CN111705123A - 一种衰老过程中心肌纤维化的生物标志物及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明第一方面涉及一种衰老过程中心肌纤维化的生物标志物，所述生物标志物为甲基化的基质金属蛋白酶9基因。本发明第二方面涉及一种检测如前所述生物标志物的方法，步骤包括：S1、采用EDTA真空抗凝采血管采集待测者的外周静脉血，分离上层血浆，提取血浆白细胞DNA；S2、对所述DNA进行简并代表性亚硫酸盐测序检测，然后对所述测序结果进行亚硫酸氢盐扩增子测序验证；S3、对基质金属蛋白酶9基因位点：chr20:44641083，chr20:44641088和chr20:44639200中C‑G位点的甲基化频率进行高精度分析。本发明的第三方面是提供一种如前所述生物标志物在制备房颤筛查试剂盒中的应用。本发明通过检测样品中MMP9的甲基化频率可以辅助判断待检者在衰老过程中罹患房颤的可能性大小，早期有效地识别发生房颤的高危患者。

Description

一种衰老过程中心肌纤维化的生物标志物及其检测方法和 应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种衰老过程中心肌纤维化的生物标志物及其检测方法和应用。

背景技术

心房颤动(房颤)是临床上最常见的心律失常之一，流行病学研究结果提示：房颤是衰老相关的疾病，其发病率随着年龄的增长而增加。房颤可导致心力衰竭，也是引起缺血性脑卒中的重要原因之一，且与其他原因的缺血性脑卒中相比，房颤导致的缺血性脑卒中致残率及致死率更高，社会危害极大。由此可见：房颤已成为当前老龄化社会面临的严重公共健康问题。目前认为房颤形成的核心机制主要与心房组织结构重构的基础上进而出现电学异常有关，而心肌纤维化在这过程中发挥关键作用。

最近的一系列证据表明，调控表观遗传机制可能是衰老相关基因表达调控的主要方式。DNA甲基化是表观遗传调控中研究得最早，也是最重要的一种修饰方式，它参与了基因/环境间复杂的相互作用，同时也是衰老过程中的标志性事件。富含C-G岛的基因启动子区作为甲基化发生的主要区域，DNA序列中的腺嘌呤或胞嘧啶碱基在DNA甲基化转移酶的催化下与甲基发生共价结合，甲基化水平改变后引起基因转录受到抑制或促进，导致蛋白表达量的改变。另外，DNA甲基化序列是以一种高度稳定的形式存在于细胞中，针对外周血检测相关基因DNA甲基化改变成为研究相关疾病表观遗传学调控机制的重要方法。而DNA甲基化本身就是心肌纤维化维持的重要机制。不同疾病和病理改变中存在不同的DNA甲基化谱，通过识别DNA异常甲基化谱并有效构建特异文库可作为潜在的分子生物标志物用于心肌纤维化的诊断。

基质金属蛋白酶9(MMP9)，是基质金属蛋白酶超家族成员中明胶酶的一种，可分解胞外基质(ECM)并导致基质性质改变和组织重构，是机体中调控结缔组织成形、损伤修复中重要的酶。同时MMP9在房颤患者心房组织中高表达，作为房颤发生的独立因素，并且在心房结构重构和房颤发病中起到重要作用。

由于基因异常甲基化是疾病发生过程的早期事件，识别并构建甲基化谱文库对于房颤早期诊断和预后具有重要的应用价值，尤其是识别外周血中纤维化特异性DNA甲基化谱更是为寻找无创性房颤诊断标志物提供了线索。由于DNA甲基化可以通过外源药物逆转，因而该研究结果也具有潜在的治疗应用前景。

