KR20080010771A - 소 백혈병 바이러스의 유전자 재조합 곤충세포 발현 단백질및 이를 이용한 소 백혈병 진단 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 국내 분리 소 백혈병(Bovine enzootic leukosis) 바이러스의 외피당단백질의 gp51 및 gp30 유전자를 클로닝하고 그 염기서열을 분석한 다음 곤충세포에서 발현시켜 제조한 재조합 발현 단백질 및 이를 이용하여 소 백혈병을 진단하는 방법에 관한 것이다.
소 백혈병, 재조합 발현단백질, 소 백혈병 진단방법
Description
도 1은 본 발명에 의한 소 백혈병 곤충세포 재조합 발현 단백질을 이용하는 소 백혈병 진단방법을 보여주는 순서도이다.
도 2는 소 백혈병 바이러스의 외피당단백질 gp51 및 gp30 유전자 및 클로닝 부위를 보여주는 모식도이다.
도 3은 소 백혈병 바이러스의 외피당단백질 gp51 및 gp30 유전자가 클로닝된 베큘로바이러스의 발현 벡터 작성 모식도이다.
도 4는 본 발명에서 사용한 재조합 단백질의 유전자 염기서열과 아미노산 서열로서, 소 백혈병 바이러스의 gp51(아미노산 :1∼268) 및 gp30(아미노산 :1∼109)의 염기서열과 아미노산 서열을 보여준다.
도 5는 본 발명에서 사용한 재조합 바이러스를 곤충세포에 감염시킨 후 발현 항원을 양성 소혈청으로 검사한 곤충세포의 형광현미경 사진이다.
[A : 정상 곤충세포, B : 발현한 곤충세포를 이용한 사진 (양성)]
도 6은 본 발명에서 사용한 재조합 바이러스를 곤충세포에 감염시킨 후 나타 난 곤충세포의 세포 변성 사진이다.
도 7은 발현 재조합 단백질의 경시별 발현 상태를 분석한 그래프이다.
도 8은 발현 재조합 단백질의 한천겔면역침강반응(AGID) 결과를 보여주는 사진이다.
[Ab+ : 소 백혈병 강양성 항체
+ : FLK 세포를 이용한 AGID 양성 항원
1 : 재조합 외피당단백질 gp51을 30배 농축시킨 항원
2 : 재조합 외피당단백질 gp51+gp30을 30배 농축시킨 항원
3 : 재조합 외피당단백질 gp51+gp30을 125배 농축시킨 항원]
도 9는 발현 재조합 단백질을 이용하여 자연감염송아지의 항체를 효소면역반응(ELISA)으로 검사한 결과를 보여주는 그림이다.
본 발명은 국내 분리 소 백혈병(Bovine enzootic leukosis) 바이러스의 외피당단백질 유전자인 gp51 및 gp30 유전자를 클로닝하고 그 염기서열을 분석한 다음 곤충세포에서 발현시켜 제조한 재조합 발현 단백질 및 이를 이용하여 소 백혈병을 진단하는 방법에 관한 것이다.
소 백혈병은 국제무역사무국의 리스트 B(List B) 질병으로 짧은 초기 바이러 스혈증과 긴 잠복기가 특징이며 일반적으로 B 림프구에 감염되어 혈액을 통해서 전파된다. 감염된 소의 1/3 정도는 지속적인 B 림프구 증가증을 보이고, 극히 일부 림프육종을 보인다. 대부분 감염된 소는 소 백혈병 바이러스의 외피 당단백질에 대한 지속적인 항체반응을 보이고, 림프구내에 프로바이러스(provirus)를 갖는다. 병인체인 소 백혈병 바이러스는 미생물 분류학적으로 레트로 바이러스과(Family Retroviridae), 델타 레트로 바이러스속(Genus Deltaretrovirus)에 속한다.
소 백혈병의 구조단백질은 대부분 면역원성을 지닌다. 비리온의 구조를 형성하는 Gag 단백질은 감염 초기 단계에서 중요한 역할을 하는 것으로 분자 무게에 따라서 p24, p15, p12 및 p10으로 분류되고, 여기서 p24는 중요 캡시드 구성요소로 항원 결합부위가 있으며 단클론항체에 의해 검출 가능하다. 외피 단백질은 세포의 수용체에 의해서 인식이 되고 세포 트리포지움, 바이러스의 방해현상(interference), 세포 융합과 관계되는 것으로 표면 구조 단백질인 gp51과 세포막 단백질인 gp30으로 구성된다. gp51과 gp30은 세포 융합에 있어서 필수적인 구조로 공통된 전구체인 gp72의 글리코실화와 단백질 가수 분해 분할(proteolytic cleavage)에 의해 형성된다. gp51에는 8개의 항원 결정기가 있는데 이중 F, G 및 H는 바이러스의 생물학적 활성과 관계되고 바이러스 중화, 합포체 형성 억제와 관계되며, 세포 수용체와 결합하는 도메인이 있어 새로 감염된 숙주에 면역반응을 일으키는 최초의 바이러스 항원이다. gp30은 세포막에 gp51과 함께 고정시키는 역할을 하고 바이러스와 세포 융합을 매개한다. 소 백혈병 바이러스의 숙주세포에서의 감염은 표면 당단백질이 세포표면 수용체에 비리온과 결합하도록 중개하고 세포막 단 백질이 바이러스와 세포의 막 융합을 유도하는데에서 시작된다.
