CN112195148B - 无血清悬浮适应的mdck细胞及其在制备流感病毒疫苗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种无血清悬浮适应的MDCK细胞及其在制备流感病毒疫苗中的应用。本发明的无血清悬浮适应的MDCK细胞能够实现流感病毒高滴度扩增、适合工业化生产。

Description

无血清悬浮适应的MDCK细胞及其在制备流感病毒疫苗中的 应用
技术领域
本发明属于病毒学和生物药物领域。具体涉及一种无血清悬浮适应的MDCK细胞及其在制备流感病毒疫苗中的应用。
背景技术
流感是由流行性感冒病毒(简称“流感病毒”)引起的一种发病急、传染性强、传播速度快的呼吸道传染病。据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)新近统计数据，每年流感的季节性流行在全球可导致300万-500万例重症病例、29万-65万例死亡病例。时而发生的流感大流行(如2009年甲型H1N1流感大流行)和人感染H5N1、H9N2、H7N9、H5N6等禽流感疫情也给人类健康带来巨大危害和潜在威胁。
接种疫苗是预防流感最有效的手段。70多年来，基于传统鸡胚培养的流感疫苗在流感防控中发挥了积极作用，但存在潜在的不足，如疫苗生产必须依赖于大量符合质量标准的鸡胚的有计划供应、疫苗生产工艺劳动强度较大，难以全面实现自动化、疫苗病毒株较易发生鸡胚传代适应性变异、鸡胚潜在致病因子污染与残体无害化处理等问题；特别是在高致病性禽流感流行期间，可能会因鸡胚供应问题导致疫苗制备原料缺乏，疫苗供应存在极大的隐患。以上潜在不足也是限制流感疫苗产能扩大、质量提升和应急生产能力提高的瓶颈。
WHO建议流感疫苗生产企业使用哺乳动物细胞培养来替代鸡胚培养以进行流感疫苗生产。相对于鸡胚培养，基于细胞培养的流感疫苗的优势主要体现在：摆脱了对鸡胚供应的依赖；工艺易于自动化、规模化；疫苗病毒株在细胞中传代突变几率低，疫苗抗原性更接近自然流行株；工艺采用相对密闭的生物反应器系统，可有效降低微生物污染风险；疫苗不含卵清蛋白，可降低接种后过敏反应风险。
值得注意的是，在2017-2018南半球流感流行季，细胞基质流感疫苗比鸡胚流感疫苗在不同人群(尤其是老年人群)中表现出更高的保护效率。初步分析表明，H3N2流感病毒在鸡胚中的传代适应性突变可能导致了其与流行株抗原性的差异，从而造成鸡胚疫苗接种人体后产生的抗体中和流行病毒株能力下降，细胞基质流感疫苗引起了疫苗审评与监管部门的高度重视。
近年来，基于不同类型细胞基质的季节性流感疫苗和大流行流感疫苗已在不同国家和地区获批上市，为流感流行和大流行的有效防控提供了重要支持。
所以，本领域急需提供能够实现流感病毒高滴度扩增、适合工业化生产流感疫苗的细胞基质。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够实现流感病毒高滴度扩增、适合工业化生产流感疫苗的细胞基质。
本发明第一方面，提供了一种无血清悬浮适应的犬肾传代(Madin Darby caninekidney，MDCK)细胞，所述细胞是保藏号为CCTCC NO:C2019193的细胞。
在另一优选例中，所述细胞具有一个或多个选自下组的特征：
(1)所述细胞能够在无血清培养基中存活和稳定传代；
(2)所述细胞在培养基中能够以单细胞形式悬浮培养。
在另一优选例中，所述细胞能够在无血清、无动物源培养基中培养。
在另一优选例中，所述培养基为不含血清、生长因子、细胞因子或动物源性成分的培养基。
在另一优选例中，所述细胞能够表达流感病毒受体唾液酸α2,6-半乳糖(SAα2,6-gal)和/或禽流感病毒受体唾液酸α2,3-半乳糖(SAα,2,3-gal)。
在另一优选例中，所述无血清悬浮适应的MDCK细胞的无菌、支原体和外源病毒污染检查均为阴性，符合中华人民共和国药典的规定。
本发明第二方面，提供了如本发明第一方面所述的细胞的用途，用于培养流感病毒。
在另一优选例中，所述流感病毒选自下组：季节性流感病毒和禽流感病毒。
本发明第三方面，提供了如本发明第一方面所述的细胞的用途，用于制备流感病毒疫苗。
在另一优选例中，所述细胞用作流感病毒扩增的细胞基质，从而制备所述病毒的疫苗。
在另一优选例中，所述流感病毒选自下组：季节性流感病毒和禽流感病毒。
