CN113957059B - 一步柱层析工艺精纯猪蓝耳病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及兽用生物制品技术领域，特别公开了一种一步柱层析工艺精纯猪蓝耳病毒的方法。该方法包括如下步骤：1）对猪蓝耳病毒细胞培养收获液进行三级过滤，去除细胞碎片，获得病毒澄清液；2）采用切向流对澄清液进行超滤浓缩；3）向病毒浓缩液中加入PBS溶液；4）重复步骤2和3，置换酚红；5）采用复合填料一步法纯化病毒浓缩置换液，收获流穿液即为猪蓝耳病毒精纯液。本发明操作简单，采用一步法柱层析工艺，纯化方法简单，处理量大，抗原回收率高，纯化效果好，适合规模化生产。

Description

一步柱层析工艺精纯猪蓝耳病毒的方法
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，特别涉及一种一步柱层析工艺精纯猪蓝耳病毒的方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种传染性疾病，主要引起母猪早产、流产、产木乃伊胎，仔猪和育肥猪出现呼吸系统症状，发病率与死亡率很高。该病于1987年在美国首次报道，我国于1996年获得该病毒的分离株，2006年出现该病的大面积爆发。根据抗原性和基因序列的不同，将猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）分为美洲株和欧洲株，而我国主要以美洲株为主。PRRSV变异性和重组能力强，不时有新毒株的流行，如最近流行的NADC30-like毒株，这大大增加了猪繁殖与呼吸综合征的防控难度。
PRRSV是一种有囊膜的RNA病毒，呈球形或卵圆形，直径为45-65nm，呈20面体对称。基因组大约有15kb大小，由至少9个重叠的开放阅读框(ORFs)组成,分别命名为ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3-ORF7。其中ORF5编码的GP5蛋白是最主要的结构蛋白，也是不同毒株间变异最大的蛋白。目前用于控制PRRS的疫苗有活疫苗和灭活疫苗两大类。活疫苗具有免疫效果好、免疫力强、免疫期长等优点，但可能存在散毒及毒力返强的风险；灭活疫苗具有安全、不散毒、便于贮存和运输且对母源抗体的干扰作用不敏感等优点。同时，灭活疫苗免疫剂量大，免疫副反应率高，这主要由于病毒培养液中的血清、宿主蛋白等过敏原所致，因此，蓝耳病毒的纯化成为影响蓝耳病毒灭活疫苗的关键点。现有纯化工艺多采用两步法，即离子交换和分子筛串联，但分子筛每次处理量为0.1个柱体积，纯化工艺繁琐，效率低，损失大，急需一种适用大规模生产的简单工艺。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种操作简单易行、产品纯度高、易于放大生产的一步柱层析工艺精纯猪蓝耳病毒的方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种一步柱层析工艺精纯猪蓝耳病毒的方法，包括如下步骤：
（1）以猪蓝耳病毒细胞培养液为处理对象，将其采用0.22-1μm滤芯进行过滤，去除细胞碎片，得到病毒澄清液；
（2）采用孔径为30-300kd的切向流膜包，对病毒澄清液进行5-15倍浓缩，得到浓缩液；
（3）向浓缩液中加入5-15倍体积的PBS溶液；
（4）重复步骤（2）和步骤（3）3-5次；
（5）将步骤（4）所得浓缩液进行复合填料柱层析，收获的流穿液即为蓝耳病毒精纯液。
本发明的更优技术方案为：
步骤（1）中，猪蓝耳病毒细胞培养液依次采用0.65μm滤芯、0.45μm滤芯、0.22μm滤芯串联过滤，经三级过滤澄清。
步骤（2）中，切向流膜包的孔径为30-100kd；进一步优选的，病毒澄清液浓缩5-10倍。
步骤（3）中，向浓缩液中加入5-8倍体积的PBS溶液。
步骤（5）中，复合填料层析介质为复合型交联琼脂糖微球，其兼具分子排阻和结合层析功能。
进一步优选的，复合填料柱的上样量为1-5个柱体积。
