CN101968485A - 检测血吸虫循环抗原的方法及其酶联免疫试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明一种检测血吸虫循环抗原的方法，包括一个制备抗血吸虫可溶性虫卵抗原的特异IgY多克隆抗体的步骤，一个采用杂交瘤技术制备酶标抗血吸虫可溶性虫卵抗原的单克隆抗体的步骤，包括一个选取多克隆抗体用于包被固相载体的步骤，包括一个选取抗血吸虫可溶性虫卵抗原的单克隆抗体用于制备酶结合物的步骤，包括一个形成抗血吸虫可溶性虫卵抗原的特异IgY多克隆抗体-循环抗原-酶标抗血吸虫SEA单克隆抗体夹心复合物的步骤，加入底物显色读数的步骤。本发明还提供了一种检测血吸虫循环抗原的酶联免疫试剂盒。本发明的检测血吸虫循环抗原的方法敏感性高、特异性强、重复性好，分别适合批量标本的检测和疗效考核。

Description

检测血吸虫循环抗原的方法及其酶联免疫试剂盒

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种血吸虫病的快速诊断方法，特别是一种检测血吸虫循环抗原的方法及其酶联免疫试剂盒。

背景技术

1、免疫诊断在日本血吸虫病防治中的重要性

血吸虫病是一种广泛流行于热带和亚热带地区的人兽共患寄生虫病，全球76个国家和地区的约2亿人口受感染，有6亿人口受感染威胁。我国是日本血吸虫病流行区，建国初期曾严重影响了人们的正常生产和生活。经过50多年的防治，已经取得了举世瞩目的成就，到2003年全国共有血吸虫病病人数843007人，较建国初期(1161.2万人)减少了92.74％。已有广东、上海、福建、广西、浙江等5省(区、市)阻断了血吸虫病的传播；仅剩湖南、湖北、江西、安徽、江苏等5省湖区及川、滇山区未得到控制。我们在欣喜的同时，也面临着进一步防治工作的巨大挑战。随着防治工作的深入，人群感染度不断下降，低度流行区扩大，血吸虫病的病原学诊断在现场大范围的应用越来越困难，不但敏感性差、费时费力，且不易被群众和工作人员接受。另一方面，现在控制血吸虫病的主要手段是吡喹酮化疗，但大规模、反复单一药物化疗，可能产生药物抗性，据国外报道，已经出现具吡喹酮抗性的曼氏血吸虫株，因此研制用于血吸虫病低度流行区的敏感性和特异性更高的诊断手段已经被列为第三大世界血吸虫病防治规划优先研究项目。

2、循环抗原在日本血吸虫病免疫诊断中的作用

经过几十年的发展，血吸虫病免疫诊断技术已具有较高的敏感性、特异性和可行性。检测血吸虫循环抗体是一种成本低、操作简单的检测，也是目前现场流行病学调查时应用最广的途径，但循环抗体在治疗后相当长一段时间内仍保持较高水平，不易区分既往感染和现症感染，无法在现场应用时确定目标化疗人群；而且难以反映药物疗效，不宜用作疗效考核的评价指标。另一种途径是检测循环抗原，循环抗原(circulating antigen，CAg)是存在于患者血液、唾液、尿液等体液中的血吸虫虫体的代谢产物及分泌物，检测患者血清或尿液中的循环抗原，可评估虫负荷数和活动性感染，可以作为诊断的依据。而且，在治疗后，CAg转阴较快，检测循环抗原可以作为疗效考核的依据，基于循环抗原检测的各种方法层出不穷，但都困扰在敏感性低、特异性不强的问题上，因此寻找敏感性高、特异性强的循环抗原检测方法和技术是血吸虫病免疫诊断的新方向。

