BR112013005298A2 - Linhagem celular derivada de rim canino de madin-darby (mdck), método para produzir um vírus vaccinia usando a linhagem celular derivada de mdck, método para produzir um vírus influenza a partir de uma cultura de célula, vírus ou antígeno de vírus e método para preparar uma linhagem celular derivada de mdck - Google Patents

Linhagem celular derivada de rim canino de madin-darby (mdck), método para produzir um vírus vaccinia usando a linhagem celular derivada de mdck, método para produzir um vírus influenza a partir de uma cultura de célula, vírus ou antígeno de vírus e método para preparar uma linhagem celular derivada de mdck Download PDF

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Lee Bong-Yong
Park Mahnhooon
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Abstract

linhagem celular derivada de rim canino de madin-darby (mdck), método para produzir um vírus vaccinia usando a linhagem celular derivada de mdck, método para produzir um vírus influenza a partir de uma cultura de célula, vírus ou antígeno de vírus e método para preparar uma linhagem celular derivada de mdck a presente invenção descreve uma linhagem celular derivada de rim canino de madin-darby (mdck). a linhagem celular derivada de mdck é derivada de células mdck depositadas sob o numero de acessá atcc ccl-34. a linhagem celular derivada de mdck pode ser preparada por cultura livre de soro e cultura de suspensão. preferivelmente, a linhagem celular derivada de mdck tem baixa ou nenhuma tumorigenicidade. a linhagem celular derivada de mdck é preferivelmente selecionada a partir de mdck sky1023, mdck sky10234 e mdck sky3851. também são descritos um método de cultura para o crescimento das células derivadas de mdck e um método para produzir um vírus vaccinia usando as células derivadas de mdck.

Description

LINHAGEM CELULAR DERIVADA DE RIM CANINO DE MADIN-DARBY (MDCK), MÉTODO PARA PRODUZIR UM VÍRUS VACCINIA USANDO A LINHAGEM CELULAR DERIVADA DE MDCK, MÉTODO PARA PRODUZIR UM VÍRUS INFLUENZA A PARTIR DE UMA CULTURA DE CÉLULA, VÍRUS OU ANTÍGENO DE VÍRUS E MÉTODO PARA
PREPARAR UMA LINHAGEM CELULAR DERIVADA DE MDCK
CAMPO TÉCNICO
A presente invenção se refere a nina nova linhagem celular derivada de MDCK que pode ser preparada por cultura livre de soro e cultura de suspensão sem a necessidade de ser presa aos veículos, um método para preparar a linhagem celular derivada de MDCK, e um método para produzir um vírus vaccinia usando a linhagem celular derivada de MDCK.
TÉCNICA ANTECEDENTE
Ovos fertilizados, cérebros de camundongo, células primárias, e células estabelecidas são geralmente usados como fontes para a produção de vacinas. Entretanto, tais fontes de vacina tradicionais apresentam vários problemas. Por exemplo, quando for pretendido usar ovos de galinha fertilizados para a produção de vacina, haverá dificuldades na criação de galinhas, o controle dos ovos fertilizados dependendo dos programas de produção de vacina e ingredientes de purificação derivados de proteínas do ovo.
O soro de bezerro fetal é geralmente adicionado como um fator de crescimento para a cultura de célula. Entretanto, o soro é susceptível à contaminação com príons e vírus e seus produtos comerciais podem variar na qualidade. Além disso, os produtos de soro de bezerro fetal de alta qualidade derivados de bezerros da Austrália e Nova Zelândia apresentam preços elevados, resultando em um aumento no custo da produção.
