CN117778299A - 一种用于cho细胞高效表达重组胶原蛋白的无血清培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于CHO细胞高效表达重组胶原蛋白的无血清培养。所述培养基包括氨基酸、维生素、无机盐、微量元素及碳水化合物和补充因子组分：本发明首先结合控制甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸含量促进胶原蛋白合成；进而引入维生素C和Fe2+的结合，维持Fe2+不被氧化成有毒性的Fe3+；同时结合优化维生素、微量元素和补充因子，引入了重组小分子胶原蛋白，进一步促进胶原蛋白的高效表达。最后，为了使整个培养过程更有效表达重组胶原蛋白，本发明还提供了一种补料培养基，所述无血清培养基和补料培养基不含任何血清组分，安全环保，对提高大规模CHO细胞表达重组胶原蛋白技术有重要意义，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于CHO细胞高效表达重组胶原蛋白的无血清培养基。
背景技术
重组胶原蛋白是将胶原蛋白基因克隆到选定的表达载体并转化到表达细胞内，通过纯化技术所获得的蛋白质。由于重组胶原蛋白分子单一、结构清晰、制备过程可控，可以解决生物医学上使用的胶原蛋白存在变异性、潜在的免疫原性和感染风险等问题，已成为代替动物源胶原蛋白的最佳替代物。重组胶原蛋白现阶段表达体系中以大肠杆菌、酵母为主，但因其缺乏动物细胞中胶原蛋白翻译后修饰，所表达的胶原蛋白缺乏羟基化及相应活性。而哺乳动物细胞表达体系所产生胶原蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子。在哺乳动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。CHO细胞具有良好的基因组背景特征和准确的转录后修饰功能，有利于外源重组基因高效扩增和表达。利用基因重组技术及CHO细胞表达系统生产的重组胶原蛋白，具有完整的三螺旋结构，力学强度高，有较好的热稳定性、不易受温度影响而解螺旋或降解，理化性质和生物活性接近天然胶原蛋白，产物为分泌型，易于分离纯化，避免内毒素风险。
CHO细胞是表达重组蛋白一种重要的底盘细胞，目前包括进口和国产的各大品牌培养基公司均有CHO无血清培养基产品，但是价格昂贵，成本较高。而且，多数CHO无血清培养基主要集中于维持细胞活率、细胞密度的研究；如专利(CN202310025615.9)一种CHO细胞无血清传代培养基及其制备方法和应用以及专利(CN202011219724.7)一种用于CHO细胞大规模培养的无血清培养基及应用等。关于针对重组胶原蛋白的表达以及提高胶原蛋白的质量和产量的培养基研究鲜有报道。对于应用于胶原蛋白生产中的CHO细胞来说，在正常生长的前提下，得到重组胶原蛋白的高表达量才是关键。目前市场上大部分的国内外厂商都是根据细胞的类型来配制相应的培养基，这样的做法虽然简化了培养基的产品类型，但是降低了目的蛋白的产率。
因此，目前CHO无血清培养基商业化产品难以针对性地实现重组胶原蛋白的高效表达并大规模应用于胶原蛋白的生产；所以研发用于CHO细胞高效表达重组胶原蛋白的无血清培养基至关重要。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种用于CHO细胞中高效表达重组胶原蛋白的无血清培养基，在提升细胞活率、细胞密度的同时，可针对性地提高重组胶原蛋白的表达，从而得到更多的目标产物，提高生产效率。
为了实现以上技术目的，本发明采取如下技术方案：
提供一种用于CHO细胞中高效表达重组胶原蛋白的无血清培养基，包括氨基酸组分、维生素组分、无机盐组分、微量元素组分及碳水化合物和补充因子组分：
氨基酸的组分和用量：
L-精氨酸240-360mg/L
L-组氨酸25-150mg/L
L-赖氨酸120-910mg/L
L-甲硫氨酸50-300mg/L
L-脯氨酸80-600mg/L