일반적으로 행해지는 본 질병의 진단 방법으로는 혈청학적 진단법으로 한천겔면역침강반응(Aagr gel immunidiffusion; AGID), 효소면역반응(ELISA) 및 항원검출을 위한 PCR법이 있다. 한천겔면역침강반응은 외피당단백질 중 gp51에 대한 항체를 검출하는 것으로서 p24를 이용하는 경우는 민감성이 떨어지는 단점이 있다.
또한 한천겔면역침강반응(AGID)은 소 백혈병의 구조단백질 중에서 gp51과 관계되는 것으로 양성 항원은 소 백혈병 바이러스가 자연감염된 FLK 세포에 소 백혈병 바이러스를 생산하여 그 상층액을 정제 및 농축하여 사용한다. 그러나, 정제 및 농축에 있어 많은 시간이 소요되고 다른 바이러스의 감염이 용이한 단점이 있다.
효소면역반응은 한천겔면역침강반응 보다 민감하고 특이성이 더 높은 것으로 p24, gp51 및 gp30에 대한 항체를 검출할 수 있다. 소 백혈병에 대한 진단 효율을 높이기 위하여 p24 및 gp51을 대장균이나 베큘로바이러스 등에서 발현시켜 효소면역반응에 적용하는 방법들이 개발되고 있다.
이에 본 발명자들은 국내 분리 소 백혈병 바이러스의 외피당단백질 중에서 gp51 전체와 세포막 윗부분인 gp30 일부를 베큘로바이러스에서 동시에 발현시키고, 곤충 세포 상층액에 분비되도록 하여 정제 및 농축에 유용하도록 하여, 한천겔면역침강반응의 진단항원으로서 소 백혈병을 진단할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 외피당단백질 중에서 gp51 전체와 세포막 윗부분인 gp30 일부를 베큘로바이러스에서 동시에 발현시킨 후 곤충 세포에 형질감염시켜서 발현된 재조합 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
또한 본 발명의 목적은 재조합 단백질을 한천겔면역침강반응(AGID) 및 효소면역학적 방법의 진단의 진단 항원으로 사용하는 소 백혈병 진단방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 외피당단백질 중에서 gp51 전체와 세포막 윗부분인 gp30 일부를 베큘로바이러스에서 동시에 발현시킨 후 곤충 세포에 형질감염시켜서 발현된 재조합 단백질 및 그 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질을 한천겔면역침강반응(AGID)과 효소면역학적 방법의 진단 항원으로 사용하는 소 백혈병 진단방법을 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
소 백혈병은 국제수역사무국에 의한 리스트 B 질병으로 완전 치료가 불가능하며 예방이 최우선인 질병이다. 소 백혈병의 구조단백질은 대부분 면역성을 가지고 있는데 특히 Gag 단백질의 p24와 외피 단백질인 gp51과 gp30이 면역원성에서 가장 중요한 구조단백질이다. 소 백혈병 구조 단백질 성분 중 바이러스 중화 항체 생산과 관계되는 것이 gp51과 gp30이다. 이 질병은 대표적으로 한천겔면역침강반 응(AGID) 또는 효소면역법(ELISA)으로 항체를 진단하고 혈액 등에서 프로바이러스 DNA를 검출해 내는 PCR 법을 사용하여 항원을 진단한다.
본 발명에서는 한천겔면역침강반응에서 나타나는 단점을 극복하기 위하여 소 백혈병 바이러스의 외피 당단백질 유전자 중 gp51 전체(아미노산 1∼268)와 세포막 윗부분인 gp30 일부(아미노산 1∼109)를 재조합한 서열번호 1의 유전자(gp51+gp30)를 베큘로바이러스에 클로닝한 후 이를 곤충세포에서 발현하여 서열번호 2의 재조합 단백질을 생산한다.
본 발명에 의한 서열번호 2의 재조합 단백질 생산 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
1) 소 백혈병 양성우로부터 혈액내 소 백혈병 바이러스의 외피당단백질을 클로닝한 후 염기서열을 분석하는 단계;
2) 서열번호 1의 재조합 바이러스 유전자를 곤충세포에 형질감염시킨 다음 서열번호 2의 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및
3) 곤충 세포 내에서 생산된 재조합 단백질을 정제 및 농축하는 단계.