传统的心肌纤维化的监测金标准为心肌组织活检，但由于此类有创操作风险较高，在临床上很少采用。其他检测方法包括血液心肌纤维化标志物检测、心脏超声、磁共振等。其中血液纤维化标志物监测容易受饮食等多种因素影响，特异性低；心脏超声其敏感性和特异性均比较低；磁共振检查结果可靠，但存在费用高昂等缺点。为此，寻找快速、简便、灵敏、特异、经济的诊断方法成为当前衰老相关房颤防治监测工作中的一项重要任务。DNA甲基化改变常常是衰老过程中心肌纤维化的关键性早期改变，如果能够建立合理的多指标的DNA甲基化图谱，在病理改变的早期阶段即采用分子生物学技术识别出这种特异性变化，无疑对实现衰老过程中房颤的预防和诊治都将具有极重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种衰老过程中心肌纤维化的生物标志物及其检测方法和应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

本发明的第一方面是提供一种衰老过程中心肌纤维化的生物标志物，所述生物标志物为甲基化的基质金属蛋白酶9基因。

优选地，所述甲基化位点为基质金属蛋白酶9基因的C-G位点。

优选地，所述基质金属蛋白酶9基因位点为chr20:44641083，chr20:44641088和chr20:44639200。

本发明的第二方面是提供一种检测如前所述生物标志物的方法，步骤包括：

S1、采用EDTA真空抗凝采血管采集待测者的外周静脉血，分离上层血浆，提取血浆白细胞DNA；

S2、对所述DNA进行简并代表性亚硫酸盐测序检测，然后对所述测序结果进行亚硫酸氢盐扩增子测序验证；

S3、对基质金属蛋白酶9基因位点：chr20:44641083，chr20:44641088和chr20:44639200中C-G位点的甲基化频率进行高精度分析。

优选地，提取血浆白细胞DNA后使用NanoDrop检测和琼脂糖凝胶电泳检测，确认所述DNA的质量。

优选地，进行简并代表性亚硫酸盐测序检测后对文库制备中各步骤的产物进行纯化回收，所述纯化方法为磁珠纯化、纯化柱纯化或琼脂糖胶电泳纯化中的一种或多种。

优选地，所述高精度分析为Q-PCR验证甲基化结果。

优选地，所述Q-PCR引物序列为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18。

本发明的第三方面是提供一种如前所述生物标志物在制备房颤筛查试剂盒中的应用。

优选地，所述试剂盒包括简并代表性亚硫酸盐测序检测时连接的甲基化接头序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及亚硫酸氢盐扩增子测序验证时使用的特异性引物序列SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.16。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明通过检测样品中MMP9的甲基化频率可以辅助判断待检者罹患房颤的可能性大小，早期有效地识别发生房颤的高危患者。DNA的异常甲基化早于基因表达改变，在疾病发生过程中是一个较早的分子事件，通过对其进行检测能早期筛查房颤发生的高危人群；相较于目前检测心肌纤维化的方法，外周血提取白细胞检测目标基因甲基化水平作为生物标志物用于衰老过程中房颤发生的预判，具有快速、简便、灵敏、特异、无创、经济等优点，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为不同年龄房颤/非房颤组MMP9基因C-G位点甲基化饼图(n＝80，每组样本数为10)(其中黑色部分代表甲基化比例，白色部分为非甲基化比例；CpG1-10分别代表MMP9上的以下甲基化位点：chr20:44641033；chr20:44641036；chr20:44641042；chr20:44641083；chr20:44641088；chr20:44641101；chr20:44641107；chr20:44641109；chr20:44641136；chr20:44641191)；

图2为各年龄组房颤组及非房颤组MMP9甲基化扩大样本验证(n＝200，每组样本数25)(其中包括启动子在内的三个区域，每个区域展示了4个位点)；

图3为MMP9在各年龄组中的mRNA表达(n＝200，每组样本数为25)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。

实施例1

本实施例的第一方面是提供一种衰老过程中心肌纤维化的生物标志物，所述生物标志物为C-G位点甲基化的基质金属蛋白酶9基因位点：chr20:44641083，chr20:44641088和chr20:44639200。