3、IgY用作免疫诊断抗体的可行性

卵黄免疫球蛋白(egg yolk immunoglobulin，IgY)是鸟类、两栖和爬行类动物主要的免疫球蛋白。IgY是一种系统型抗体，可根据抗原分子的大小结合1～2个抗原，显示为单价或二价。IgY相对分子质量(Mr)为180000，沉降系数约为7.8，包含2个重链(H)和2个轻链(L)，重链相对分子质量(Mr)为68000，比IgG(H)(Mr50000)稍重。IgY的免疫学特性：(1)由于种系发生距离相差很大，禽类IgY与哺乳动物免疫球蛋白之间不会发生交叉血清学反应。(2)不与类风湿因子(Rheumatoid factors，RF)结合。(3)不会激活补体系统。(4)不结合细菌和哺乳动物细胞表面Fc受体，使得IgY在双重免疫组化方面比IgG更具优势。(5)与IgG几无交叉反应，常用于循环复合物的测定.基于以上优点，IgY技术在医学领域已经得到广泛应用，特别是一些免疫诊断技术如沉淀反应、免疫电泳、ELISA、免疫电镜和免疫印迹，表明IgY完全可以取代传统的IgG。免疫十天后，在鸡体内即可获得高滴度的抗体，而且效价稳定，可以持续6-28周。另外，免疫鸡的饲养简单，花费少，符合3个RS[替代(replacing)、减少(reducing)、改善(refining)]的动物保护原则，减少了对动物的伤害。鉴于IgY的产量大、稳定性好、独特的免疫学特性以及动物种系发生学距离远等优点，被称为最有潜力的哺乳动物抗体替代品。

4.单克隆抗体技术在血吸虫病免疫诊断技术中的应用

自Kohler和Milstein(1975)发明单克隆抗体制备技术以来，单抗技术广泛运用于医学和生物学的各个领域，为疾病的发生、发展、诊断和治疗提供了重要的手段。单克隆抗体是由一个细胞产生的，其成分(类，亚类，型和结合P位等)是同源的，只针对复杂抗原的一个抗原决定簇，并有相同的亲和性，抗体滴度也很高，检测循环抗原具有高度的特异性，抗原和单抗可规模化生产，方法简便实用，且具有较好的疗效考核价值，可区分现症感染与既往感染，可用于血吸虫病的免疫诊断和流行病学现场调查。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种检测血吸虫循环抗原的方法及其酶联免疫试剂盒，所述的这种血吸虫循环抗原的检测方法及其酶联免疫试剂盒要解决现有技术检测血吸虫循环抗原的方法敏感性低、特异性不强的技术问题。

本发明提供了一种检测血吸虫循环抗原的方法，包括一个制备抗血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的特异IgY多克隆抗体的步骤，包括一个采用杂交瘤技术制备抗血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的单克隆抗体[产生于小鼠杂交瘤细胞(日本血吸虫病单克隆抗体细胞株A1E3)，保藏号CGMCC NO：3642]的步骤，包括一个选取抗血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的特异IgY多克隆抗体的步骤，所述的抗血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的特异IgY多克隆抗体用于包被固相载体，包括一个选取抗血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的单克隆抗体用于制备酶结合物的步骤，所述的单克隆抗体用于制备酶结合物，在上述步骤均实行之后，将待测血清样品滴于包被好的抗血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的特异IgY多克隆抗体的固相载体中，保温反应并洗涤后，加入酶标记抗血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的单克隆抗体，保温反应并洗涤后，形成抗血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的特异IgY多克隆抗体-循环抗原-酶标抗血吸虫SEA单克隆抗体夹心复合物，加入底物显色，终止显色后通过酶标议读数，确定样品阴阳性结果，阳性标本形成有色产物，而阴性则无。

进一步的，在制备抗血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的特异IgY多克隆抗体的步骤中，又包括如下步骤：

1)制备日本血吸虫的可溶性抗原；

2)抗原免疫及鸡蛋的收集；

3)抗血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的特异IgY多克隆抗体的提取与纯化。

进一步的，在采用杂交瘤技术制备抗血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的单克隆抗体[产生于小鼠杂交瘤细胞(日本血吸虫病单克隆抗体细胞株A1E3)，保藏号CGMCC NO：3642]的步骤中，所述的抗血吸虫可溶性虫卵抗原SEA单克隆抗体的制备方法如下：

