Fibrometro

Conteo de plaquetas, Indice de protrombina, AST, a2- macroglobulina, hialuronano, urea, edad HIV/HCV HCV NAFLD 51, 61, 64, 66, 81

NFSA

Edad, hiperglicemia, Indice de masa corporal, plaquetas, albumina, AST/AlT NAFLD 81

Ultrasonido + APRI

HCV 82

Metwally y otros index

Conteo de plaquetas, albumina, AST, historia de transfusiones de sangre, anticuerpos contra la nucleoprotelna del HBV HCV 90

En el Indice Mohamadnejad y otros

Edad, niveles de DNA del HBV, fosfatasa alcalina, albumina, conteo de plaquetas, AST HCV 91

FibroSpect II

Hialuronano, TIMP-1, a2- macroglobulina HCV 85, 92, 93

Algoritmos de combinaciones por etapas

Combinacion del APRI y del Fibrotest HCV 94

En el Indice Imbert- Bismut

a2 macroglobulina, AST, ALT YGT, bilirubina total, albumina, a1 globulina, a2 globulina, p globulina, y globulina, apolipoprotelna A1 HCV 95

Nunes y otros

Edad, Plaquetas, INR, CD4, AST/ALT, Hialuronano, YKL-40, PIIINP HCV/HIV HCV 96

Fibroscan +++

Fibroscan, Fibrotest, APRI, HCV 97

La patente US5387504 describe el neo-epltopo VDIPEN que se libera por la accion de la estromelisina en el sitio N341 - F342 del agrecano y un ensayo RIA que emplea un anticuerpo monoclonal especlfico para este neo-epltopo. Mas generalmente se describe el uso de anticuerpos monoespeclficos especlficos para los fragmentos de agrecano, que se generan por escision de una estromelisina especlfica. Las elevaciones de la estromelisina se producen en la osteoartritis, la artritis reumatoide, las lesiones ateroscleroticas, la gota, la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), la fibrosis pulmonar idiopatica (IPF), ciertos tipos de cancer, las lesiones en las articulaciones, y numerosas enfermedades inflamatorias. Se informo que la estromelisina se eleva en la fibrosis pulmonar idiopatica, y se alega que el ensayo puede llevarse a cabo con la sangre u otros fluidos biologicos para detectar los productos del escision por la estromelisina del agrecano y que la cuantificacion de tales fragmentos se puede utilizar para el diagnostico en relacion

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con la IPF as! como tambien en relacion con otras condiciones. Sin embargo, no existe evidencia de esto ni publicaciones posteriores en nuestro conocimiento que validen esta prediccion. Dichos ensayos RIA estan disponibles comercialmente desde muchos anos atras y no hay informes de su uso exitoso en diagnosticar o supervisar cualquier enfermedad fibrotica.

La Patente de Estados Unidos 7,225,080 describe un metodo para el diagnostico de una enfermedad inflamatoria, fibrotica o cancerosa en un paciente mediante la medicion de los valores de al menos cuatro marcadores bioqulmicos seleccionados del grupo que consiste en a2-macroglobulina, AST (aspartato aminotransferasa), ALT (alanina aminotransferasa), GGT (gammaglutamil transpeptidasa), Y-globulina, bilirrubina total, albumina, a1-globulina, a2- globulina, haptoglobina, p-globulina, apoA1, IL-10, TGF-p1, apoA2, y apoB en el suero o plasma de dicho paciente y posterioremente combinar dichos valores para determinar la presencia de fibrosis hepatica y/o de lesiones necroinflamatorias en el hlgado de dicho paciente. La patente no ensena la medicion cuantitativa del fragmento de peptido que porta los neo-epltopos que se generan durante la enfermedad fibrotica.

La Patente de Estados Unidos 6,060,255 describe un metodo para diagnosticar el grado de fibrosis hepatica, que comprende las etapas de medir la concentracion de la forma de alto peso molecular del colageno tipo IV en una muestra mediante el uso de un anticuerpo que se une especlficamente al colageno tipo IV y relacionar la medicion con el grado de fibrosis hepatica. De nuevo, no se hace uso de los neo-epltopos que se producen por las enzimas proteollticas que actuan en el cuerpo. La muestra se digiere en realidad con pepsina, lo que puede oscurecer el patron natural de escision del colageno en la muestra.

La Patente de Estados Unidos 4,628,027 (Gay) describe la produccion de anticuerpos especlficos para las protelnas del tejido conectivo y, mas particularmente, la produccion de anticuerpos monoclonales por los hlbridos de celulas fusionadas contra los colagenos humanos y las enzimas que participan en la degradacion del colageno. Se describe el uso de anticuerpos monoclonales contra las protelnas del tejido conectivo para establecer el perfil de colageno de muestras histologicas, citologicas y de fluidos biologicos. Sin embargo, la patente no describe la medicion de las protelnas del tejido conjuntivo sobre la base de la union de los anticuerpos a los neo-epltopos en dichas protelnas del tejido conectivo.

Guanabens N y otros, J Bone Miner Res, 1998 98 evaluaron los marcadores del recambio oseo N-telopeptido del colageno tipo I (NTX), C-telopeptido del colageno tipo I (CTX) y N-terminal pro-peptido del colageno de tipo I (PINP) en pacientes con cirrosis biliar primaria, una enfermedad con aumento de la fibrosis hepatica. Los niveles de NTX, CTX y PINP se elevan en los pacientes en comparacion con los controles y se correlacionan con la etapa histologica de la enfermedad. Los anticuerpos empleados en el NTX se elevaron contra a un sitio escindido por catepsina K en el N- terminal del colageno tipo I y dependen del neoepltopo JYDGKGVG|. Los anticuerpos empleados en el CTX se elevaron contra a un sitio escindido por catepsina K en el extremo C del colageno tipo I y dependen del neoepltopo EKAHDGGR|. Estos marcadores se localizan en los telopeptidos de colageno tipo I y no en la parte interna (la parte helicoidal triple) del colageno tipo I. Los anticuerpos monoclonales empleados para el ensayo PINp se elevaron contra un epltopo interno en la secuencia PINP que no es neo-epitopo.

M0ller S y otros, Gut., 1999 99 demostraron que el telopeptido reticulado C-terminal del colageno de tipo I (ICTP) se elevo en los pacientes con cirrosis alcoholica en comparacion con los controles. El estudio que se describio demostro que un marcador bioqulmico puede reflejar la fibrosis hepatica. El anticuerpo policlonal ICTP se indujo contra el colageno tipo I que se clivo por la tripsina y la colagenasa. Sin embargo, los anticuerpos no se unen a un neo-epitopo.

Rosen HN y otros, Calcif Tissue Int, 2004 100 evaluaron los marcadores de recambio oseo N-telopeptido del colageno tipo I (NTX) y C-telopeptido del colageno tipo I (CTX) en mujeres que reciben el tratamiento de reemplazo hormonal (HRT).En el estudio se observo que los marcadores de recambio oseo disminuyeron con el tratamiento. Los anticuerpos empleados en el NTX se elevaron contra a un sitio escindido por catepsina K en el N-terminal del colageno tipo I y dependen del neoepltopo JYDGKGVG|. Los anticuerpos empleados en el CTX se elevaron contra a un sitio escindido por catepsina K en el extremo C del colageno tipo I y dependen del neoepltopo EKAHDGGR|. En contraste con la presente invention, estos anticuerpos se usaron para la evaluation del metabolismo oseo y no la fibrosis.

Lein M y otros, Eur Urol, 2007101 evaluaron el uso de los marcadores de recambio oseo N-telopeptido del colageno tipo I (NTX) y C-telopeptido del colageno tipo I (CTX) especificos para el neo-epitopo en pacientes con cancer de prostata que reciben acido zoledronico. En el estudio se observo que los marcadores de recambio oseo disminuyeron con el tratamiento. Los anticuerpos empleados en el NTX se elevaron contra a un sitio escindido por catepsina K en el N- terminal del colageno tipo I y dependen del neoepltopo JYDGKGVG|. Los anticuerpos empleados en el CTX se elevaron contra a un sitio escindido por catepsina K en el extremo C del colageno tipo I y dependen del neoepltopo EKAHDGGR|. En contraste con la presente invencion, estos anticuerpos se usaron para la evaluacion del metabolismo oseo durante la invasion de metastasis osea y no fibrosis.

El PIIINP se uso en una serie de estudios para evaluar la gravedad de la enfermedad fibrotica 102, en pacientes con fibrosis de la piel seguido de un trauma por quemadura severo 103, para la progresion de la enfermedad en cirrosis biliar primaria no cirrotica , en la cirrosis biliar primaria y la hepatitis viral C cronica 105

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El PIIINP y el ICTP se midieron en los pacientes con fibrosis del miocardio 106

Muchos informes combinan un conjunto de marcadores bioqulmicos para mejorar el valor predictivo del Indice bioqulmico. Once marcadores sericos diferentes se midieron en 205 pacientes con estadios fibroticos de F0 a F4, y los marcadores mas informativos fueron la alfa2 macroglobulina, la alfa2 globulina (o haptoglobina), la gammaglobulina, la apolipoprotelna A1, la gamma glutamiltranspeptidasa, y la bilirrubina total 107Un Indice de estos marcadores que tuvo un valor predictivo negativo (100% de certeza de la ausencia de F2, F3, o F4) se obtuvo para las puntuaciones que varlan de cero hasta 0.10 (12% [41] de todos los pacientes), y un alto valor predictivo positivo (> 90% de certeza de la presencia de F2, F3, o F4) para las puntuaciones que varlan de 0.60 a 1.00 (34% [115] de todos los pacientes).

Sin embargo, en ninguno de los informes mencionados anteriormente se sugiere que las mediciones de fragmentos peptldicos basados en anticuerpos que se unen a neo-epltopos tal como se reivindican ahora podrlan ser utiles para la evaluacion de pacientes con enfermedad fibrotica. El documento WO2009/059972 publicado el 14 de mayo de 2009 (despues de la fecha de prioridad de esta) describe ensayos para neoepltopos de colageno III, pero no revela que un nivel elevado de tal medida este asociado con la presencia o extension de fibrosis.

La presente invencion incluye un metodo de inmunoensayo para medir fragmentos de protelna que contienen neoepltopos naturalmente presentes en la muestra de fluido corporal, en donde dicho inmunoensayo se lleva a cabo mediante un metodo que comprende:

contactar fragmentos de protelna naturalmente presentes en dicha muestra con una pareja de union inmunologica reactiva con un neo-epltopo N-terminal formado por escision de una protelna por una proteinasa o un neo-epltopo C- terminal formado por escision de una protelna por una proteinasa, cuya pareja de union inmunologica es no reactiva con la protelna intacta a partir de la cual se deriva el epitopo y es no reactiva con una version prolongada de la secuencia del neo-epitopo en la que la secuencia del neo-epitopo se prolonga mas alla del sitio de escision, y medir la extension de la union de los fragmentos de peptidos a dicha pareja de union inmunologica para medir los fragmentos de proteina que comprenden dicho neo-epitopo, en donde dicha pareja de union inmunologica se une especificamente a un neo- epitopo constituido por una secuencia de aminoacido N-terminal presente en peptidos producidos por escision de colageno tipo I, dichos peptidos comprenden una secuencia N-terminal seleccionada del grupo que consiste en:

Colageno I, alfa 1

ISVPGP...sec. con num. de ident.:23

VPGPMG... sec. con num. de ident.:24 PGPMGP... sec. con num. de ident.:25

FQGPPG... sec. con num. de ident.:27

KNGDDG... sec. con num. de ident.:28 ARGLPG... sec. con num. de ident.:29

LDGAKG... sec. con num. de ident.:31

LPGERG... sec. con num. de ident.:32 ATGAAG... sec. con num. de ident.:67

VRGEPG... sec. con num. de ident.:33

PGAKGA... sec. con num. de ident.:34 GIAGAP... sec. con num. de ident.:69

GGPPGP... sec. con num. de ident.:35

NSGEPG... sec. con num. de ident.:36 VQGPPG... sec. con num. de ident.:71

DGVAGP... sec. con num. de ident.:37

ERGSPG... sec. con num. de ident.:38 RGSPGP... sec. con num. de ident.:74

LTGSPG... sec. con num. de ident.:39

QDGRPG... sec. con num. de ident.:40 ARGQAG... sec. con num. de ident.:77

RGVPGP...sec. con num. de ident.:41

VGPAGK...sec. con num. de ident.:42 KDGEAG...sec. con num. de ident.:80

ERGEQG...sec. con num. de ident.:43

RGEQGP...sec. con num. de ident.:44 QGLPGP...Sec. con num de ident.:83

PGERGV...Sec. con num de ident.:45

ANGAPG...Sec. con num de ident.:46 AGLPGP...Sec. con num de ident.:86

ARGAPG...Sec. con num de ident.:47

PGDRGE...Sec. con num de ident.:48 FAGPPG...Sec. con num de ident.:75

AKGDAG...Sec. con num de ident.:49

PIGNVG...Sec. con num de ident.:50 NVGAPG...Sec. con num de ident.:78

AAGRVG...Sec. con num de ident.:51

PPGPAG...Sec. con num de ident.:52 GEVGPP...Sec. con num de ident.:81

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

GADGPA...Sec. con ident.:53

num de GPQGIA...Sec. ident.:54 con num de IAGQRG...Sec. con ident.:84 num de

GQRGVV...Sec. con

num de QRGVVG...Sec. con num de RGVVGL...Sec. con num de

ident.:55

ident.:56 ident.:87

GLPGQR...Sec. con

num de PGLPGP...Sec. con num de EPGKQG...Sec. con num de

ident.:57

ident.:58 ident.:90

PMGPPG...Sec. con

num de MGPPGL...Sec. con num de LAGPPG...Sec. con num de

ident.:59

ident.:60 ident.:89

DKGETG...Sec. con

num de LQGPPG...Sec. con num de PSGASG...Sec. con num de

ident. :61

ident.:62 ident.:92

SAGAPG...Sec. con

num de RTGDAG...Sec. con num de VGPPGP...Sec. con num de

ident.:63

ident.:64 ident.:99

FDFSF...Sec. con

num de DFSF...Sec. con num de AGQRGV...Sec. con num de

ident.:65

ident.:66 ident.:95

LPGPGG...Sec. con

num de QAGVMG...Sec con num de VVGLPG...Sec. con num de

ident.:26

ident.:76 ident.:98

SGLDGA...Sec. con

num de PAGERG...Sec. con num de GKQGPS...Sec. con num de

ident.:30

ident.:79 ident.:93

AKGEAG...Sec. con

num de ARGERG...Sec. con num de ARGPAG...Sec. con num de

ident.:68

ident.:82 ident.:96

IAGAPG...Sec. con

num de LTGPIG...Sec. con num de ASGPAG...Sec. con num de

ident.:70

ident.:85 ident.:97

LPGPPG...Sec. con

num de AGPPGA...Sec. con num de GPPGPP...Sec. con num de

ident.:72

ident.:88 ident.:100

AGPKGS...Sec. con

num de ATGFPG...Sec. con num de

ident.:73

ident.:91

GPPGPA...Sec. con num de

ident.:94

o en donde dicha pareja de union inmunologica se une especlficamente a un neo-epltopo constituido por una secuencia de aminoacidos C-terminal presente en los peptidos que se producen por escision del colageno tipo III, dichos peptidos comprenden una secuencia C-terminal que se selecciona del grupo que consiste en:

Colageno I, alfa 1

...QLSYGY sec. con num. de ident. :101

...EKSTGG sec. con num. de ident.: 102 ...PPGPQG sec. con num. de ident.:103

...KGHRGF sec. con num. de ident.:104

...PSGPRG sec. con num. de ident.:105 ...APGPQG sec. con num. de ident.:106

...APGPAG sec. con num. de ident.:107

...FPGAVG sec. con num. de ident.:108 ...SEGPQG sec. con num. de ident.:109

...GANGAP sec. con num. de ident. :110

...ANGAPG sec. con num. de ident.:46 ...SGPQGP sec. con num. de ident. :112

...EPGPVG sec. con num. de ident. :113

...EPGPTG sec. con num. de ident.: 114 ...RGFPGA sec. con num. de ident. :115

...KGPAGE sec. con num. de ident. :116

...RGSPGP sec. con num. de ident.:74 ...LPGAKG sec. con num. de ident. :118

...AVGPAG sec. con num. de ident.:122

...PPGARG sec. con num. de ident.:120 ...PGKAGE sec. con num. de ident. :121

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

...APGPDG sec. con num. de ident.:125

...PAGPAG sec. con num. de ident.:123 ...AGPAGE sec. con num. de ident.:124

...KDGVRG sec. con num. de ident.:128

...RGERGF sec. con num. de ident.:126 ...PAGPRG sec. con num. de ident.:127

...PGPAGF sec. con num. de ident. :131

...PAGPTG sec. con num. de ident.:129 ...TGARGA sec. con num. de ident.:130

...SAGPPG sec. con num. de ident.:134

...EPGDAG sec. con num. de ident.:132 ...PAGPPG sec. con num. de ident.:133

...GEVGPP sec. con num. de ident.:81

...ATGFPG sec. con num. de ident.:91 ...NAGPPG sec. con num. de ident.:136

...PGPQGI sec. con num. de ident.:140

...GEKGSP SEQ ID 138 ...GAPGTP sec. con num. de ident.:139

...IAGQRG sec. con num. de ident.:84

...GPQGIA sec. con num. de ident.:54 ...PQGIAG sec. con num. de ident.:142

...GPSGEP sec. con num. de ident.:146

...GQRGVV sec. con num. de ident.:55 ...RGERGF sec. con num. de ident.:126

...PVGPVG sec. con num. de ident.:149

...ERGPPG sec. con num. de ident.:147 ...RGPPGP sec. con num. de ident.:148

...EQGPSG sec. con num. de ident.:152

...PQGPRG SEQ ID 150 ...HRGFSG sec. con num. de ident. :151

...GPPGPP sec. con num. de ident.:100

...PRGPPG sec. con num. de ident.:153 ...PPGPRG sec. con num. de ident.:154

...PPGPPG sec. con num. de ident. :119

...GPPSAG sec. con num. de ident.:156 ...PPSAGF sec. con num. de ident.:157

...QMGPRG sec. con num. de ident. :161

...PPGPAG sec. con num. de ident.:52 ...TPGPQG sec. con num. de ident.:160

...PGADGQ sec. con num. de ident.:164

...PGPPGA SEQ ID 162 ...QGIAGQ SEQ ID 163

...PPGPKG sec. con num. de ident.:167

...AGSPGF sec. con num. de ident.:165 ...LPGPSG sec. con num. de ident.:166

...PKGPAG sec. con num. de ident.:170

...PGERGA sec. con num. de ident.:168 ...PMGPPG sec. con num. de ident.:59

...GPAGRP sec. con num. de ident.:173

...PPGPIG sec. con num. de ident.:174 ...SPGEQG sec. con num. de ident.:172

...TGDAGP sec. con num. de ident.:175

El termino "pareja de union inmunologica", como se usa en la presente descripcion incluye anticuerpos policlonales y monoclonales y ademas fragmentos de union especlficos de anticuerpos tales como Fab o F(ab')2.Asl, dicha pareja de union inmunologica puede ser un anticuerpo monoclonal o un fragmento de un anticuerpo monoclonal que tiene afinidad de union especlfica.

Preferentemente, la secuencia del neo-epltopo al que la pareja de union inmunologica se une no se encuentra en ninguna otra protelna o no se encuentra en ninguna de las otras protelnas a las que el metodo de la invencion se refiere.

Varias proteasas candidatas pueden ser responsables de la digestion de las protelnas en los tejidos fibroticos. Probablemente, esto es el resultado de la gran variedad de procesos complicados que resultan en diferentes perfiles de neo-epltopos que dependen de los niveles de enfermedad.

Colageno tipo I

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Determinamos que las enzimas que se enumeran en la siguiente tabla escinden el colageno tipo I en al menos los siguientes sitios de escision (marcados

Tabla 8. Sitios de escision Colageno tipo I.

Proteasa

Colageno tipo I

MMP-2

V.PGPMGPSGPRGLPGPPGAPGPQG.F sec. con num. de ident.:4

MMP-2

S.VPGPMGPSGPRGLPGPPGAPGPQG.F sec. con num. de ident.:5

MMP-2

G.ISVPGPMGPSGPRGLPGPPGAPGPQG.F sec. con num. de ident.:6

MMP-9

G.ISVPGPMGPSGPRGLPGPPGAPGPQG.F sec. con num. de ident.:6

MMP-13

G.FQGPPGEPGEPGASGPMGPRGPPGPPG.K sec. con num. de ident.:7

MMP-13

V.PGPMGPSGPRGLPGPPGAPGPQG.F sec. con num. de ident.:8

MMP-2

F.SGLDGAKGDAGPAGPKGEPGSPGENGAPGQMGPRG.L sec. con num. de ident.:9

MMP-9

F.SGLDGAKGDAGPAGPKGEPGSPGENGAPGQMGPRG.L sec. con num. de ident.:9

MMP-13

F.SGLDGAKGDAGPAGPKGEPGSPGENGAPGQMGPRG.L sec. con num. de ident.:9

MMP-9

G.LPGERGRPGAPGPAG.A sec. con num. de ident.: 10

MMP-13

G.LPGERGRPGAPGPAG.A sec. con num. de ident.: 10

MMP-2

G.LTGSPGSPGPDGKTGPPGPAG.Q sec. con num. de ident.:11

MMP-2

E.RGSPGPAGPKGSPGEAG RPGEAGLPGAKG.L sec. con num. de ident.:12

MMP-2

G.ERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKG.L sec. con num. de ident.:13

MMP-9

G.LTGSPGSPGPDGKTGPPGPAG.Q sec. con num. de ident.:14

MMP-9

G.LTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPG.A sec. con num. de ident.:15

MMP-9

G.LTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARG.Q sec. con num. de ident.:16

MMP-13

G.LTGSPGSPGPDGKTGPPGPAG.Q sec. con num. de ident.:14

MMP-13

G.ERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKG.L sec. con num. de ident.:13

MMP-9

G.QDGRPGPPGPPGARG.Q sec. con num. de ident.: 17

MMP-9

G.LTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARG.Q sec. con num. de ident.:18

MMP-2

G.KDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGF.Q sec. con num. de ident.:19

MMP-2

G.ERGEQGPAGSPGF.Q sec. con num. de ident.:20

MMP-3

E.RGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGF.Q sec. con num. de ident.:21

MMP-8

E.RGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGF.Q sec. con num. de ident.:21

-

113 PKGDTGPRGP.122 sec. con num. de ident.:22

P indica hidroxiprolina, M indica metionina oxidada, y K indica hidroxilisina.

La pareja de union inmunologica puede ser una reactiva especlficamente con un neoepltopo C-terminal o N-terminal que se forma por escision del colageno de tipo I, excluyendo la escision en el sitio del colageno tipo I de la captesina K.

