EA027858B1 - Средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота и способ его применения - Google Patents
Средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота и способ его применения Download PDFInfo
- Publication number
- EA027858B1 EA027858B1 EA201500615A EA201500615A EA027858B1 EA 027858 B1 EA027858 B1 EA 027858B1 EA 201500615 A EA201500615 A EA 201500615A EA 201500615 A EA201500615 A EA 201500615A EA 027858 B1 EA027858 B1 EA 027858B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- suspension
- agent
- diagnostics
- leukemia
- blood
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к ветеринарии и может быть использована для диагностики лейкоза крупного рогатого скота (КРС). Средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота содержит водорастворимую белковую фракцию клеточной линии почки эмбриона свиньи, контаминированной онкорнавирусами С и D и полученной при культивировании в анаэробных условиях, имеющую молекулярную массу от 75 до 82 кД в количестве 0,49-0,52 мас.% и характеризующуюся наличием пиков при длине волны 214 нм в ультрафиолетовой области спектра, и дополнительно содержит фосфатно-солевой буферный раствор. Способ заключается в отборе крови животного, приготовлении взвеси цитратной крови 0,25-0,5% концентрации, смешивании взвеси со средством для диагностики при соотношении средства к взвеси 1:4-6, выдерживании смеси при температуре 4-8°С в течение 12-15 ч и учете результата реакции по характеру взаимодействия взвеси цитратной крови со средством для диагностики, при этом о наличии лейкоза судят при положительной реакции взвеси цитратной крови со средством. Использование изобретений позволяет расширить спектр диагностических препаратов, сформировать новые подходы к проблеме диагностики лейкоза КРС, быстро и с минимальными затратами проводить диагностику лейкоза КРС при сохранении эффективности диагностических исследований.
Description
Изобретение относится к ветеринарии, в частности к ветеринарной онкологии, и может быть использовано для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Изобретение расширяет арсенал средств заявленного назначения.
Известны средства для диагностики лейкоза крупного рогатого скота и способы диагностики заболевания с использованием этих средств.
В частности, известен набор для серологической диагностики, содержащий антиген вируса лейкоза, разбавитель антигена вируса лейкоза, специфическую преципитирующую сыворотку, солевую смесь агара, разбавитель солевой смеси агара (см. Ы1р://№№№.Ъ1ок.ги/уе1_б1адп).
Набор предназначен для постановки реакции иммунодиффузии, которую проводят в геле агара с целью выявления антител против гликопротеидного антигена вируса лейкоза.
Однако реакция иммунодиффузии (РИД) не позволяет выявить животных-вирусоносителей, титр антител которых недостаточен для их идентификации.
На решение задачи выявления животных-вирусносителей с помощью реакции РИД с использованием данного набора направлен способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота (КРС), заключающийся в использовании инактивированной вакцины против лейкоза КРС, которую вводят трёхкратно с интервалом 14 дней в дозе 2 мл (см. патент РФ № 2264628 по кл. МПК Ο01Ν 33/53, опуб. 20.11.2005). Способ позволяет выявлять животных-вирусоносителей среди серонегативных коров и телок старше пятимесячного возраста. Данный способ заключается в повторном серологическом исследовании в РИД после провокации иммунного ответа путём трёхкратного введения инактивированной вакцины.
Однако любая провокация иммунного ответа приводит к выработке значительного количества антител, что может привести к необратимым изменением организма животных и в, конечном итоге, их гибели.
Известен также набор для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, предназначенный для проведения иммуноферментного анализа (см. там же: 1Шр://\у\у\у.Ъюкги/уе1_Фа8П). Набор содержит 11 компонентов:
компонент № 1 - полистироловый 96-луночный цельный или стрипованный планшет с иммобилизованным в лунках гликопротеидным антигеном (др51) ВЬУ;
компонент № 2 - сыворотка крови крупного рогатого скота, содержащая антитела к др51 ВЬУ (положительный контроль);
компонент № 3 - сыворотка крови крупного рогатого скота, не содержащая антител к др51 ВЬУ (отрицательный контроль);
компонент № 4 - молоко, содержащее антитела к др51 ВЬУ (положительный контроль); компонент № 5 - молоко, не содержащее антител к др51 ВЬУ (отрицательный контроль); компонент № 6 - антивидовой конъюгат (моноклональные антитела к 1§О крупного рогатого скота, меченные пероксидазой);
компонент № 7 - концентрат (х 20) буферного раствора для разведения контрольных и испытуемых проб сывороток крови и конъюгата;
компонент № 8 - концентрат (х 20) промывочного буферного раствора;
компонент № 9 - раствор субстрата (Н202);
компонент № 10 - раствор хромогена (ТМБ);
компонент № 11 - стоп-раствор (0,2 М раствор серной кислоты).
