ES2695044T3 - Líneas celulares derivadas de MDCK adaptadas a un cultivo exento de suero y a un cultivo en suspensión, y procedimiento para la preparación de un virus para una vacuna usando las células - Google Patents
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Abstract
Una línea celular derivada de riñón canino de Madin-Darby (MDCK) que deriva de las células MDCK depositadas con el número de acceso de la ATCC CCL-34, no requiere suero para el crecimiento celular y se prepara mediante un cultivo en suspensión sin la necesidad de ser unida a portadores, en la que la línea celular derivada de riñón canino de Madin-Darby (MDCK) es la MDCK Sky1023 depositada en la DSMZ con el nº de acceso DSM ACC3112.
Description
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DESCRIPCIÓN
Líneas celulares derivadas de MDCK adaptadas a un cultivo exento de suero y a un cultivo en suspensión, y procedimiento para la preparación de un virus para una vacuna usando las células
Campo técnico
La presente invención se refiere a una nueva línea celular derivada de MDCK que puede ser preparada mediante un cultivo exento de suero y un cultivo en suspensión sin la necesidad de ser unida a portadores, a un procedimiento para la preparación de la línea celular derivada de MDCK y aun procedimiento para la producción de un virus para una vacuna usando la línea celular derivada de MDCK.
Antecedentes de la técnica
Los huevos fertilizados, los cerebros de ratón, las células primarias y las células establecidas se usan generalmente como fuente para la producción de vacunas. Sin embargo, dichas fuentes de vacuna tradicionales tienen numerosos problemas. Por ejemplo, cuando se pretende usar huevos de pollo fertilizados para la producción de una vacuna, existen dificultades en la cría de los pollos, el manejo de los huevos fertilizados dependiendo de los programas de producción de la vacuna, y la purificación de los ingredientes derivados de las proteínas del huevo.
Generalmente se añade suero bovino fetal como factor de crecimiento para el cultivo celular. Sin embargo, el suero es susceptible de estar contaminado con priones y virus, y podría variar la calidad de sus productos comerciales. Además, los productos de suero bovino fetal de alta calidad de terneros de Australia y Nueva Zelanda tienen un elevado precio, dando como resultado un aumento en el coste de producción.
Las líneas celulares MDCK son líneas celulares establecidas en las que pueden proliferar diversos tipos de virus. Dado que las líneas celulares MDCK muestran una fuerte tendencia a adherirse a otras superficies, se requieren unos recipientes de cultivo con una gran área y portadores para el cultivo gran escala, incurriendo en unos costes considerables. Específicamente, los costes de la inversión para el equipo de cultivo o los portadores son enormes, y es necesaria una etapa de procesado para eliminar las células adheridas a los portadores, lo que presenta el riesgo de pérdida de, y de daño a, las células. Por lo tanto, hay una necesidad de una línea celular que pueda ser preparada mediante un cultivo exento de suero y un cultivo en suspensión y que sea por lo tanto adecuada para su uso en la producción de una vacuna a través de un cultivo de células animales de una forma económica y segura.
La Patente de Estados Unidos n° 6.825.036 desvela una línea celular derivada de MDCK que puede ser cultivada en un cultivo exento de suero y en un cultivo en suspensión sin un portador sólido. La Patente de Estados Unidos emplea dos metodologías para la adaptación de la línea celular al cultivo en suspensión. Según la primera metodología, la línea celular derivada de MDCK se obtiene mediante el cultivo en suspensión directo en un matraz de agitación. En este caso, la densidad celular no alcanza las 1,0 x 106 células/ml, un nivel necesario para la producción a escala industrial. Según la segunda metodología, la línea celular derivada de MDCK se obtiene mediante el cultivo de las células MDCK originales en presencia de microesferas como portadores, expandiendo la escala del cultivo y cultivando las células cultivadas en ausencia de portadores. La segunda metodología tiene el inconveniente de que el procedimiento es relativamente complicado.