As linhagens celulares de MDCK são linhagens celulares estabelecidas onde vários tipos de vírus podem proliferar. Uma vez que as linhagens celulares de MDCK exibem uma forte tendência a se prender a outras superfícies, os veículos e recipientes de cultura de área grande são requeridos para cultura de grande escala, incorrendo em custos consideráveis. Especificamente, os custos de investimento para os veículos ou
2/13 equipamento de cultura são vastos e uma etapa de processamento é necessária para remover as células presas aos veículos, colocando em risco de perda e dano às células. Desse modo, há uma demanda por uma linhagem celular que possa ser preparada por cultura livre de soro e cultura de suspensão e é, desse modo, adequada para uso na produção de uma vacina através da cultura de célula animal de uma maneira econômica e segura.
A Patente U.S. No. 6.825.036 descreve uma linhagem celular derivada de MDCK que pode crescer em cultura livre de soro e em cultura de suspensão sem um veículo sólido. A Patente U.S. emprega duas abordagens para a adaptação da linhagem celular para a cultura de suspensão. De acordo com a primeira abordagem, a linhagem celular derivada de MDCK é obtida por cultura de suspensão direta em um frasco giratório. Neste caso, a densidade celular não alcança Ι,ΟχΙΟ6 células/mL, um nível necessário para a produção em escala industrial. De acordo com a segunda abordagem, a linhagem celular derivada de MDCK é obtida por cultura das células MDCK originais na presença de contas como veículos, expandindo a escala de cultura e desenvolvendo as células cultivadas na ausência de veículos. A segunda abordagem apresenta a desvantagem de que o procedimento é relativamente complicado.
Há vários relatos de que as linhagens celulares de MDCK originais são tumorigênicas. Desse modo, existe um risco de tumorigenicidade potencial quando linhagens celulares de MDCK originais são usadas para a produção de vacina. Nessas circunstâncias, há uma demanda de desenvolver uma nova linhagem celular que pode ser preparada por cultura livre de soro e cultura de suspensão e preferivelmente apresenta tumorigenicidade muito baixa ou é não tumorigênica.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Problema Técnico
A presente invenção foi desenvolvida para resolver os problemas da técnica anterior, e, portanto, é um objetivo da presente invenção fornecer uma linhagem celular derivada de MDCK que pode ser vantajosamente preparada por cultura
3/13 livre de soro e cultura de ’suspensão e que tenha muito baixa ou nenhuma tumorigenicidade quando comparado com as linhagens celulares de MDCK originais que podem ser usadas para crescimento dos vírus vaccinia. É outro objetivo da presente invenção fornecer 5 um método para a produção de um vírus, particularmente virus influenza, usando a linhagem celular.
Solução ao Problema
Referência Cruzada a Pedido Relacionado
Este pedido reivindica prioridade sob a 35 USC 10 119(a) ao Pedido de Patente PCT No. PCT/KR2010/006041 depositado em 6 de Setembro de 2010 e ao Pedido de Patente Coreano No. 102011-0085902 depositado na República da Coréia em 26 de Agosto de 2011, os teores totais das quais estão incorporados aqui por referência.
Solução Técnica
Para alcançar os objetivos acima, a presente invenção fornece uma linhagem celular derivada de rim canino de Madin-Darby (MDCK) particular que é derivada de células MDCK depositadas sob o número de acesso ATCC CCL-34, não requer soro 20 para o crescimento celular e pode ser preparado por cultura de suspensão sem a necessidade de ser presa aos veículos.
A linhagem celular derivada de MDCK da presente invenção pode ser preparada através das seguintes etapas: Sl) adaptar uma linhagem celular de MDCK original a um meio livre de 25- soro para preparar uma linhagem celular adaptada à cultura livre de soro; e S2) adaptar diretamente a linhagem celular adaptada à cultura livre de soro para cultura de suspensão sem passar por adaptação do veículo e mapeamento (screening) da linhagem celular desejada.