Набор предназначен для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в сыворотках крови и молоке крупного рогатого скота иммуноферментным методом (ИФА) (см. Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота. МСХ РФ, Департамент ветеринарии № 13-72/2130 от 23.08.00).
Известен также способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота с помощью иммуноферментного анализа (см. патент РФ № 2425377 по кл. МПК Ο01Ν 33/487, опубл. 27.07.2011), заключающийся в предварительной перед проведением ИФА инкубации пробы обезжиренного молока или сыворотки крови, что повышает чувствительность ИФА диагностики до 20%.
Иммуноферментный метод обладает значительными преимуществами перед РИД: более высокой чувствительностью и специфичностью, возможностью автоматизации процесса и сокращения времени анализа.
Однако набор и метод проведения ИФА с его помощью не позволяет выявлять антитела, которые могут быть нейтрализованы вирусом лейкоза в сыворотке крови и молоке инфицированных животных.
Известны средства и методы диагностики лейкоза КРС путём постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР), которую проводят в случаях, когда серологическими методами животные не выявляются, например, когда инфекция протекает атипично - без образования антител.
В частности, известен способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота (см. патент РФ № 2445370 по кл. МПК С12Ц 1/68, опубл. 20.03.2012), заключающийся в использовании олигонуклеотидных праймеров определённой структуры для выявления фрагмента гена ро1 повируса лейкоза КРС.
Однако проведение ПЦР является очень дорогостоящим методом. Более того, эффективность ПЦР
- 1 027858 составляет от 58,3 до 72,6% (см, например, Двоеглазов Н.Г. Оценка эффективности различных методов диагностики инфекции вируса лейкоза крупного рогатого скота// Материалы диссертации, - Новосибирск. - 2009 г, опубликована на сайте НЦр://теФса1-Ф55.сот/уе1ег1паг1уа/о15епка-еГГек11Упо511-га/НсНпуНте1обоу-б1адпо8Йк1-1п£ек18Й-у1ги8а-1еуко7а-кгирподо-года1одо-8ко1а#1Х773Ар0уЯКх).
Наиболее близким к заявляемому является средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, содержащее белковую фракцию вируса лейкоза (гликопротеидный антиген §р51), используемое для проведения иммуноферментного анализа (см. НЦр://иии.Ь|ок.ги/уе1_Фадп).
Однако данный белковый компонент используется только в наборе для проведения иммуноферментного анализа. Сам набор многокомпонентен, а способ диагностики с использованием этого набора длителен и трудоёмок в реализации.
Изобретение направлено на решение задачи расширения спектра диагностических препаратов и формирования новых подходов к проблеме диагностики лейкоза крупного рогатого скота.
Достигаемый при этом технический результат заключается в создании простого и недорогого средства для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, позволяющего быстро и с минимальными затратами проводить диагностику лейкоза КРС при сохранении эффективности диагностических исследований.
Указанный технический результат в части самого средства достигается тем, что средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, содержащее водорастворимую белковую фракцию, согласно изобретению, в качестве водорастворимой белковой фракции содержит белковую фракцию клеточной линии почки эмбриона свиньи, контаминированной онкорнавирусами С и И и полученной при культивировании в анаэробных условиях, имеющую молекулярную массу от 75 до 82 кД и характеризующуюся наличием пиков при длине волны 214 нм в ультрафиолетовой области спектра, и дополнительно содержит фосфатно-солевой буферный раствор при следующем соотношении компонентов, мас.%: водорастворимая белковая фракция клеточной линии почки эмбриона свиньи СПЭВ, контаминированной онкорнавирусами С и И, имеющая молекулярную массу 75-82 кДа - 0,49-0,52%; фосфатно-солевой буферный раствор - остальное.