Las parejas de union inmunologica adecuadas pueden ser por lo tanto especlficamente reactivas con cualquiera de las siguientes secuencias en el N terminal de un peptido:

Tabla 9. Secuencias N-terminal de fragmentos peptldicos generados por proteasa de Colageno tipo I. (El slmbolo '.' indica el sitio de escision)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Colageno I, alfa 1

.ISVPGP sec. con num. de ident.:23

.VPGPMG sec. con num. de ident.:24 .PGPMGP sec. con num. de ident.:25

.LPGPGG sec. con num. de ident.:26

.FQGPPG sec. con num. de ident.:27 .KNGDDG sec. con num. de ident.:28

.ARGLPG sec. con num. de ident.:29

.SGLDGA sec. con num. de ident.:30 .LDGAKG sec. con num. de ident.:31

.LPGERG sec. con num. de ident.:32

.VRGEPG sec. con num. de ident.:33 .PGAKGA sec. con num. de ident.:34

.GGPPGP sec. con num. de ident.:35

.NSGEPG sec. con num. de ident.:36 .DGVAGP sec. con num. de ident.:37

.ERGSPG sec. con num. de ident.:38

.LTGSPG sec. con num. de ident.:39 .QDGRPG sec. con num. de ident.:40

.RGVPGP sec. con num. de ident.:41

.VGPAGK sec. con num. de ident.:42 .ERGEQG sec. con num. de ident.:43

.RGEQGP sec. con num. de ident.:44

.PGERGV sec. con num. de ident.:45 .ANGAPG sec. con num. de ident.:46

.ARGAPG sec. con num. de ident.:47

.PGDRGE sec. con num. de ident.:48 .AKGDAG sec. con num. de ident.:49

.PIGNVG sec. con num. de ident.:50

.AAGRVG sec. con num. de ident.:51 .PPGPAG sec. con num. de ident.:52

.GADGPA sec. con num. de ident.:53

.GPQGIA sec. con num. de ident.:54 .GQRGVV sec. con num. de ident.:55

.QRGWG sec. con num. de ident.:56

.GLPGQR sec. con num. de ident.:57 .PGLPGP sec. con num. de ident.:58

.PMGPPG sec. con num. de ident.:59

.MGPPGL sec. con num. de ident.:60 .DKGETG sec. con num. de ident.:61

.LQGPPG sec. con num. de ident.:62

.SAGAPG sec. con num. de ident.:63 .RTGDAG sec. con num. de ident.:64

.FDFSF sec. con num. de ident.:65

.DFSF sec. con num. de ident.:66 .ATGAAG sec. con num. de ident.:67

.AKGEAG sec. con num. de ident.:68

.GIAGAP sec. con num. de ident.:69 .IAGAPG sec. con num. de ident.:70

.VQGPPG sec. con num. de ident.:71

.LPGPPG sec. con num. de ident.:72 .AGPKGS sec. con num. de ident.:73

.RGSPGP sec. con num. de ident.:74

.FAGPPG sec. con num. de ident.:75 .QAGVMG sec. con num. de ident.:76

.ARGQAG sec. con num. de ident.:77

.NVGAPG sec. con num. de ident.:78 .PAGERG sec. con num. de ident.:79

.KDGEAG sec. con num. de ident.:80

.GEVGPP sec. con num. de ident.:81 .ARGERG sec. con num. de ident.:82

.QGLPGP sec. con num. de ident.:83

.IAGQRG sec. con num. de ident.:84 .LTGPIG sec. con num. de ident.:85

.AGLPGP sec. con num. de ident.:86

.RGVVGL sec. con num. de ident.:87 .AGPPGA sec. con num. de ident.:88

.LAGPPG sec. con num. de ident.:89

.EPGKQG sec. con num. de ident.:90 .ATGFPG sec. con num. de ident.:91

.PSGASG sec. con num. de ident.:92

.GKQGPS sec. con num. de ident.:93 .GPPGPA sec. con num. de ident.:94

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

.AGQRGV sec. con num. de ident.:95

.ARGPAG sec. con num. de ident.:96 .ASGPAG sec. con num. de ident.:97

.VVGLPG sec. con num. de ident.:98

.VGPPGP sec. con num. de ident.:99 .GPPGPP sec. con num. de ident.:100

.TGDAGP sec. con num. de ident.:175

Alternativamente, las parejas de union inmunologica adecuadas pueden ser especlficamente reactivas con cualquiera de las siguientes secuencias en el C terminal de un peptido:

Tabla 10. Secuencias de proteasa en el C-terminal de fragmentos peptldicos generados por proteasa of Colageno tipo I (El slmbolo '.' indica el sitio de escision).

Colageno I, alfa 1

QLSYGY.sec. con num. de ident.: 101

EKSTGG.sec. con num. de ident.:102 PPGPQG.sec. con num. de ident.:103

KGHRGF.sec. con num. de ident.:104

PSGPRG.sec. con num. de ident.:105 APGPQG.sec. con num. de ident.:106

APGPAG.sec. con num. de ident.:107

FPGAVG.sec. con num. de ident.:108 SEGPQG.sec. con num. de ident.:109

GANGAP.sec. con num. de ident.: 110

ANGAPG. Sec. con num de ident.:46 SGPQGP.sec. con num. de ident.: 112

EPGPVG.sec. con num. de ident. :113

EPGPTG.sec. con num. de ident.: 114 RGFPGA.sec. con num. de ident.: 115

KGPAGE.sec. con num. de ident. :116

RGSPGP.sec. con num. de ident.:74 LPGAKG.sec. con num. de ident.: 118

PPGPPG.sec. con num. de ident.: 119

PPGARG.sec. con num. de ident.:120 PGKAGE.sec. con num. de ident.: 121

AVGPAG.sec. con num. de ident.:122

PAGPAG.sec. con num. de ident.:123 AGPAGE.sec. con num. de ident.:124

APGPDG.sec. con num. de ident.:125

RGERGF.sec. con num. de ident.:126 PAGPRG.sec. con num. de ident.:127

KDGVRG.sec. con num. de ident.:128

PAGPTG.sec. con num. de ident.:129 TGARGA.sec. con num. de ident.:130

PGPAGF.sec. con num. de ident.: 131

EPGDAG.sec. con num. de ident.:132 PAGPPG.sec. con num. de ident.:133

SAGPPG.sec. con num. de ident.:134

ATGFPG.sec. con num de ident.:91 NAGPPG.sec. con num. de ident.:136

GEVGPP.sec. con num de ident.:81

GEKGSP.sec. con num. de ident.:138 GAPGTP.sec. con num. de ident.:139

PGPQGI.sec. con num. de ident.:140

GPQGlA.sec. con num de ident.:54 PQGIAG.sec. con num. de ident.:142

lAGQRG.sec. con num. de ident.:4

GQRGVV.sec. con num de ident.:55

GPSGEP.sec. con num. de ident.:146

ERGPPG.sec. con num. de ident.:147 RGPPGP.sec. con num. de ident.:148

PVGPVG.sec. con num. de ident.:149

PQGPRG.sec. con num. de ident.:150 HRGFSG.sec. con num. de ident.: 151

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

EQGPSG.sec. con num. de ident.:152

PRGPPG.sec. con num. de ident.:153 PPGPRG.sec. con num. de ident.:154

GPPGPP.sec. con num de ident.:100

GPPSAG.sec. con num. de ident.:156 PPSAGF.sec. con num. de ident.:157

PPGPAG.sec. con num de ident.:52 TPGPQG.sec. con num. de ident.:160

QMGPRG.sec. con num. de ident.: 161

PGPPGA.sec. con num. de ident.:162 QGIAGQ.sec. con num. de ident.:163

PGADGQ.sec. con num. de ident.:164

AGSPGF.sec. con num. de ident.:165 LPGPSG.sec. con num. de ident.:166

PPGPKG.sec. con num. de ident.:167

PGERGA.sec. con num. de ident.:168 PMGPPG.sec. con num de ident.:59

PKGPAG.sec. con num. de ident.:170

GRNGDP.sec. con num. de ident. :171 SPGEQG.sec. con num. de ident.:172

GPAGRP.sec. con num. de ident.:173

PPGPIG.sec. con num. de ident.:174 TGDAGP.sec. con num. de ident.:175

TGPRGP.sec. con num. de ident.:177

Ademas, los ensayos se pueden basar en los neo-epltopos generados adyacente a los sitios de escision ilustrados, es decir, en las secuencias C-terminal que conducen a los epltopos N-terminal que se indican anteriormente y las secuencias N-terminal que se conectan con los epltopos C-terminales descritos.

Los ensayos para mas de uno de los peptidos que se describen anteriormente pueden llevarse a cabo por separado y sus resultados combinados o mas de uno de los peptidos que se describen anteriormente se pueden medir juntos.

El resultado de un ensayo de acuerdo con la invention se puede combinar con uno o mas de otros biomarcadores que se midieron para formar un Indice compuesto de valor diagnostico o pronostico.

Generalmente, todos los formatos de inmunoensayos que se conoclan previamente se pueden utilizar de acuerdo con esta invencion lo que incluye los formatos heterogeneos y homogeneos, los ensayos tipo sandwich, los ensayos de competencia, los ensayos ligados a enzimas, los ensayos radio-inmunes y similares. Asl, opcionalmente, dicho metodo se lleva a cabo como un inmunoensayo de competencia en el que dicha pareja de union inmunologica y un agente de competencia se incuban en presencia de dicha muestra y el agente de competencia compite con los fragmentos de peptidos en la muestra para unirse a la pareja de union inmunologica.

Dicho agente de competencia puede ser (1) un peptido sintetico que se deriva de la secuencia de colageno tipo I o un agente de competencia que se deriva de (2) un colageno tipo I nativo purificado escindido por proteasas para revelar dicho neo-epltopo.

Un metodo adecuado podrla ser un inmunoensayo de competencia usando anticuerpos monoclonales o fragmentos de union a anticuerpos que se unen a neo-epltopos de colageno tipo I. Los peptidos sinteticos apropiadamente seleccionados revestidos sobre la superficie solida de una placa de microtitulacion podrlan competir con la muestra para unirse a los anticuerpos monoclonales o Fragmentos de union. Alternativamente, los fragmentos de colageno de tipo I nativos, purificados, que portan el neo-epltopo que se reconoce por el anticuerpo monoclonal o por el fragmento de union se podrlan usar en la superficie solida. Aun otra alternativa es inmovilizar el anticuerpo monoclonal o el fragmento de union en la superficie solida y despues co-incubar la muestra con un peptido sintetico que se unio apropiadamente a una molecula de senal, por ejemplo, la peroxidasa de rabano picante o la biotina.

La muestra puede ser una muestra de suero, sangre, plasma u otro, por ejemplo, de biopsia de tejido fibrotico.

Los ensayos pueden llevarse a cabo como ensayos de tipo sandwich mediante el uso de una primera pareja de union inmunologica reactiva especlficamente con uno de los dichos neo-epltopos y una segunda pareja de union inmunologica reactiva con la protelna de referencia a la que el neo-epltopo pertenece. Opcionalmente, dicha segunda pareja de union inmunologica se dirige a un segundo neo-epltopo de la misma protelna.

En ciertos metodos que se prefieren el metodo comprende ademas comparar el nivel que se determino de dicha union de dichos fragmentos peptldicos con los valores caracterlsticos de (a) individuos sanos comparables y/o (b) una

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condicion fibrotica patologica y asociar opcionalmente un nivel mas alto del peptido que se midio (normalmente indicado por un mayor nivel de union) con un grado mas grave de dicha condicion.

La presente descripcion se refiere al desarrollo de anticuerpos monoclonales que reconocen neo-epitopes como se describio anteriormente. Esto puede alcanzarse mediante la inmunizacion de ratones con peptidos sinteticos procedentes de la secuencia de aminoacidos de colageno tipo I (que incluye las secuencias enumeradas anteriormente o las secuencias que terminan en las mismas), por la fusion de las celulas del bazo de ratones seleccionados a las celulas de mieloma, y mediante la comprobacion los anticuerpos monoclonales para la union a neo-epltopos en los peptidos sinteticos correspondientes. La especificidad por los neo-epltopos se puede asegurar al exigir la reactividad con un peptido sintetico y una falta de reactividad con ya sea una forma C-prolongada del peptido inmunizante (para un neo-epltopo C-terminal) o una forma N-terminal prolongada del peptido inmunizante (para un neo-epltopo N- terminal).Los anticuerpos para neo-epltopos tambien pueden evaluarse para establecer una falta de la capacidad de union al colageno tipo I nativo. Alternativamente, la especificidad por un neo-epltopo se puede asegurar al exigir que la reactividad del anticuerpo sea negativamente dependiente de la presencia de biotina o de otros grupos funcionales que se unen covalentemente a uno de los aminoacidos terminales.

En la presente se describe una pareja de union inmunologica que es especlficamente inmunorreactiva con un neo- epltopo que se forma por escision del colageno tipo I por una proteasa en un sitio terminal en cualquiera de las secuencias parciales del colageno tipo I expuesto anteriormente, y puede ser por ejemplo un anticuerpo monoclonal o un fragmento de union del mismo.

En la presente se describe ademas una llnea celular que produce un anticuerpo monoclonal contra un neo-epltopo C- terminal o N-terminal que se forma por escision del colageno tipo I en los sitios terminales de las secuencias en cualquiera de las secuencias parciales del colageno tipo I expuestas anteriormente.

La presente descripcion proporciona ademas un peptido que comprende un neo-epltopo C-terminal o N-terminal que se forma por escision del colageno de tipo I en cualquiera de las secuencias parciales expuestas anteriormente. Tal peptido puede conjugarse como un hapteno a un portador para producir una respuesta inmune a dicho peptido, o inmovilizarse a una superficie solida o conjugarse con un marcador detectable para su uso en un inmunoensayo.