本实施例的第二方面是提供一种检测如前所述生物标志物的方法，步骤包括：

S1、采用EDTA真空抗凝采血管采集待测者的外周静脉血，分离上层血浆，采用Blood Genomic DNA Mini Kit提取血浆白细胞DNA；

提取血浆白细胞DNA后使用NanoDrop检测和琼脂糖凝胶电泳检测，确认所述DNA的质量；

S2、对所述DNA进行简并代表性亚硫酸盐测序(RRBS)检测，包括：将所述DNA片段化、将所述片段化DNA进行末端修复且3'末端添加碱基A、将所述3'末端添加碱基A的产物连接甲基化接头、将所述连接产物进行PCR扩增、纯化并质检、使用EZ DNA Methylation-Gold试剂盒进行重亚硫酸氢盐转化、使用链霉亲和素标记磁珠将杂交有目标区域DNA的探针捕获下来、使用PCR富集所述捕获的目标区域DNA并在两端加上完整的文库接头序列；

所述甲基化接头序列信息如下，其中胞嘧啶全部是经过甲基化修饰的，P-代表经磷酸化修饰：

Adapter PE1：

ACACTCTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.1)

Adapter PE2：

P-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(SEQ ID NO.2)

使用PCR富集所述捕获的目标区域DNA并在两端加上完整的文库接头序列后，使用Illumina公司通用的建库PCR引物进行第二次PCR扩增，包括一条通用的上游引物和一条带有标签(Index)序列的下游引物，使用高效的PCR扩增酶进行PCR；使用带有标签(Index)序列的引物进行PCR以后，可以将不同来源的文库进行混合，然后上机测序；

所述第二次PCR引物序列信息如下，其中下划线部分的碱基是依据Illumina的官方说明使用的用于区分不同文库的碱基组合：

TrueSeq Universal Primer：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ IDNO.3)

TrueSeq Primer-Index X：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQID NO.4)

进行简并代表性亚硫酸盐测序检测后，为了有效提高建库各步骤中的产物纯度、减少杂质干扰、有利于后续步骤的进行，对文库制备中各步骤的产物进行纯化回收，所述纯化方法为磁珠纯化、纯化柱纯化或琼脂糖胶电泳纯化中的一种或多种；优选地，所述纯化方法为磁珠纯化；

然后对所述测序结果进行亚硫酸氢盐扩增子测序(BSAS)验证；

使用EZ DNA Methylation-GoldTM试剂盒对样本进行亚硫酸盐预处理，并用6对引物进行甲基化PCR扩增，所述引物序列信息如下：

MMP9-TSS-F GGGTTGTTGTTTTGTTGTTTTTAG(SEQ ID NO.5)

MMP9-TSS-R TACCCATTTCTAACCATCACTACTC(SEQ ID NO.6)

TRAF3-TSS-F GTTAGGTTTAGTTAGGTTGGGTGTT(SEQ ID NO.7)

TRAF3-TSS-R TTAATAACACTTTCCTTTCTCCCTC(SEQ ID NO.8)

IKBKG-F TTTTGGTAGAGTTGGGTGGTAGT(SEQ ID NO.9)

IKBKG-R CCCATACTCAATAATATCACTTCTCAA(SEQ ID NO.10)

MMP9-088-F-2 ATAAGAAGTGGGGTTTTTGT(SEQ ID NO.11)

MMP9-088-R-2 CAATTCTTTAATACTATAACACAACCA(SEQ ID NO.12)

MMP9-200-F-2 TGTTAGGGTTATTGTGAGGG(SEQ ID NO.13)

MMP9-200-R-2 CCCAAATCTCTTAAATTTTCCC(SEQ ID NO.14)

TRAF3-F GGGYGTTAGGGTTTTTAGTA(SEQ ID NO.15)

TRAF3-R AAAAAATCCRGACTAAACTACAAC(SEQ ID NO.16)