Mais especificamente, a linhagem celular derivada de MDCK da presente invenção pode ser preparada por um método incluindo (a) preparar células MDCK originais depositadas sob o número de acesso ATCC CCL-34, (b) adaptar as células MDCK originais a um meio livre de soro quimicamente definido para 35 permitir que as células MDCK originais cresçam no meio livre de soro, e (c) induzir adaptação direta das células MDCK aderentes adaptadas na etapa (b) à cultura de suspensão em um meio livre de
4/13 soro quimicamente definido sem passar por adaptação do veículo para permitir que as células MDCK cresçam em um estado de suspensão sem os veículos.
A linhagem celular derivada de MDCK recentemente estabelecida pelo método pode ser preparada por cultura livre de soro e cultura de suspensão. A linhagem celular derivada de MDCK da presente invenção é preferivelmente selecionada a partir de MDCK Skyl023 (DSM ACC3112), MDCK Skyl0234 (DSM ACC3114) e MDCK Sky3851 (DSM ACC3113), os quais foram depositados em Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Braunschweig, Alemanha, em 27 de Janeiro de 2011.
O termo meio livre de soro como usado aqui significa um meio ao qual o soro não é substancialmente adicionado e no qual a linhagem celular estabelecida da presente invenção pode ser preparada por cultura.
A expressão soro não é substancialmente adicionado significa que o soro está presente em uma quantidade de 0,5% em volume ou menos, preferivelmente 0,1% em volume ou menos, mais preferivelmente 0,01% em volume ou menos, mais preferivelmente não está presente em nenhuma quantidade.
A Patente U.S. No. 6.825.036 emprega duas abordagens para preparar uma linhagem celular derivada de MDCK em um meio livre de soro por cultura de suspensão. A primeira abordagem tenta a cultura de suspensão direta de uma linhagem celular de MDCK original em um frasco giratório. Neste caso, a densidade das células não alcança 1,0x10® células/mL, um nível necessário para produção em escala industrial. De acordo com a segunda abordagem, a linhagem celular derivada de MDCK é obtida por cultura das células MDCK originais na presença de veículos e crescimento das células cultivadas na ausência de veículos.
Em contraste, a presente invenção tenta a cultura direta de células MDCK originais em um frasco giratório sem passar por adaptação de veículo para preparar uma linhagem celular recentemente estabelecida que pode ser preparada em um meio livre de soro por cultura de suspensão. A linhagem celular estabelecida B-702 da Patente U.S. No. 6.825.036 alcança uma densidade celular de 1,0x10® células/mL em uma semana, ao passo que a linhagem
5/13 celular estabelecida da presente invenção alcança uma densidade celular de pelo menos Ι,ΟχΙΟ6 células/mL em cerca de 3 dias, indicando potencial de proliferação muito superior.
Vários relatos declaram que as linhagens celulares de MDCK previamente conhecidas são tumorigênicas. Em contraste, a linhagem celular estabelecida da presente invenção tem muito baixa ou nenhuma tumorigenicidade quando comparada com as linhagens celulares de MDCK conhecidas. Especificamente, as linhagens celulares derivadas de MDCK recentemente estabelecidas preparadas na seção de Exemplos foram confirmadas como tendo muito baixa ou nenhuma tumorigenicidade quando comparadas com as linhagens celulares de MDCK existentes através de testes usando as linhagens celulares, os lisatos celulares e DNAs celulares em camundongos nus. A partir desses resultados de teste, pode ser concluído que a linhagem celular derivada de MDCK da presente invenção é estável o suficiente para ser usada para a produção de vacina. Mais preferivelmente a linhagem celular derivada de MDCK da presente invenção pode ser preparada por cultura livre de soro e cultura de suspensão.
A presente invenção também fornece um método para produzir um vírus vaccinia usando a linhagem celular derivada de MDCK. Os exemplos de vírus que podem ser crescidos usando a linhagem celular derivada de MDCK inclui vírus influenza, vírus do sarampo, vírus de encefalite japonesa, vírus da papeira, vírus da rubéola, vírus da pólio, HSV-1, HSV-2, vírus da raiva, vírus RS, reovírus tipo 3, vírus, da febre amarela, parvovirus, coxsackievirus, adenovirus tipo 1 ao 47, vírus de Lassa e vírus vaccinia. A linhagem celular derivada de MDCK da presente invenção é mais adequada para uso na produção de vírus influenza.