상기 재조합 단백질은 외피당단백 유전자(gp51)의 특이 펩타이드에 대해 항체를 생산하여 발현 정도를 확인하였다. 또한 상기 재조합 단백질은 한천겔면역침강반응(AGID)과 효소면역학적 방법의 진단 항원으로 사용한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질을 이용하는 소 백혈병 진단방법에 관한 것으로서, 본 발명에 의한 진단방법은 도 1에 도시된 순서에 따라 수행될 수 있다. 즉,
1) 소 백혈병 양성우로부터 혈액내 소 백혈병 바이러스의 외피당단백질을 클로닝한 후 염기서열을 분석하는 단계;
2) 서열번호 1의 재조합 바이러스 유전자를 곤충세포에 형질감염시킨 다음 서열번호 2의 재조합 단백질을 발현시키는 단계;
3) 곤충 세포 내에서 생산된 재조합 단백질을 정제 및 농축하는 단계;
4) 서열번호 2의 재조합 단백질을 진단 항원으로 사용하여 한천겔면역침강반응 및 효소면역학적 방법의 진단 항원에 적용하여 소 백혈병을 진단하는 단계; 및
5) 서열번호 2의 재조합 단백질을 진단 항원으로 사용하여 효소면역반응으로 자연감염소를 검출하는 단계;
를 포함한다.
이하 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.
<바이러스, 세포 및 발현 벡터>
국내 분리 소 백혈병 바이러스는 감염우의 혈액을 이용하였으며, 재조합 단백질을 삽입할 베큘로바이러스는 아우토그라파 캘리포니아 뉴클리어 폴리 헤드로시스 바이러스(Autographa colifornica nuclear polyhedrosis virus DNA(AcNPV, Clontek))를 사용하였다. 재조합 바이러스는 스포도프테라 프루지페라(Spodoptera frugiperda (Sf-9; Invitrogen)) 세포주와 하이 파이브(High five; Invitrogen) 세포주에서 배양하였다. Sf-9와 하이 파이브 세포주는 무혈청배지인 SF-900 II 배지(Invitrogen)에 2% 태아송아지혈청(fetal calf serum)과 항균-항진균제(Antibiotic-antimycotic, Gibco)을 첨가한 배지로 24-27℃ 저온 항온기에서 배양하였다.
[실시예 1] 소 백혈병 바이러스의 프로바이러스 DNA 추출, 유전자 증폭, 클로닝 및 DNA 염기 서열 분석
소 백혈병의 프로바이러스 DNA는 다음과 같이 추출하였다. 소 백혈병 감염우의 미정맥에서 혈액을 채취하여 항응고제(EDTA)가 들어있는 튜브에 혈액을 넣고 3,000 rpm에서 10분간 원심하여 백혈구를 분리하였다. 분리된 백혈구를 PBS로 세척한 후 Genomic DNA 키트(Promega)를 사용하여 백혈구내의 프로바이러스 DNA를 추출하였다.
PCR 프라이머는 유전자 은행에서 검색한 소 백혈병 바이러스의 유전자 서열(AF503581)을 참고로 하여 서열번호 3 및 4의 프라이머(F: 5'-CTCGAGATGCCCAAAGAACGACGGTA-3', R: 5'-GCTGGAGATCACCGAGGCGGA-3')를 작성하였다. 소 백혈병의 프로바이러스 DNA는 합성된 프라이머와 Tag 폴리머라아제를 사용하여 Gene Amp PCR 시스템 9600(Perkin Elmer)에서 95℃에서 15분간 변성(denature)시킨 후 95℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 45초간 확장하는 사이클을 30회 순환 반응시킨 다음 72℃ 5분간 반응하여 증폭하였다. PCR을 이용하여 증폭된 DNA 단편은 제한효소 처리없이 바로 pGEM-T Easy 벡터(Promega, USA)에 클로닝하였고, 염기서열분석은 양 방향으로 2-3회 실시하여 판독하였다(도 2 참조).