(一)包括一个动物免疫的步骤，在一个动物免疫的步骤中，先制备日本血吸虫的可溶性抗原，然后通过日本血吸虫的可溶性抗原免疫动物；

(二)包括一个细胞融合的步骤；

(三)包括一个杂交瘤细胞筛选和克隆化的步骤；

(四)包括一个将单克隆细胞株注入动物内产生抗体的步骤；

(五)包括一个纯化血吸虫可溶性抗原(SEA)的单克隆抗体的步骤；

(六)还包括一个标记血吸虫可溶性抗原(SEA)的单克隆抗体的步骤。

本发明还提供了一种检测血吸虫循环抗原的酶联免疫试剂盒，包括了包被有包被原的酶标板、酶标记物、浓缩洗涤液、样品稀释液、血吸虫病阳性血清、血吸虫病阴性血清、显色液、终止液。

进一步的，所述的浓缩洗涤液为0.01～0.05mol/L pH值7.0-7.4，含有1％吐温20的0.3％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液。

进一步的，所述的样品稀释液为洗涤缓冲液，洗涤缓冲液为上述浓缩洗涤液的18-22倍稀释的工作液，优选的为上述浓缩洗涤液的20倍稀释工作液。

进一步的，当所述的酶标记物为辣根过氧化物酶时，显色液为过氧化氢(A液)和四甲基联苯胺(B液)，终止液为2mol/L的硫酸。

进一步的，当所述的酶标记物为碱性磷酸酶时，显色液为4-硝基酚磷酸盐缓冲液，终止液为1mol/L氢氧化钠缓冲液。

进一步的，所述的血吸虫病阳性血清为血吸虫病人血清或实验感染血吸虫家兔血清，所述的血吸虫病阴性血清为健康人血清或正常兔血清。

进一步的，所述的酶标板为96孔可拆卸聚苯乙烯酶标板；

进一步的，所述的包被缓冲液为pH值9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液。

本发明还提供了一种抗血吸虫可溶性抗原(SEA)的单克隆细胞株，其分类命名为小鼠杂交瘤细胞(日本血吸虫病单克隆抗体细胞株A1E3)，该细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院(中科院微生物研究所)，保藏日期为2010年3月3号，保藏号为3642。该细胞株是由小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与免疫脾细胞融合得到的杂交瘤细胞株。

本发明还提供了一种抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体，由所述的小鼠杂交瘤细胞单克隆细胞株CGMCC NO：3642产生。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

(一)本发明的检测血吸虫循环抗原的双抗体夹心法为两步法，敏感性高、特异性强、重复性好，分别适合批量标本的检测和疗效考核；

(二)本发明的一种血吸虫循环抗原的酶联免疫试剂盒，此试剂盒操作简便、快速，检测急、慢性血吸虫病病人血清，检出率高，适合医院检验科、疾病防控中心、社康中心等部门用于血吸虫病的临床诊断、疗效考核和流行病学调查，具有很高的实用价值。

附图说明

图1是本发明的一种检测血吸虫循环抗原的方法的原理图，其中，1代表包被抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原多克隆抗体IgY(Anti-SEA-IgY)的固相载体；2代表血清(循环抗原)；3代表酶标记抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体；4代表抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原多克隆抗体IgY-循环抗原-酶标记抗血吸虫SEA单克隆抗体夹心复合物。

具体实施方式

实施例1抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原多克隆抗体IgY的制备方法如下：

1.日本血吸虫可溶性抗原的制备：将每只感染1500条日本血吸虫尾蚴(来自中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所)的7只新西兰兔在42天后按常规方法解剖，从肝脏中分离收集虫卵并冻干。取干卵称重，按1％的比例溶于0.9％的生理盐水中，研磨后，置4℃冷浸，期间每天振摇2次，每次2分钟。4天后冰浴超声粉碎，每次3分钟，间歇3分钟，共3次。再如上冷浸2天，10000rpm4℃离心30分钟，取上清，收集分装，用Braford法测定抗原蛋白浓度，-20℃保存备用。

2.抗原免疫及鸡蛋的收集：将日本血吸虫SEA抗原50μg与等量弗氏完全佐剂混合、充分乳化后，经海蓝蛋鸡双翅翅根静脉注射。4周后，用SEA抗原与等体积弗氏不完全佐剂加强免疫一次，剂量同上。以后4周直接用抗原加强免疫一次，剂量同首次。收集免疫后4-20周的鸡蛋，并做好标记，4℃冰箱储存。