L-丝氨酸220-540mg/L
L-苏氨酸220-540mg/L
L-缬氨酸120-910mg/L
L-丙氨酸10-50mg/L
L-甘氨酸40-320mg/L
L-亮氨酸220-540mg/L
L-苯丙氨酸60-370mg/L
L-天冬氨酸200-1500mg/L
L-谷氨酸20-170mg/L
L-异亮氨酸150-390mg/L
L-色氨酸20-170mg/L
L-酪氨酸150-390mg/L
L-半胱氨酸40-260mg/L
L-天冬酰胺120-910mg/L
或/和羟脯氨酸90-750mg/L
维生素的组分和用量:
烟酰胺8-25mg/L
D-泛酸钙盐2-15mg/L
吡哆素盐酸盐2-15mg/L
维生素B1 22-15mg/L
盐酸硫胺5-11mg/L
生物素0.8-5.5mg/L
腺嘌呤磷酸盐2-15mg/L
叶酸10-20mg/L
核黄素0.1-1.2mg/L
烟酸0.2-1.5mg/L
或/和维生素C 0.5-5mg/L
无机盐的组分和用量：
NaHCO3 800-4000mg/LNaCl 1500-14500mg/L
Na2HPO4 30-100mg/L
NaH2PO4 30-100mg/LKCl 150-560mg/L
MgSO4 50-120mg/L
MgCl2 50-120mg/L
CaCl2 50-120mg/L
微量元素的组分和用量：
ZnSO4·7H2O 0.2-2mg/L
或/和FeSO4·7H2O 0.5-1.2mg/L
CuSO4·5H2O 0.005-0.15mg/L
CoCl2·6H2O 0.18-0.56mg/L
AlCl3 0.001-0.05mg/L
TiCl4 0.01-0.15mg/L
NaVO3 0.0001-0.002mg/L
CrCl3 0.0001-0.005mg/L
NiCl2·6H2O 0.0001-0.002mg/L
碳水化合物和补充因子的组分和含量如下
葡萄糖4000-8000mg/L
丙酮酸钠25-150mg/L
延胡索酸0.05-0.711mg/L
琥珀酸0.01-0.5mg/L
α-酮戊二酸0.05-0.871mg/L
腐胺二盐酸盐0.2-1.5mg/L
乙醇胺盐酸盐2-50mg/L
精胺5-35mg/L
组胺0.05-0.95mg/L
次黄嘌呤钠5-35mg/L
胸苷0.1-1.2mg/L
肌醇40-200mg/L
硫辛酸0.01-0.5mg/L
亚油酸0.1-1.25mg/L
氯化胆碱40-200mg/L
Pluronic F68 200-2000mg/L
和/或重组小分子胶原蛋白10-200mg/L。
进一步的，所述无血清培养基组分及用量如下，
氨基酸的组分和用量：
L-精氨酸240-360mg/L
L-组氨酸25-150mg/L
L-赖氨酸120-910mg/L
L-甲硫氨酸50-300mg/L
L-脯氨酸80-600mg/L
L-丝氨酸220-540mg/L
L-苏氨酸220-540mg/L
L-缬氨酸120-910mg/L
L-丙氨酸10-50mg/L
L-甘氨酸40-320mg/L
L-亮氨酸220-540mg/L
L-苯丙氨酸60-370mg/L
L-天冬氨酸200-1500mg/L
L-谷氨酸20-170mg/L
L-异亮氨酸150-390mg/L
L-色氨酸20-170mg/L
L-酪氨酸150-390mg/L
L-半胱氨酸40-260mg/L
L-天冬酰胺120-910mg/L
羟脯氨酸90-750mg/L
维生素的组分和用量:
烟酰胺8-25mg/L
D-泛酸钙盐2-15mg/L
吡哆素盐酸盐2-15mg/L
维生素B1 22-15mg/L
盐酸硫胺5-11mg/L
生物素0.8-5.5mg/L
腺嘌呤磷酸盐2-15mg/L
叶酸10-20mg/L
核黄素0.1-1.2mg/L
烟酸0.2-1.5mg/L
维生素C 0.5-5mg/L
无机盐的组分和用量：
NaHCO3 800-4000mg/L
NaCl 1500-14500mg/L
Na2HPO4 30-100mg/L
NaH2PO4 30-100mg/L