[실시예 2] 소 백혈병 바이러스의 외피당단백질 유전자 발현 벡터 작성
서열번호 1의 국내분리 소 백혈병 바이러스 염기 서열을 주형 DNA로 하여 외피당단백질 gp51 전체 268개의 아미노산과 gp30의 일부 109개의 아미노산 유전자 부위를 포함하도록 서열번호 5 및 6의 프라이머(F: 5'-CTCGAGATGCCCAAAGAACGACGGTA-3', R: 5'-GCTGGAGATCACCGAGGCGGA-3')를 작성하였다. 그리고 5' 말단 부위에 단백질 발현 개시 코돈인 ATG를 함유하고 Xho I 제한효소 작용 부위를 삽입하였으며, 3' 말단 부위에는 정지 서열(TAG)을 설정하였다. 이렇게 조작된 프라이머를 사용하여 95℃에서 15분간 변성(denature)시킨 후 95℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 45초간 확장하는 사이클을 30회 순환 반응시킨 다음 72℃ 5분간 반응하는 PCR을 실시하였고, 이렇게 증폭된 서열번호 1의 DNA를 pGEM T-Easy 벡터(Promega, USA)에 클로닝하였다(도 4 참조).
단백질을 발현시키기 위해서 클로닝한 벡터를 Xho I과 Spe I 제한효소로 처리한 후 외피당단백질에 해당하는 부위만 정제하였다. 한편 pBacPAK8 벡터는 Xho I과 Xba I 제한효소로 처리하여 정제한 다음 상기의 외피당단백질 유전자와 접합하여 재조합 발현 벡터인 pBacBAK8-외피당단백질(gp51+gp30)을 작성하였다(도 3 참 조).
[실시예 3] 재조합 베큘로바이러스 발현 벡터 작성
재조합 베큘로바이러스의 코트랜스펙션은 크론텍(Clonteck, USA)사의 BacPAK6 베큘로바이러스 DNA 0.5㎍ (Bsu36 I 처리)과 발현 벡터인 pBacPAK8-외피당단백질(gp51+gp30) 플라즈마 DNA 5㎍이 포함된 무혈청 그레이스배지 100㎕와 동량의 리포펙틴(lipofectin 0.1㎎/㎖, Gibco)과 혼합하여 코트랜스펙션 혼합물 (cotransfection mixture)을 제조하고 실온에서 15분간 방치한 후 35㎜ 페트리디쉬에 미리 준비된 Sf-9 세포(1.5x105 cells)에 첨가하여 25-27℃에서 5시간 배양한 다음 상층액을 제거하고 10% FCS가 함유된 새 그레이스배지를 5ml 첨가한 후 27℃에서 4-6일간 배양하여 세포변성효과(CPE)가 관찰될 때 수확하여 재조합 베큘로바이러스를 작성하였다.
[실시예 4] 재조합 소 백혈병 바이러스 외피당단백질의 발현
재조합 바이러스를 Sf-9 세포에 감염시킨 후 5일째에 감염 세포를 100% 냉아세톤으로 10분간 고정하고 소 백혈병 바이러스에 자연 감염된 소의 양성 혈청과 FITC 컨쥬게이트된 항-보바인(anti-bovine) IgG(KPL)를 이용하여 특이반응을 나타내는 서열번호 2의 재조합 외피당단백질(gp51+gp30)의 발현을 확인하였다(도 5 참조).
재조합 바이러스를 하이 파이브 세포에 감염시킨 후 5일째에 감염 세포의 세포변성효과(Cytopathic effect)를 관찰한 결과, 정상세포와는 다르게 재조합 베큘로바이러스를 접종한 세포는 합포체를 형성함을 확인하였다(도 6 참조).
[실시예 5] 발현된 재조합 소 백혈병 바이러스 외피당단백질의 상층액으로 분비
재조합 바이러스를 하이 파이브 세포에 감염시킨 후 감염 1일째부터 경시별로 상층액을 수확하여 상층액으로의 분비 여부 및 경시별 발현 상태를 분석하였다.
재조합 바이러스를 감염시켜 경시별로 수확한 상층액을 코팅 완충액에 10배 희석한 뒤, 96웰 플레이트(Nunc, Polysorb)에 100㎕씩 분주하고 4℃에서 16∼18시간 정도 정치하여 코팅한 다음 내용물을 버리고 PBS 세척액(PBST; Phosphate buffered saline containg 0.05% Tween 20)으로 세 번 세척하였다. 그런 다음 10% 탈지유(skim milk)가 함유된 PBST를 각 웰에 200㎕씩 분주한 후 37℃, 포화습도에서 1시간동안 반응시켰다. PBS 세척액으로 세 번 세척한 다음 소 백혈병 강양성, 약양성 및 음성혈청(USA)을 5% 탈지유가 함유된 PBST에 25배 희석하여 100㎕씩 분주하고 37℃, 포화습도에서 30분 동안 반응시켰다. PBS 세척액으로 3번 세척한 후 퍼옥시다아제(peroxidase)가 결합된 안티보바인고우트 이뮤노글로불린(Goat anti-bovine HRP)을 5% 탈지유가 함유된 PBST에 5000배 희석하여 100㎕씩 각 웰에 분주한 다음, 37℃ 포화습도에서 1시간동안 반응시켰다. 세척액으로 3번 세척한 후 기질용액 TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine; KPL, 1 component)를 각 웰에 100㎕ 씩 분주한 다음 20분간 반응시켰다. 2N 황산용액을 넣고 발색 반응을 정지시킨 후 마이크로플레이트 판독기로 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7의 결과를 통하여 재조합 바이러스를 하이 파이브 세포에 감염시키면 세포 상층액으로 발현 단백질이 분비됨을 확인할 수 있었고, 경시별로 보았을 때 5일째에 가장 발현 효율이 높음을 알 수 있었다.