Указанный технический результат в части способа применения этого средства достигается тем, что способ заключается в отборе крови животного, приготовлении взвеси цитратной крови 0,25-0,5% концентрации, смешивании взвеси со средством для диагностики при соотношении средства к взвеси 1:4-6, выдерживании смеси при температуре 4-8°С в течение 12-15 ч и учете результата реакции по характеру взаимодействия взвеси цитратной крови со средством для диагностики, при этом о наличии лейкоза судят при положительной реакции взвеси цитратной крови со средством, представляющим собой водорастворимую белковую фракцию клеточной линии почки эмбриона свиньи, контаминированной онкорнавирусами С и И и полученной при культивировании в анаэробных условиях, имеющую молекулярную массу от 75 до 82 кД и характеризующуюся наличием пиков при длине волны 214 нм в ультрафиолетовой области спектра, и фосфатно-солевой буферный раствор при следующем соотношении компонентов, мас.%: белковая фракция - 0,49-0,52 мас.% и фосфатно-солевой буферный раствор - остальное.
Указанные признаки являются существенными и достаточными для получения требуемого технического результата.
В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано средства для диагностики лейкоза крупного рогатого скота на основе водорастворимой белковой фракции клеточной линии почки эмбриона свиньи, контаминированной онкорнавирусами С и И и полученной при культивировании в анаэробных условиях, имеющей молекулярную массу от 75 до 82 кД и характеризующейся наличием пиков при длине волны 214 нм, содержащего дополнительно фосфатно-солевой буферный раствор при определённых соотношениях компонентов.
Также неизвестны способы диагностики лейкоза КРС, основанные на агглютинирующей способности взаимодействия двух компонентов: первого - это диагностикума, выполненного на основе водорастворимого белкового компонента из клеточной линии почки эмбриона свиньи, контаминированной онкорновирусами С и Д, (а не эритроцитарного диагностикума, как это общепринято в постановке реакции агглютинации), а в качестве второго компонента выступает кровь больного животного (взвесь цитратной крови определённой концентрации).
Исследования эффективности существующих методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота (РИД, ИФА и ПЦР) показали, что ни один из этих методов не позволяет полностью выявлять всех животных-вирусоносителей (см, например, 1Шр://\у\у\у.рапФа.ги/465284).
Эффективность РИД составляет 76,1%, ИФА - 83,3%, ПЦР - от 58,3 до 72,6%. В настоящее время для достижения наилучшего диагностического эффекта исследователями предлагается комбинированное использование серологических и генно-молекулярных методов, что увеличивает время проведения и повышает стоимость диагностических исследований.
Известно использование надосадочной жидкости, полученной при культивировании клеток СПЭВ, для экспресс-диагностики онкологических заболеваний человека (см. патент РФ № 2383891 по кл. МПК Ο01Ν33/49, опубл. 10.03.2010).
Однако применение данного способа, в котором в качестве реагента используют надосадочную
- 2 027858 жидкость, полученную при культивировании клеток СПЭВ, для диагностики лейкоза крупного рогатого скота не дало никакого эффекта: реакции взаимодействия как отмытых эритроцитов, так и взвеси цитратной крови с надосадочной жидкостью не было.
Надосадочная жидкость является многокомпонентной структурой, в которой присутствуют и липиды, и полисахариды, и белок.
Именно поэтому была поставлена задача выявления такой белковой фракции, которая взаимодействовала бы (вступала в реакцию агглютинации) с кровью больного животного (эритроцитами - отмытыми и неотмытыми).
В ходе исследований были получены результаты взаимодействия 0,49-0,52% фосфатно-солевого буферного раствора белковой фракции с молекулярной массой 75-82 кДа, выделенной из надосадочной жидкости клеточной линии СПЭВ, контаминированной онкорновирусами С и Д, только с неотмытыми эритроцитами (т.е. со взвесью цитратной крови, причём определённой концентрации). При этом, полученные результаты совпадали с результатами исследований крови одних и тех-же животных в РИД, ИФА и ПЦР.