KCl 150-560mg/L
MgSO4 50-120mg/L
MgCl2 50-120mg/L
CaCl2 50-120mg/L
微量元素的组分和用量：
ZnSO4·7H2O 0.2-2mg/L
FeSO4·7H2O 0.5-1.2mg/L
CuSO4·5H2O 0.005-0.15mg/L
CoCl2·6H2O 0.18-0.56mg/L
AlCl3 0.001-0.05mg/L
TiCl4 0.01-0.15mg/L
NaVO3 0.0001-0.002mg/L
CrCl3 0.0001-0.005mg/L
NiCl2·6H2O 0.0001-0.002mg/L
碳水化合物和补充因子的组分和含量如下
葡萄糖4000-8000mg/L
丙酮酸钠25-150mg/L
延胡索酸0.05-0.711mg/L
琥珀酸0.01-0.5mg/L
α-酮戊二酸0.05-0.871mg/L
腐胺二盐酸盐0.2-1.5mg/L
乙醇胺盐酸盐2-50mg/L
精胺5-35mg/L
组胺0.05-0.95mg/L
次黄嘌呤钠5-35mg/L
胸苷0.1-1.2mg/L
肌醇40-200mg/L
硫辛酸0.01-0.5mg/L
亚油酸0.1-1.25mg/L
氯化胆碱40-200mg/L
Pluronic F68 200-2000mg/L
重组小分子胶原蛋白10-200mg/L。
更进一步，所述无血清培养基组分及用量如下：
氨基酸的组分和用量：
L-精氨酸240-360mg/L
L-组氨酸25-150mg/L
L-赖氨酸120-910mg/L
L-甲硫氨酸50-300mg/L
L-脯氨酸190-510mg/L
L-丝氨酸220-540mg/L
L-苏氨酸220-540mg/L
L-缬氨酸120-910mg/L
L-丙氨酸10-50mg/L
L-甘氨酸55-275mg/L
L-亮氨酸220-540mg/L
L-苯丙氨酸60-370mg/L
L-天冬氨酸200-1500mg/L
L-谷氨酸20-170mg/L
L-异亮氨酸150-390mg/L
L-色氨酸20-170mg/L
L-酪氨酸150-390mg/L
L-半胱氨酸40-260mg/L
L-天冬酰胺120-910mg/L
羟脯氨酸500-750mg/L
维生素的组分和用量:
烟酰胺8-25mg/L
D-泛酸钙盐2-15mg/L
吡哆素盐酸盐2-15mg/L
维生素B1 22-15mg/L
盐酸硫胺5-11mg/L
生物素0.8-5.5mg/L
腺嘌呤磷酸盐2-15mg/L
叶酸10-20mg/L
核黄素0.1-1.2mg/L
烟酸0.2-1.5mg/L
维生素C 0.5-5mg/L
无机盐的组分和用量：
NaHCO3 800-4000mg/L
NaCl 1500-14500mg/L
Na2HPO4 30-100mg/L
NaH2PO4 30-100mg/L
KCl 150-560mg/L
MgSO4 50-120mg/L
MgCl2 50-120mg/L
CaCl2 50-120mg/L
微量元素的组分和用量：
ZnSO4·7H2O 0.2-2mg/L
FeSO4·7H2O 0.5-1.2mg/L
CuSO4·5H2O 0.005-0.15mg/L
CoCl2·6H2O 0.18-0.56mg/L
AlCl3 0.001-0.05mg/L
TiCl4 0.01-0.15mg/L
NaVO3 0.0001-0.002mg/L
CrCl3 0.0001-0.005mg/L
NiCl2·6H2O 0.0001-0.002mg/L
碳水化合物和补充因子的组分和含量如下
葡萄糖4000-8000mg/L
丙酮酸钠25-150mg/L
延胡索酸0.05-0.711mg/L
琥珀酸0.01-0.5mg/L
α-酮戊二酸0.05-0.871mg/L
腐胺二盐酸盐0.2-1.5mg/L
乙醇胺盐酸盐2-50mg/L
精胺5-35mg/L
组胺0.05-0.95mg/L
次黄嘌呤钠5-35mg/L
胸苷0.1-1.2mg/L
肌醇40-200mg/L
硫辛酸0.01-0.5mg/L