在另一优选例中，所述流感病毒为病毒的疫苗株。
在另一优选例中，所示季节性流感病毒选自下组：甲型、乙型，或其组合。
在另一优选例中，所述季节性流感病毒选自下组：H1N1、H3N2、乙型Victoria系、乙型Yamagata系，或其组合。
在另一优选例中，所述流感病毒疫苗为四价季节性流感疫苗。
在另一优选例中，所述禽流感病毒选自下组：H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2、H7N9，或其组合，较佳地，H5N1、H7N9，或其组合。
在另一优选例中，所述禽流感病毒的疫苗为人用禽流感病毒疫苗。
本发明第四方面，提供了如本发明第一方面所述的细胞的制备方法，包括步骤：
(1)将血清贴壁培养适应的MDCK细胞(如CCL-34，P55)用消化液消化成单个形式存在的细胞；和
(2)将所述单个形式存在的细胞在无血清培养基中连续传代培养25-35次，获得所述无血清悬浮适应的MDCK细胞。
本发明第五方面，提供了一种流感病毒的培养方法，包括步骤：
(1)将如本发明第一多方面所述的MDCK细胞接种于无血清的培养基中培养；和
(2)在胰酶存在下，用所述病毒感染细胞并在所述细胞中扩增。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述培养基不含有动物源原料。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述MDCK细胞接种时处于对数生长期。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述MDCK细胞接种密度为1×106-1×107个/ml，较佳地，2×106-5×106个/ml。
在另一优选例中，所述胰酶为TPCK-胰酶。
在另一优选例中，所述胰酶在培养液中的终浓度为0.5-20μg/mL，较佳地，1-15ug/L，更佳地，2-8μg/mL。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述病毒的感染复数(病毒数量：细胞数量)为0.0005-0.2，较佳地，0.0008-0.12，更佳地，0.001-0.1。
在另一优选例中，所述病毒选自下组：H1N1、H3N2、乙型Yamagata系流感病毒疫苗株，或其组合，且所述步骤(2)具有一个或多个下述特征：
(a)所述胰酶为TPCK-胰酶，其在培养液中的终浓度为3-12μg/mL，较佳地，4-10μg/mL，更佳地，5-8μg/mL；
(b)所述病毒的感染复数为0.0008-0.1，较佳地，0.0009-0.01，更佳地，0.001-0.002。
在另一优选例中，所述病毒为乙型Yamagata系流感病毒疫苗株，且所述步骤(2)具有一个或多个下述特征：
(a)所述胰酶为TPCK-胰酶，其在培养液中的终浓度为3-12μg/mL，较佳地，4-10μg/mL，更佳地，5-8μg/mL；
(b)所述病毒的感染复数为0.008-0.5，较佳地，0.009-0.03，更佳地，0.01-0.02。
在另一优选例中，所述病毒为H7N9流感病毒疫苗株，且所述步骤(2)具有一个或多个下述特征：
(a)所述胰酶为TPCK-胰酶，其在培养液中的终浓度为3-12μg/mL，较佳地，4-10μg/mL，更佳地，5-8μg/mL；
(b)所述病毒的感染复数为0.0008-0.1，较佳地，0.0009-0.01，更佳地，0.001-0.002。
在另一优选例中，所述病毒为H5N1流感病毒疫苗株，且所述步骤(2)具有一个或多个下述特征：
(a)所述胰酶为TPCK-胰酶，其在培养液中的终浓度为3-12μg/mL，较佳地，4-10μg/mL，更佳地，5-8μg/mL；
(b)所述病毒的感染复数为0.008-0.5，较佳地，0.009-0.03，更佳地，0.01-0.02。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述病毒的扩增时间为24-96h。
本发明第六方面，提供了一种流感病毒疫苗的制备方法，包括步骤：
(1)将如本发明第一多方面所述的的MDCK细胞接种于无血清的培养基中培养；和
(2)在胰酶存在下，用所述病毒感染细胞并在所述细胞中扩增。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤；