通过高通量测序平台Illumina Miseq进行测序，并进行数据分析，确定是否存在突变；

S3、对基质金属蛋白酶9基因位点：chr20:44641083，chr20:44641088和chr20:44639200中C-G位点的甲基化频率进行Q-PCR验证甲基化结果；

RNA的抽提是使用Trizol(Life Technologies)法，具体操作按说明书进行；

所述Q-PCR引物序列信息如下：

Forward Primer GGGACGCAGACATCGTCATC(SEQ ID NO.17)

Reverse Primer TCGTCATCGTCGAAATGGGC(SEQ ID NO.18)

本实施例的第三方面是提供一种如前所述生物标志物在制备房颤筛查试剂盒中的应用。

优选地，所述试剂盒包括简并代表性亚硫酸盐测序检测时连接的甲基化接头序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及亚硫酸氢盐扩增子测序验证时使用的特异性引物序列SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.16。

应用实施例1

MMP9启动子区甲基化作为心肌纤维化生物标志物的应用

1、研究方法

首先利用RRBS技术初筛不同年龄组中房颤患者和非房颤差异甲基化位点；然后扩大样本对初筛出的甲基化位点进行质谱法验证，确定衰老过程中房颤患者的甲基化谱的改变。

病例来源于在上海交通大学附属第六人民医院的住院患者。要求：(1)有心电图或者动态心电图依据；(2)获得患者的知情同意；(3)未接受过房颤导管消融或者相关的外科手术；(4)明确的结构性心脏病、冠心病患者以及年龄<18周岁者排除。术前采用EDTA真空抗凝采血管采集静脉血5mL，离心后置-80℃冷冻保存。

第一阶段初筛采用RRBS测序，第二阶段采用BSAS外周血DNA甲基化。采用Sequenom在线设计软件(https：//www.mysequenom.com/Tools)设计MMP9启动子区域的甲基化引物并制成试剂盒，其余的相关基因通过此方法设计相关引物。针对每个CG位点设计多重PCR反应的特异引物和单碱基延伸所用的延伸引物，考虑单个反应的成功率以及多个反应产生的PCR产物大小间的相互影响，选取最佳的引物组合。对于白细胞DNA片段化严重的血清样本，则采用多对引物扩增法。

2、结果

2.1 衰老过程中房颤病人甲基化水平的变化

入选患者包括1)房颤和2)非房颤病人，根据实际分成4个年龄组：a.≤49岁；b.50-64岁；c.65-79岁；d.≥80岁，共8个组。

结果显示，现随着年龄增加，一些原本低甲基化的区域，比如富含CpG岛的区域和启动子区域，DNA甲基化增加；而高甲基化的非CpG岛区域，随着年龄增加甲基化水平降低。而RRBS技术集中覆盖了人类基因组约60％的启动子区域和85％的CpG岛区域。随着年龄增加，甲基化水平整体上略有增加，而在四组中房颤组甲基化水平都一致地低于非房颤组，提示低甲基化修饰与房颤发生可能相关。在房颤组甲基化水平低于非房颤组的差异甲基化位点中，我们发现TNF-α信号通路调控的基因MMP9、TRAF1、SOCS3和TNFAIP3有显著的甲基化变化，其中以MMP9的甲基化变化最为显著(见图1)。随着年龄增加，非房颤组甲基化增加，而房颤组因为某些因素，甲基化水平不但没有增加反而降低，导致MMP9基因表达在房颤组中显著高于对照组。

2.2 甲基化位点的验证

从MMP9整个染色体结构分析，四组中有差异的甲基化主要集中在基因中内含子部分。接下来使用BSAS(Bisulfte amplicon sequencing，BSAS)的方法扩大样本验证了MMP9基因差异甲基化位点，包括其启动子位点chr20:44641083，chr20:44641088区域以及包含位点chr20:44639200的区域。