Таким образом, авторами найден новый подход к диагностике лейкоза КРС путём использования реакции взаимодействия взвеси цитратной крови (неотмытых эритроцитов) инфицированных животных с белковой фракции из клеточной линии СПЭВ при постановке диагноза.
Т.е. наряду с существующими методами диагностики лейкоза КРС (проведением серологических и генно-молекулярных исследований) авторами предложен новый подход к решению проблемы диагностики лейкоза КРС - определение инфицированности животных вирусом лейкоза по агглютинирующей способности эритроцитов цитратной крови с белковым компонентом определённой молекулярной массы, выделенным из надосадочной жидкости клеточной линии СПЭВ, контаминированной онкорновирусами С и Д.
Сказанное позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию изобретательский уровень.
Изобретение иллюстрируется фиг. 1, на котором представлен результат жидкостной хроматографии высокого давления (НРЬС).
Средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота готовят следующим образом.
Культуру клеток СПЭВ, контаминированную онкорновирусами С и Д, засевают на ростовую питательную среду и осуществляют культивирование при 37°С в течение 3-4 суток до формирования монослоя.
Затем ростовую среду сливают и добавляют раствор Версена с трипсином, который через 3-5 мин сливают и добавляют снова ростовую питательную среду.
Осуществляют подсчёт дезинтегрированных клеток и доводят количество клеток в 1 мл среды до 100-120 тысяч.
Эту суспензию клеток помещают в стерильные пробирки и создают анаэробные условия (соотношение питательной среды к воздушной фазе 1:5).
Пробирки помещают в термостат и осуществляют культивирование также при 37°С в течение 3-4 суток до формирования монослоя в этих пробирках.
Ростовую среду сливают и добавляют в каждую пробирку поддерживающую среду.
Помещают пробирки в термостат при 37°С. Через 16-18 ч их просматривают и отбирают те пробирки, в которых произошло разрушение монослоя.
Пробирки с разрушенным монослоем однократно замораживают и оттаивают, а остальные пробирки выбраковывают. В результате получают суспензию из оттаявших разрушенных клеток СПЭВ, контаминированных онкорнавирусами С и Д.
Для исключения артефактов по неспецифическому разрушению монослоя клеток и накопления большего объёма суспензии для получения диагностического средства полученную суспензию из оттаявших разрушенных клеток СПЭВ вносят в следующую партию пробирок с монослоем и поддерживающей средой, выращенных в аналогично описанных выше условиях, из расчёта 20% суспензии и 80% поддерживающей среды с монослоем.
Через сутки пробирки с разрушенным монослоем клеток отбирают. Процедуру повторяют несколько раз до появления 90% количества разрушенных клеток в одной партии пробирок.
Суспензию клеток с разрушенным монослоем замораживают и оттаивают 2-3 раза, центрифугируют в течение 30 мин со скоростью 3000 об/мин и отбирают надосадочную жидкость.
Затем надосадочную жидкость осаждают солевым раствором (например, сульфатом аммония) в количестве 60% от насыщения, центрифугируют при 4500 об/мин в течение 20 мин. Надосадок удаляют, а осадок перерастворяют в минимальном объёме 0,01М фосфатно-солевого буферного раствора при рй 7,4. Диализуют при помощи диализной мембраны с диаметром пор 3500 Да в 0,01М растворе фосфатносолевого буфера при рН 7,4 в течение 24 ч. После чего определяют концентрацию белка общепринятыми методами.
Для определения молекулярной массы полученного белка проводили жидкостную хроматографию высокого давления (НРЬС), в частности на жидкостном хроматографе Стайер, с использованием спек- 3 027858 трофотометрического детектора А214 (длина волны 214 нм). Для разделения использовали колонку Вю8ер-8ЕС-8 2000 5 мкм 145А, 300x7,8 мм. В качестве элюента применяли 0,01М фосфатно-солевой буфер, скорость потока составляла 1 мл в минуту.
В качестве стандартов использовали бычий сывороточный альбумин с молекулярной массой 64-70 кДа, лактоферрин с молекулярной массой 75-80 кДа и папаин с молекулярной массой 20 кДа.