La Patente Alemana n° DE 101 44 906 desvela que la línea celular MDCK 33016 es oncogénicamente silente, al parecer. Todavía existen informes (véase Rappuoli y Del Giudice; "Influenza Vaccines of the Future" Springer Science & Business Media, (2011), pág. 303 párrafo intermedio) que indican que la MDCK 33016 sería oncogénica.
También, el documento WO 2008/032219 desvela la línea celular MDCK 33016. También es oncogénicamente silente, aunque - como se ha dicho anteriormente - existen informes que dan a entender la oncogenicidad de esta línea celular.
Como se ha indicado anteriormente, existen numerosos informes sobre que las líneas celulares MDCK originales son oncogénicas. Por lo tanto, existe el peligro de una potencial oncogenicidad cuando se usan líneas celulares MDCK originales para la producción de una vacuna. En estas circunstancias, existe una necesidad de desarrollar una nueva línea celular que pueda ser preparada mediante un cultivo exento de suero y un cultivo en suspensión y que preferentemente tenga una oncogenicidad muy baja o que no sea oncogénica.
Divulgación de la invención
Problema técnico
La presente invención está diseñada para resolver los problemas de la técnica anterior, y por lo tanto es un objeto de la presente invención proporcionar una línea celular derivada de MDCK que pueda prepararse ventajosamente mediante un cultivo exento de suero y un cultivo en suspensión y que tenga una oncogenicidad muy baja o que no sea oncogénica en comparación con las líneas celulares MDCK originales que pueden usarse para cultivar los virus para una vacuna. Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para la producción de un virus, particularmente de un virus de la gripe, usando la línea celular.
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Solución al problema Solución técnica
Con objeto de conseguir los objetos anteriores, la presente invención proporciona una línea celular derivada de riñón canino de Madin-Darby (MDCK) particular que deriva de las células MDCK depositadas con el número de acceso de la ATCC CCL-34, que no requiere suero para el cultivo de las células y puede ser preparada mediante un cultivo en suspensión sin la necesidad de ser unida a portadores. La línea celular derivada de MDCK de la presente invención se selecciona entre la MDCK Sky1023 (DSM ACC3112), la MDCK Sky10234 (DSM ACC3114) y la MDCK Sky3851 (DSM ACC3113).
La línea celular derivada de MDCK de la presente invención puede ser preparada a través de las siguientes etapas: S1) adaptar una línea celular MDCK original a un medio exento de suero para preparar una línea celular adaptada al cultivo exento de suero; y S2) adaptar directamente la línea celular adaptada al cultivo exento de suero a un cultivo en suspensión sin experimentar la adaptación a un portador, y cribar la línea celular deseada.
Más específicamente, la línea celular derivada de MDCK de la presente invención puede ser preparada mediante un procedimiento que incluye (a) preparar las células MDCK originales depositadas con el número de acceso de la ATCC CCL-34, (b) adaptar las células MDCK originales a un medio exento de suero definido químicamente para permitir que las células MDCK originales crezcan en el medio exento de suero, y (c) inducir la adaptación directa de las células MDCK adherentes adaptadas de la etapa (b) a un cultivo en suspensión en un medio exento de suero definido químicamente sin experimentar la adaptación a un portador, para permitir que las células MDCK crezcan en un estado de suspensión sin portadores.
La línea celular derivada de MDCK recién establecida mediante el procedimiento puede ser preparada mediante un cultivo exento de suero y un cultivo en suspensión. Como se ha dicho anteriormente, la línea celular derivada de MDCK de la presente invención se selecciona entre la MDCK Sky1023 (DSM ACC3112), la MDCK Sky10234 (DSM ACC3114) y la MDCK Sky3851 (DSM ACC3113), que han sido depositadas en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Braunschweig, Alemania, el 27 de enero de 2011.
El término "medio exento de suero" según se usa en el presente documento significa un medio al que sustancialmente no se le ha añadido suero y en el que la línea celular establecida de la presente invención puede ser preparada mediante un cultivo.