3.特异抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原多克隆抗体IgY的提取与纯化：用卵黄分离器取卵黄，双蒸水清洗后量筒计量，与PH为5.2的双蒸水按1∶8稀释，置常温搅拌2.5小时，后在-20℃冷冻3小时，再放4℃缓慢融化，4℃5000rpm离心25分钟，取上清即获得IgY粗提液。加入等体积的饱和硫酸铵溶液，放置3小时，在4℃10000rpm，25分钟离心，将离心后的沉淀稀释到原卵黄液体积，再加入1/2的饱和硫酸铵溶液，4℃放置3小时。此过程反复2-3次。所得沉淀经透析、浓缩至原蛋黄液的1/10(或用聚乙二醇6000浓缩)，分装到冷冻管中-20℃保存。

实施例2抗血吸虫SEA单克隆抗体的制备方法如下：

(一)动物免疫

①抗原制备：将每只感染1500条日本血吸虫尾蚴(来自中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所)的7只新西兰兔在42天后按常规方法解剖，从肝脏中分离收集虫卵并冻干。取干卵称重，按1％的比例溶于0.9％的生理盐水中，研磨后，置4℃冷浸，期间每天振摇2次，每次2分钟。4天后冰浴超声粉碎，每次3分钟，间歇3分钟，共3次。再如上冷浸2天，10000rpm4℃离心30分钟，取上清，收集分装，用Braford法测定抗原蛋白浓度，-20℃保存备用。

②免疫动物的选择：选用6～8w的雌性BALB/c小鼠。初次免疫将血吸虫可溶性抗原(SEA)与弗氏完全佐剂混合并乳化完全，按25～100μg/只剂量腹腔注射小鼠。4周后用相同剂量的SEA与弗氏不完全佐剂混合乳化进行加强免疫，以后每隔2周，再用SEA单独加强免疫2次，用ELISA法检测免疫效价，达到1/10000以上时，进行最后一次尾静脉加强免疫，三天后取脾脏融合。

(二)细胞融合：取骨髓瘤细胞SP2/0与免疫脾细胞按1∶5～1∶10比例在PEG4000作用下进行融合，融合好后杂交细胞通过在含有次黄嘌呤(hypoxanthine，H)、氨基喋呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)的培养基(HAT)中进行选择生长，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。

(三)杂交瘤细胞筛选和克隆化：杂交瘤细胞在融合后2周左右即用SEA进行筛选，挑选出针对SEA的杂交瘤细胞株进行克隆化，直到获得分泌稳定的针对SEA的单克隆细胞株。一种抗血吸虫可溶性抗原(SEA)的单克隆细胞株，其分类命名为小鼠杂交瘤细胞(日本血吸虫病单克隆抗体细胞株A1E3)，该细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院(中科院微生物研究所)，保藏日期为2010年3月3号，保藏号为3642。

(四)将此抗小鼠杂交瘤细胞(CGMCC 3642)注入BALB/c小鼠腹腔内，1～2周后小鼠腹腔产出大量的抗体，小心抽取腹水，离心得到大量针对SEA的单克隆抗体腹水上清。

(五)所述的血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的单克隆抗体的纯化方法如下：

①饱和硫酸铵溶液的配制：500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的量，用2mol/L NaOH调pH至7.8。

②盐析：吸取10ml处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和硫酸铵溶液5.0ml；继续缓慢搅拌30min；10000r/min离心15min；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30min，同法离心；重复前一步1～2次；沉淀物溶于1.5ml PBS(0.01mol/L pH7.2)或Tris-HCl缓冲液中。

③脱盐：常用柱层析或透析法。柱层析法是将盐析样品过Sephadex G-50层析柱，以PBS或Tris-HCl缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速1ml/min。第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。透析法是将透析袋于2％NaHCO₃，1mmol/L EDTA溶液中煮10min，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10min，冷至室温即可使用(并可于0.2mol/L EDTA溶液中，4℃保存备用)。将盐析样品装入透析袋中，对50～100倍体积的PBS或Tris-HCl缓冲液透析(4℃)12～24小时，其间更换5次透析液，用萘氏试剂(碘化汞11.5g，碘化钾8g，加蒸馏水50ml，待溶解后，再加20％NaOH 50ml)检测，直至透析外液无黄色物形成为止。