Пример 1 приготовления средства для диагностики лейкоза КРС
Берут культуру клеток СПЭВ, контаминированную онкорновирусами С и Д, в концентрации 100120 тысяч клеток в 1 мл ростовой питательной среды, засевают культуру на матрасики объёмом 50 мл на ростовую питательную среду Игла с добавлением 10% аллогенной сыворотки в количестве 10 мл и осуществляют культивирование при 37°С в течение 3-4 суток до формирования монослоя.
Затем ростовую среду сливают и добавляют раствор Версена с трипсином в соотношении 1:1 в количестве 3-5 мл, которую через 3-5 мин сливают и снова добавляют ростовую питательную среду Игла с 10% аллогенной сывороткой.
Матрасики встряхивают для снятия монослоя, осуществляют подсчёт дезинтегрированных клеток и доводят (путём добавления той же ростовой среды) количество клеток в 1 мл среды до концентрации 100-120 тысяч клеток в 1 мл среды.
Эту суспензию клеток в количестве 1 мл помещают в 10 стерильных пробирок Флоринского объёмом 5 мл по 1 мл в каждую и создают анаэробные условия (соотношение суспензии к воздушной фазе 1:5).
Пробирки помещают в термостат и осуществляют культивирование также при 37°С в течение 3-4 суток до формирования монослоя.
Ростовую среду сливают и добавляют в каждую пробирку по 1 мл поддерживающей среды Игла. Помещают пробирки в термостат при 37°С, через 16-18 ч их просматривают и отбирают те пробирки, в которых произошло разрушение монослоя - 2 пробирки. Остальные 8 пробирок выбраковывают.
Отобранные 2 пробирки с разрушенным монослоем однократно замораживают и оттаивают, в результате чего получают суспензию из оттаявших разрушенных клеток СПЭВ, контаминированных онкорнавирусами С и Д, в количестве 2 мл.
Полученную суспензию из оттаявших разрушенных клеток СПЭВ вносят в следующую партию из 10 пробирок с монослоем и поддерживающей средой, выращенных в аналогично описанных выше условиях, из расчёта 0,2 мл суспензии и 0,8 мл среды.
Через 16-18 ч пробирки с разрушенным монослоем клеток снова отбирают. Процедуру накопления большего объёма суспензии повторяют несколько раз до появления 90% количества разрушенных клеток в одной партии пробирок.
Окончательно берут 120 пробирок, в каждую из которых вносят по 0,2 мл суспензии и 0,8 мл среды с монослоем. В итоге получают 100 мл суспензии.
Суспензию клеток с разрушенным монослоем замораживают и оттаивают 2-3 раза, затем центрифугируют в течение 30 мин со скоростью 3000 об/мин и отбирают надосадочную жидкость.
Берут 100 мл надосадочной жидкости, добавляют 42 г сульфата аммония для осаждения белка, центрифугируют при 4500 об/мин, в течение 20 мин. Надосадок удаляют, а осадок перерастворяют в 1 мл 0,01М раствора фосфатно-солевого буфера при рй 7,4. Диализуют при помощи диализной мембраны с диаметром пор 3500 Да в 0,01М растворе фосфатно-солевого буфера при рН 7,4 в течение 24 ч, после чего определяют концентрацию белка методом Лоури на биохимическом анализаторе 81а1Рах 3300. Она составляла 5 мг/мл.
Для обоснования граничных значений концентрации белка был проведён ряд экспериментов, аналогично описанному в примере 1. Во всех случаях концентрация белка была в пределах от 4,9 до 5,2 мг/мл.
Результаты НРЬС - хроматографии показали (см. фиг. 1), что основные белки (пики 1 и 2) имели молекулярную массу от 75 до 82 кДа и составляли 93 % от всей массы входящих в надосадочную жидкость белков.
В табл. 1 представлен результат жидкостной хроматографии.
Таблица 1
| № п/п | Время, мин | Высота, тли | Площадь, тАи*сек | Отношение каждого пика к общей площади пиков, А, % | Молекулярная масса пиков |
| 1. | 11,36 | 58,44 | 5029,95 | 93,18 | 75-82 кДа |
| 2. | 16,04 | 0,03 | 0,02 | 0,00 | 15-20 кДа |
| 3. | 21,44 | 4,38 | 367,99 | 6,82 | 10 кДа и менее |
Способ применения средства осуществляется следующим образом.