La expresión "sustancialmente no se ha añadido suero" significa que el suero está presente en una cantidad del 0,5% en volumen menos, preferentemente del 0,1 % en volumen o menos, más preferentemente del 0,01 % en volumen o menos, lo más preferentemente no está presente en absoluto.
La Patente de Estados Unidos n° 6.825.036 emplea dos metodologías para la preparación de una línea celular derivada de MDCK en un medio exento de suero mediante un cultivo en suspensión. La primera metodología intenta un cultivo en suspensión directo de una línea celular MDCK original en un matraz de agitación. En este caso, la densidad celular no alcanza las 1,0 x 106 células/ml, un nivel necesario para la producción a escala industrial. Según la segunda metodología, la línea celular derivada de MDCK se obtiene mediante el cultivo de las células MDCK originales en presencia de portadores y cultivando las células cultivadas en ausencia de portadores.
Por el contrario, la presente invención intenta el cultivo directo de las células MDCK originales en un matraz de agitación sin experimentar la adaptación a un portador para la preparación de una línea celular recién establecida que puede ser preparada en un medio exento de suero mediante un cultivo en suspensión. La línea celular establecida B-702 de la Patente de Estados Unidos n° 6.825.036 alcanza una densidad celular de 1,0 x 106 células/ml en una semana, mientras que la línea celular establecida de la presente invención alcanza una densidad celular de al menos 1,0 x 106 células/ml en aproximadamente 3 días, lo que indica un potencial de proliferación muy superior.
Numerosos informes establecen que las líneas celulares MDCK conocidas previamente son oncogénicas. Por el contrario, la línea celular establecida de la presente invención tiene una oncogenicidad muy baja o no es oncogénica cuando se compara con las líneas celulares MDCK conocidas. Específicamente, se confirmó que las recién establecidas líneas celulares derivadas de MDCK preparadas en la sección de Ejemplos tenían una oncogenicidad muy baja o no eran oncogénicas cuando se comparaban con las líneas celulares MDCK existentes a través de pruebas que usan las líneas celulares, lisados celulares y el ADN de las células en ratones inmunodeficientes. A partir de los resultados de estas pruebas puede concluirse que la línea celular derivada de MDCK de la presente invención es lo suficientemente estable como para ser usada en la producción de una vacuna. Mas preferentemente, la línea celular derivada de MDCK de la presente invención puede ser preparada mediante un cultivo exento de suero y un cultivo en suspensión.
La presente invención también proporciona un procedimiento para la producción de un virus para una vacuna que usa la línea celular derivada de MDCK de la invención. Algunos ejemplos de virus que pueden cultivarse usando la línea celular derivada de MDCK de la invención incluyen el virus de la gripe, el virus del sarampión, el virus de la encefalitis japonesa, el virus de la parotiditis, el virus de la rubéola, el virus de la poliomielitis, el HSV-1, el HSV-2, el
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virus de la rabia, el virus RS, el reovirus de tipo 3, el virus de la fiebre amarilla, parvovirus, el virus de Coxsackie, los tipos de adenovirus 1 a 47 el virus Lassa y los virus de vacuna. La línea celular derivada de MDCK de la presente invención es lo más adecuada para su uso en la producción del virus de la gripe.