④蛋白质含量的测定：(Pr)(mg/ml)＝(1.45×OD₂₈₀-0.74×D₂₆₀)×稀释倍数；或(Pr)＝OD₂₈₀×稀释倍数/3

⑤分装冻存备用。

(六)标记抗血吸虫可溶性抗原(SEA)的单克隆抗体

所述的标记物的标记酶为辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)或碱性磷酸酶(alkaline phosohatase，AP)，其标记过程如下：

(一)辣根过氧化物酶(HRP)标记：辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。其操作步骤如下：

①将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO₃溶液中；加0.5ml10mmol/L NaIO₄溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时；

②加0.75ml 10.1mol/L Na₂CO₃混匀；

③加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml)，混匀；

④称取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜；

⑤用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH₄溶液，混匀，室温作用30min；再加入3/20VNaBH₄溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)；

⑥将交联物过Sephadex G200或Sepharose 6B(2.5×50cm)层析纯化，分管收集第一峰；

⑦酶结合物质量鉴定：酶活性和抗体活性的测定，可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H₂O₂显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效价、特异性；

⑧HRP抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融；或加入等量60％甘油4℃保存；不宜加NaN₃或酚防腐，否则会影响酶活性，必要时还可以冻干保存，以BSA或脱脂牛奶作保护剂。

(二)碱性磷酸酶(AP)标记：碱性磷酸酶(AP)用于标记抗体，常用戊二醛一步法，将酶和单抗混合，再加入适量戊二醛，使酶和抗体蛋白的NH₂分别与两个醛基结合，制备成结合物。其程序如下：

①将5mg AP加入1ml抗体溶液(2mg/ml)中溶解，装入透析袋，于4℃对0.01mol/L pH 7.2PBS透析18小时，换液三次。

②加入2.5％戊二醛20ul，室温作用1-2小时，4℃对PBS透析过夜，其间换液三次。

③换用0.05mol/L PH8.0Tris-HCl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。

④取出标记抗体，用含1％BSA的Tris-HCl缓冲液稀释至4ml，即为AP标记物原液。

⑤每毫升中加入0.4ml甘油，小量分装，保存备用。

实施例3一种检测血吸虫循环抗原的方法

如图1所示，本发明的一种检测血吸虫循环抗原的方法包括如下步骤：

(一)选择抗血吸虫虫卵可溶性抗原的多克隆抗体IgY用于包被固相载体(1)，抗血吸虫虫卵可溶性抗原单克隆抗体用于制备酶结合物；

(二)将人或鼠、兔类血清等待测样品(2)滴于包被好抗血吸虫虫卵可溶性抗原的多克隆抗体IgY的固相载体(1)中，保温反应并洗涤后，加入酶标记抗血吸虫虫卵可溶性抗原的单克隆抗体(3)，保温反应并洗涤后，形成抗血吸虫虫卵可溶性抗原的多克隆抗体IgY-循环抗原-酶标抗血吸虫SEA单克隆抗体夹心复合物(4)，加底物显色后阳性标本形成有色产物，而阴性则无，终止显色后通过酶标议读数，确定样品阴阳性结果。

实施例4一种检测血吸虫循环抗原的酶联免疫试剂盒

(一)本发明还提供了一种检测血吸虫循环抗原的酶联免疫试剂盒，包括包被有包被原的酶标板、酶标记物、浓缩洗涤液、样品稀释液、血吸虫病阳性血清、阴性血清、显色液、终止液。

进一步的，所述的浓缩洗涤液为0.01～0.05mol/L pH值7.0-7.4，含有1％吐温20、0.3％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液。