Mais especificamente, a presente invenção fornece um método para produzir um vírus influenza a partir de uma cultura celular, o método incluindo: (a) inocular um meio de cultura livre de soro com as células derivadas de MDCK a uma concentração de cerca de lxlO4 a cerca de lxlO6 células/mL; (b) permitir que as células derivadas de MDCK cresçam em um sistema biorreator descartável até que a densidade celular alcance pelo menos cerca de 5xl06 células/mL, incluindo cultivar as células derivadas de
6/13
MDCK ao mesmo tempo em que mantêm uma ou mais condições de cultura selecionadas a partir do grupo consistindo em uma taxa de agitação de cerca de 40 a cerca de 100 rpm, um pH de cerca de 6,5 a cerca de 7,5 e uma concentração de oxigênio dissolvido (DO) de cerca de 35 a cerca de 100%; (c) infectar as células derivadas de MDCK crescidas com um vírus influenza,· (d) cultivar as células derivadas de MDCK crescidas infectadas sob condições que permitam a clonagem do vírus influenza; e' (e) isolar o vírus influenza da composição de cultura de célula. Preferivelmente, o método de produção do vírus influenza da presente invenção também inclui adicionar um meio fresco à cultura de célula ou substituir uma parte do meio por um meio fresco na etapa (b).
A presente invenção também fornece um vírus ou um antígeno de vírus produzido pelo método de produção de vírus. A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica imunogênica incluindo o antígeno do vírus.
Efeitos Vantajosos da invenção
A nova linhagem celular derivada de MDCK da presente invenção pode ser preparada por cultura livre de soro e cultura de suspensão e apresenta a vantagem de tumorigenicidade muito baixa ou nenhuma tumorigenicidade. Além disso, a nova linhagem celular derivada de MDCK da presente invenção pode ser eficazmente usada para proliferação de vírus. Ademais, a nova linhagem celular derivada de MDCK da presente invenção é adequada para uso na produção de um vírus, particularmente um vírus influenza.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Os desenhos anexos ilustram as modalidades preferidas da invenção e, junto com a descrição anterior, servem para fornecer entendimento adicional do espírito técnico da invenção. Entretanto, a presente invenção não deve ser considerada como sendo limitada aos desenhos.
A Figura 1 mostra os perfis de crescimento celular de linhagens celulares derivadas de MDCK durante a cultura de suspensão em frascos giratórios;
7/13.
A Figura 2 é um fluxograma mostrando um processo de purificação representativo de um vírus influenza; e
A Figura 3 mostra os resultados do teste de soro de HI obtidos em experimentos animais usando amostras purificadas de vírus crescidos em linhagens celulares derivadas de MDCKs.
MODO PARA INVENÇÃO
Os seguintes exemplos são fornecidos para auxiliar em um entendimento adicional da invenção. Entretanto, esses exemplos podem tomar várias outras formas, e o escopo da invenção não deve ser considerado comosendo limitado aos mesmos. Esses exemplos são fornecidos para mais completamente explicar a invenção para aqueles tendo conhecimento ordinário na técnica a qual a invenção pertence.
Exemplo 1: Preparação de Linhagens Celulares Derivadas de MDCK por Cultura Livre de Soro e Cultura de Suspensão
CCL-34, uma linhagem celular MDCK, foi fornecida a partir de ATCC. CCL-34 foi cultivada em um meio EMEM suplementado com 10% de soro em um frasco de T-25 a 372C e 5% de C02 - Após as células terem sido expandidas, elas foram cultivadas em um meio consistindo do meio EMEM e um meio livre de soro (50%). Foi confirmado se o crescimento das células foi normal ou não durante a cultura. Quando o crescimento das células foi confirmado como normal, as células crescidas foram cultivadas em um meio contendo um meio livre de soro (75%) . Este procedimento foi repetido para obter uma linhagem celular adaptada a um meio livre de soro (100%) . EX-CELL MDCK (Sigma) , UltraMDCK (Lonza) e VP-SFM (Invitrogen) podem ser usados como os meios para a cultura livre de soro.