В пробирки со стабилизатором (лимонно-кислым натрием или гепарином) отбирают 2-5 мл крови от одного животного.
- 4 027858
Из цитратной крови готовят 0,25-0,5% взвеси на физиологическом растворе.
Постановку реакции осуществляют на специальных планшетах с лунками. Ряды лунок заполняют 0,25-0,5% взвесями цитратной крови. Одни из рядов лунок с разными концентрациями взвесей цитратной крови заполняют физраствором в каждой лунке (контроль), а в другие ряды с теми же разными концентрациями взвесей добавляют средство для диагностики лейкоза КРС, полученное по примеру 1 данного изобретения, в том же количестве, как и физраствора.
При этом, соотношение средства к взвеси (а также физраствора к взвеси) выбирают из условия: одна часть средства и четыре-шесть частей взвеси.
Выдерживают эти смеси при температуре 4-8°С в течение 12-15 ч, после чего производят учёт реакции.
За положительный результат реакции принимают наличие осадка в виде зонтика с неровными краями по всей поверхности лунки.
За отрицательный результат реакции принимают наличие осадка в виде пуговки или точки на дне лунки.
Концентрация взвеси цитратной крови (0,25-0,5%), соотношение вводимого средства к цитратной крови (1:4-6), а также температурный режим (4-8°С), при котором выдерживают смесь в течение 12-15 ч, были подобраны экспериментальным путём.
Так, при концентрации ниже 0,25% и количестве средства для диагностики менее одной части реакция с цитратной кровью практически отсутствовала, а при концентрации выше 0,5% и количестве средства более одной части реакции были не выражены, трудно учитывались.
Температурный режим, при котором происходило взаимодействие средства со взвесями цитратной крови, подбирался также экспериментально. Было апробировано 3 режима: при комнатной температуре (22°С), при 37°С и 4-8°С. При комнатной температуре и при 37°С реакции были плохо выражены, трудно учитывались.
Пример осуществления способа 2
В пробирки со стабилизатором (лимонно-кислым натрием или гепарином) отбирают 2-5 мл крови от одного животного.
Из цитратной крови готовят 0,25-0,5% взвесь на физиологическом растворе. Ставят реакцию на планшетах с лунками.
Ряды лунок заполняют 0,25-0,5% взвесями цитратной крови, которые берут в количестве 0,5 мл в каждой лунке: ряд лунок заполняют взвесью 0,25% концентрации, другой - 0,5% концентрации и т.д.
Одни из рядов лунок с разными концентрациями взвесей цитратной крови заполняют физраствором в количестве по 0,1 мл в каждой лунке (контроль), а в другие ряды с теми же концентрациями взвесей добавляют средство для диагностики лейкоза КРС, полученное по примеру 1 данного изобретения, также в количестве 0,1 мл.
Соотношение средства к взвеси в данном примере составляет 1:5.
Выдерживают все смеси при температуре 4-8°С в течение 12-15, после чего производят учёт реакции.
Результат реакции - положительный (наблюдалось наличие осадка в виде зонтика по всей поверхности лунки).
Аналогично описанному в примере 2 было исследовано ещё 50 проб крови животных, из них 32 пробы были положительными, а 18 отрицательными.
Дополнительно был проведён эксперимент, аналогично описанному в примере 2, но с отмытыми эритроцитами, приготовленными общепринятым методом из цитратной крови животных. Способ проводился при тех же концентрациях и режимах как в примере 2.
Было исследовано также 50 проб. Положительных результатов при использовании отмытых эритроцитов получено не было. Все результаты были отрицательными и не совпадали с общеизвестными методами.
Была произведена сравнительная оценка эффективности заявляемого способа диагностики лейкоза крупного рогатого скота и тестов РИД, ИФА, ПЦР при диагностике лейкоза крупного рогатого скота.
Исследования проводились в одном из неблагополучных хозяйств на коровах 3-х летнего возраста. В эксперимент были отобраны 10 коров, инфицированных вирусом лейкоза КРС, которые одновременно реагировали положительно в РИД, ИФА и ПЦР и 10 голов животных, не реагирующих одновременно ни в одной из указанных реакций.
Все исследования были выполнены в двукратной повторности с целью подтверждения совпадения результатов исследования и выявления возможных ошибок. Полученные результаты представлены в табл. 2.