Más específicamente, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de un virus de la gripe a partir de un cultivo celular, procedimiento que incluye: (a) inocular un medio de cultivo exento de suero con las células derivadas de MDCK a una concentración de entre aproximadamente 1 x 104 y aproximadamente 1 x 106 células/ml; (b) permitir que las células derivadas de MDCK crezcan en un sistema de biorreactor desechable hasta que la densidad celular alcance al menos aproximadamente 5 x 106 células/ml, lo que incluye el cultivo de las células derivadas de MDCK mientras se mantienen una o más condiciones del cultivo seleccionadas entre el grupo que consiste en un estado de agitación de entre aproximadamente 40 y aproximadamente 100 rpm, un pH de entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5 y una concentración de oxígeno disuelto (OD) de entre aproximadamente el 35 y aproximadamente el 100 %; (c) infectar las células derivadas de MDCK cultivadas con un virus de la gripe; (d) cultivar las células derivadas de MDCK infectadas cultivadas en unas condiciones que permiten la clonación del virus de la gripe; y (e) aislar el virus de la gripe a partir de la composición del cultivo celular. Preferiblemente, el procedimiento de producción del virus de la gripe de la presente invención incluye adicionalmente la adición de medio reciente al cultivo celular o la sustitución de una porción del medio por medio reciente en la etapa (b).
La presente invención también describe un virus o un antígeno vírico producido mediante el procedimiento de producción del virus. La presente invención también describe una composición farmacéutica inmunogénica que incluye el antígeno vírico.
Efectos ventajosos de la invención
La nueva línea celular derivada de MDCK de la presente invención puede ser preparada mediante un cultivo exento de suero y un cultivo en suspensión, y tiene la ventaja de una oncogenicidad muy baja o ausente. Además, la nueva línea celular derivada de MDCK de la presente invención puede usarse eficazmente para la proliferación de virus. Adicionalmente, la nueva línea celular derivada de MDCK de la presente invención es adecuada para su uso en la producción de un virus, particularmente de un virus de la gripe.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos anexos ilustran las realizaciones preferidas de la invención y, junto con la anterior divulgación, sirven para proporcionar una comprensión adicional de la invención.
La FIG. 1 muestra los perfiles de crecimiento celular de las líneas celulares derivadas de MDCK durante el cultivo en suspensión en matraces de agitación;
la FIG. 2 es un diagrama de flujo que muestra un proceso de purificación representativo de un virus de la gripe; y
la FIG. 3 muestra los resultados de las pruebas de HI en los sueros obtenidos en experimentos con animales usando muestras purificadas de un virus cultivado en las líneas celulares derivadas de MDCK.
Modo para la invención
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ayudar a una comprensión adicional de la invención. Estos ejemplos se proporcionan para explicar más completamente la invención a aquellos con un conocimiento habitual en la materia a la que pertenece la invención.
<Ejemplo 1> Preparación de líneas celulares derivadas de MDCK mediante un cultivo exento de suero y un cultivo en suspensión
La CCL-34, una línea celular MDCK, fue proporcionada por la ATCC. La CCL-34 se cultivó en un medio EMEM complementado con un 10 % de suero en un matraz T-25 a 37 °C y un 5 % de CO2. Después de la expansión de las células, se cultivaron en un medio que consiste en el medio EMEM y un medio exento de suero (50 %). Se confirmó si el crecimiento de las células era normal o no durante el cultivo. Cuando se confirmó que el crecimiento de las células era normal, las células cultivadas se cultivaron en un medio que contiene un medio exento de suero (75 %). Este procedimiento se repitió para obtener una línea celular adaptada a un medio exento de suero (100 %). Puede usarse EX-CELL MDCK (Sigma), UltraMDCK (Lonza) y VP-SFM (Invitrogen) como el medio para el cultivo exento de suero.
La línea celular adaptada al medio exento de suero se expandió suficientemente en un matraz T. A continuación, la línea celular expandida se adaptó a un cultivo en suspensión con agitación a una velocidad de 40-80 rpm en un matraz de agitación (Corning) a 37 °C y un 5 % de CO2. Cuando el pH del medio de cultivo había disminuido o las células habían crecido por encima de un nivel predeterminado, el medio se cambió por uno nuevo o las células se subcultivaron. Después de la adaptación al cultivo en suspensión durante 3-6 meses, la concentración celular alcanzó las 2 x 106 células/ml o más. La viabilidad celular era del 95% o mayor, y se observó el cultivo en
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suspensión en las células individuales. Puede usarse EX-CELL 302 CHO (Sigma), UltraCHO (Lonza) y SMIF-6 (Invitrogen) como el medio para el cultivo en suspensión. Como resultado del cultivo exento de suero y del cultivo en suspensión, se obtuvieron tres tipos de líneas celulares derivadas de MDCK y se denominaron MDCK Sky1023, MDCK Sky10234 y MDCK Sky3851.