A linhagem celular adaptada ao meio livre de soro foi suficientemente expandida em um frasco em T. Depois, a linhagem celular expandida foi adaptada à cultura de suspensão com agitação em uma taxa de 40-80 rpm em um frasco giratório (Corning) a 372C e 5% de C02. Quando o pH do meio de cultura foi diminuído ou as células foram crescidas acima de um nível predeterminado, o meio foi trocado por outro novo ou as células foram subcultivadas. Após a adaptação à cultura de suspensão durante 3-6 meses, a
8/13 concentração de células alcançou 2xl06 células/mL ou mais. A viabilidade celular foi de 95% ou maior e a cultura de suspensão em células isoladas foi observada. EX-CELL 302 CHO (Sigma), UltraCHO (Lonza) e SMIF-6 (Invitrogen) podem ser usados como os meios para a cultura de suspensão. Como um resultado da cultura livre de soro e cultura de suspensão, três tipos de linhagens celulares derivadas de MDCK foram obtidos e designados MDCK Skyl023, MDCK Skyl0234 e MDCK Sky3851.
Exemplo 2: Avaliação de Potenciais de Proliferação das Linhagens Celulares
As linhagens celulares derivadas de MDCK preparadas por cultura nos meios livres de soro foram cultivadas sob as condições indicadas na Tabela 1. Os potenciais de proliferação das linhagens celulares derivadas de MDCK foram, avaliados. A linhagem celular de MDCK (ATCC CCL-34) como um controle foi cresceu em um meio suplementado com 10% de soro.
TABELA 1
Linhagens celulares derivadas de MDCK Controle (ATCC CCL-34)
Meios de Cultura EX-CELL MDCK (Sigma), UltraMDCK (Lonza), VP-SFM (Invitrogen) EMEM (Lonza)
Aditivos L-Glutamina (Lonza) 2% em v/v L-Glutamina (Lonza) 2% em v/v, Soro de bezerro fetal (Lonza) 10% em v/v
Condições da Cultura 37eC, 5% de CO2, umidade 37SC, 5% de CO2, umidade
Volume da Cultura Frasco T-75 (15 ml) Frasco T-75 (15 ml)
As concentrações celulares foram cerca de Ι,ΟχΙΟ5 células/mL no início da cultura. Quando as concentrações celulares alcançam cerca de IxlO6 células/mL ou 3-4 dias após a cultura, as células foram subcultivadas. As concentrações de células no início da subcultura foram ajustadas para IxlO5 células/mL.
Cada uma das linhagens celulares derivadas de MDCK crescidas nos meios livres de soro mostrou uma taxa de crescimento celular comparável àquela da linhagem celular de MDCK crescida no meio de soro.
Exemplo 3: Avaliação dos Perfis de Proliferação e Estabilidade de
9/13
Subcultura das Linhagens Celulares
Após os três tipos de linhagens. celulares adaptadas à cultura livre de soro e cultura de suspensão terem sido continuamente cultivados nos respectivos frascos giratórios, seus perfis de proliferação e estabilidade de subcultura foram avaliados. As concentrações de célula no início da cultura foram ajustadas para cerca de 4xl05 células/mL. Cerca de 3-4 dias após a cultura, as concentrações de célula alcançaram cerca de 2xl06 células/mL ou mais. A cultura foi conduzida sob as seguintes condições. Os resultados são mostrados na Figura 1.
