CN103386125A - 肾综合征出血热鼻黏膜免疫气溶胶疫苗的研制 - Google Patents
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Abstract
本项技术发明的肾综合征出血热滴鼻或气雾疫苗,由传统注射途径改为鼻腔黏膜给药,是疫苗免疫途径的重大创新和突破。本发明源头创新性从HFRS病人急性早期全血和褐家鼠中分离出I型和II型病毒作为毒种,成功地将毒种适应到Vero细胞上并获得大量增殖,发明了Matrex Cellufine Sulfate亲和层析与Sepharose4FF凝胶过滤等多柱串联层析纯化方法,经载体筛选优化,制备了适合鼻黏膜给药途径的HFRS气溶胶疫苗。研制了HN-2012JZQ型气溶胶疫苗接种枪。经动物实验,该疫苗具备免疫原性和免疫反应性。本项发明为规模化生产、使用方便、简单安全的HFRS气溶胶疫苗,提供了重要的应用基础理论依据。
Description
技术领域:
本发明属于气溶胶疫苗技术领域范畴。涉及肾综合征出血热(HFRS)病原分离培养、适应训化、疫苗载体材料优化和气溶胶鼻黏膜免疫接种枪。
背景技术:
肾综合征出血热是由汉坦病毒(HTNV)引起的重大传染性疾病,全世界每年约有20万人患HFRS,我国是HFRS危害最严重的国家,90%以上的HFRS病例发生在中国,占世界发病率的90%,死亡率3~10%,我国东北地区是该传染病的自然疫原地,也是监测防治的重点。由于临床上无特异性治疗药物和控制方法,接种疫苗仍然是预防HFRS采取的重要措施。HFRS气溶胶疫苗能够改变病毒性疾病一直以传统针剂注射疫苗为主的现状,特别是每年在世界范围内由于疫苗注射导致的疾病死亡率高达500万人,同时存在接种速度慢,覆盖率低的缺陷。气雾途径给药可做到起效快、副作用小、成本低、使用方便,预防效果好的特点。并具备放大生产等优势,可大量快速地提供给疫区和突发公共卫生事件中大规模人群使用,社会效益显著,同时对人民群众身体健康和社会稳定能够作出贡献,具有重大的科技战略意义。
目前,我国使用的HFRS疫苗多数为鼠脑或鼠肾细胞生产的注射给药途径的免疫方法,尚存在地域排斥的缺点(流行株由于地域来源不同,用于异地则免疫保护缺失)。研究表明,气溶胶传播是汉坦病毒从啮齿动物感染人类的主要途径,因此,通过鼻黏膜给药进行气溶胶免疫是符合原位免疫设计理念的,它可以在感染起始阶段进行预防,同时还具有安全方便由刺激局部黏膜免疫带动机体系统免疫的优点。本项发明使用的病毒是刘江秋等1982年冬季从吉林省长白山地区肾综合征出血热病人急性早期全血中分离出的病毒H8207(I型)和1983年春季在辽西葫芦岛疫区从褐家鼠体内分离出家鼠型病毒Y86013(II型)作为疫苗毒种。经载体选择与优化,创新了传统HFRS疫苗的给药途径,发明了HFRS气溶胶疫苗和气溶胶疫苗接种枪,获得了理想的免疫实验效果。
发明内容:
本发明的目的是研究实验肾综合征出血热病毒气溶胶疫苗。通过如下技术方案实现:
1.HFRS病毒I型H8207和II型Y86013株的分离与鉴定:
源头创新性从肾综合征出血热病人急性早期全血中分离出两株病毒(I型和II型),对病毒进行了理化性质、免疫学性状和基因测序等全面系统鉴定。该毒株具有病毒毒力强,免疫原性好,在Vero细胞上适应性强,H8207株镜下呈片状荧光反应等生物学特性。经序列分析鉴定为新基因亚型,疫苗毒株具有自主知识产权。经国家药监局和中国药品生物制品检定所鉴定确认,适合作为HFRS气雾疫苗的生产毒种。