<Ejemplo 2> Evaluación de los potenciales de proliferación de las líneas celulares
Las líneas celulares derivadas de MDCK preparadas mediante el cultivo en el medio exento de suero fueron cultivadas en las condiciones indicadas en la Tabla 1. Se evaluaron los potenciales de proliferación de las líneas celulares derivadas de MDCK. La línea celular MDCK (ATCC CCL-34) se cultivó como control en un medio complementado con un 10 % de suero.
Tabla 1
[Tabla 1]
[Tabla]
- Líneas celulares derivadas de MDCK Control (ATCC CCL-34)
- Medio de cultivo
- EX-CELL MDCK (Sigma), UltraMDCK (Lonza), VP-SFM (Invitrogen) EMEM (Lonza)
- Aditivos
- L-Glutamina (Lonza) al 2 % v/v L-Glutamina (Lonza) al 2 % v/v, suero bovino fetal (Lonza) al 10 % v/v
- Condiciones de cultivo
- 37 °C, 5 % de CO2, humedad 37 °C, 5 % de CO2, humedad
- Volumen del cultivo
- Matraz T-75 (15 ml) Matraz T-75 (15 ml)
Las concentraciones celulares eran de aproximadamente 1,0 x 105 células/ml al comienzo del cultivo. Cuando las concentraciones celulares alcanzaron aproximadamente 1 x 106 células/ml o 3-4 días después del cultivo, las células se subcultivaron. Las concentraciones celulares al comienzo del subcultivo se ajustaron a 1 x 105 células/ml.
Cada una de las líneas celulares derivadas de MDCK cultivadas en el medio exento de suero mostró una velocidad de crecimiento celular comparable a la de la línea celular MDCK cultivada en el medio con suero.
<Ejemplo 3> Evaluación de los perfiles de proliferación y estabilidad del subcultivo de las líneas celulares
Después de que los tres tipos de líneas celulares adaptadas al cultivo exento de suero y al cultivo en suspensión se cultivaran de forma continua en los respectivos matraces de agitación, se evaluaron sus perfiles de proliferación y la estabilidad del subcultivo. Las concentraciones celulares al comienzo del cultivo se ajustaron a aproximadamente 4 x 105 células/ml. Aproximadamente 3-4 días después del cultivo, las concentraciones celulares alcanzaron aproximadamente 2 x 106 células/ml o más. El cultivo se llevó a cabo en las siguientes condiciones. Los resultados se muestran en la FIG. 1.
Concentración celular inicial: 4 x 105 células/ml Escala del cultivo: matraz de agitación de 50 ml Velocidad de rotación del matraz: 60 rpm Condiciones de cultivo: 37 °C, 5 % de CO2, humedad Condiciones de subcultivo: 3-4 días después del cultivo
<Ejemplo 4> Evaluación de la proliferación del virus
Se cultivaron cepas de la vacuna de la gripe estacional 2010/2011 usando las células derivadas de MDCK en las siguientes condiciones de cultivo en suspensión:
Concentración celular: 2 x 106 células/ml Escala del cultivo: matraz de agitación de 1.000 ml Velocidad de rotación del matraz: 60 rpm Condiciones de cultivo: 34 °C, 5 % de CO2, humedad Periodo de cultivo: 3 días
Es comúnmente conocido que el virus de la gripe se cultiva mejor durante un cultivo a 34 °C que a 37 °C, lo que fue confirmado experimentalmente. Se incluyó tripsina en el medio de cultivo para infectar las líneas celulares con el virus de la gripe durante el cultivo. Los títulos del virus de la gripe se midieron mediante un ensayo de hemaglutinación. Después de un cultivo durante 3 días, se destruyó la mayoría de las células. Los sobrenadantes del cultivo se recogieron y se midieron los títulos del virus. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Como puede observarse a partir de los resultados de la Tabla 2, la mayor parte de los virus mostró unos títulos de HA de 1024 o más. Los niveles de crecimiento de los virus eran similares a los de los huevos o las células MDCK cultivadas en un
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10 % de medio que contiene FBS. Estos resultados han demostrado que las líneas celulares derivadas de MDCK son adecuadas para la producción eficaz de virus en unas condiciones de cultivo exentas de suero y en un cultivo en suspensión.