Concentração de células inicial: 4xl05 células/mL
Escala de Cultura: frasco giratório de 50 mL
Taxa de rotação da centrífuga: 60 rpm
Condições da Cultura: 372C, 5% de CO2, umidade
Condições de Subcultura; 3-4 dias após a cultura
Exemplo 4: Avaliação da proliferação do Vírus
2010/2011 cepas de vacina da influenza sazonal foram crescidas usando as células derivadas de MDCK sob as seguintes condições de cultura de'suspensão:
Concentração das células: 2xl06 células/mL
Escala da Cultura: frasco giratório de 1.000 mL Taxa de rotação da centrífuga: 60 rpm
Condições da Cultura: 342C, 5% de CO2, umidade
Período da Cultura: 3 dias
Sabe-se geralmente que os vírus influenza crescem melhor durante a cultura a 34 2C do que a 372C, o que foi experimentalmente confirmado. A tripsina foi incluída em meios de cultura para infectar as linhagens celulares com os vírus da influenza durante a cultura. As concentrações (titers) dos vírus da influenza foram medidos por ensaio de hemaglutinação. Após cultura durante 3 dias, a maioria das células foi morta. Os sobrenadantes da cultura foram coletados e as concentrações dos vírus foram medidas. Os resultados são mostrados na Tabela 2. Como pode ser observado a partir dos resultados na Tabela 2, a maioria dos vírus mostrou concentrações de HA de 1.024 ou mais. Os níveis de crescimento dos vírus foram similares àqueles de ovos ou
10/13 células MDCK cultivadas em meio contendo FBS a 10%. Esses resultados provaram que as linhagens celulares derivadas de MDCK são adequadas para a produção eficiente de vírus em condições de cultura livre de soro e cultura de suspensão.
TABELA 2
Vírus MDCK Sky1023 MDCK Sky10234 MDCK Sky3851
A/California/07/2009 (H1N1) 512 1.024 2.048
A/perth/16/2009 (H3N2) 1.024 1.024 4.096
B/Brisbane/60/2008 4.096 2.048 4.096
Exemplo 5: Identificação da Capacidade dos Vírus Crescidos formarem Anticorpos
Para identificar a capacidade dos vírus influenza crescidos nas células derivadas de MDCK de formar anticorpos, os vírus foram purificados das soluções de cultura e inoculados em camundongos. Os valores do anticorpo dos vírus foram medidos. Um fluxograma do processo de purificação é mostrado na Figura 2, e uma breve explicação do mesmo é dada abaixo.
Em primeiro lugar, cada uma das soluções de cultura de vírus foi centrifugada para remover os lisatos de célula das mesmas e filtrada através de um filtro de 0,45 pm. O filtrado foi concentrado por ultrafiltração usando um cartucho de corte de 300 kDa, e o vírus foi inativado com formalina. Depois, o vírus foi isolado da solução de cultura por ultracentrifugação através de um gradiente de concentração de sacarose. O vírus foi rompido por tratamento com Triton X-100, concentrado por ultrafiltração para remover o detergente, filtrado através de um filtro de 0,2 pm para esterilizar, proporcionando uma solução de vacina.
As soluções purificadas da cepa de vírus A/California/07/2009 (H1N1) cresceram usando as três linhagens celulares derivadas de MDCK: MDCK Skyl023, MDCK Skyl0234 e MDCK Sky3851 foram usadas para experimentos animais para identificar a eficácia da cepa do vírus. Como um controle, uma vacina de influenza sazonal 08/09 (IVR-148, NYMC X-175C, B/Florida/4/2006) foi usada. Um total de seis grupos de teste foram usados, cada um dos quais foi inoculado em cinco camundongos. As amostras de soro
11/13 dos cinco camundongos foram, coletadas. Um teste de inibição de hemaglutinação (HI) foi conduzido no soro coletado para medir o valor do anticorpo do vírus.