(3)将步骤(2)所得病毒进行纯化、灭活后配制成疫苗。
本发明的方法、用途为体外、非治疗性的。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为含血清贴壁培养适应的MDCK细胞与本发明的无血清悬浮适应的MDCK细胞形态照片；
图2a为无血清悬浮适应的MDCK细胞生长曲线；
图2b显示了无血清悬浮适应的MDCK细胞传代稳定性；
图3a显示了无血清悬浮适应的MDCK细胞表面SAα-2,3Gal、SAα-2,6Gal表达情况；
图3b显示了贴壁培养适应的MDCK细胞表面SAα-2,3Gal、SAα-2,6Gal表达情况；
图4a显示了四价季节性流感病毒疫苗株在生物反应器中扩增情况；
图4b显示了禽流感病毒疫苗株在生物反应器中扩增情况。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，提供了一种无血清悬浮适应的MDCK细胞。本发明的细胞可在无血清、无动物源培养基中悬浮培养，且该细胞可适应于多种季节性流感病毒疫苗株和人用禽流感病毒疫苗株的高滴度扩增，非常适合流感疫苗的规模化制备。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用，术语“室温”是指温度为4-40℃，较佳地，25±5℃。
如本文所用，术语“无血清悬浮适应的犬肾传代细胞”、“本发明的细胞”、“本发明的MDCK细胞”“无血清悬浮适应的MDCK细胞”、“本发明的无血清悬浮的细胞”可互换使用，指本发明的可在无血清培养基中悬浮培养的MDCK细胞(保藏号为CCTCC NO:C2019193的细胞)。
如本文所用，术语“细胞基质”指用于病毒扩增的宿主细胞。
无血清悬浮适应的细胞
本发明的提供了一种无血清悬浮适应的犬肾传代(Madin Darby canine kidney，MDCK)细胞，所述细胞是保藏号为CCTCC NO:C2019193的细胞。
本发明中，所述细胞能够在无血清培养基中存活和稳定传代。所述细胞在培养基中能够以单细胞形式悬浮培养。
本发明中，所述无血清培养基可以为本领域常用的无血清培养基。通常，无血清培养基为不含血清、不含动物源性成分的培养基。优选地，所述无血清培养基包括(但并不限于)：碳水化合物、氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、缓冲剂、蛋白水解物等。
本发明中，所述无血清悬浮适应的犬肾传代细胞包括单个所述细胞或多个所述细胞的集合。
用途
本发明的无血清悬浮适应的犬肾传代细胞非常适合用于培养流感病毒或用于制备流感病毒疫苗。
优选地，所述流感病毒选自下组：季节性流感病毒和禽流感病毒。
季节性流感
季节性流感是一种由流感病毒引起的急性呼吸道感染，分为甲、乙、丙、丁四型。甲型和乙型流感病毒可传播并引起季节性流行性疾病。
甲型流感病毒：根据病毒表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的组合情况，甲型流感病毒进一步分类为亚型。目前正在人际间传播的甲型流感病毒是甲型H1N1和甲型H3N2流感亚型。乙型流感病毒无亚型之分，而分为两个系。目前流行的乙型流感病毒属于乙型Yamagata系或乙型Victoria系。
四价季节性流感疫苗
四价季节性流感疫苗包括针对以下四种流感病毒的疫苗：甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Victoria系(BV)和乙型Yamagata系(BY)。
本发明的细胞对四价季节性流感病毒疫苗株都具有优异的扩增效果。
禽流感病毒
禽流感病毒，属于甲型流感病毒。至今发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有：H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2和H7N9亚型。其中，H5N1亚型和H7N9亚型具有高致病性尤可造成人类伤亡。
本发明的细胞对禽流感病毒，尤其是人用禽流感病毒疫苗的病毒株(如H5N1、H7N9)有优异的扩增效果。
本发明的主要优点包括：