进一步的，所述的样品稀释液为洗涤缓冲液，洗涤缓冲液为上述浓缩洗涤液的20倍稀释工作液。

进一步的，当所述的酶标记物为辣根过氧化物酶时，显色液为过氧化氢(A液)和四甲基联苯胺(B液)，终止液为2mol/L的硫酸。

进一步的，当所述的酶标记物为碱性磷酸酶时，显色液为4-硝基酚磷酸盐缓冲液，终止液为1mol/L氢氧化钠缓冲液。

进一步的，所述的血吸虫病阳性血清为血吸虫病人血清或实验感染血吸虫家兔血清，所述的血吸虫病阴性血清为健康人血清或正常兔血清。

进一步的，所述的酶标板为96孔可拆卸聚苯乙烯酶标板；

进一步的，所述的包被缓冲液为pH值9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液。

具体的所述的一种检测血吸虫循环抗原的酶联免疫试剂盒的制备方法如下：

①包被有包被原的酶标板：用包被缓冲液(pH值9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液)抗血吸虫虫卵可溶性抗原的多克隆抗体IgY稀释成200μg/ml，在96孔可拆卸聚苯乙烯酶标板每孔加入100μl，37℃孵育2h，倒去包被液，用19倍稀释的浓缩洗涤液洗2～3次，每次30s，拍干，然后加入100μl封闭液(10％脱脂奶粉)，37℃孵育1h，倒去孔内液体，干燥后真空密封保存。

②酶标记物：如例一所述，为HRP标记；

③浓缩洗涤液：0.01～0.05mol/L pH值7.0-7.4，含有1％吐温20、0.3％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液；

④样品稀释液：洗涤缓冲液；

⑤血吸虫病人阳性血清、阴性血清：阳性血清为血吸虫病人血清或实验感染血吸虫尾蚴家兔血清；阴性血清为健康人血清或正常兔血清。

⑥显色液：

所述当酶标记物为辣根过氧化物酶时，显色液为过氧化氢(A液)：51.4ml0.2mol/L的Na₂HPO₄与48.6ml0.1mol/L的柠檬酸混合并用HCl调pH至5.1～5.4，最后加入67μl30％的H₂O₂；四甲基联苯胺(B液)：将四甲基联苯胺50mg，无水乙醇5ml，0.1mol/L的柠檬酸，0.1mol/L的EDTA 0.5ml，加蒸馏水至100ml；

⑦终止液：将纯硫酸与蒸馏水按体积比1∶17的比例混合得到2mol/L硫酸溶液。

实施例5一种检测血吸虫循环抗原的酶联免疫试剂盒的检测方法

将人或家兔阳性、阴性血清100μl滴于包被有包被原的酶标板中，37℃孵育25～30min后，倒出孔内液体，用19倍稀释的浓缩洗涤液液洗3～5次，每次30s，拍干，加入HRP标记抗血吸虫SEA单克隆抗体，37℃孵育25～30min，倒出孔内液体，用19倍稀释的浓缩洗涤液洗3～5次，每次30s，拍干，加底物显色液100μl后37℃避光显色5～10min，每孔加入终止液(2mol/L硫酸溶液)50μl，混匀，用酶标议测定每孔吸光值(OD值)，样品OD值大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即判为阳性。

实施例6试剂盒特异性、灵敏度检测：

①特异性检测：20份急性血吸虫病人血清、23份慢性血吸虫病人血清、20份正常人血清、10份蛔虫病人血清、10份肝吸虫病人血清、20份肺吸虫病病人血清、10份囊虫病病人血清、10份鞭虫病人血清、10份裂头蚴病人血清、10份钩虫病人血清、10份旋毛虫病人血清、10份弓形虫病人血清，采用实施例4制备的检测血吸虫循环抗原的酶联免疫试剂盒进行检测，结果检测急性、慢性血吸虫病人血清阳性率分别为100％和91.3％，20份正常人血清特异性为90％，除与蛔虫、肺吸虫、囊虫病人血清存在少量交叉反应外，与其他寄生虫无交叉反应。

②灵敏度检测：用实施例4制备的样品稀释液对SEA进行梯度稀释，用实施例4制备的检测血吸虫循环抗原的酶联免疫试剂盒进行检测，以样品稀释液为空白对照，以实施例4制备的阳性、阴性血清为阳性、阴性对照，结果如表1所示，表明该酶联免疫试剂盒检测血吸虫循环抗原的最低检测值(检测限)为3μg/ml。