La presente descripcion proporciona ademas una molecula de acido nucleico aislada que codifica para un peptido que comprenda un neo-epltopo C-terminal o N-terminal que se forma por escision del colageno tipo I en cualquiera de las secuencias parciales del colageno tipo I expuestas anteriormente.

La presente descripcion proporciona ademas un vector que comprende una secuencia de acido nucleico que comprende una senal de expresion y una secuencia codificante que codifica para la expresion de un peptido que comprende un neo-epltopo C-terminal o N-terminal que se forma por escision del colageno tipo I en cualquiera de las secuencias parciales del colageno tipo I expuestas anteriormente e incluye ademas una celula huesped transformada con un vector de este tipo y que expresa dicho peptido.

Todavla otro aspecto de la presente descripcion se refiere a estuches, que pueden usarse convenientemente para llevar a cabo los metodos descritos anteriormente. Tales estuches pueden incluir (1) una placa de microtitulacion recubierta con el peptido sintetico; (2) un anticuerpo monoclonal o fragmento de union de anticuerpo de la invencion reactivo con dicho peptido sintetico; y (3) una inmunoglobulina IgG anti-raton marcada. Alternativamente, tales estuches pueden incluir (1) una placa de microtitulacion recubierta con fragmentos de colageno tipo I nativos purificados; (2) un anticuerpo monoclonal que reconoce un neo-epltopo en los fragmentos del colageno tipo I y que sea reactivo con dichos fragmentos del colageno de tipo I purificados; y (3) una inmunoglobulina IgG anti-raton marcada. Alternativamente, tales estuches pueden incluir (1) una placa de microtitulacion recubierta con estreptavidina; (2) un peptido sintetico que se une a biotina; (3) un anticuerpo monoclonal que reconoce un neo-epltopo en el colageno tipo I y que sea reactivo con dicho peptido sintetico; y (4) una inmunoglobulina IgG anti-raton marcada. Aun otra alternativa podrla ser estuches que incluyen (1) una placa de microtitulacion recubierta con estreptavidina; (2) un peptido sintetico que se une a biotina; (3) un anticuerpo monoclonal que reconoce un neo-epltopo en el colageno de tipo I (y que sea reactivo con dicho peptido sintetico) y conjugado con peroxidasa de rabano picante.

Asl, la presente descripcion proporciona un estuche de inmunoensayo que comprende una pareja de union inmunologica como se describe en la presente descripcion, y un agente de competencia que se une a dicha pareja de union inmunologica, y opcionalmente uno o mas de un reactivo de lavado, un tampon, un reactivo de parada, un marcador enzimatico, un sustrato marcador enzimatico, estandares de calibracion, un anticuerpo anti-raton e instrucciones.

Los ensayos descritos en la presente descripcion son utiles en el diagnostico de la fibrosis en pacientes. Adicionalmente, los ensayos son utiles para la evaluacion de la progresion de la enfermedad, y la supervision de la respuesta a la terapia. Las parejas de union inmunologica descritas en la presente descripcion pueden usarse ademas en la inmunotincion para mostrar la presencia o localizacion de los productos del escision del colageno de tipo I.

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La presente descripcion se describira e ilustrara adicionalmente con referenda a los siguientes ejemplos y a las figuras adjuntas, en los que:

La Figura 1 muestra un grafico con los resultados de ELISA para el C03 de diferentes muestras biologicas: Muestras de suero humano agrupadas (suero); Fluido amniotico humano (AF); medio de cultivo de fibroblastos humanos (Fibr.Cltr.); La Figura 2a muestra un grafico que muestra los niveles sericos del C03 en ratas con operacion(es) simulada(s) y con el conducto biliar ligado al inicio del estudio (b) y en la terminacion (t);

La Figura 2b muestra los valores delta correspondientes de C03 en suero de rata: Niveles de terminacion - Niveles de los valores iniciales;

La Figura 3 muestra un grafico que muestra los niveles de CO3 en diferentes muestras de suero humano. Suero normal: de individuos sanos. COPD: Enfermedad Pulmonar Obstructiva Cronica (que conduce a la fibrosis pulmonar).Esclerodermia (que conduce a la fibrosis de la piel y pulmonar). HCV:Virus de la Hepatitis C (que conduce a la fibrosis hepatica);

La Figura 4 muestra los pesos del Hlgado y las puntuaciones del Hlgado que se determinan en el Ejemplo 5;

La Figura 5 muestra los niveles de los fragmentos de escision con MMP-9 del colageno Tipo III que se midieron de acuerdo con la invencion en el Ejemplo 5;

La Figura 6 muestra los niveles de expresion genica del colageno Tipo III en BDL o ratas con operacion simulada que se determinan en el Ejemplo 5;

La Figura 7 muestra los cambios de los niveles de expresion del fragmento del escision con MMP-9 del colageno Tipo III reactivo con el anticuerpo que se utilizo en el Ejemplo 5 como se determina por Western blot;

La Figura 8 muestra los resultados de la tincion histologica de las secciones del hlgado que se obtienen en el Ejemplo 5; La Figura 9 muestra las correlaciones entre las mediciones de los fragmentos del colageno Tipo III de acuerdo con la invencion con otros biomarcadores del hlgado como se determinan en el Ejemplo 5;

La Figura 10 muestra los resultados que se obtienen en las muestras de suero humano en el Ejemplo 6; y

La Figura 11 muestra los resultados que se obtienen en la prueba de la reactividad de un anticuerpo monoclonal que

reconoce un neo-epltopo N-terminal de la CRP.

La Figura 12 muestra la acumulacion de colageno en el hlgado de rata que se mide en el Ejemplo 8.

La Figura 13 muestra los resultados del inmunoensayo que se obtienen en el Ejemplo 8.

La Figura 14 muestra la correlacion de los resultados del inmunoensayo de la Figura 13 con el contenido de colageno hepatico.

La Figura 15 muestra una comparacion de los resultados de un inmunoensayo de acuerdo con la invencion con las mediciones de acido hialuronico y de la tincion con rojo Sirio en el Ejemplo 8.

La Figura 16 muestra en el primer panel la correlacion de los resultados del inmunoensayo de acuerdo con la invencion con la tincion con rojo Sirio y en el segundo panel de la correlacion entre los niveles de acido hialuronico y la tincion con rojo Sirio.

La Figura 17 muestra la falta de correlacion entre los resultados del inmunoensayo de la invencion y los niveles de acido hialuronico.

La Figura 18 muestra las secciones de piel y las mediciones del grosor de la piel que se describen en el Ejemplo 9.

La Figura 19 muestra los resultados de un inmunoensayo de acuerdo con la invencion en el Ejemplo 9.

La Figura 20 muestra en el panel A imagenes de Western Blot que se obtuvieron en el Ejemplo 9 y en el panel B los resultados del inmunoensayo correspondientes de acuerdo con la invencion.

La Figura 21 muestra una correlacion entre los resultados del inmunoensayo y las mediciones del grosor de la piel.

La Figura 22 muestra una correlacion entre los resultados del inmunoensayo de orina y las mediciones de Western blot que se describen en el Ejemplo 9.

Ejemplo 1: Colageno tipo III degradado con MMP-9

Metodo

Escision: El colageno tipo III aislado de placenta humana se disolvio en 10 mM de acido acetico (1 mg/ml).La disolucion de protelna se paso despues a traves de un filtro (Microcon Ultracel YM-10) para eliminar las contaminaciones de los fragmentos. La MMP-9 se preactivo con acetato de 4-aminofenilmercurico (APMA, Sigma) a 37°C durante 3 horas. Despues de las activaciones, el colageno tipo III y la MMP-9 se mezclaron 100:1 y se incubaron con agitacion durante 3 dlas a 37°C.

La solucion se analizo por cromatografla llquida/espectrometrla de masas (LC/MS) y los fragmentos se identificaron mediante la realizacion de una busqueda en el programa Mascot. Las secuencias de peptidos se seleccionaron por la busqueda de homologla, asegurando que no existiera reactividad cruzada con protelnas relacionadas u otras, as! como tampoco reactividad cruzada interespecies.

Diseno de anticuerpos: Las secuencias de peptidos se sintetizaron y conjugaron con ovoalbumina (OVA).Los ratones se inmunizaron cada 2-3 semanas, hasta cinco inmunizaciones. Los tltulos de anticuerpos se verificaron por peptidos de tamizaje, tanto en la seleccion como en la de-seleccion. Cuando se lograron suficientes tltulos de anticuerpos, se seleccionaron los ratones positivos para la fusion, se sometieron a eutanasia, y el bazo se desintegro y las celulas B se extrajeron para la fusion con las celulas de mieloma. Las selecciones de las celulas productoras de anticuerpos se

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realizaron mediante el cultivo y la re-siembra de las celulas de las quimeras supervivientes en clones de celulas individuales. Los clones se seleccionan por seleccion y deseleccion de peptidos, seguidos por pruebas de reactividad nativa (Figura 1), ya que los neoepltopos se generan por secuencias peptldicas pequenas sinteticas, que pueden no reflejar las protelnas nativas. Un clon de subtipo IgG se selecciono para la produccion de anticuerpos. La purificacion de anticuerpos se realiza mediante una columna de protelna-G.

Desarrollo del Ensayo: Las concentraciones optimas de anticuerpos se determinan mediante analisis de tablero de ajedrez, con diluciones de recubrimiento de anticuerpo y del peptido de tamizaje, en los ELISA de competencia. La determinacion diferente para el ensayo de colageno degradado por la MMP-9 (CO3) se muestra en la tabla 24.

Llmite de Deteccion

0.5 ng/ml

Variacion Interensayo promedio

3.71 %

Variacion Intraensayo promedio

5.48 %

Tabla 24. Llmite de Deteccion, Promedio de variacion Inter e Intraensayo del ensayo de CO3.

Ejemplo 2: CO3 en muestras biologicas relevantes: Niveles del CO3 en las ratas con el conducto biliar ligado en comparacion con las ratas con operacion simulada.

Metodo: Cuarenta ratas hembras Sprague-Dawley (6 meses de edad) se alojaron en las instalaciones de investigacion de animales de Nordic Bioscience. Los experimentos se aprobaron por el Comite de Animales de Experimentacion del Ministerio de Justicia de Dinamarca, y se realizaron de acuerdo con el Estandar Europeo de Buenas Practicas Cllnicas (2008/561-1450).Las ratas se alojaron en jaulas estandar tipo III-H a 18-22°C con lecho y material de nido (Altromin 1324; Altromin, Lage, Alemania) y agua purificada (sistema Milli-Q; Millipore, Glostrup, Dinamarca) libremente. Las ratas se mantuvieron bajo condiciones de un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad.

La fibrosis hepatica se indujo por BDL comun. En resumen: La rata se anestesio, se encontro el conducto biliar, se realizaron dos ligaduras alrededor de la via biliar seguido de la diseccion entre las ligaduras, se cerro el abdomen. En ratas con operacion simulada, el abdomen se cerro sin la ligadura del conducto biliar. Las ratas se dividieron en 2 grupos: Grupo 1 (10 ratas con operacion BDL y 10 con operacion simulada) se sacrificaron despues de 2 semanas, y el Grupo 2 (9 ratas con operacion BDL y 10 con operacion simulada) se sacrificaron despues de 4 semanas. Al finalizar el perlodo de estudio (2, o 4 semanas), despues de al menos 14 horas de ayuno, todos los animales supervivientes fueron asfixiados con CO2 y se sacrificaron por desangrado.

Las muestras de sangre se tomaron del seno retro-orbital de ratas con al menos 14 horas de ayuno bajo anestesia ligera con CO2/O2 al inicio y a la terminacion. La sangre se colecto y se dejo 30 minutos a temperatura ambiente para su coagulacion, lo que se siguio por una centrifugacion a 1500 g durante 10 minutos. Todos los llquidos libres de coagulos se transfirieron a nuevos tubos y se centrifugaron de nuevo a 1500 g durante 10 minutos. El suero se transfirio a tubos limpios y se almaceno a -80 °C.

Los niveles de CO3 se midieron en x 5 muestras de suero diluido de las ratas. Los niveles en BDL y Simulada se compararon mediante la prueba Mann-Whitney de dos colas no parametrica (a =0.05) de signification estadlstica suponiendo una distribucion normal.

Los niveles de CO3 aumentaron significativamente en los grupos BDL en comparacion con los animales con la operacion simulada. Los resultados se muestran en las Figuras 2a y b.