1.本发明的MDCK细胞能够在无血清、无动物源原料的培养基中悬浮培养，稳定传代，可以避免动物源血清等带来的污染风险，同时悬浮培养形式能够达到更高的细胞密度，病毒扩增效率更高。
2.无血清悬浮培养操作简便、易于放大、成本低、稳定性高，所以本发明的MDCK细胞非常适合作为细胞基质，工业化生产流感疫苗。
3.令人惊讶的，本发明的MDCK细胞在适应无血清培养基等特性后，还能够实现多种季节性流感病毒、禽流感病毒疫苗株的高效、快速、高滴度扩增。
4.单位体积细胞收获液中病毒有效成分血凝素的含量高于目前传统鸡胚培养的尿囊液中血凝素含量(如针对H7N9流感病毒疫苗株，鸡胚培养的尿囊液中血凝素含量为：12.6±0.8μg/ml，而本发明的细胞收获液中血凝素含量为：35.0±1.9μg/ml)，也有利于流感疫苗的应急生产和产能提升。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
细胞：MDCK细胞株(CCL-34)，为含血清贴壁培养适应的MDCK细胞，来源于ATCC。引进后按照《中华人民共和国药典》2015版三部要求建立了细胞库和工作细胞库，并获得中国食品药品检定研究院检定(工作库检定报告编号：SH201701475)。
流感病毒疫苗株：WHO发布的2018年度南半球四价季节性流感病毒疫苗株：A/Michigan/45/2015(H1N1)pdm09、A/Hongkong/4801/2014(H3N2)、乙型流感病毒B/Brisbane/60/2008(B/Victoria lineage)、B/Phuket/3073/2013(B/Yamagata lineage)；甲型H7N9流感病毒疫苗株：A/Shanghai/2/2013(H7N9)NIBRG-267；H5N1流感疫苗株：A/Vietnam/1194/2004(H5N1)NIBRG-14均购自英国国家生物制品检定所(NationalInstitute for Biological Standards and Control,NIBSC)，并由上海生物制品研究所有限责任公司保存。
试剂：MDCK无血清培养基购于上海倍谙基生物科技有限公司，货号：FG00100403；DMEM培养基购于Gibco公司，货号：41500；胎牛血清购于Gibco公司，货号：25200；PPOL、支原体半流体培养基、支原体液体培养基由上海生物制品研究所有限责任公司；鸡胚、乳鼠由上海生物制品研究所有限责任公司实验动物中心提供；TPCK-trypsin甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮(Tosyl-L-phenylalanine chloromethyl-ketone，TPCK)-胰蛋白酶购自美国ThermoFisher公司，货号：20233；标准糖链检测试剂盒购于Roche公司，货号：11210238001。
流式细胞仪(Attune NxT声波聚焦流式细胞仪，ThermoFisher公司)
HA效价评价方法：
在U型血凝板中加入PBS，50μl/孔。将50μl待测病毒加入第1孔，连续倍比稀释到第11孔，第12孔为PBS阴性对照。每孔加入50μl 1％鸡红细胞悬液，室温静置20～30min，观察红细胞凝集情况，以出现阳性结果的最大稀释度为病毒的HA效价。
实施例1
无血清悬浮MDCK的驯化
从含血清贴壁培养适应的MDCK细胞主细胞库复苏细胞1支，利用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养，待MDCK细胞在培养瓶中生长至约70％丰度，弃上清液，并洗涤，再用胰酶-EDTA消化液消化细胞，计数后加入MDCK无血清培养基使细胞初始密度保持在1×106/ml。待细胞密度达到或超过2×106/ml，按比例进行传代。按照以上方法进行连续传代驯化,共30代，经筛选，得到一株无血清悬浮适应的MDCK细胞，命名为“MDCK-SFSU2019”，保藏编号为CCTCC NO:C2019193。
如图1所示，令人惊讶地，原贴壁培养适应的MDCK细胞在无血清培养基中实现了全悬浮培养，且细胞大小基本均一(直径约20μM)、细胞生长稳定、细胞状态良好(细胞活力>90％)。
实施例2
无血清悬浮适应的MDCK细胞培养特性研究