soro foi obtido retirando-se sangue do plexo 5 retro-orbital dos camundongos usando um tubo capilar antes da injeção (semana 0) do grupo de teste nos camundongos. Após a retirada de sangue, um total de 200 pL do grupo de teste foi injetado nas pernas traseiras (100 pl para cada perna) de cada um dos camundongos através da rota de IM. Duas semanas após a 10 injeção, o soro foi obtido retirando-se sangue do plexo retroorbital da mesma maneira como acima. A mesma quantidade do grupo de teste como aquela injetada na semana 0 foi inoculada em cada um dos camundongos para reforçar a capacidade de formar anticorpos. Quatro semanas após a injeção, o soro foi obtido retirando-se 15 sangue do plexo retro-orbital da mesma maneira como acima.
As amostras de soro obtidas foram tratadas pelo seguinte procedimento. As amostras de soro retiradas dos camundongos foram coletadas e divididas em amostras de 30 pL. 90 pL de RDE foram adicionados a cada 3 0 pL de amostra e foram 20 permitidos repousar a 372C durante pelo menos 18 horas. A mistura também foi deixada repousar a 5 6 2C durante pelo menos 30 min para inativar o RDE. Subsequentemente, 120 pL de solução salina fisiológica a 0,85% e 15 pL (um volume correspondendo a 1/20 do volume total) de hemácias de frango foram subsequentemente 25 adicionadas, suficientemente suspensas, e deixadas repousar a 42C durante 1 hora. As células sanguíneas sedimentadas foram novamente suspensas em intervalos de 30 minutos. Depois, a suspensão foi centrifugada a 1.200 rpm durante 10 minutos para separar o soro. O teste de HI foi conduzido no soro para medir o valor de anticorpo 30 do soro. Os resultados medidos são mostrados na Tabela 3. Todos os grupos experimentais foram medidos para ter concentrações de HI de 40 ou mais. Isto é, quando o vírus cultivado das células derivadas de MDCK foi injetado nos animais, similarmente à vacina existente, foi confirmado que os anticorpos contra o vírus foram formados. A 35 partir desses resultados, pode ser concluído que as linhagens celulares derivadas de MDCK são úteis para a produção de vacinas de vírus.
12/13
TABELA 3
Grupo Experimental Linhagem Celular Quantidade de antígeno inoculado Concentração (titer) de HI
1 MDCK Sky 1023 15 pg/camundongo 80
2 MDCK Sky10234 15 pg/camundongo 160
3 MDCK Sky10234 7,5 pg/camundongo 160
4 MDCKSky3851 15 pg/camundongo 80
5 MDCKSky3851 7,5 pg/camundongo 80
6 Vacina de Referência 320
Exemplo 6: Identificação de Tumorigenicidade das Linhagens Celulares em Camundongos Nus
Para avaliar a tumorigenicidade das linhagens celulares MDCK Skyl203 e MDCK Sky3851, a linhagens celulares derivadas de MDCK e substâncias derivadas delas (incluindo os lisatos de célula e DNAs de célula) foram transplantados na hipoderme de camundongos BALB/c-nu/nu como animais de teste, como indicado na Tabela 4. Uma observação foi feita para determinar se 10 os tumores foram formados durante 12 semanas. As células foram inoculadas em doses de 101, 103, 105 e 107 células, os lisatos de célula foram inoculados em doses de 105 e 107 células, e os DNAs de célula foram inoculados em doses, de 105 e 107 células. Cada um dos grupos foi inoculado em 5-10 camundongos. Os resultados 15 experimentais são mostrados na Tabela 4. As linhagens celulares
MDCK Skyl023 e MDCK Sky3851 foram confirmadas por ter baixa ou nenhuma tumorigenicidade quando comparado com a linhagem celular de MDCK original (ATCC) como um controle interno.