[실시예 6] 소 백혈병 진단용 한천겔면역침강반응(AGID) 항원 생산
실시예 4에서 제조한 재조합 바이러스를 하이 파이브 세포에 접종한 후 5일째에 상층액을 수확하였다. 상층액을 24,000rpm으로 2시간동안 4℃에서 초원심분리하여 재조합 베큘로바이러스를 제거하고, 제거된 상층액을 반투막 용기에 넣은 다음 폴리에틸렌 글리콜(PEG, MW 8000)로 12시간정도 농축시켰다. 농축된 재조합 단백질이 소 백혈병 양성 혈청과 침강 반응을 일으키는 것을 확인하였다(도 8 참조).
[실시예 7] 소 백혈병 자연감염우에서 재조합 발현 항원과 기존 세포를 이용한 항원의 AGID 진단 효율성 비교 분석
재조합 발현 단백질을 이용한 진단 항원과 기존 소 백혈병에 자연감염된 양태아신장세포(FLK cell)를 이용한 항원을 소 백혈병 항원, 항체 양성모우에서 태어난 소 백혈병 자연감염우의 경시별 혈청을 이용해서 AGID 진단 효율성을 비교한 실험 결과를 하기 표 1에 나타내었으며, 그 결과 본 발명에 의한 AGID용 항원의 경우 기존의 진단항원보다 더 민감하게 진단 가능함을 알 수 있어 그 진단 효율성을 확인하였다.
| 주1) | 9 | 12 | 15 | 18 | 21 | 24 | 27 | 30 | 33 | 36 | 39 | 42 | 45 | 48 | 51 | 54 | P2) | N3) |
| Ag+4) | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | + | + | + | + | - |
| gp51+305) | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | + | + | + | + | + | + | - |
1) : 소 백혈병 감염우가 분만한 자우의 경시별 혈청. 분만일을 0으로 하여 3주 간격으로 채혈.
2) : 소 백혈병의 표준양성 혈청
3) : 소 백혈병의 표준음성 혈청
4) : FLK 세포를 이용한 AGID 진단액
5) : 재조합 발현 단백질
[실시예 8] 본 발명에 의한 AGID용 항원, 기존의 진단 항원 및 미국의 IDEXX 키트와의 비교
국내에서 수집된 210두의 소 혈청에 대한 비교 실험 결과를 하기 표 2에 나타내었으며, 그 결과 기존의 FLK 세포를 이용한 진단 항원과 비교시 민감도가 100% (29/29), 특이도가 98.89% (179/181)로 본 발명의 AGID용 항원 진단 효율성을 확인하였다. 그리고 IDEXX 키트와 비교시 기존의 FLK 세포를 이용한 경우 민감도가 67.4%에 반해 본 발명의 AGID용 항원은 민감도가 69.8%로 진단에 있어 더 민감함을 알 수 있었다.