Ejemplo 3:

CO3 en diferentes enfermedades fibroticas (suero humano)

Los niveles de CO3 se midieron en suero de humanos con tres enfermedades fibroticas diferentes: Enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD), esclerodermia y virus de la hepatitis C (HCV).Las muestras de suero se recuperaron de Sera Laboratories International Ltd (SLI Ltd), Reino Unido.

Los niveles del CO3 se incrementaron en las tres enfermedades fibroticas diferentes (Figura 3)

Ejemplo 4:

Desarrollo de anticuerpos - deteccion del marcador CO3-610C

El colageno tipo III (Abcam, Cambridge, Reino Unido) se degrado in vitro por la MMP-9 activada (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) durante 2 dlas. Los fragmentos de degradation se secuenciaron por LS-MS/MS y se identificaron mediante la busqueda en el MASCOT. Una secuencia peptldica especlfica 610KNGETGPQ se selecciono para la

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produccion del anticuerpo. El N-terminal de esta secuencia es el residuo 610 del colageno humano tipo III. El peptido sintetico se conjugo con la ovoalbumina antes de la inmunizacion subcutanea de los ratones Balb/C de 4-6 semanas de edad con aproximadamente 200pL de antlgeno emulsificado y 50pg del CO3-610C (KNGETGPQGPGGC-OVA).Las inmunizaciones consecutivas se realizaron a intervalos de dos semanas en adyuvante incompleto de Freund hasta que se alcanzaron niveles de titulacion de suero estables. Los ratones se sangraron de la segunda inmunizacion en lo adelante. En cada sangrado, se midio el tltulo del suero y el raton con el mayor tltulo de anti-suero se selecciono para la fusion. Despues de la cuarta inmunizacion, este raton descanso durante un mes y despues se le dio una dosis de refuerzo por via intravenosa con 50 pg del CO3-610C en 100 pl de solucion de cloruro sodico al 0.9 % tres dlas antes del aislamiento del bazo para la fusion celular.

Los clones productores de los anticuerpos monoclonales se seleccionaron mediante el uso de a) un peptido inmunogenico: KNGETGPQGP-GGC-Ovalbumina (OVA) (807678), b) un peptido de tamizaje KNGETGPQGP-PG-K- Biotina (807971), c) los peptidos de deseleccion KDGETGAAGPPGK-Biotina (118318 ) que representa una cadena alfa 1 de colageno tipo II, KDGEAGAQGPPGK-Biotina que representa un producto de la degradacion de la cadena alfa 1 del colageno tipo I, comprados a la Chinese Peptide Company, Beijing, China. La placa de ELISA recubierta se obtuvo de NUNC (Thermofisher, Copenhague, Dinamarca).Los reactivos de conjugacion de peptidos y los tampones se produjeron por Pierce (Thermofisher, Copenhague, Dinamarca).

El tampon usado para disolver el peptido de recubrimiento estaba compuesto de lo siguiente:40 mM Na2HPO4, 12 H2O, 7 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 25 mM EDTA, 0,1 % Tween 20, 1 % BSA, 10 % sorbitol, pH 7.Para un ensayo de suero, se uso tampon que contenla los siguientes productos qulmicos:8 mM Na2HPO4, 12 H2O, 1.5 mM KH2PO4, 13,7 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0.1 % Tween 20, 1 % BsA, 0.003 % fenol rojo, pH 7.4. Un tampon diferente que se uso para un ensayo de orina contenla Trizma 400 mM, 0.05% de Tween 20, 0.1% de BSA, 0.36% de Bronidox L5, pH 8.0.Tanto para el ensayo de suero como el de orina se uso un tampon de lavado compuesto por Trizma 25 mM, NaCl 50 mM, 0.036% de Bronidox L5, 0.1% de Tween 20, y tampon de parada de la reaccion compuesto por 0.1 % de H2SO4.Las placas de ELISA que se usaron para el desarrollo del ensayo se recubrieron con Estreptavidina de Roche (Hvidovre, Dinamarca) cat.:11940279.Todas las placas de ELISA se analizaron con el lector de ELISA de Molecular Devices, SpectraMax M, (CA Estados Unidos).

En los experimentos preliminares, optimizamos los reactivos, sus concentraciones y los perlodos de incubacion mediante la realizacion de varios analisis de tablero de ajedrez. Una placa de ELISA de 96 pocillos recubierta con estreptavidina se recubrio adicionalmente con 5 ng/ml del peptido sintetico biotinilado KNGETGPQGP disuelto en tampon PBS-TBE a 20°C durante 30 minutos en agitacion constante a 300 rpm. Despues de lavar con tampon de lavado, se anadieron 20 pl de la muestra, seguido por 100 pl de solucion del mAb-NB51-32 CO3-610C anti-humano conjugado con peroxidasa (23 pg/ml en tampon de incubacion).La placa se incubo durante 1 hora a 20°C tiempo durante el cual se agito a 300 rpm. Esto se siguio por un lavado y, finalmente, se dispensaron 100pl de tetrametilbencinidina (TMB) (Kem-En-Tec cat.4380H) y se incubo la placa durante 15 minutos en la oscuridad y con agitacion a 300 rpm. Con el objetivo de poner fin a la reaccion, se anadieron 100pl de disolucion de parada y la placa se analizo en el lector de ELISA a 450nm con 650nm como referencia.

Se realizo una curva estandar por diluciones en serie del NB51-32 CO3-610C-biotinilado para un ensayo de suero, y NB51-134 C03-610C-biotinilado para un ensayo de orina. Las concentraciones estandares fueron 0, 0.33, 1, 3, 9, 27, 81 y 162 ng/ml.

Designamos los fragmentos que se detectaron mediante el uso de los inmunoensayos as! obtenidos como CO3-610C teniendo en cuenta que el aminoacido K en el N-terminal de la secuencia KNGETGPQGP es el aminoacido 610 de la secuencia del colageno III humano.

Ejemplo 5

Comparacion del CO3-610C y otros biomarcadores en la fibrosis hepatica que se indujo en ratas Animales

40 ratas Sprague-Dawley hembras de 6 meses de edad se alojaron en las instalaciones de investigacion de animales de Nordic Bioscience, Copenhague, Dinamarca. Los experimentos se aprobaron por el Comite de Animales de Experimentation del Ministerio de Justicia de Dinamarca y se realizaron de acuerdo con el Estandar Europeo de Buenas Practicas Cllnicas (2008/561 a 1.450). Las ratas se alojaron en jaulas de tipo estandar III-H a 18-22°C con lecho y material de nido (Altromin 1324; Altromin, Lage, Alemania) y agua libremente. Las ratas se mantuvieron bajo condiciones de un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad.

Diseno del Estudio

En 20 ratas, la fibrosis hepatica se indujo mediante BDL comun. El procedimiento quirurgico se realizo en condiciones esteriles .La rata se anestesio, el conducto biliar se localizo y se ligo en dos lugares seguido por la diseccion entre las ligaduras, y se cerro el abdomen. Las otras 20 ratas se sometieron a una operation simulada, en la que el abdomen se

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cerro sin la ligadura del conducto biliar. Las ratas se dividieron despues en 2 grupos: Grupo 1 (10 ratas BDL y 10 ratas con operation simulada) se sacrifico despues de 2 semanas y el Grupo 2 (10 bDl y 10 ratas con operation simulada) se sacrifico despues de 4 semanas. Al finalizar el perlodo de estudio (2, o 4 semanas), despues de al menos 14 horas de ayuno, todos los animales supervivientes fueron asfixiados con CO2 y se sacrificaron por desangrado.

Muestreo de sangre

Las muestras de sangre se tomaron del seno retro-orbital de las ratas despues de al menos 14 horas de ayuno, bajo anestesia ligera con CO2/O2, al inicio y a la termination. La sangre se dejo 30 minutos a temperatura ambiente para su coagulation, lo que se siguio por una centrifugation a 1500 g durante 10 minutos Todo el llquido libre de coagulos se transfirio a tubos frescos y se centrifugo de nuevo a 1500 g durante 10 minutos. El suero se transfirio despues a tubos limpios y se almaceno a -80°C.

Manipulacion de los tejidos

Despues que las ratas se sacrificaron, sus hlgados se diseccionaron cuidadosamente, se pesaron, se fijaron en formaldehldo al 4% durante un mlnimo de 24 horas, se cortaron en rebanadas apropiadas y se embebieron en parafina. Secciones de 5pm de grosor se cortaron, se montaron en portaobjetos de vidrio y se tineron con Rojo Sirio. Las secciones del hlgado se evaluaron histologicamente por la evaluation de la arquitectura, la presencia de inflamacion, la proliferation de los conductos biliares y de la fibrosis. La formation de novo del conducto de la bilis en el parenquima se evaluo semicuantitativamente mediante el uso del siguiente sistema de puntuacion: normal = 0, cambios leves (1/3 o menos del lobulo afectado) = 1, cambios moderados (entre 1/3 y 2/3 del lobulo afectado) = 2, y cambios severos (2/3 o mas del lobulo afectado) = 3.Las fotograflas digitales se capturaron mediante el uso de un microscopio Olympus BX60 con x 40 y x 100 de aumento y una camara digital con zoom 5050 Olympus (Olympus, Tokio, Japon).

Determination del colageno total y del CTX-II del suero

La concentration total de colageno se ensayo mediante el uso del estuche comercial QuickZyme Collagen Assay (QuickZyme Bioscience, Leiden, Palses Bajos).La concentracion de CTX-II se ensayo mediante el uso del estuche comercial Rat CTX-II. Todas las muestras se comprobaron por duplicado.

Cuantificacion del ARNm del colageno tipo III

El numero de transcriptos del colageno tipo III (Col3a1) en muestras de tejido del hlgado se determino por reaction en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-PCR) mediante el uso de sondas reporteras fluorescentes. El numero de copias Col3a1 en la muestra se extrapolo a partir de una curva patron que se obtuvo mediante el uso del ADNc plasmldico de Col3a1 Image Clone 7097081 (Geneservice, Cambridge, Reino Unido) como estandar de dilucion.Las cantidades de Col3a1 se normalizaron con los genes domesticos hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1). Los iniciadores y sondas para los ARNm de Col3a1 y HPRT1 se disenaron mediante el uso de las Secuencias de Referencia del NCBI NM_032085.1 y NM_012583.2 como moldes, respectivamente (TIB Molbiol GmbH, Berlin, Alemania).El ARN total se extrajo de muestras congeladas de hlgado mediante el uso del estuche Absolutely RNA Miniprep (Stratagene, La Jolla, Ca, Estados Unidos) mediante el seguimiento de las instrucciones del fabricante y su calidad se evaluo en Nano chips de ARN mediante el uso de un instrumento 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Estados Unidos).Inmediatamente despues del aislamiento del ARN, el aDn complementario (ADNc) se sintetizo con el estuche Transcriptor First Strand cDNA Synthesis (Roche, Basilea, Suiza) mediante el uso de 1pg de ARN como molde. Para cada muestra que se ensayo, se incluyo un control negativo de slntesis de ADNc, omitiendo la enzima transcriptasa inversa de la mezcla de reaccion. Las reacciones de PCR separadas para Col3a1 y HPRT1 se realizaron en un formato de 20pL mediante el uso del estuche LightCycler Faststart DNA Master Plus HybProbe (Roche) segun las instrucciones del fabricante. Los datos de fluorescencia en tiempo real se recogieron en un instrumento LightCycler 2.0 (Roche).

Extracciones

El tejido se pulverizo en un mortero de acero en exceso de nitrogeno llquido. Las muestras se transfirieron despues a un tubo Eppendorf de 1.5 ml y se dejaron en agitation durante la noche a 4°C en disolucion de acido acetico 0.5M que contiene un coctel inhibidor de proteasas (Roche).Las muestras se sometieron a sonicacion con ultrasonido mediante el uso de 5 pulsos al 60% de la amplitud (U50 control, IKA Labortechnik) y se dejaron durante un perlodo adicional de 2 horas a 4 °C despues de lo cual se centrifugaron durante 5 minutos a 13,000 rpm. Se elimino el sobrenadante con cuidado, y se transfirio a un Eppendorf nuevo y se almaceno a -80 °C.

Densitometrla

Las mediciones de densitometrla se realizaron con un UN-SCAN-IT Version 6.1 de Silk Scientific (proporcionar ciudad, pals).