在30mL摇瓶中以1×106初始密度接种细胞，设3个培养瓶的重复，在接种后不同时间(0h、24h、48h、72h、96h、120h)取样进行检测，记录细胞密度和细胞活力，绘制细胞生长曲线。同时，通过细胞的连续传代监测细胞的传代稳定性。
如图2a所示，MDCK-SFSU2019细胞在以初始密度1×106接种，细胞活力保持在90％以上，细胞均能够有效扩增，最高细胞密度可达1×107/ml，倍增时间24h左右。
如图2b所示，通过细胞的连续传代(超过10代)表明细胞传代稳定性良好，细胞生长速率稳定。
实施例3
无血清悬浮适应的MDCK细胞表面流感病毒受体表达情况
使用高辛标记的2种凝集素检测贴壁培养适应的MDCK细胞和无血清悬浮适应的MDCK细胞表面人流感病毒受体唾液酸α2,6-半乳糖(SAα2,6-gal)和禽流感病毒受体唾液酸α2,3-半乳糖(SAα,2,3-gal)的表达丰度。利用黑接骨木果凝集素(SNA)可特异性识别SAα2,6-gal，高丽槐黄柏甙凝集素(MAA)可特异性识别SAα,2,3-gal，以FITC标记抗地高辛抗体为二抗，再借助流式细胞仪进行检测细胞表明病毒受体表达情况。具体操作方法为：取处于对数生长期的贴壁培养适应的MDCK细胞和无血清悬浮适应的MDCK细胞1×106个，用TBS清洗2遍，用封闭液均匀重悬细胞，于冰上封闭1h，重复洗涤。分别用DIG-SNA、DIG-MAA及空白对照(不加SNA或MAA)处理细胞，于冰上孵育1h后重复洗涤步骤，再用1μl FITC标记抗DIG二抗，于30μl的Buffer 1中均匀重悬细胞沉淀，冰上孵育1h，最后用TBS洗涤3次用于流式细胞仪检测。
结果如图3a和3b所示，本发明的无血清悬浮适应的MDCK细胞表面人流感病毒受体唾液酸α2,6-半乳糖(SAα2,6-gal)和禽流感病毒受体唾液酸α2,3-半乳糖(SAα,2,3-gal)能够有效表达，与贴壁适应的MDCK细胞表面病毒受体表达无显著差别，说明驯化过程未对细胞表面病毒受体表达产生影响，该无血清悬浮适应的MDCK细胞株具备扩增人流感病毒和禽流感病毒疫苗株的基本特征。
实施例4
无血清悬浮适应的MDCK细胞检定
参照《中华人民共和国药典》2015年版第三部生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程，建立无血清悬浮适应的MDCK细胞主细胞库和工作细胞库。并对细胞库主要项目进行了自检，检测项目包括：无菌检测、支原体检查和动物体内接种法检测外源因子。具体检测方法参照《中华人民共和国药典》2015年版第三部。
表1无血清悬浮适应的MDCK细胞主细胞库和工作细胞库检查结果
Figure BDA0002636914840000101
结果如表1所示，对本发明的无血清悬浮适应的MDCK细胞主细胞库和工作细胞库细菌、真菌、支原体和病毒污染检查显示以上检查结果均为阴性，检查结果符合中华人民共和国药典》2015年版第三部生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程中相关标准。
实施例5
四价季节性流感和大流行流感病毒疫苗株在悬浮细胞中最佳扩增条件研究
研究四价季节性流感病毒疫苗株在本发明无血清悬浮适应的MDCK细胞中的最适培养条件以及病毒的扩增情况。将细胞以1×106/ml接种于在125ml摇瓶(工作体积：30ml)中，培养48小时后细胞密度达到4-6×106/ml后，稀释使细胞密度为3×106/ml后，分别以不同感染复数(MOI)：0.1、0.01、0.001和不同终浓度的TPCK-胰酶：1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL条件下进行病毒感染，每个条件设3瓶重复。将病毒感染后的细胞置于35℃下培养，分别于24、48、72、96小时收集培养上清液，测定上清液病毒HA效价。此外，按照以上同样方法研究甲型H5N1和H7N9流感病毒疫苗株扩增参数。如表2-7所示。
表2
Figure BDA0002636914840000111
表3
Figure BDA0002636914840000112
Figure BDA0002636914840000121
表4
Figure BDA0002636914840000122
表5
Figure BDA0002636914840000123
Figure BDA0002636914840000131