表1.血吸虫循环抗原的酶联免疫试剂盒灵敏度检测

Claims (14)

1.一种检测血吸虫循环抗原的方法，其特征在于：所述的方法中包括一个制备抗血吸虫可溶性虫卵抗原的特异IgY多克隆抗体的步骤，包括一个采用杂交瘤技术制备抗血吸虫可溶性虫卵抗原的单克隆抗体的步骤，包括一个选取用于包被固相载体的抗血吸虫可溶性虫卵抗原的特异IgY多克隆抗体的步骤，包括一个选取用于制备酶结合物的抗血吸虫可溶性虫卵抗原的单克隆抗体的步骤，在上述步骤均实行之后，将待测血清样品滴于包被好的抗血吸虫可溶性虫卵抗原的特异IgY多克隆抗体的固相载体中，保温反应并洗涤后，加入酶标记抗血吸虫可溶性虫卵抗原的单克隆抗体，保温反应并洗涤后，形成抗血吸虫可溶性虫卵抗原的特异IgY多克隆抗体-循环抗原-酶标抗血吸虫可溶性虫卵抗原的单克隆抗体夹心复合物，加入底物显色，终止显色后通过酶标仪读数，确定样品阴阳性结果。

2.如权利要求1所述的检测血吸虫循环抗原的方法，其特征在于：所述的制备抗血吸虫可溶性虫卵抗原的特异IgY多克隆抗体的步骤中又包括如下步骤，

1)制备日本血吸虫的可溶性抗原；

2)抗原免疫及鸡蛋的收集；

3)抗血吸虫可溶性虫卵抗原的特异IgY多克隆抗体的提取与纯化。

3.如权利要求1所述的检测血吸虫循环抗原的方法，其特征在于：所述的采用杂交瘤技术制备抗血吸虫可溶性虫卵抗原的单克隆抗体的步骤中又包括如下步骤，

1)一个动物免疫的步骤，在所述的动物免疫的步骤中，先制备日本血吸虫的可溶性抗原，然后通过日本血吸虫的可溶性抗原免疫动物；

2)一个细胞融合的步骤；

3)一个杂交瘤细胞筛选和克隆化的步骤；

4)将单克隆细胞株注入动物体内产生抗体的步骤；

5)一个纯化抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体的步骤；

6)一个标记抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体的步骤。

4.一种检测血吸虫循环抗原的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括了包被有包被捕获抗体的酶标板、包被缓冲液、酶标记物、浓缩洗涤液、样品稀释液、血吸虫病阳性血清、血吸虫病阴性血清、显色液、终止液。

5.如权利要求4所述的检测血吸虫循环抗原的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的浓缩洗涤液为0.01～0.05mol/L，pH值为7.0～7.4，含有1％吐温20的0.3％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液。

6.如权利要求4所述的检测血吸虫循环抗原的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的样品稀释液为洗涤缓冲液，所述的洗涤缓冲液为浓缩洗涤液的18-22倍稀释的工作液。

7.如权利要求4所述的检测血吸虫循环抗原的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的酶标记物为辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶。

8.如权利要求7所述的检测血吸虫循环抗原的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的酶标记物为辣根过氧化物酶，显色液为过氧化氢和四甲基联苯胺，终止液为2mol/L的硫酸。

9.如权利要求7所述的检测血吸虫循环抗原的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的酶标记物为碱性磷酸酶，显色液为4-硝基酚磷酸盐缓冲液，终止液为1mol/L氢氧化钠缓冲液。

10.如权利要求4所述的检测血吸虫循环抗原的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的血吸虫病阳性血清为血吸虫病人血清或实验感染血吸虫家兔血清，所述的血吸虫病阴性血清为健康人血清或正常兔血清。

11.如权利要求4所述的检测血吸虫循环抗原的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的酶标板为96孔可拆卸聚苯乙烯酶标板。

12.如权利要求4所述的检测血吸虫循环抗原的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的包被缓冲液为pH值为9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液。

13.一种小鼠杂交瘤细胞，其保藏号为CGMCC NO：3642。

14.一种血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体，其特征在于：由权利要求13所述的小鼠杂交瘤细胞CGMCC NO：3642产生。

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