| FLK* | IDEXX** | 합계 | ||||
| P | N | P | N | |||
| C-5*** (gp51+gp30) | P | 29 | 2 | 30 | 1 | 31 |
| N | 0 | 179 | 13 | 166 | 179 | |
* FLK 세포를 이용한 AGID용 진단 항원
** IDEXX : 소 백혈병 항원 진단 키트 (USA)
*** 발현 재조합 항원
P : 소 백혈병의 표준양성 혈청
N : 소 백혈병의 표준음성 혈청
[실시예 9] 본 발명에 의한 재조합 항원으로 자연감염된 소 항체의 경시별 진단 결과
실시예 4에서 사용한 재조합 단백질을 코팅 완충액에 10배 희석한 뒤, 96웰 플레이트(Nunc, Polysorb)에 100㎕씩 분주하고 4℃에서 16∼18시간 정도 정치하여 코팅한 다음 내용물을 버리고 PBS 세척액(PBST; Phosphate buffered saline containg 0.05% Tween 20)으로 세 번 세척하였다. 그런 다음 10% 탈지유(skim milk)가 함유된 PBST를 각 웰에 200㎕씩 분주한 후 37℃, 포화습도에서 1시간동안 반응시켰다. PBS 세척액으로 세 번 세척한 다음 소 백혈병에 자연감염된 소의 혈액을 3주 간격으로 채취하여 혈청을 분리한 후 5% 탈지유가 함유된 PBST에 25배 희석하여 100㎕씩 분주하고 37℃, 포화습도에서 30분 동안 반응시켰다. PBS 세척액으로 3번 세척한 다음 퍼옥시다아제(peroxidase)가 결합된 안티보바인고우트 이뮤노글로불린(Goat anti-bovine HRP), 안티 보바인고우트 이뮤노글로불린 개별 항체(Goat anti-bovine Ig M, Ig G1, Ig G2 HRP)를 5% 탈지유가 함유된 PBST에 5000배 희석하여 100㎕씩 각 웰에 분주한 후, 37℃ 포화습도에서 1시간동안 반응시켰다. 세척액으로 3번 세척한 다음 기질용액 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine; KPL, 1 component)를 각 웰에 100㎕씩 분주한 후 20분간 반응시켰다. 2N 황산용액을 넣고 발색 반응을 정지시킨 다음 마이크로플레이트 판독기로 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9의 결과에서, 본 발명에 의한 실시예 4의 재조합 항원으로 자연감염시킨 소에서 상기 재조합 항원을 인식하고 이에 대항하는 Ig G, Ig G1, Ig G2 및 Ig M 항체들을 생성함을 확인할 수 있었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 소 백혈병 재조합 AGID용 항원은 기존의 진단항원에 비해 민감도와 특이성 면에서 우수하고, 소 백혈병 바이러스의 외피 당단백특이항체는 질병의 다른 진단에 적용 가능하여 소 백혈병 진단에 광범위하게 이용하여 효과적인 방제 대책의 수립에 크게 기여할 것으로 기대된다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Management : Ministry of Agriculture and Forestry, National Veterinary Research)
<120> Recombinant protein of enzootic bovine leukemia virus expressed
in a insect cell and the diagnostic method
<160> 6
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1230
<212> DNA
<213> recombinant gene containing gp51 and gp30 gene of bovine leukemia virus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1230)
<400> 1
atg ccc aaa gaa cga cgg tcc cga aga cac cca caa ccg atc atc aga 48
Met Pro Lys Glu Arg Arg Ser Arg Arg His Pro Gln Pro Ile Ile Arg
1 5 10 15
tgg gta agt ctc act ctc act ctc ctc gct ctc tct cgg ccc atc cag 96
Trp Val Ser Leu Thr Leu Thr Leu Leu Ala Leu Ser Arg Pro Ile Gln
20 25 30
act tgg aga tgc tcc ctg tcc cta gga aac caa caa tgg atg aca gca 144
Thr Trp Arg Cys Ser Leu Ser Leu Gly Asn Gln Gln Trp Met Thr Ala
35 40 45
tat aac caa gag gca aaa ttt tcc atc tcc att gac caa ata cta gag 192
Tyr Asn Gln Glu Ala Lys Phe Ser Ile Ser Ile Asp Gln Ile Leu Glu
50 55 60
gct cat aat cag tca cct ttc tgt gcc aag tct ccc aga tac acc ttg 240
Ala His Asn Gln Ser Pro Phe Cys Ala Lys Ser Pro Arg Tyr Thr Leu
65 70 75 80
gac tct gta aat ggc tat cct aag atc tac tgg ccc ccc cca caa ggg 288
Asp Ser Val Asn Gly Tyr Pro Lys Ile Tyr Trp Pro Pro Pro Gln Gly
85 90 95
cgg cgc cgg ttt gga gcc agg gcc atg gtc aca tat gat tgc gag ccc 336
Arg Arg Arg Phe Gly Ala Arg Ala Met Val Thr Tyr Asp Cys Glu Pro
100 105 110
cga tgc cct tat gtg ggg gca gat cgc ttc gac tgc ccc cac tgg gac 384
Arg Cys Pro Tyr Val Gly Ala Asp Arg Phe Asp Cys Pro His Trp Asp
115 120 125
aat gcc tcc cag gcc gat caa gga tcc ttt tat gcc aat cat cag att 432
Asn Ala Ser Gln Ala Asp Gln Gly Ser Phe Tyr Ala Asn His Gln Ile
130 135 140
tta ttc ctg cat ctc aaa caa tgt cat gga att ttc act cta acc tgg 480
Leu Phe Leu His Leu Lys Gln Cys His Gly Ile Phe Thr Leu Thr Trp
145 150 155 160
gag ata tgg gga tat gat ccc ctg atc acc ttt tct tta cat aag atc 528