根据扩大样本用BSAS方法验证的结果，我们可以看到MMP9基因启动子区域，以及包含了chr20:44641083，chr20:44641088以及chr20：44639200位点区域的甲基化水平，房颤组甲基化水平均显著低于对照组(见图2)。

2.3 MMP9表达水平的验证

通过qPCR检测血液中房颤组和非房颤组MMP9 mRNA表达量的变化。非房颤组甲基化增加，而房颤组因为某些因素，甲基化随着年龄没有增加，导致我们可以明显看到在各个年龄组中，房颤组血液中的MMP9 mRNA表达量都高于对照组(见图3)，提示衰老过程中MMP9的表达量升高是通过MMP基因低甲基化所介导的，进而导致心肌纤维化。

综上所述，本发明通过检测样品中MMP9的甲基化频率可以辅助判断待检者罹患房颤的可能性大小，早期有效地识别发生房颤的高危患者。DNA的异常甲基化早于基因表达改变，在疾病发生过程中是一个较早的分子事件，通过对其进行检测能早期筛查房颤发生的高危人群；相较于目前检测心肌纤维化的方法，外周血提取白细胞检测目标基因甲基化水平作为生物标志物用于衰老过程中房颤发生的预判，具有快速、简便、灵敏、特异、无创、经济等优点，具有重要的应用价值。

以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 上海市第六人民医院

上海昂朴生物科技有限公司

<120> 一种衰老过程中心肌纤维化的生物标志物及其检测方法和应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

acactcttcc ctacacgacg ctcttccgat ct 32

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cac 33

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58

<210> 4

<211> 64

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

caagcagaag acggcatacg agataggaat gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60

atct 64

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gggttgttgt tttgttgttt ttag 24

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tacccatttc taaccatcac tactc 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gttaggttta gttaggttgg gtgtt 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ttaataacac tttcctttct ccctc 25

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ttttggtaga gttgggtggt agt 23

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

cccatactca ataatatcac ttctcaa 27

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ataagaagtg gggtttttgt 20

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

caattcttta atactataac acaacca 27

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

tgttagggtt attgtgaggg 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

cccaaatctc ttaaattttc cc 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

gggygttagg gtttttagta 20

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

aaaaaatccr gactaaacta caac 24

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

gggacgcaga catcgtcatc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

tcgtcatcgt cgaaatgggc 20

Claims (10)

1.一种衰老过程中心肌纤维化的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为甲基化的基质金属蛋白酶9基因。

2.根据权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述甲基化位点为基质金属蛋白酶9基因的C-G位点。

3.根据权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述基质金属蛋白酶9基因位点为chr20:44641083，chr20:44641088和chr20:44639200。

4.一种检测如权利要求1-3任一项所述生物标志物的方法，其特征在于，步骤包括：

S1、采用EDTA真空抗凝采血管采集待测者的外周静脉血，分离上层血浆，提取血浆白细胞DNA；

S2、对所述DNA进行简并代表性亚硫酸盐测序检测，然后对所述测序结果进行亚硫酸氢盐扩增子测序验证；

S3、对基质金属蛋白酶9基因位点：chr20:44641083，chr20:44641088和chr20:44639200中C-G位点的甲基化频率进行高精度分析。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，提取血浆白细胞DNA后使用NanoDrop检测和琼脂糖凝胶电泳检测，确认所述DNA的质量。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，进行简并代表性亚硫酸盐测序检测后对文库制备中各步骤的产物进行纯化回收，所述纯化方法为磁珠纯化、纯化柱纯化或琼脂糖胶电泳纯化中的一种或多种。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述高精度分析为Q-PCR验证甲基化结果。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述Q-PCR引物序列为SEQ ID NO.17和SEQID NO.18。

9.一种如权利要求1-3任一项所述生物标志物在制备房颤筛查试剂盒中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括简并代表性亚硫酸盐测序检测时连接的甲基化接头序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及亚硫酸氢盐扩增子测序验证时使用的特异性引物序列SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.16。

Images