- 5 027858
Таблица 2
| Группы исследуемых животных | Наименование реакции и характер реакции | |||
| РИД | ИФА | ПЦР | Заявляемый способ | |
| Группа 1 (10 голов) | + | + | + | + |
| Группа 2 (10 голов) | - | - | - | - |
Из табл. 2 следует, что заявляемый способ позволяет эффективно выявлять инфицированных животных и совпадает с результатами всех общепринятых методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота, что доказывает специфичность заявляемого средства.
Таким образом, заявляемое изобретение решает задачу расширения спектра диагностических препаратов в отношении лейкоза крупного рогатого скота. Средство позволяет быстро и с минимальными затратами проводить диагностику лейкоза КРС при сохранении эффективности диагностических исследований.
Claims (2)
1. Средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, содержащее водорастворимую белковую фракцию клеточной линии почки эмбриона свиньи (СПЭВ), контаминированной онкорнавирусами С и Ό и полученной при культивировании в анаэробных условиях, причём указанная фракция имеет молекулярную массу от 75 до 82 кД и характеризуется наличием пиков при длине волны 214 нм в ультрафиолетовой области спектра, и фосфатно-солевой буферный раствор при следующем соотношении компонентов, мас.%: белковая фракция СПЭВ - 0,49-0,52%; фосфатно-солевой буферный раствор - остальное.
2. Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота, включающий отбор крови, приготовление 0,25-0,5% взвеси цитратной крови, смешивание взвеси со средством по п.1 при соотношении средства к взвеси 1:4-6, выдерживание при температуре 4-8°С в течение 12-15 ч и определение характера взаимодействия взвеси цитратной крови со средством, причём о наличии лейкоза судят по наличию осадка в виде зонтика с неровными краями.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014141177/15A RU2560684C1 (ru) | 2014-10-13 | 2014-10-13 | Средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота и способ его применения |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201500615A1 EA201500615A1 (ru) | 2016-04-29 |
| EA027858B1 true EA027858B1 (ru) | 2017-09-29 |
Family
ID=53880783
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201500615A EA027858B1 (ru) | 2014-10-13 | 2015-07-07 | Средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота и способ его применения |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA027858B1 (ru) |
| RU (1) | RU2560684C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108335335A (zh) * | 2018-02-11 | 2018-07-27 | 北京大学深圳研究生院 | 一种基于增强图变换的点云属性压缩方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023048596A1 (ru) * | 2021-09-22 | 2023-03-30 | Владислав Николаевич ЛАСКАВЫЙ | Композиция для поддержания нормального состояния гомеостаза и препарат на её основе |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1652338A1 (ru) * | 1989-06-05 | 1991-05-30 | Институт биохимии АН ЛитССР | Штамм культивируемых клеток почки эмбриона коровы дл культивировани вируса лейкоза крупного рогатого скота |
| KR20080010771A (ko) * | 2006-07-28 | 2008-01-31 | 대한민국(관리부서 : 농림부 국립수의과학검역원) | 소 백혈병 바이러스의 유전자 재조합 곤충세포 발현 단백질및 이를 이용한 소 백혈병 진단 방법 |
| RU2377962C1 (ru) * | 2008-06-10 | 2010-01-10 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко РАСХН(ВИЭВ) | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2282854C1 (ru) * | 2004-12-30 | 2006-08-27 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота |
| RU2379683C1 (ru) * | 2008-06-04 | 2010-01-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Сибирского отделения Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИБТЖ СО Россельхозакадемии) | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота |
| RU2425377C1 (ru) * | 2010-01-11 | 2011-07-27 | Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана" | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота |
-
2014
- 2014-10-13 RU RU2014141177/15A patent/RU2560684C1/ru not_active IP Right Cessation
-
2015
- 2015-07-07 EA EA201500615A patent/EA027858B1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1652338A1 (ru) * | 1989-06-05 | 1991-05-30 | Институт биохимии АН ЛитССР | Штамм культивируемых клеток почки эмбриона коровы дл культивировани вируса лейкоза крупного рогатого скота |