亚油酸0.1-1.25mg/L
氯化胆碱40-200mg/L
Pluronic F68 1000-2000mg/L
重组小分子胶原蛋白75-200mg/L。
优选的，所述无血清培养基的组分及用量如下，
L-精氨酸317-360mg/L
L-组氨酸89-150mg/L
L-赖氨酸825-910mg/L
L-甲硫氨酸210-300mg/L
L-脯氨酸510-600mg/L
L-丝氨酸310-540mg/L
L-苏氨酸235-540mg/L
L-缬氨酸565-910mg/L
L-丙氨酸24-50mg/L
L-甘氨酸57-275mg/L
L-亮氨酸423-540mg/L
L-苯丙氨酸150-370mg/L
L-天冬氨酸921-1500mg/L
L-谷氨酸109-170mg/L
L-异亮氨酸280-390mg/L
L-色氨酸67-170mg/L
L-酪氨酸250-390mg/L
L-半胱氨酸65-260mg/L
L-天冬酰胺427-910mg/L
羟脯氨酸540-750mg/L
维生素的组分和用量:
烟酰胺19-25mg/L
D-泛酸钙盐4.4-15mg/L
吡哆素盐酸盐8.7-15mg/L
维生素B12 6.5-15mg/L
盐酸硫胺10-11mg/L
生物素1.5-5.5mg/L
腺嘌呤磷酸盐6.5-15mg/L
叶酸14-20mg/L
核黄素0.5-1.2mg/L
烟酸0.5-1.5mg/L
维生素C 0.8-5mg/L
无机盐的组分和用量：
NaHCO3 2400-4000mg/LNaCl 2000-14500mg/L
Na2HPO4 71-100mg/L
NaH2PO4 62-100mg/LKCl 310-560mg/L
MgSO4 70-120mg/L
MgCl2 100-120mg/L
CaCl2 116-120mg/L
微量元素的组分和用量：
ZnSO4·7H2O 0.3-2mg/L
FeSO4·7H2O 0.7-1.2mg/L
CuSO4·5H2O 0.005-0.15mg/L
CoCl2·6H2O 0.28-0.56mg/L
AlCl3 0.01-0.05mg/L
TiCl4 0.020.15mg/L
NaVO3 0.0005-0.002mg/L
CrCl3 0.0018-0.005mg/L
NiCl2·6H2O 0.00012-0.002mg/L
碳水化合物和补充因子的组分和含量如下：
葡萄糖7000-8000mg/L
丙酮酸钠91-150mg/L
延胡索酸0.211-0.711mg/L
琥珀酸0.03-0.5mg/L
α-酮戊二酸0.557-0.871mg/L
腐胺二盐酸盐0.7-1.5mg/L
乙醇胺盐酸盐35-50mg/L
精胺14-35mg/L
组胺0.35-0.95mg/L
次黄嘌呤钠7-35mg/L
胸苷0.2-1.2mg/L
肌醇168-200mg/L
硫辛酸0.08-0.5mg/L
亚油酸0.21-1.25mg/L
氯化胆碱162-200mg/L
Pluronic F68 1500-2000mg/L
重组小分子胶原蛋白75-200mg/L。
具体的，本发明所提供的无血清培养基，包括以下组分及用量：
L-精氨酸317.044mg/L
L-组氨酸89.67mg/L
L-赖氨酸825.11mg/L
L-甲硫氨酸210.39mg/L
L-脯氨酸510.56mg/L
L-丝氨酸411.43mg/L
L-苏氨酸235.86mg/L
L-缬氨酸565.25mg/L
L-丙氨酸35.90mg/L
L-甘氨酸270.72mg/L
L-亮氨酸423.69mg/L
L-苯丙氨酸150.82mg/L
L-天冬氨酸921.68mg/L
L-谷氨酸109.54mg/L
L-异亮氨酸280.05mg/L
L-色氨酸67.19mg/L
L-酪氨酸250.95mg/L
L-半胱氨酸65.96mg/L
L-天冬酰胺427.88mg/L
羟脯氨酸540mg/L
烟酰胺19.9mg/L
D-泛酸钙盐4.49mg/L
吡哆素盐酸盐8.74mg/L
维生素B12 6.56mg/L
盐酸硫胺10.51mg/L
生物素1.505mg/L