Glu Ile Trp Gly Tyr Asp Pro Leu Ile Thr Phe Ser Leu His Lys Ile
165 170 175
cct gat ccc cct caa ccc gac ttc ccc cag ttg aac agt gac tgg gtt 576
Pro Asp Pro Pro Gln Pro Asp Phe Pro Gln Leu Asn Ser Asp Trp Val
180 185 190
ccc tct gtc aga tca tgg gcc ctg ctt tta aat caa aca gca cgg gcc 624
Pro Ser Val Arg Ser Trp Ala Leu Leu Leu Asn Gln Thr Ala Arg Ala
195 200 205
ttc cca gac tgt gct ata tgt tgg gaa cct tcc cct ccc tgg gct ccc 672
Phe Pro Asp Cys Ala Ile Cys Trp Glu Pro Ser Pro Pro Trp Ala Pro
210 215 220
gaa ata tta gta tat aac aaa acc atc tcc agc tct gga ccc ggc ctc 720
Glu Ile Leu Val Tyr Asn Lys Thr Ile Ser Ser Ser Gly Pro Gly Leu
225 230 235 240
gcc ctc ccg gac gcc caa atc ttc tgg gtc aac acg tcc tcg ttt aac 768
Ala Leu Pro Asp Ala Gln Ile Phe Trp Val Asn Thr Ser Ser Phe Asn
245 250 255
acc acc caa gga tgg cac cac cct tcc cag agg ttg ttg ttc aat gtt 816
Thr Thr Gln Gly Trp His His Pro Ser Gln Arg Leu Leu Phe Asn Val
260 265 270
tct caa ggc aac gcc ttg tta tta cct cct atc tcc ctg gtt aat ctc 864
Ser Gln Gly Asn Ala Leu Leu Leu Pro Pro Ile Ser Leu Val Asn Leu
275 280 285
tct acg gct tcc tcc gcc cct cct acc cgg gtc aga cgt agt ccc gtc 912
Ser Thr Ala Ser Ser Ala Pro Pro Thr Arg Val Arg Arg Ser Pro Val
290 295 300
gca gcc ctg acc tta ggc cta gcc ctg tca gtg ggg ctc act gga att 960
Ala Ala Leu Thr Leu Gly Leu Ala Leu Ser Val Gly Leu Thr Gly Ile
305 310 315 320
aat gta gcc gtg tct gcc ctt agc cat cag aga ctc acc tcc ctg atc 1008
Asn Val Ala Val Ser Ala Leu Ser His Gln Arg Leu Thr Ser Leu Ile
325 330 335
cac gtt ctg gag caa gat cag caa cgc ttg atc aca gca att aac cag 1056
His Val Leu Glu Gln Asp Gln Gln Arg Leu Ile Thr Ala Ile Asn Gln
340 345 350
acc cac tat aat ttg ctt aat gtg gcc tct gtg gtt gcc cag aac cga 1104
Thr His Tyr Asn Leu Leu Asn Val Ala Ser Val Val Ala Gln Asn Arg
355 360 365
cgg ggg ctt gat tgg tta tac atc cgg ctg ggt ttt caa agc cta tgt 1152
Arg Gly Leu Asp Trp Leu Tyr Ile Arg Leu Gly Phe Gln Ser Leu Cys
370 375 380
ccc aca att aat gag cct tgc tgt ttc ctg cgc att caa aat gac tcc 1200
Pro Thr Ile Asn Glu Pro Cys Cys Phe Leu Arg Ile Gln Asn Asp Ser
385 390 395 400
att atc cgc ctc ggt gat ctc cag cat cac 1230
Ile Ile Arg Leu Gly Asp Leu Gln His His
405 410
<210> 2
<211> 410
<212> PRT
<213> recombinant gene containing gp51 and gp30 gene of bovine leukemia virus
<400> 2
Met Pro Lys Glu Arg Arg Ser Arg Arg His Pro Gln Pro Ile Ile Arg
1 5 10 15
Trp Val Ser Leu Thr Leu Thr Leu Leu Ala Leu Ser Arg Pro Ile Gln
20 25 30
Thr Trp Arg Cys Ser Leu Ser Leu Gly Asn Gln Gln Trp Met Thr Ala
35 40 45
Tyr Asn Gln Glu Ala Lys Phe Ser Ile Ser Ile Asp Gln Ile Leu Glu
50 55 60
Ala His Asn Gln Ser Pro Phe Cys Ala Lys Ser Pro Arg Tyr Thr Leu
65 70 75 80
Asp Ser Val Asn Gly Tyr Pro Lys Ile Tyr Trp Pro Pro Pro Gln Gly
85 90 95
Arg Arg Arg Phe Gly Ala Arg Ala Met Val Thr Tyr Asp Cys Glu Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Tyr Val Gly Ala Asp Arg Phe Asp Cys Pro His Trp Asp
115 120 125
Asn Ala Ser Gln Ala Asp Gln Gly Ser Phe Tyr Ala Asn His Gln Ile
130 135 140
Leu Phe Leu His Leu Lys Gln Cys His Gly Ile Phe Thr Leu Thr Trp
145 150 155 160
Glu Ile Trp Gly Tyr Asp Pro Leu Ile Thr Phe Ser Leu His Lys Ile
165 170 175
Pro Asp Pro Pro Gln Pro Asp Phe Pro Gln Leu Asn Ser Asp Trp Val
180 185 190
Pro Ser Val Arg Ser Trp Ala Leu Leu Leu Asn Gln Thr Ala Arg Ala
195 200 205
Phe Pro Asp Cys Ala Ile Cys Trp Glu Pro Ser Pro Pro Trp Ala Pro