2.HFRS毒株在Vero细胞基质培养、适应、驯化、传代和增殖:
Vero传代细胞是WHO推荐的第二代疫苗生产基质,其替代动物组织细胞可以提升疫苗质量。由于HFRS病毒不易适应于Vero细胞,因此,经过大量的实验改进,最终使HFRS毒株在Vero细胞中反复传代适应,本发明成功地将毒种适应到Vero细胞上并能够大量增殖,毒力研究,病毒滴度达到7.0~7.8logTCID50/ml。解决了制备该疫苗的毒种问题。
3.HFRS病毒抗原制备:
HFRS病毒经切向流过滤澄清、灭活、超滤浓缩、建立了Matrex Cellufine Sulfate亲和层析与Sepharose 4FF凝胶过滤的多柱串联层析纯化方法。无外源性DNA污染,使疫苗更纯净、安全,抗原收率增加,为解决该疫苗大规模生产,实现疫苗质量可控和免疫效果理想的目标奠定了基础。该技术使疫苗具有高纯度、高效价和高质量稳定性,降低了生产成本,质量标准达到国内外领先水平。
4.HFRS气溶胶疫苗载体选择优化:
本发明选择具有良好的生物相容性和生物可降解性材料-壳聚糖为肾综合征出血热气溶胶疫苗递呈载体,尚未见国内外报道。实验中分别以不同分子量(分子量:Mr:173KDa;210KDa;250KDa;390Kda;脱乙酰程度60~90%,)、不同浓度壳聚糖和不同含量HFRS病毒抗原作变量,鼻黏膜免疫小鼠,筛选最佳量-效配比关系。通过系列正交实验,结果确定初免剂量为10~20μg//只,一周后同等剂量加强免疫1次。病毒抗原∶0.25%壳聚糖(250KDa)=1∶1(v/v),免疫小鼠血清中和抗体效价达≥1∶20以上,各组小鼠无异常反应。
4.气溶胶疫苗接种枪的研制:
本发明研制了HN-2012JZQ型气溶胶疫苗接种枪。其特点是剂量可控,强度可调,一次性枪头。具有使疫苗接种成本低、方便简洁快速、接种质量效果好、易于大规模群体免疫接种等优点。
5.肾综合征出血热气溶胶疫苗的免疫原性和免疫反应性
采用气溶胶发射枪经鼻黏膜途径免疫小鼠,剂量为(10~20μg/100μl/只),一周后加强免疫1次,间接ELISA法检测血清抗体,流式细胞仪(FACS)检测3000个脾T淋巴细胞,结果表明:以HFRS病毒抗原和壳聚糖为载体材料制备的肾综合征出血热气溶胶疫苗,能够激发小鼠体内产生高滴度的中和抗体和增强细胞免疫水平,本项研究发明的肾综合征出血热气溶胶疫苗及鼻黏膜途径给药的免疫方法能提高实验小鼠的体液免疫与细胞免疫,具备免疫原性与免疫反应性。
本发明的实用意义:
肾综合征出血热是由汉坦病毒(HTNV)引起的一种自然疫源性疾病,在临床上以发热、出血和肾损害为基本特征,但发病机制尚未最后阐明,临床缺乏特异有效的治疗措施,因此寻找安全有效的疫苗是控制HFRS流行和发生的关键。国内外有关HFRS病毒疫苗的生产经历了鼠脑-地鼠肾细胞-传代细胞(Vero细胞和2BS细胞)过程,用原代细胞培养生产疫苗所用的动物均为开放式饲养,外源病毒和微生物无法控制,疫苗杂蛋白含量高,毒副反应强,抗体阳转率低。使用原代细胞生产周期长,产品成本高。本发明使用Vero细胞制备的肾综合征出血热气溶胶疫苗,模拟HFRS病毒自然感染途径进行鼻黏膜免疫,使病原体通过黏膜侵入机体的同时就能中和病原体,在感染的起始阶段进行预防,具有重要的实用价值。
Claims (7)
1.肾综合征出血热鼻黏膜免疫气溶胶疫苗的研制,其特征在于:包括以下步骤:
(1)HFRS病毒I型H8207和II型Y86013株的分离与鉴定:
源头创新性从肾综合征出血热病人急性早期全血中分离出两株病毒(I型和II型),该毒株具有病毒毒力强,免疫原性好,在Vero细胞上适应性强,镜下呈片状荧光反应等生物学特性。经序列分析鉴定为新基因亚型,疫苗毒株具有自主知识产权。
(2)HFRS毒株在Vero细胞基质培养、适应、驯化、传代和增殖:
HFRS病毒不易适应于Vero细胞。本发明经过大量的实验改进,成功地将毒种适应到Vero细胞上并能够大量增殖,病毒滴度达到在7.0~7.8logTCID50/ml。
(3)HFRS病毒抗原制备:
建立了Matrex Cellufine Sulfate亲和层析与Sepharose 4FF凝胶过滤的多柱串联层析纯化方法。无外源性DNA污染,使疫苗更纯净、安全,且抗原收率增加,为解决该疫苗大规模生产,实现疫苗质量可控和免疫效果理想的目标奠定基础。
(4)HFRS气溶胶疫苗载体选择优化:
本发明在实验中分别以不同分子量(分子量:Mr:173KDa;210KDa;250KDa;390Kda;脱乙酰程度60~90%,)、不同浓度壳聚糖和不同含量HFRS病毒抗原作变量,鼻黏膜免疫小鼠,通过系列正交实验,确定初免剂量为10~20μg//只,一周后同等剂量加强免疫1次。病毒抗原∶0.25%壳聚糖(250KDa)=1∶1(v/v),免疫小鼠血清中和抗体效价达≥1∶20以上,各组小鼠无异常反应。
(5)HFRS气溶胶疫苗接种枪的研制:
本发明研制了HN-2012JZQ型气溶胶疫苗接种枪。其特点是剂量可控,强度可调,一次性枪头。具有使疫苗接种成本低、方便简洁快速、接种质量效果好、易于大规模群体免疫接种等优点。
(6)HFRS气溶胶疫苗的免疫原性和免疫反应性
采用气溶胶发射枪经鼻黏膜途径免疫小鼠,间接ELISA法检测血清抗体,流式细胞仪(FACS)检测3000个脾T淋巴细胞,结果表明:以HFRS病毒抗原和壳聚糖为载体材料制备的肾综合征出血热气溶胶疫苗,能够激发小鼠体内产生高滴度的中和抗体和T淋巴细胞水平,本发明研制的肾综合征出血热气溶胶疫苗及鼻黏膜途径给药的免疫方法能提高实验小鼠的体液免疫与细胞免疫,具备免疫原性与免疫反应性。
2.根据权利要求1所述的肾综合征出血热鼻黏膜免疫气溶胶疫苗的研制,其特征在于:所述的HFRS病毒I型H8203和II型Y86013株为源头创新,疫苗毒株具有自主知识产权。
3.根据权利要求1所述的肾综合征出血热鼻黏膜免疫气溶胶疫苗的研制,其特征在于:所述的HFRS毒株经过适应、驯化和大量的实验改进,最终成功地将毒种适应到Vero细胞上并能够大量增殖,病毒滴度达到在7.0~7.8logTCID50/ml。
4.根据权利要求1所述的肾综合征出血热鼻黏膜免疫气溶胶疫苗的研制,其特征在于:所述的创建了Matrex Cellufine Sulfate亲和层析与Sepharose 4FF凝胶过滤的多柱串联层析纯化方法。
5.根据权利要求1所述的肾综合征出血热鼻黏膜免疫气溶胶疫苗的研制,其特征在于:所述的选择壳聚糖为肾综合征出血热气溶胶疫苗递呈载体,筛选了最佳量-效配比关系。确定初免剂量为10~20μg//只,同等剂量加强免疫1次。病毒抗原∶0.25%壳聚糖(250KDa)=1∶1(v/v),免疫小鼠血清中和抗体效价达≥1∶20以上。
6.根据权利要求1所述的肾综合征出血热鼻黏膜免疫气溶胶疫苗的研制,其特征在于:所述的研制了HN-2012JZQ型气溶胶疫苗接种枪。
7.根据权利要求1~6所述的发明了具有免疫原性和免疫反应性的肾综合征出血热鼻黏膜免疫气溶胶疫苗。
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