腺嘌呤磷酸盐6.575mg/L
叶酸14.55mg/L
核黄素0.54mg/L
烟酸0.503mg/L
维生素C 0.89mg/L
NaHCO3 2400mg/L
NaCl 2000mg/L
Na2HPO4 71mg/L
NaH2PO4 62mg/L
KCl 310mg/L
MgSO4 70mg/L
MgCl2 100mg/L
CaCl2 116mg/L
ZnSO4·7H2O 0.349mg/L
FeSO4·7H2O 0.754mg/L
CuSO4·5H2O 0.005mg/L
CoCl2·6H2O 0.281mg/L
AlCl3 0.0142mg/L
TiCl4 0.0211mg/L
NaVO3 0.00054mg/L
CrCl3 0.0018mg/L
NiCl2·6H2O 0.00012mg/L
葡萄糖7000mg/L
丙酮酸钠91.85mg/L
延胡索酸0.211mg/L
琥珀酸0.03315mg/L
α-酮戊二酸0.557mg/L
腐胺二盐酸盐0.762mg/L
乙醇胺盐酸盐35.25mg/L
精胺14.25mg/L
组胺0.3555mg/L
次黄嘌呤钠7.91mg/L
胸苷0.289mg/L
肌醇168.5mg/L
硫辛酸0.084mg/L
亚油酸0.21mg/L
氯化胆碱162.5
Pluronic F68 1500mg/L
重组小分子胶原蛋白75mg/L。
本发明还提供了所述无血清培养基用于培养CHO细胞高效表达重组胶原蛋白的用途。
所述的用途，包括以下步骤：
首先按照配方配制无血清培养基，取无血清培养基进行预热，然后接种CHO细胞，并加入谷氨酰胺进行培养，实现CHO细胞高效表达重组胶原蛋白的用途；所述预热的温度条件为37℃，接种CHO细胞的浓度为0.5×106cells/mL；所述谷氨酰胺的终浓度为6mM；所述培养的条件为：温度37℃，5％CO2，摇床转速120rpm。
本发明还提供了在所述加入谷氨酰胺进行培养至活细胞密度达到5.0-6.0×106cells/mL时，利用补料培养基进行补料，每间隔一段时间在无血清培养基中补加补料培养基后继续按照相同条件培养；
所述每间隔一段时间为2天，所述补料培养基的添加量为初始培养基(无血清培养基)体积的4％；
所述补料培养基的组分及用量如下：
氨基酸的组分和用量：
L-丙氨酸0.1-5.86g/L
L-精氨酸1.2-12.54g/L
L-天冬氨酸2.6-14.6g/L
L-半胱氨酸3.77-11.8g/L
L-甘氨酸1.26-15.4g/L
L-组氨酸0.1-7.94g/L
L-亮氨酸2.1-23.6g/L
L-异亮氨酸2.25-14.6g/L
L-赖氨酸1.2-24.7g/L
L-甲硫氨酸0.1-8.683g/L
L-苯丙氨酸1.5-15.2g/L
L-脯氨酸4.6-28.14g/L
L-丝氨酸2.56-16.13g/L
L-苏氨酸1.5-26.5g/L
L-酪氨酸4.5-30.5g/L
L-缬氨酸1.2-14.26g/L
L-色氨酸0.5-17.9g/L
L-瓜氨酸0.1-12g/L
L-鸟氨酸0.1-12g/L
L-天冬酰胺3.5-21.87g/L
羟脯氨酸8-32.16g/L
维生素的组分和用量:
核黄素0.001-0.054g/L
烟酰胺0.05-0.69g/L
吡哆素盐酸盐0.215-1.8g/L
生物素0.005-0.14g/L
叶酸0.01-1.19g/L
维生素B12 0.01-1.03g/L
D-泛酸钙盐0.01-3.62g/L
维生素C 0.0001-0.009g/L
盐酸硫胺0.05-0.89g/L
烟酸0.001-0.0412g/L
无机盐的组分和用量：
NaHCO3 0.52-12.8g/LNaCl 3.6-25.5g/L
Na2HPO4 0.1-3.6g/L
KCl 0.1-7.48g/L
MgSO4 0.08-6.38g/L
MgCl2 0.01-5.73g/L
CaCl2 0.001-0.12g/L
微量元素的组分和用量：
ZnSO4·7H2O 0.02-1.68g/L
FeSO4·7H2O 0.19-8.9g/L