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Analisis de imageries de histologla

Las secciones histologicas que se tineron con Rojo Sirio se analizaron mediante la utilizacion del software Visiopharm version 3.2.8.0 (proporcionar ciudad, palsj.Las imagenes se adquirieron mediante una camara digital de microscopio PixelinkPL-A623C.

SDS PAGE y Western blots

20 g de extracto de tejido se mezclaron con el tampon de carga (Invitrogen LDS 4x, NP0007) que contiene el agente reductor (NuPAGE, NP0004 de Invitrogen).Las muestras se cargaron despues en gel de gradiente Bis-Tris 4-12 % (NP0332BOX de Invitrogen) y se pasaron 52 minutos a 200 V. Las protelnas se transfirieron despues sobre una membrana de nitrocelulosa usando el sistema de transferencia i-Blot (Invitrogen), se bloquearon con leche al 5 % en (^Necesidad de deletrear?)TTBS durante la noche a 4 grados. El anticuerpo anti Beta Actina (AbCam ab8229, proporcionar empresa, pals ciudad?) se utilizo como control de carga.

Analisis Estadlstico

Los valores medios y el error estandar de la media (SEM) se calcularon usando el programa GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, Estados Unidos) y se compararon mediante la prueba t de Student pareada de dos colas (a = 0.05) de significacion estadlstica asumiendo una distribucion normal, o mediante la prueba no parametrica de Mann-Whitney de dos colas (a = 0.05).El coeficiente de correlacion (R2) y el valor p correspondiente se determino por una regresion lineal.

Resultados

Apariencia del hlgado; En el momento del sacrificio, los hlgados de los animales de control mostraron una morfologla macroscopica normal, mientras que los hlgados de los animales BDL eran agrandados. Los pesos de los hlgados aumentaron significativamente en ratas BDL en comparacion con los controles simulados (pesos medios al sacrificio:2 semanas despues de la cirugla, simulado 8.1 g; BDL 14.1 g; 4 semanas despues de la cirugla, simulado 9.0 g; BDL 19.4 g) (Figura 4 panel A). La puntuacion semicuantitativa de las secciones del hlgado mediante el uso de la escala de 0-3 mostro significativamente mas cambios estructurales del hlgado a las 4 semanas en comparacion con a las 2 semanas (Figura 4 Panel B).La Figura 4, panel A muestra el peso del hlgado en las ratas con ligadura del conducto biliar (BDL) - o en las ratas con operacion simulada. Los datos se muestran como la media + SEM.[***, P<0.0001.El panel B muestra la puntuacion de los cambios estructurales en el hlgado de cada grupo. Los datos se muestran como media + SEM.**, P=0.0094.El panel C muestra las microfotograflas con Rojo Sirio que muestran la estructura hepatica en ratas con operacion simulada, y en ratas BDL a las 2 y 4 semanas despues de la cirugla. La estructura hepatica en todo el tracto portal se desorganiza claramente en las ratas BDL en comparacion con las ratas con operacion simulada. Los colagenos se resaltan en rojo. El aumento original fue x40.

Bajo el examen histologico, el hlgado de los animales con operacion simulada no mostro signos de fibrosis y era microscopicamente normal (Figura 4C).En los hlgados BDL, se observo una proliferacion ductal marcada. En el grupo de 2 semanas de post-cirugla, la proliferacion se localizo alrededor del tracto portal mientras que en el grupo de 4 semanas la proliferacion se extendio (Figura 4C).La deposicion de colageno se encontro alrededor de las estructuras ductulares. La inflamacion fue minima y se limito a los tractos portales. No se observaron signos de colestasis, ya sea colestasis intracelular, tapones biliares, infartos biliares o formacion de rosetas hepatoclticas.

Cambios en los niveles del CO3-610C; La Figura 5 muestra en el panel A los niveles en suero de la degradacion del CO3 mediada por MMP-9 en las ratas con ligadura del conducto biliar (BDL) - o en las ratas con operacion simulada. Los datos se muestran como la media + el error estandar de la media.2 semanas post-cirugla *** P<0.0001 y 4 semanas post cirugla ** P=0.0014.En el panel B se muestran los valores delta del CO3-610C (terminacion-inicio apareados), 2 semanas post-cirugla P<0.0001 y 4 semanas post-cirugla P=0.0016.En el panel C se muestran los niveles de CTX-II en las ratas BDL- o en las ratas con operacion simulada. Los datos se muestran como la media + el error estandar de la media.

En los grupos BDL CO3-610C los niveles aumentaron significativamente en comparacion con los grupos con operacion simulada (valores medios: 2 semanas, post-cirugla simulada 39.7 ng/ml, BDL 100.3 ng/ml; el aumento promedio entre los grupos fue de 153 %; 4 semanas post-cirugla, operacion simulada 39.7, BDL 92.6 ng/ml, el aumento promedio entre los grupos fue de 133 %) (Figura 5 paneles A y B).No hubo cambios en los grupos con operacion simulada .Los niveles de CTX-II que indican la degradacion del colageno tipo II no cambiaron en los grupos de operacion simulada o en los grupos BDL (Figura 5 Panel C).

Expresion del gen de colageno tipo III; La Figura 6 muestra la Expresion del gen de colageno tipo III en ratas BDL o de operacion simulada. Los datos se muestran como media + estandar de la media; 2 semanas post-cirugla P<0.0001 y 4 semanas post-cirugla P=0.0006

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El ARNm de la cadena a1 del colageno tipo III aumento significativamente en ambos grupos BDL en comparacion con las ratas con operacion simulada.

Western Blot y Densitometrla: La Figura 7 muestra los cambios en la expresion de CO3-610C en el hlgado de ratas en los grupos BDL y con operacion simulada que se evaluaron por A) Western blot 2 y 4 semanas post-cirugla y B) Bandas de western blot que se cuantificaron por densitometrla.

El analisis por Western Blot mostro niveles muy bajos de CO3-610C en las ratas con operacion simulada (Figura 7 Panel A).Durante y despues de 2 semanas los niveles de CO3-610C post-cirugla aumentaron prominentemente (Figura 7 Panel A).Los resultados se cuantificaron mediante el analisis de densitometrla (Figura 7 panel B).

Analisis de las imagenes de histologla: La Figura 8 Panel A muestra en la fila superior las secciones de histologla de las ratas BDL o de las ratas con operacion simulada tenidas con Rojo Sirio. La fila inferior muestra las secciones histologicas enmascaradas para la cuantificacion del contenido total de colageno (color rojo) en el hlgado. El panel B muestra el colageno total que se cuantifico por el programa Visiopharm - 2 semanas post-cirugla P=0.0081; 4 semanas post-cirugla P=0.0047

Las secciones histologicas tenidas con Rojo Sirio y que se mejoraron mediante el uso del programa Visiopharm mostraron un aumento del contenido de colageno en el tiempo en las ratas operadas-BDL (Figura 8 panel A).El color rojo en la mascara que representa el colageno se cuantifico mediante el uso del mismo programa (Figura 8 panel B) y confirmo un aumento significativo en el contenido total de colageno en las ratas operadas-BDL en comparacion con las ratas con operacion simulada (2 semanas post-cirugla P=0.0081; 4 semanas post-cirugla P=0.0047).

Correlacion: La Figura 9 Panel A muestra que una correlacion de Col3a1 con respecto a CO3-610C se encontro con R2=0.6993, P<0.0001.En el panel B, una correlacion del CO3-610C con respecto al % del colageno se encontro con R2=0.2278 y P=0.0050.En el panel C se encontro una correlacion del Co13a1 con respecto al % de colageno con R2=0.5409, P<0.0001.

Se encontraron correlaciones de los siguientes: ARNm de Col3a1 con respecto al CO3-610C con R2=0.6993 y P<0.0001 (Figura 9A), y del C03-610C con respecto al % de colageno que se cuantifico mediante el visiopharm con R2=0.2278 y P=0.0050 (Figura 9B), y del ARNm de Col3a1 con respecto al % de colageno que se cuantifico mediante el Visiopharm con R2=0.5409 y P<0.0001 (Figura 9C).

La remodelacion de la ECM es un proceso integrado de desarrollo de los tejidos, de mantenimiento y de patogenesis. La actividad proteolltica es esencial en este proceso para la migracion celular, la eliminacion del tejido danado, y el secuestro de nuevas protelnas, para la orientacion correcta y optima del tejido y la calidad (108: 109). Los productos especlficos de la degradacion de la matriz, los neo-epltopos, pueden ser importantes para la identificacion de nuevos marcadores bioqulmicos del recambio de la matriz de la fibrosis hepatica y la comprension de la patogenesis de la fibrosis. En la actualidad no hay tecnicas de medicion disponibles, ni marcadores bioqulmicos, que permitan la evaluacion de la remodelacion de la ECM en la patogenesis de la fibrosis.

En este ejemplo, para investigar el marcador CO3 - 610C en situaciones in vivo, se eligieron ratas BDL de 6 meses, ya que previamente demostraron tener una remodelacion de colageno mas baja en comparacion con las ratas mas jovenes. Las ratas son maduras esqueleticamente, y el cartllago de crecimiento es casi inactivo, contribuyendo as! en un grado mucho menor a la remodelacion global del colageno. Esto influye en la sensibilidad y la especificidad por el biomarcador. Estas ratas claramente presentadas con fibrosis hepatica, tal como se evaluo tanto por analisis histologico cuantitativo, como por el alargamiento con un aumento de peso, por tanto, el modelo fue uno apropiado para buscar evidencia de la remodelacion de la ECM, en particular para evidencias de colageno de tipo III en el suero.

Los datos actuales demuestran claramente que el neo-epltopo CO3 - 610C que se obtiene de la degradacion del colageno tipo III por la MMP-9 es un marcador bioqulmico de diagnostico para la fibrosis hepatica con un incremento promedio en el suero de hasta el 153 % de las ratas con operacion simulada respecto a las ratas operadas-BDL.

Para investigar mas aun la razon biologica para el aumento del marcador CO3 - 610C, hicimos las extracciones de protelnas a partir de hlgados sanos y enfermos. Por Western Blot, identificamos una banda predominante, lo que sugiere que se trata de un fragmento de protelna abundante en los hlgados enfermos pero no en los sanos. Esto proporciona evidencia de la exactitud patologica de este marcador novedoso.

Para investigar adicionalmente la representacion del recambio patologico del hlgado, se midio el ARNm del colageno tipo III. Se encontro un aumento de ARNm en las ratas BDL en comparacion con aquellas que se sometieron a la operacion simulada, lo que se correlaciona con los resultados anteriores. Estos datos sugieren fuertemente que la fibrosis hepatica no es solo una acumulacion de protelnas de la ECM, sino ademas una situacion de recambio acelerado, en la que tanto la formacion del tejido como la degradacion del tejido son ambas altamente reguladas positivamente. La formacion de tejido supera la degradacion del tejido, lo que lleva a una acumulacion de tejido cicatricial en el tiempo. Investigadores anteriores utilizaron otras protelnas del recambio de la matriz para evaluar la

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fibrosis hepatica, una de ellas es el marcador de formacion del colageno tipo III N-terminal pro-colageno III. Este marcador representa la formacion de colageno tipo III y demostro que se aumenta en la fibrosis hepatica en estudios anteriores.

Para comprender ademas la dinamica de los marcadores bioqulmicos CO3 - 610C, hicimos una variedad de correlaciones. Lo mas importante, habla una correlation significativa del CO3 - 610C con el grado de la fibrosis que se midio en el hlgado por la histologla cuantitativa. El nivel de la fibrosis hepatica se correlaciono con los niveles de expresion del ARNm del colageno tipo III. Finalmente, el CO3 - 610C se correlaciona con el ARNm del colageno tipo III en el hlgado. En conjunto, hubo una correlacion significativa de los procesos patologicos en el hlgado con los niveles de los marcadores bioqulmicos sistemicos CO3 - 610C. Ademas, las extracciones tisulares demostraron que los niveles de circulation se produclan localmente.

Ejemplo 6: ELISA en muestras de suero humanas

Las muestras de suero humano se obtuvieron de pacientes con Enfermedad Pulmonar Obstructiva Cronica (COPD) (n = 5), con esclerodermia (n = 5), con infection cronica por virus de la hepatitis C (n = 5), y de controles sanos (n = 5).Las muestras de suero se ensayaron en el ELISA de CO3-610 (vease el Ejemplo 4 anteriormente) para determinar la concentration de los fragmentos del CO3-610.Los resultados se muestran en la Figura 10. Mientras que las muestras de suero de los sujetos sanos tuvieron una concentracion de fragmentos de CO3-610 por debajo de 30 ng/ml, se encontro que los sujetos enfermos tenlan niveles elevados en circulacion lo que sugiere una remodelacion masiva del tejido en los tejidos fibroticos afectados.