表6
Figure BDA0002636914840000132
表7
Figure BDA0002636914840000133
Figure BDA0002636914840000141
季节性流感病毒疫苗株在无血清悬浮适应的MDCK细胞中的扩增结果显示：A/Michigan/45/2015(H1N1)pdm09、A/Hongkong/4801/2014(H3N2)、B/Phuket/3073/2013分别以MOI 0.001、TPCK-Typsin浓度为5μg/mL接种时，HA滴度最高，分别达到1:256、1:1024、1:1024；B/Brisbane/60/2008病毒以MOI0.01、TPCK-Typsin浓度为5μg/mL接种细胞时，HA滴度最高达到1:1024(210)。
禽流感病毒疫苗株在无血清悬浮适应的MDCK细胞中的扩增结果显示：甲型H7N9禽流感病毒疫苗株A/Shanghai/2/2013(H7N9)NIBRG-267以MOI 0.001、TPCK-Typsin浓度为5μg/mL接种细胞时，HA滴度最高为1:512；H5N1禽流感病毒疫苗株A/Vietnam/1194/2004(H5N1)NIBRG-14以MOI0.01、TPCK-Typsin浓度5μg/mL接种细胞时，HA滴度最高达到1:128。
实施例5
生物反应器中流感病毒扩增
在生物反应器中培养(3L搅拌罐式生物反应器，Applikon)无血清悬浮适应的MDCK细胞，所有培养基与以上实验相同，培养条件为搅拌速度150rpm，培养pH7.0±0.1，溶氧40％。将按照以上确定病毒接种最佳参数进行病毒接种，接种病毒后的细胞于搅拌速度150rpm，培养pH 7.2±0.1，溶氧40％。35℃培养，并于病毒感染后24、48、72小时收集培养上清液，测定上清液病毒HA效价。
如图4a所示，在生物反应器中进行细胞培养和病毒的扩增，A/Hongkong/4801/2014(H3N2)、B/Phuket/3073/2013和B/Brisbane/60/2008病毒培养后的病毒HA滴度最高均可达到1：1024(210)，A/Michigan/45/2015(H1N1)pdm09培养后的病毒HA滴度最高均可达到1：256(28)。
如图4b所示，在生物反应器中进行细胞培养和病毒的扩增，禽流感病毒疫苗株在无血清悬浮适应的MDCK细胞中的扩增结果显示：甲型H7N9禽流感病毒疫苗株A/Shanghai/2/2013(H7N9)NIBRG-267HA滴度最高为1：512(29)；H5N1禽流感病毒疫苗株A/Vietnam/1194/2004(H5N1)NIBRG-14HA滴度最高达到1：128(27)。
通过生物反应器培养能够实现流感病毒的有效扩增。相对于贴壁培养系统，该悬浮培养体系是通过将细胞培养后稀释进行接毒，对于后续的工艺放大具有巨大优势。需要说明的是，在本实施案例中培养方式为批次培养，未对培养方式进行进一步优化，将来可考虑连续灌注培养、高密度细胞状态下感染等手段，同时借助生物反应器对相关参数的精密扩增，有望进一步提高病毒的扩增效率。
对比例1
四价季节性流感和大流行流感病毒疫苗株在贴壁细胞中最佳扩增条件研究
在6孔细胞培养板中，以5×105/孔细胞数接种6孔细胞培养板，37℃、5％CO2、DMEM+10％胎牛血清(FBS)培养24h。用DMEM洗涤2次，补充DMEM(分别含最终质量浓度为1、5、10μg/mL的TPCK-胰蛋白酶)至2mL/孔，以感染复数(multiplicity of infection，MOI)分别为0.1000、0.0100、0.0010的病毒接种，34℃、5％CO2培养72h后取培养上清液，测定上清病毒血凝素(hemagglutintin，HA)效价，结果如表8-13。
表8
Figure BDA0002636914840000151
表9
Figure BDA0002636914840000152
Figure BDA0002636914840000161
表10
Figure BDA0002636914840000162
表11
Figure BDA0002636914840000163
Figure BDA0002636914840000171
表12
Figure BDA0002636914840000172
表13