本发明工艺较现有技术有几个优势：（1）复合填料，一步柱层析工艺，操作简单，纯度高，损失小；（2）抗原为流穿模式，可直接使用，无需脱盐处理；（3）抗原处理量为1-5个柱体积，是分子筛的10-50倍，处理速度快。
本发明操作简单，采用一步法柱层析工艺，纯化方法简单，处理量大，抗原回收率高，纯化效果好，适合规模化生产。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为本发明复合填料纯化蓝耳病毒的SDS-PAGE图；
图中，M：25-120kd蛋白marker，1为浓缩液，2为流穿液1，3为流穿液2；
图2为采用复合填料纯化蓝耳病毒的峰图；
图3为复合填料纯化蓝耳病毒的Western-blot检测图；
图中，M：10-120kd蛋白marker，1为BSA，2为纯化后蓝耳病毒。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将对本发明的实施例中的技术方案进行清楚完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
本发明的实施例中蛋白浓度检测采用BCA检测试剂盒（Thermo），并使用传统方法TCID50测定蓝耳病毒毒价。
实施例1：
本实施例的纯化方法如下：
（1）取病毒含量TCID50/ml为7.8、蛋白含量为3490ug/ml的猪蓝耳病毒细胞培养液，采用0.65um+0.45um+0.22um三级过滤，去除细胞碎片，收集澄清液；
（2）采用孔径为100kd的横向切流浓缩膜包对步骤（1）中澄清液进行浓缩，浓缩倍数为10倍；
（3）向步骤（2）的浓缩液中加入5倍的PBS溶液；
（4）重复步骤（2）和（3）3次；
（5）采用复合填料复合型交联琼脂糖微球（purose shell V30，采购自江苏千纯生物科技有限公司）对步骤（4）中病毒浓缩液进行柱层析工艺纯化，上样量为5个柱体积，收获流穿液，即为猪蓝耳病毒抗原精纯液。
将各处理步骤均换算成相同体积，计算病毒滴度和总蛋白含量，以确定不同处理步骤对猪蓝耳病毒含量及杂蛋白的影响，如表1所示：
表1 不同处理步骤对猪蓝耳病毒滴度及杂蛋白的影响
。
实施例2：
本实施例的纯化方法如下：
（1）取病毒含量TCID50/ml为8.0、蛋白含量为4052mg/ml的猪蓝耳病毒细胞培养液，采用0.65um+0.45um+0.22um三级过滤，去除细胞碎片，收集澄清液；
（2）采用孔径为30kd的横向切流浓缩膜包对步骤（1）中澄清液进行浓缩，浓缩倍数为10倍；
（3）向步骤（2）的浓缩液中加入5倍的PBS溶液；
（4）重复步骤（2）和（3）5次；
（5）采用复合填料复合型交联琼脂糖微球（purose 6 Fast Flow，采购自苏州市海崴生物科技有限公司）对步骤（4）中病毒浓缩液进行柱层析工艺纯化，上样量为3个柱体积，收获流穿液，即为猪蓝耳病毒抗原精纯液。
将各处理步骤均换算成相同体积，计算病毒滴度和总蛋白含量，以确定不同处理步骤对猪蓝耳病毒含量及杂蛋白的影响，如表2所示：
。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (2)

1.一种一步柱层析工艺精纯猪蓝耳病毒的方法,其特征为,包括如下步骤: (1)以猪蓝耳病毒细胞培养液为处理对象,将其依次采用0.65μm滤芯、0.45μm滤芯、0.22μm滤芯串联过滤，经三级过滤澄清,得到病毒澄清液; (2)采用孔径为30-100kd的切向流膜包，对病毒澄清液进行 5-10 倍浓缩，得到浓缩液；(3)向浓缩液中加入5-15倍体积的 PBS溶液；(4)重复步骤(2)和步骤(3)3-5次；(5)将步骤(4)所得浓缩液进行复合填料柱层析，收获的流穿液即为蓝耳病毒精纯液;复合填料层析介质为江苏千纯生物科技有限公司生产的复合型交联琼脂糖微球purose shellV30；步骤(5)中,复合填料柱的上样量为1-5个柱体积。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，向浓缩液中加入5-8倍体积的PBS溶液。
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