13/13
TABELA 4
Grupo Experimental Amostra Experimental Dose Número de animais onde o tumor foi encontrado
Controle Negativo PBS 0/5
Controles Positivos Células HeLa 105 1/5
Células HeLa 107 5/5
Grupos Internos MDCK 101 0/10
MDCK 103 0/10
MDCK 105 10/10
MDCK 107 9/10
MDCK Sky1023 Células 101 0/10
103 0/10
105 3/10
107 10/10
Lisatos de célula 105 0/5
107 0/5
DNAs 106 0/5
107 0/5
MDCKSky3851 Células 101 0/10
103 0/10
105 0/10
107 0/10
Lisatos de Célula 105 0/5
107 0/5
DNAs 105 0/5
107 0/5
r — — — — — '— — ____ ______ ______ _____ _ _
REIVINDICAÇÕES

Claims (10)

1. Linhagem celular derivada de rim canino de Madin-Darby (MDCK) caracterizada por ser derivada de células MDCK depositadas sob o número de acesso ATCC CCL-34, não requerer soro
5 para o crescimento celular e ser preparada por cultura de suspensão sem a necessidade de ser presa aos veículos.
2. Linhagem celular derivada de MDCK, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a linhagem celular derivada de MDCK tem baixa ou nenhuma tumorigenicidade .10 .. quando comparada com a linhagem celular de MDCK original.
3. Linhagem celular derivada de MDCK, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a linhagem celular derivada de MDCK é MDCK Skyl023 (DSM ACC3112), MDCK Skyl0234 (DSM ACC3114) ou MDCK Sky3851 (DSM ACC3113).
15
4. Método para produzir um vírus Vaccinia usando a linhagem celular derivada de MDCK caracterizado por ser como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o vírus é selecionado do grupo
20 consistindo em vírus da influenza, vírus do sarampo, vírus da encefalite japonesa, vírus da papeira, vírus da rubéola, vírus da pólio, HSV-1, HSV-2, vírus da raiva, vírus RS, reovírus tipo 3, vírus da febre amarela, parvovirus, coxsackievirus, adenovirus tipo 1 a 47, vírus Lassa e vírus Vaccinia.
25
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o vírus é um vírus influenza.
7. Método para produzir um vírus influenza a partir de uma cultura de célula, o método caract eri z ado por compreender:
30 (a) inocular um meio de cultura livre de soro com a célula derivada de MDCK como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em - uma concentração de lxlO4 a lxlO6 células/mL;
(b) permitir que as células derivadas de MDCK
35 cresçam em um sistema de biorreator disponível até que a densidade da célula alcance pelo menos 5xl06 células/mL, compreendendo cultivar as células derivadas de MDCK ao mesmo tempo em que se
2/2 mantêm uma ou mais condições de cultura selecionadas a partir do grupo consistindo em uma taxa de agitação de 40 a 100 rpm, um pH de 6,5 a 7,5 e uma concentração de oxigênio dissolvido (DO) de 35 a 100%;
5 (c) infectar ás células derivadas de MDCK crescidas com um vírus influenza;
(d) cultivar as células derivadas de MDCK crescidas infectadas em condições que permitam a clonagem do vírus influenza; e
10 (e) isolar o vírus influenza da composição de cultura, de célula.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende também adicionar um meio fresco à cultura de célula ou substituir uma parte do meio por um
15 meio fresco na etapa (b).
9. Vírus ou antígeno de vírus caracterizado por ser produzido pelo método conforme definido na reivindicação 7 ou
8.
10. Método para preparar uma linhagem celular
20 derivada de MDCK que não requer soro para o crescimento celular e é preparada por cultura de suspensão sem a necessidade de ser presa aos veículos, o método caracterizado por compreender:
(a) preparar as células MDCK originais depositadas sob o número de acesso ATCC CCL-34;
25 (b) adaptar as células MDCK originais a um meio livre de soro para permitir que as células MDCK originais cresçam no meio livre de soro; e (c) adaptar as células MDCK aderentes adaptadas na etapa (b) a um meio livre de soro para permitir que as células
3 0 MDCK cresçam em um estado, de suspensão sem a necessidade de veículos.
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