Figure BDA0002636914840000173
Figure BDA0002636914840000181
季节性流感病毒疫苗在有血清贴壁MDCK细胞中的扩增结果显示：A/Michigan/45/2015(H1N1)pdm09、A/Hongkong/4801/2014(H3N2)、B/Phuket/3073/2013分别以MOI 0.01、TPCK-Typsin浓度为5μg/mL接种时，HA滴度最高，分别是1:128、1:256、1:256；B/Brisbane/60/2008病毒以MOI0.001、TPCK-Typsin浓度为5μg/mL接种细胞时，HA滴度最高达到1:512。
禽流感病毒疫苗株在有血清贴壁MDCK细胞中的扩增结果显示：甲型H7N9禽流感病毒疫苗株A/Shanghai/2/2013(H7N9)NIBRG-267以MOI 0.001、TPCK-Typsin浓度为5μg/mL接种细胞时，HA滴度最高为1:256；H5N1禽流感病毒疫苗株A/Vietnam/1194/2004(H5N1)NIBRG-14以MOI0.01、TPCK-Typsin浓度5μg/mL接种细胞时，HA滴度最高达到1:64。
不同细胞中病毒扩增后最大HA滴度对比结果总结如下表14：
表14最大HA滴度比较
Figure BDA0002636914840000182
Figure BDA0002636914840000191
结果表明，四价流感病毒及禽流感病毒疫苗株在本发明的无血清悬浮适应的细胞中HA滴度均明显高于贴壁细胞，说明相对贴壁细胞，本发明的无血清悬浮适应的细胞更有利于生产四价季节性流感病毒及禽流感病毒疫苗，具有更大的成本、产能优势。
菌种保藏
本发明的无血清悬浮适应的犬肾传代(MDCK)细胞株MDCK-SFSU2019，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉)，保藏日期：2019年11月28日，保藏编号：CCTCCNO:C2019193。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种无血清悬浮适应的犬肾传代(Madin Darby canine kidney，MDCK)细胞，其特征在于，所述细胞是保藏号为CCTCC NO:C2019193的细胞；
且所述细胞具有以下特征：
(1)所述细胞能够在无血清培养基中存活和稳定传代；
(2)所述细胞在培养基中能够以单细胞形式悬浮培养。
2.如权利要求1所述的细胞的用途，其特征在于，用于培养流感病毒。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述流感病毒选自下组：季节性流感病毒和禽流感病毒。
4.如权利要求2所述的细胞的用途，其特征在于，用于制备流感病毒疫苗。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述流感病毒选自下组：季节性流感病毒和禽流感病毒。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所示季节性流感病毒选自下组：甲型、乙型，或其组合。
7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述禽流感病毒选自下组：H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2、H7N9，或其组合。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述禽流感病毒选自下组：H5N1、H7N9，或其组合。
9.一种流感病毒的培养方法，其特征在于，包括步骤：
(1)将如权利要求1所述的MDCK细胞接种于无血清的培养基中培养；和
(2)在胰酶存在下，用所述病毒感染细胞并在所述细胞中扩增。
10.一种流感病毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(1)将如权利要求1所述的MDCK细胞接种于无血清的培养基中培养；和
(2)在胰酶存在下，用所述病毒感染细胞并在所述细胞中扩增。
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