Tabla 2
[Tabla 2]
[Tabla]
- Virus
- MDCK Sky1023 MDCK Sky10234 MDCK Sky3851
- A/California/07/2009 (H1N1)
- 512 1024 2048
- A/perth/16/2009 (H3N2)
- 1024 1024 4096
- B/Brisbane/60/2008
- 4096 2048 4096
<Ejemplo 5> Identificación de la capacidad de los virus cultivados para formar anticuerpos
Para identificar la capacidad del virus de la gripe cultivado en las células derivadas de MDCK para formar anticuerpos, se purificaron los virus procedentes de las soluciones de cultivo y se inocularon en ratones. Se midieron los valores de anticuerpos del virus. Un diagrama de flujo del proceso de purificación se muestra en la FIG. 2, y a continuación se proporciona una breve explicación del mismo.
En primer lugar, se centrifugó cada una de las soluciones de cultivo del virus para eliminar los lisados celulares de las mismas y se filtró a través de un filtro de 0,45 pm. El filtrado se concentró mediante una ultrafiltración usando un cartucho con un corte de 300 kDa, y el virus se inactivó con formalina. A continuación, el virus se aisló a partir de la solución de cultivo mediante una ultracentrifugación a través de un gradiente de concentración de sacarosa. El virus fue alterado mediante un tratamiento con Triton X-100, concentrado mediante una ultrafiltración para retirar el detergente, filtrado a través de un filtro de 0,2 pm para esterilizarlo, proporcionando una solución de vacuna.
Las soluciones purificadas de la cepa del virus A/California/07/2009 (H1N1) cultivado usando las tres líneas celulares derivadas de MDCK, MDCK Sky1023, MDCK Sky10234 y MDCK Sky3851, se usaron para experimentos con animales para identificar la eficacia de la cepa del virus. Como control se usó una vacuna de la gripe estacional 08/09 (IVR-148, NYMC X-175C, B/Florida/4/2006). Se usó un total de seis grupos de prueba, cada uno de los cuales fue inoculado en cinco ratones. Se recogieron muestras de suero de los cinco ratones. Se realizó una prueba de inhibición de la hemaglutinación (HI) con el suero recolectado para medir el valor del anticuerpo del virus.
El suero se obtuvo mediante la extracción de sangre del plexo retroorbital de los ratones usando un tubo capilar antes de la inyección (semana 0) del grupo de prueba en los ratones. Después de la extracción de sangre, se inyectó un total de 200 pl en las patas traseras de cada ratón del grupo de prueba (100 pl en cada pata) a través de la vía IM. Dos semanas después de la inyección se obtuvo el suero mediante una extracción de sangre del plexo retroorbital de la misma forma que anteriormente. En cada ratón del grupo prueba se inoculó la misma cantidad que la inyectada en la semana 0 para potenciar la capacidad de formar anticuerpos. Cuatro semanas después de la inyección se obtuvo el suero mediante una extracción de sangre del plexo retroorbital de la misma forma que anteriormente.