| KR20080010771A (ko) * | 2006-07-28 | 2008-01-31 | 대한민국(관리부서 : 농림부 국립수의과학검역원) | 소 백혈병 바이러스의 유전자 재조합 곤충세포 발현 단백질및 이를 이용한 소 백혈병 진단 방법 |
| RU2377962C1 (ru) * | 2008-06-10 | 2010-01-10 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко РАСХН(ВИЭВ) | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| БОРОВИКОВ С.Н. и др. Получение стандартных антигенов для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Материалы Республиканской научно-теоретической конференции "Сейфуллинские чтения-9: новый вектор развития высшего образования и науки", посвященной дню Первого Президента Республики Казахстан. 2013, т. 1, ч. 2, с. 216-217. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108335335A (zh) * | 2018-02-11 | 2018-07-27 | 北京大学深圳研究生院 | 一种基于增强图变换的点云属性压缩方法 |
| CN108335335B (zh) * | 2018-02-11 | 2019-06-21 | 北京大学深圳研究生院 | 一种基于增强图变换的点云属性压缩方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA201500615A1 (ru) | 2016-04-29 |
| RU2560684C1 (ru) | 2015-08-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101581726B (zh) | 新一代布鲁氏菌病抗体竞争酶联免疫吸附试验检测试剂盒 | |
| CN101592661A (zh) | 布鲁氏菌病抗体竞争酶联免疫吸附试验检测试剂盒 | |
| CN101592660B (zh) | 布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验奶液抗体检测试剂盒 | |
| CN101799470A (zh) | 布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒 | |
| RU2560684C1 (ru) | Средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота и способ его применения | |
| RU2377308C1 (ru) | Диагностикум псевдотуберкулезный эритроцитарный моноклональный | |
| RU2425377C1 (ru) | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота | |
| US20230078548A1 (en) | Method for evaluation of viability of viruses with lymphotropism properties | |
| CN108948185B (zh) | 蒜氨酸抗原及其免疫应答获得的家兔蒜氨酸抗体 | |
| RU2703282C1 (ru) | Способ получения диагностикума для определения токсина холерного вибриона, выделенного из объектов окружающей среды | |
| CN105759054A (zh) | 一种用于检测牛布鲁菌病的elispot检测试剂盒 | |
| RU2530627C2 (ru) | Экспресс-способ определения холестерина в иммунных комплексах | |
| RU2410699C1 (ru) | Способ получения диагностикума эритроцитарного сибиреязвенного антигенного для обнаружения антител к протективному антигену | |
| RU2490647C2 (ru) | Способ дифференциальной диагностики бруцеллеза | |
| RU2640192C1 (ru) | Тест-система ИФА для серологической диагностики нодулярного дерматита крупного рогатого скота - Dermatitis nodularis bovum | |
| SU1673973A1 (ru) | Способ диагностики заболеваний растений, вызванных РSеUDомоNаS SYRINGae 1у серогруппы | |
| RU2535982C1 (ru) | Штамм культивируемых гибридных клеток животного mus musculus l. cchfv vd-1-продуцент моноклонального антитела 4g4/b6 к вирусу крым-конго геморрагической лихорадки | |
| RU2769578C1 (ru) | Способ получения флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума для выявления возбудителей риккетсиозов и коксиеллезов, флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум и его применение | |
| RU2805871C1 (ru) | Способ получения диагностикума эритроцитарного сибиреязвенного антигенного сухого | |
| RU2741239C1 (ru) | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота | |
| RU2528869C1 (ru) | ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО MUS MUSCULUS L. CCHFV Vd-3-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА 3H6/F2 К ВИРУСУ КРЫМ-КОНГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ | |
| CN103814296B (zh) | 人类血液和血液制品中非典型抗体的鉴定 | |
| Nuralieva et al. | Assessment of the significance of immunoenzyme test-system for determining antiendotoxic immunity against the endotoxin of gram negative bacteria | |
| RU2130615C1 (ru) | Способ экспресс-диагностики туберкулеза на основе реакции латекс-агглютинации | |
| RU2528868C1 (ru) | ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО MUS MUSCULUS L. CCHFV Vd-2-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА 1E2/E5 К ВИРУСУ КРЫМ-КОНГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC4A | Registration of transfer of a eurasian patent by assignment | ||
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): TJ TM |