Ejemplo 7: Reactividad del clon nb94

Los ratones se inmunizaron con el peptido sintetico KAFVFP (sec. con num. de ident.: 1167) conjugado con ovoalbumina (KAFVFPKESD-GGC-OVA (sec. con num. de ident.:1049)), se usaron celulas de bazo para la fusion, y los anticuerpos monoclonales se comprobaron para determinar la reactividad con el KAFVFP biotinilado (sec. con num. de ident.: 1167) , es decir, (KAFVFPKESD-biotina (sec. con num. de ident.:1049)) inmovilizado en pocillos de placas de microtitulacion recubiertas previamente con estreptavidina. Los anticuerpos que se unen al KAFVFPKESD biotinilado (sec. con num. de ident.:1049), que podrlan ser inhibidos mediante la co-incubacion con el KAFVFPKESD (sec. con num. de ident.:1049) pero no con el peptido alargado RKAFVFPKESD (SEQ ID N01166), se seleccionaron para una caracterizacion adicional. El anticuerpo monoclonal preferido se designo NB94-37-1A7.

El uso de un ELISA de competencia, se realizo esencialmente como se describio anteriormente con el KAFVFPKESD biotinilado (sec. con num. de ident.:1049) (utilizado a 0.15 ng/ml) inmovilizado en los pocillos de las placas de microtitulacion recubiertas con estreptavidina, una etapa de incubation (90 minutos a 20°C) con la muestra y el anticuerpo monoclonal NB94-37-1A7 seguido por una etapa de lavado, y despues la adicion de inmunoglobulinas anti- raton conjugados con peroxidasa. Para la competencia se uso el siguiente material en diluciones dobles; (1) el peptido sintetico KAFVFP (SEQ ID N01167); (2) un peptido sin sentido (KNEGTG) no relacionado con la CRP; (3) una mezcla de muestras de suero humano; (4) la CRP escindida proteollticamente con MMP3 durante 7 dlas, posteriormente detenida mediante la adicion de EDTA para bloquear la actividad de la proteasa, y almacenada a -80 °C hasta las pruebas; (5) igual que (4), pero con el uso de MP8 en lugar de MMP3; (6) igual que (4) excepto por el uso de catepsina K (durante 2 dlas) en lugar de MP3 (y E64 como inhibidor para bloquear la actividad de la catepsina K).

Los datos demuestran que el anticuerpo monoclonal NB94-37-1A7 se une fuertemente al peptido sintetico KAFVFPKESD (SEQ ID n01049), y con la CPR que se escindio con la MMP3 y la MMP8.El escision de la CRP con la catepsina K libera menos analito que se reconoce por el anticuerpo monoclonal NB94-37-1A7. Finalmente, los datos muestran que el anticuerpo se une a los fragmentos peptldicos en el suero humano lo que confirman la presencia de esta secuencia en los fragmentos peptldicos que circulan.

Ejemplo 8: CO3 en muestras biologicas relevantes: Niveles de CO3 en cirrosis inducida por tetracloruro de carbono (CCl4) en ratas.

Animales e induction de la cirrosis:

Este estudio incluyo a 52 ratas Wistar machos con fibrosis o cirrosis y 35 ratas macho Wistar de control. Para hacer que desarrollen fibrosis o cirrosis animales de tres meses de edad se incluyeron en un programa de induccion con tratamientos con tetracloruro de carbono (CCl4) y con fenobarbital. El CCU se administro por inhalation dos veces por semana y el fenobarbital (0.3 g/l) se anadio al agua de beber. A los animales se les permitio el libre acceso al agua y los alimentos durante todo el estudio.

Cuantificacion de la fibrosis:

Las secciones de hlgado (4 pM) se tineron en 0.1 % de rojo Sirio F3B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en acido plcrico saturado (Sigma-Aldrich).El area de fibrosis relativa (que se expreso como un porcentaje del area total del hlgado) se evaluo mediante el analisis de 36 campos de las secciones de hlgado que se tineron con rojo Sirio por animal. Cada

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campo se adquirio con un aumento de 10X [microscopio E600 (Nikon) y camara digital RT-Slider SPOT (Diagnostic Instruments, Inc., Sterling Heights, MI).Los resultados se analizaron mediante el uso de un sistema de morfometrla Bioquant Life Science computarizado. Para evaluar el area de fibrosis relativa, el area de colageno que se midio se dividio por el area de campo neta y luego se multiplico por 100.La resta del area luminal vascular de la superficie total del campo produjo el calculo final de la superficie neta de la fibrosis. De cada animal que se analizo, se midio la cantidad de fibrosis en porcentaje y el valor promedio que presento.

Clasificacion de los grupos de acuerdo con su estadio de fibrosis/cirrosis:

Los animales se clasificaron en 4 estadios de fibrosis y cirrosis diferentes (Grupo A: fibrosis moderada, grupo B: fibrosis avanzada, Grupo C: cirrosis moderada, y Grupo D: cirrosis avanzada) que se determinaron por el porcentaje de area del hlgado positiva a rojo Sirio (Grupo A: <5 %, Grupo B: 5 a 10 %, Grupo C: 10 a 15 % y Grupo D: >15 %).Con este proposito, las ratas de control y fibroticas/cirroticas se estudiaron considerando cuatro puntos de tiempo diferentes durante el tratamiento con CC14:8, 12, 16 y 20 semanas despues de iniciar el programa de induccion de la cirrosis.

Medicion de acido hialuronico:

El hialuronano en suero se midio mediante el uso de un estuche de ELISA sandwich (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA).

Estadlsticas:

El analisis estadlstico de los resultados se realizo mediante pruebas t de Student no pareadas cuando se considero adecuado. Los datos se expresaron como media ±S.E.M, y se consideraron significativos a nivel de p de 0.05 o menos.

Diseno del Estudio:

Los animales incluidos en este protocolo fueron asignados aleatoriamente a uno de los siguientes grupos: A/ ocho semanas de tratamiento con CCU, B/ doce semanas de tratamiento con CCU , C/ dieciseis semanas de tratamiento con CCl4 y D/ veinte semanas de tratamiento con CCU En paralelo, se estudiaron cuatro grupos de control en los mismos puntos de tiempo. Trece ratas fibroticas y siete ratas de control se incluyeron en cada grupo. Al final del estudio, las ratas se colocaron en jaulas metabolicas estandar (Tecniplast Deutschland, Hohenpeissenberg, Alemania) durante un perlodo de adaptacion de 3 dlas antes de proceder a la recoleccion de orina de veinticuatro horas. Los volumenes urinarios se determinaron por gravimetrla. Durante el periodo de adaptacion, a las ratas se les permitio el libre acceso al agua del grifo y a los alimentos. Despues, las muestras de orina de 24 horas se centrifugaron durante 5 min a 2,500 rpm y se dispensaron en 10 tubos de polipropileno (400 pL cada uno).Las muestras de orina se almacenaron a -80 °C para su posterior analisis.

En las necropsias que se programaron, las ratas se pesaron, se anestesiaron con pentobarbital (50 mg/kl) y se decapitaron. La sangre se recolecto y se dejo reposar a temperatura ambiente durante 20 min para permitir la coagulacion y despues se centrifugo durante 10 min a 2500 rpm. El suero se recogio en allcuotas en tubos de polipropileno (400 pl en cada una) y se transfirio en hielo seco a un congelador de -80°C.La recoleccion de las muestras de sangre iniciales al comienzo del tratamiento con CCl4 no se considero con el fin de evitar una intervention adicional que puede aumentar el riesgo de infection y/o introducir modificaciones en el modelo experimental que puedan comprometer la evolution del proceso fisiopatologico que se indujo. Para la histologla y para la tincion con rojo Sirio, la mitad del lobulo izquierdo del hlgado se coloco en formalina tamponada neutra al 10% durante 16 horas, se embebio en parafina y se corto en rodajas de 4-pm de grosor. Despues de la cuantificacion de la fibrosis hepatica, el material de bloque de parafina que no se utilizo se conservo para la cuantificacion de los biomarcadores. La otra mitad del lobulo izquierdo se congelo rapidamente en nitrogeno llquido y se almaceno para el Western blot, el RT-PCR o el analisis inmunohistoqulmico. Las mediciones del area fibrotica del hlgado, de la osmolalidad urinaria y del suero, de los iones Na+ y K+, de la albumina, la creatinina, de la alanina amino-transferasa y de la lactato dehidrogenasa se realizaron de acuerdo a la seccion de Material y Metodos.

Resultados:

Validation histologica del modelo:

El colageno del hlgado se cuantifico en todos los animales del estudio por tincion con rojo Sirio de los cortes del hlgado. Los datos finales para cada animal se tomaron como el promedio de tincion con rojo que se observo en 36 campos microscopicos consecutivos (Figura 12).

La Figura 12 muestra imagenes representativas de dos conjuntos de 36 imagenes que se utilizaron para cuantificar la acumulacion de colageno en el hlgado en la rata # 1 (izquierda) y en la rata # 43 (derecha) que se trataron con tetracloruro de carbono por ocho y veinte semanas respectivamente.

El marcador CO3 del suero muestra un aumento estadlsticamente significativo en las ratas fibroticas y cirroticas en

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comparacion con las ratas de control. Los animales se clasificaron de acuerdo a una tincion totalmente automatizada con rojo sirio el procedimiento de hlgado que se utilizo para cuantificar la fibrosis (Figuras 13 y 14).

La Figura 13 muestra los niveles del CO3 en las ratas de control y en las que inhalaron CCU como se realizo en el Hospital Clinic (Barcelona). Cada punto representa un animal. Las ratas se clasificaron segun un metodo de analisis de imagen computarizado de la tincion con rojo sirio del hlgado que se utilizo para cuantificar la fibrosis.

Cuando se estudiaron los valores cuantitativos del CO3 en suero y la tincion con rojo sirio del hlgado en cada animal individual, se encontro una correlation estadisticamente significativa entre las dos variables (R2=0.4087; n=21) (Figura 14).

Comparamos los niveles del CO3-610C con el punto de referencia serologico del acido hialuronico de la fibrosis hepatica (HA).Los niveles del HA se cuantificaron con un estuche de ELISA comercial y los resultados muestran elevaciones significativas de este componente de la ECM en ratas cirroticas vs. animales fibroticos (Figuras 15 y 16).

La correlacion del C03 respecto al rojo Sirio supero a la del HA. Mas del setenta por ciento de la variation en la cuantificacion histologica de la fibrosis hepatica se puede explicar por la medicion serologica del CO3. El treinta por ciento restante se debe a variables que no se conocen o a la variabilidad inherente. En cambio solamente el 25 % de la fibrosis hepatica se puede explicar mediante la medicion del acido hialuronico (Figura 15).

Como era de esperar a partir del resultado anterior no se pudo encontrar una correlacion entre el CO3 y el acido hialuronico lo que sugiere que son el resultado de dos procesos fisiopatologicos independientes en el desarrollo de la fibrosis hepatica (Figura 17).

Ejemplo 9:Fibrosis de la piel inducida por bleomicina en ratones.

Los ratones se trataron mediante la aplicacion en la piel de PBS o bleomicina. El aumento de los niveles en la orina del fragmento C03-610 de la degradation del colageno III (CO3) por la MMP-9 se asocia con la progresion de la fibrosis en la piel en los ratones.

La Figura 18 muestra una section de piel de un raton que se trato con PBS a las 8 semanas de tratamiento (panel A) y una seccion de piel de un raton que se trato con Bleomicina a las 8 semanas de tratamiento (panel B). El aumento de grosor de la piel entre los ratones que se trataron con el PBS (n=7/punto temporal) y con la Bleomicina (n=13/punto temporal) durante 2 semanas (P = 0.0029), 4 semanas (P = 0.0004), 6 semanas (P < 0.0001) y 8 semanas (P < 0.0001) se grafico en los paneles C y D. El grosor de la piel en general aumenta al comparar los ratones que se trataron con el PBS (n = 28) y los que se trataron con la bleomicina (n = 52) durante la duration del estudio (P < 0.0001).El ancho de la piel se calculo por el software Visiopharm como un numero global por seccion de piel en lugar de las imagenes de muestreo.