Las muestras de suero obtenidas se trataron mediante el siguiente procedimiento. Las muestras de suero extraídas de los ratones se recogieron y se dividieron en muestras de 30 pl. Se añadieron 90 pl de RDE a cada muestra de 30 pl y se dejó en reposo a 37 °C durante al menos 18 h. La mezcla se dejó reposar adicionalmente a 56 °C durante al menos 30 min para inactivar la RDE. Posteriormente, se añadieron 120 pl de solución salina fisiológica al 0,85 % y 15 pl (un volumen que se corresponde con un 1/20 del volumen total) de glóbulos rojos sanguíneos de pollo posteriormente, se suspendieron lo suficiente y se dejaron reposar a 4 °C durante 1 h. Las células sanguíneas sedimentadas se resuspendieron a intervalos de 30 min. A continuación, la suspensión se centrifugó a 1.200 rpm durante 10 min para separar el suero. Se llevó a cabo la prueba de HI en el suero para medir el valor de los anticuerpos del suero. Los resultados medidos se muestran en la Tabla 3. En todos los grupos experimentales se midieron unos títulos de HI de 40 o más. Esto es, cuando el virus cultivado a partir de las células derivadas de MDCK se inyectó en los animales, de forma similar a la vacuna existente, se confirmó que se formaron anticuerpos contra el virus. A partir de estos resultados puede concluirse que las líneas celulares derivadas de MDCK son útiles para la producción de vacunas de virus.
Tabla 3 [Tabla 3]
[Tabla]
- Grupo experimental
- Línea celular Cantidad de antígeno inoculado Título de HI
- 1
- MDCK Sky1023 15 pg/ratón 80
- 2
- MDCK Sky10234 15 pg/ratón 160
- 3
- MDCK Sky10234 7,5 pg/ratón 160
- 4
- MDCK Sky3851 15 pg/ratón 80
- 5
- MDCK Sky3851 7,5 pg/ratón 80
- 6
- Vacuna de referencia 320
<Ejemplo 6> Identificación de la oncogenicidad de las líneas celulares en ratones inmunodeficientes
5 Para evaluar la oncogenicidad de las líneas celulares MDCK Sky1203 y MDCK Sky3851, se trasplantaron las líneas celulares derivadas de MDCK y las sustancias derivadas de las mismas (incluyendo los lisados celulares y los ADN celulares) en la hipodermis de ratones BALB/c-nu/nu como animales de prueba, según se indica en la Tabla 4. Se realizó una observación para determinar si se formaron tumores durante 12 semanas. Las células fueron inoculadas en unas dosis de 101, 103, 105 y 107 células, los lisados celulares fueron inoculados en unas dosis de 105 y 107 10 células, y los ADN celulares fueron inoculados en unas dosis de 105 y 107 células. Cada uno de los grupos fue inoculado en 5-10 ratones. Los resultados experimentales se muestran en la Tabla 4. Se confirmó que las líneas celulares MDCK Sky1023 y MDCK Sky3851 tenían una oncogenicidad baja o no eran oncogénicas cuando se comparaban con la línea celular MDCK original (ATCC) como control interno.
Tabla 4
15 [Tabla 4]
- Grupo experimental
- Muestra experimental Dosis Número de animales en los que se encontró algún tumor
- Control negativo
- PBS 0/5
- Controles positivos
- Células HeLa 105 1/5
- Células HeLa
- 107 5/5
- Grupos internos
- MDCK 101 0/10
- MDCK
- 103 0/10
- MDCK
- 105 10/10
- MDCK
- 107 9/10
- MDCK Sky1023
- Células 101 0/10
- 103
- 0/10
- 105
- 3/10
- 107
- 10/10
- Lisados celulares
- 105 0/5
- 107
- 0/5
- ADN
- 105 0/5
- 107
- 0/5
- MDCK Sky3851
- Células 101 0/10
- 103
- 0/10
- 105
- 0/10
- 107
- 0/10
- Lisados celulares
- 105 0/5
- 107
- 0/5
- ADN
- 105 0/5
- 107
- 0/5
Claims (10)
- 510152025303540REIVINDICACIONES1. Una línea celular derivada de riñón canino de Madin-Darby (MDCK) que deriva de las células MDCK depositadas con el número de acceso de la ATCC CCL-34, no requiere suero para el crecimiento celular y se prepara mediante un cultivo en suspensión sin la necesidad de ser unida a portadores, en la que la línea celular derivada de riñón canino de Madin-Darby (MDCK) es la MDCK Sky1023 depositada en la DSMZ con el n° de acceso DSM ACC3112.