210 215 220
Glu Ile Leu Val Tyr Asn Lys Thr Ile Ser Ser Ser Gly Pro Gly Leu
225 230 235 240
Ala Leu Pro Asp Ala Gln Ile Phe Trp Val Asn Thr Ser Ser Phe Asn
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Thr Thr Gln Gly Trp His His Pro Ser Gln Arg Leu Leu Phe Asn Val
260 265 270
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275 280 285
Ser Thr Ala Ser Ser Ala Pro Pro Thr Arg Val Arg Arg Ser Pro Val
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Ala Ala Leu Thr Leu Gly Leu Ala Leu Ser Val Gly Leu Thr Gly Ile
305 310 315 320
Asn Val Ala Val Ser Ala Leu Ser His Gln Arg Leu Thr Ser Leu Ile
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355 360 365
Arg Gly Leu Asp Trp Leu Tyr Ile Arg Leu Gly Phe Gln Ser Leu Cys
370 375 380
Pro Thr Ile Asn Glu Pro Cys Cys Phe Leu Arg Ile Gln Asn Asp Ser
385 390 395 400
Ile Ile Arg Leu Gly Asp Leu Gln His His
405 410
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
ctcgagatgc ccaaagaacg acggta 26
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
gctggagatc accgaggcgg a 21
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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ctcgagatgc ccaaagaacg acggta 26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
gctggagatc accgaggcgg a 21
Claims (2)
1) 소 백혈병 양성우로부터 혈액내 소 백혈병 바이러스의 외피당단백질을 클로닝한 후 염기서열을 분석하는 단계;
2) 서열번호 1의 재조합 바이러스 유전자를 곤충세포에 형질감염시킨 다음 서열번호 2의 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및
3) 곤충 세포 내에서 생산된 재조합 단백질을 정제 및 농축하는 단계;
를 포함하는 소 백혈병 바이러스의 유전자 재조합 곤충세포 발현 외피당단백질 생산 방법.
제 1항의 방법으로 제조되는 소 백혈병 바이러스의 재조합 발현 외피당단백질을 진단 항원으로 사용하는 한천겔면역침강반응 및 효소면역반응을 통하여 소 백혈병을 진단하는 방법.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020060071258A KR100811188B1 (ko) | 2006-07-28 | 2006-07-28 | 소 백혈병 바이러스의 유전자 재조합 곤충세포 발현 단백질및 이를 이용한 소 백혈병 진단 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020060071258A KR100811188B1 (ko) | 2006-07-28 | 2006-07-28 | 소 백혈병 바이러스의 유전자 재조합 곤충세포 발현 단백질및 이를 이용한 소 백혈병 진단 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20080010771A true KR20080010771A (ko) | 2008-01-31 |
| KR100811188B1 KR100811188B1 (ko) | 2008-03-11 |
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ID=39222711
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020060071258A KR100811188B1 (ko) | 2006-07-28 | 2006-07-28 | 소 백혈병 바이러스의 유전자 재조합 곤충세포 발현 단백질및 이를 이용한 소 백혈병 진단 방법 |
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| KR (1) | KR100811188B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA027858B1 (ru) * | 2014-10-13 | 2017-09-29 | Владислав Николаевич ЛАСКАВЫЙ | Средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота и способ его применения |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004107219A (ja) | 2002-09-13 | 2004-04-08 | Inst Of Physical & Chemical Res | モノクローナル抗体およびその利用方法 |
| KR100576170B1 (ko) * | 2004-01-14 | 2006-05-03 | 대한민국 | 소지방병성백혈병바이러스 항체검출용 시약, 항원의제조방법, 항체의 검출방법 및 이를 이용한 진단용 키트 |
-
2006
- 2006-07-28 KR KR1020060071258A patent/KR100811188B1/ko active IP Right Grant
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|---|---|---|---|---|
| EA027858B1 (ru) * | 2014-10-13 | 2017-09-29 | Владислав Николаевич ЛАСКАВЫЙ | Средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота и способ его применения |
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| KR100811188B1 (ko) | 2008-03-11 |
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