La Figura 19 muestra los resultados del ensayo de CO3-610 en orina que demuestran un aumento significativo a traves de los puntos de tiempo del estudio. La figura muestra el resultado por punto de tiempo (n=7 PBS, n=13 tratados con Bleomicina por punto de termination) y los niveles de CO3-610 colectivos para todos los puntos de tiempo (n=28 PBS y n=52 ratones tratados con bleomicina). 2 semanas P = 0.0008, 4 semanas P < 0.0001, 6 semanas P < 0.0001, 8 semanas P < 0.0001 y en general P < 0.0001.

La Figura 20 muestra una imagen de Western Blot de CO3-610 con el control C y con la Bleomicina B despues de 2 y 8 semanas de tratamiento (panel A).Las mediciones de densitometria de CO3-610 para todos los puntos de tiempo (n=7 PBS y n=13 ratones tratados con Bleomicina por punto de terminacion) y los niveles de CO3-610 colectivos (n=28 PBS y n=52 ratones tratados con Bleomicina) se muestran en el panel B, lo que demuestra un aumento estadisticamente significativo de los niveles del CO3-610 (P < 0.0001).

Como se aprecia en la Figura 21, se encontro que los niveles del CO3-610 en el ensayo de orina se correlacionan con la progresion del grosor de la piel, y por lo tanto con la deposition total de colageno r=0.4883, R2=0.2384.

Como se aprecia en la Figura 22, se encontro una correlacion estadisticamente significativa (r = 0.6528, P<0.0001) entre los resultados del ensayo ELISA de orina de CO3-610 y las mediciones de densitometria del Western Blot.

En esta description, a menos que expresamente se indique lo contrario, la palabra "o" se usa en el sentido de un operador que regresa un valor verdadero cuando una o ambas de las condiciones indicadas se cumple, en contraposition con el operador "exclusivo o" que requiere que solo una de las condiciones se cumpla. La palabra "comprende" se usa en el sentido de "que incluye" y no en el sentido de "que consiste en". El no reconocimiento de cualquier documento que se publico antes en la presente invention debe tomarse como una admision o una representation de que la ensenanza de la misma era de conocimiento general comun en Australia o en cualquier otro lugar en la fecha de la misma.

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   Reivindicaciones

   1. Un metodo de inmunoensayo para medir fragmentos de protelna que contienen neo-epltopos naturalmente presentes en la muestra de fluido corporal, en donde dicho inmunoensayo se lleva a cabo mediante un metodo que comprende: contactar fragmentos de protelna naturalmente presentes en dicha muestra con una pareja de union inmunologica reactiva con un neo-epltopo N-terminal formado por escision de una protelna por una proteinasa o un neo-epltopo C-terminal formado por escision de una protelna por una proteinasa, cuya pareja de union inmunologica es no reactiva con la protelna intacta a partir de la cual se deriva el epltopo y es no reactiva con una version prolongada de la secuencia del neo-epltopo en la que la secuencia del neo-epltopo se prolonga mas alia del sitio de escision, y medir la extension de la union de los fragmentos de peptidos a dicha pareja de union inmunologica para medir fragmentos de protelna que comprende dicho neo-epltopo, en donde dicha pareja de union inmunologica se une especlficamente a un neo-epltopo constituido por una secuencia de aminoacido N-terminal presente en los peptidos producidos por escision de colageno tipo I, dichos peptidos comprenden una secuencia N-terminal seleccionada del grupo que consiste en:

   Colageno I, alfa 1

   ISVPGP...sec. con num. de ident.:23

   VPGPMG...sec. con num. de ident.:24 PGPMGP...sec. con num. de ident.:25

   FQGPPG...sec. con num. de ident.:27

   KNGDDG...sec. con num. de ident.:28 ARGLPG...sec. con num. de ident.:29

   LDGAKG...sec. con num. de ident.:31

   LPGERG...sec. con num. de ident.:32 ATGAAG...sec. con num. de ident.:67

   VRGEPG...sec. con num. de ident.:33

   PGAKGA...sec. con num. de ident.:34 GIAGAP...sec. con num. de ident.:69

   GGPPGP...sec. con num. de ident.:35

   NSGEPG...sec. con num. de ident.:36 VQGPPG...sec. con num. de ident. :71

   DGVAGP...sec. con num. de ident.:37

   ERGSPG...sec. con num. de ident.:38 RGSPGP...sec. con num. de ident.:74

   LTGSPG...sec. con num. de ident.:39

   QDGRPG...sec. con num. de ident.:40 ARGQAG...sec. con num. de ident.:77

   RGVPGP...sec. con num. de ident.:41

   VGPAGK...sec. con num. de ident.:42 KDGEAG...sec. con num. de ident.:80

   ERGEQG...sec. con num. de ident.:43

   RGEQGP...sec. con num. de ident.:44 QGLPGP...sec. con num. de ident.:83

   PGERGV...sec. con num. de ident.:45

   ANGAPG...sec. con num. de ident.:46 AGLPGP...sec. con num. de ident.:86

   ARGAPG...Sec. con num de ident.:47

   PGDRGE...Sec. con num de ident.:48 FAGPPG...Sec. con num de ident.:75

   AKGDAG...Sec. con num de ident.:49

   PIGNVG...Sec. con num de ident.:50 NVGAPG...Sec. con num de ident.:78

   AAGRVG...Sec. con num de ident.:51

   PPGPAG...Sec. con num de ident.:52 GEVGPP...Sec. con num de ident.:81

   GADGPA...Sec. con num de ident.:53

   GPQGIA...Sec. con num de ident.:54 IAGQRG...Sec. con num de ident.:84

   GQRGVV...Sec. con num de ident.:55

   QRGVVG...Sec. con num de ident.:56 RGVVGL...Sec. con num de ident.:87

   GLPGQR...Sec. con num de ident.:57

   PGLPGP...Sec. con num de ident.:58 EPGKQG...Sec. con num de ident.:90

   PMGPPG...Sec. con num de ident.:59

   MGPPGL...Sec. con num de ident.:60 LAGPPG...Sec. con num de ident.:89

   DKGETG...Sec. con num de ident.:61

   LQGPPG...Sec. con num de ident.:62 PSGASG...Sec. con num de ident.:92

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   SAGAPG...Sec. con num de ident.:63

   RTGDAG...Sec. con num de ident.:64 VGPPGP...Sec. con num de ident.:99

   FDFSF...Sec. con num de ident.:65

   DFSF...Sec. con num de ident.:66 AGQRGV...Sec. con num de ident.:95

   LPGPGG...Sec. con num de ident.:26

   QAGVMG...Sec. con num de ident.:76 VVGLPG...Sec. con num de ident.:98

   SGLDGA...Sec. con num de ident.:30

   PAGERG...Sec. con num de ident.:79 GKQGPS...Sec. con num de ident.:93

   AKGEAG...Sec. con num de ident.:68

   ARGERG...Sec. con num de ident.:82 ARGPAG...Sec. con num de ident.:96

   IAGAPG...Sec. con num de ident.:70

   LTGPIG...Sec. con num de ident.:85 ASGPAG...Sec. con num de ident.:97

   LPGPPG...Sec. con num de ident.:72

   AGPPGA...Sec. con num de ident.:88 GPPGPP...Sec. con num de ident.:100

   AGPKGS...Sec. con num de ident.:73

   ATGFPG...Sec. con num de ident.:91

   GPPGPA...Sec. con num de ident.:94

   en donde dicha pareja de union inmunologica se une especlficamente a un neo-epltopo constituido por una 5cuencia de aminoacidos C-terminal presente en los peptidos que se producen por escision del colageno tipo , dichos peptidos comprenden una secuencia C-terminal que se selecciona del grupo que consiste en:

   Colageno I, alfa 1

   .QLSYGY sec. con num. de dent.:101

   ...EKSTGG sec. con num. de ident.:102

   ...PPGPQG sec. con num. de ident.:103

   .KGHRGF sec. con num. de dent.:104

   ...PSGPRG sec. con num. de ident.:105

   ...APGPQG sec. con num. de ident.:106

   ..APGPAG sec. con num. de

   dent.:107

   ...FPGAVG sec. con num. de ident.:108

   ...SEGPQG sec. con num. de ident.:109

   ..GANGAP sec. con num. de

   dent.:110

   ...ANGAPG sec. con num. de ident.:46

   ...SGPQGP sec. con num. de ident. :112

   .EPGPVG sec. con num. de dent.:113

   ...EPGPTG sec. con num. de ident. :114

   ...RGFPGA sec. con num. de ident. :115

   ..KGPAGE sec. con num. de

   dent.:116

   ...RGSPGP sec. con num. de ident.:74

   ...LPGAKG sec. con num. de ident. :118

   ..AVGPAG sec. con num. de

   dent.:122

   ...PPGARG sec. con num. de ident.:120

   ...PGKAGE sec. con num. de ident. :121

   ..APGPDG sec. con num. de

   dent.:125

   ...PAGPAG sec. con num. de ident.:123

   ...AGPAGE sec. con num. de ident.:124

   ..KDGVRG sec. con num. de

   dent.:128

   ...RGERGF sec. con num. de ident.:126

   ...PAGPRG sec. con num. de ident.:127

   ..PGPAGF sec. con num. de

   dent.:131

   ...PAGPTG sec. con num. de ident.:129

   ...TGARGA sec. con num. de ident.:130

   ..SAGPPG sec. con num. de

   dent.:134

   ...EPGDAG sec. con num. de ident.:132

   ...PAGPPG sec. con num. de ident.:133

   .GEVGPP sec. con num. de dent.:81

   ...ATGFPG sec. con num. de ident.:91

   ...NAGPPG sec. con num. de ident.:136

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   ...PGPQGI sec. con num. de ident.:140

   ...GEKGSP SEQ ID 138 ...GAPGTP sec. con num. de ident.:139

   ...IAGQRG sec. con num. de ident.:84

   ...GPQGIA sec. con num. de ident.:54 ...PQGIAG sec. con num. de ident.:142

   ...GPSGEP sec. con num. de ident.:146

   ...GQRGVV sec. con num. de ident.:55 ...RGERGF sec. con num. de ident.:126

   ...PVGPVG sec. con num. de ident.:149

   ...ERGPPG sec. con num. de ident.:147 ...RGPPGP sec. con num. de ident.:148

   ...EQGPSG sec. con num. de ident.:152

   ...PQGPRG SEQ ID 150 ...HRGFSG sec. con num. de ident. :151

   ...GPPGPP sec. con num. de ident.:100

   ...PRGPPG sec. con num. de ident.:153 ...PPGPRG sec. con num. de ident.:154

   ...PPGPPG sec. con num. de ident. :119

   ...GPPSAG sec. con num. de ident.:156 ...PPSAGF sec. con num. de ident.:157

   ...QMGPRG sec. con num. de ident. :161

   ...PPGPAG sec. con num. de ident.:52 ...TPGPQG sec. con num. de ident.:160

   ...PGADGQ sec. con num. de ident.:164

   ...PGPPGA SEQ ID 162 ...QGIAGQ SEQ ID 163

   ...PPGPKG sec. con num. de ident.:167

   ...AGSPGF sec. con num. de ident.:165 ...LPGPSG sec. con num. de ident.:166

   ...PKGPAG sec. con num. de ident.:170

   ...PGERGA sec. con num. de ident.:168 ...PMGPPG sec. con num. de ident.:59

   ...GPAGRP sec. con num. de ident.:173

   ...PPGPIG sec. con num. de ident.:174 ...SPGEQG sec. con num. de ident.:172

   ...TGDAGP sec. con num. de ident.:175

   Un metodo como se reivindica en la reivindicacion 1, en donde dicha pareja de union inmunologica se une especlficamente a un neo-epltopo constituido por una secuencia de aminoacidos C-terminal presente en los peptidos producidos por escision del colageno tipo I, dichos peptidos comprenden una secuencia C-terminal ...KDGVRG de sec. con num. de ident:128.

   Un metodo in vitro como se reivindica en cualquier reivindicacion anterior, conducido como un metodo de diagnostico o cuantificacion de fibrosis y que comprende asociar una elevacion de dicha medida de fragmentos de protelna que contienen neo-epltopos en dicha muestra de fluido corporal por encima de un nivel normal con la presencia o extension de fibrosis.