- 2. Una línea celular derivada de riñón canino de Madin-Darby (MDCK) que deriva de las células MDCK depositadas con el número de acceso de la ATCC CCL-34, no requiere suero para el crecimiento celular y se prepara mediante un cultivo en suspensión sin la necesidad de ser unida a portadores, en la que la línea celular derivada de riñón canino de Madin-Darby (MDCK) es la MDCK Sky10234 depositada en la DSMZ con el n° de acceso DSM ACC3114.
- 3. Una línea celular derivada de riñón canino de Madin-Darby (MDCK) que deriva de las células MDCK depositadas con el número de acceso de la ATCC CCL-34, no requiere suero para el crecimiento celular y se prepara mediante un cultivo en suspensión sin la necesidad de ser unida a portadores, en la que la línea celular derivada de riñón canino de Madin-Darby (MDCK) es la MDCK Sky3851 depositada en la DSMZ con el n° de acceso DSM ACC3113.
- 4. Un procedimiento para la producción de un virus para una vacuna usando la línea celular derivada de MDCK según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
- 5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que el virus se selecciona entre el grupo que consiste en el virus de la gripe, el virus del sarampión, el virus de la encefalitis japonesa, el virus de la parotiditis, el virus de la rubéola, el virus de la poliomielitis, el HSV-1, el HSV-2, el virus de la rabia, el virus RS, el reovirus de tipo 3, el virus de la fiebre amarilla, parvovirus, el virus de Coxsackie, los tipos de adenovirus 1 a 47, el virus Lassa y los virus de vacuna.
- 6. El procedimiento según la reivindicación 5, en el que el virus es un virus de la gripe.
- 7. Un procedimiento para la producción de un virus de la gripe a partir de un cultivo celular, procedimiento que comprende:(a) inocular un cultivo exento de suero medio con la célula derivada de MDCK según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 a una concentración de entre 1 x 104 y 1 x 106 células/ml;(b) permitir que las células derivadas de MDCK crezcan en un sistema de biorreactor desechable hasta que la densidad celular alcance al menos 5 x 106 células/ml, lo que comprende el cultivo de las células derivadas de MDCK mientras se mantienen una o más condiciones del cultivo seleccionadas entre el grupo que consiste en un estado de agitación de entre 40 y 100 rpm, un pH de entre 6,5 y 7,5 y una concentración de oxígeno disuelto (OD) de entre el 35 y el 100%;(c) infectar las células derivadas de MDCK cultivadas con un virus de la gripe;(d) cultivar las células derivadas de MDCK infectadas cultivadas en unas condiciones que permiten la clonación del virus de la gripe; y(e) aislar el virus de la gripe a partir de la composición del cultivo celular.
- 8. El procedimiento según la reivindicación 7, que comprende adicionalmente la adición de medio reciente al cultivo celular o la sustitución de una porción del medio por medio reciente en la etapa (b).
- 9. La línea celular derivada de riñón canino de Madin-Darby (MDCK) según la reivindicación 1, en la que la MDCK Sky1023 depositada en la DSMZ con el n° de acceso DSM ACC3112 tiene una oncogenicidad baja o no es oncogénica en comparación con la línea celular MDCK original.
- 10. La línea celular derivada de riñón canino de Madin-Darby (MDCK) según la reivindicación 3, en la que la MDCK Sky3851 depositada en la DSMZ con el n° de acceso DSM ACC3113 tiene una oncogenicidad baja o no es oncogénica en comparación con la línea celular MDCK original.
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