CuSO4·5H2O 0.001-2.3g/L
CoCl2·6H2O 0.0005-0.053g/L
TiCl4 0.00001-0.0211g/L
NaVO3 0.000001-0.0045g/L
CrCl3 0.000001-0.00338g/L
NiCl2·6H2O 0.00000001-0.0005g/L
MnCl2 0.00001-0.0056g/L
Na2SeO3 0.00001-0.73g/L
碳水化合物和补充因子的组分和含量如下：
葡萄糖10-150g/L
蔗糖0.001-0.56g/L
丙酮酸钠0.6-15.03g/L
琥珀酸0.00001-0.87g/L
腐胺二盐酸盐0.001-0.52g/L
乙醇胺盐酸盐0.01-5.28g/L
精胺0.001-3.54g/L
组胺0.00015-0.269g/L
腺嘌呤0.0023-0.583g/L
牛磺酸0.00035-0.098g/L
肌醇0.12-15.61g/L
氯化胆碱0.47-13.49g/L
4-氨基苯甲酸0.00068-0.589g/L
亚油酸0.00012-0.653g/L
硫辛酸0.00048-0.897g/L
重组小分子胶原蛋白0.1-5g/L。
具体的，所述补料培养基的具体实施组分如下：
L-丙氨酸0.869g/L
L-精氨酸4.985g/L
L-天冬氨酸7.641g/L
L-半胱氨酸5.771g/L
L-甘氨酸6.265g/L
L-组氨酸1.8g/L
L-亮氨酸9.363g/L
L-异亮氨酸5.142g/L
L-赖氨酸4.795g/L
L-甲硫氨酸1.984g/L
L-苯丙氨酸5.055g/L
L-脯氨酸8.11g/L
L-丝氨酸6.137g/L
L-苏氨酸6.409g/L
L-酪氨酸8.17g/L
L-缬氨酸5.26g/L
L-色氨酸3.571g/L
L-瓜氨酸0.208g/L
L-鸟氨酸0.265g/L
L-天冬酰胺7.491g/L
羟脯氨酸10.6g/L
核黄素0.0374g/L
烟酰胺0.192g/L
吡哆素盐酸盐0.158g/L
生物素0.0104g/L
叶酸0.193g/L
维生素B12 0.229g/L
D-泛酸钙盐0.195g/L
维生素C 0.00177g/L
盐酸硫胺0.351g/L
烟酸0.00422g/L
NaHCO3 1.98g/L
NaCl 6.5g/L
Na2HPO4 0.48g/L
KCl 0.52g/L
MgSO4 0.863g/L
CaCl2 0.365g/L
ZnSO4·7H2O 0.01154g/L
FeSO4·7H2O 0.005851g/L
CuSO4·5H2O 0.0023g/L
CoCl2·6H2O 0.00953g/L
TiCl4 0.00008211g/L
NaVO3 0.000054g/L
CrCl3 0.0000038g/L
NiCl2·6H2O 0.0000012g/L
MnCl2 0.000084g/L
Na2SeO3 0.000339g/L
葡萄糖61.3g/L
蔗糖0.0344g/L
丙酮酸钠3.04g/L
琥珀酸0.000801g/L
腐胺二盐酸盐0.0159g/L
乙醇胺盐酸盐0.47g/L
精胺0.152g/L
组胺0.00298g/L
腺嘌呤0.0682g/L
牛磺酸0.001356g/L
肌醇1.295g/L
氯化胆碱1.25g/L
4-氨基苯甲酸0.01g/L
亚油酸0.0078g/L
硫辛酸0.0362g/L
重组小分子胶原蛋白0.125g/L。
有益效果：
(1)本发明针对目前CHO无血清培养基商业化产品难以针对性地实现重组胶原蛋白的高效表达并大规模应用于胶原蛋白的生产的技术问题，研发了一种用于CHO细胞高效表达重组胶原蛋白的无血清培养；本发明结合控制甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸含量，甘氨酸在胶原蛋白合成中占据独特的空间优势，羟脯氨酸和脯氨酸对胶原蛋白的折叠，维持三级结构的稳定性起着关键作用；一方面为细胞生存和增殖、蛋白合成提供原料，另一方面能够促进胶原蛋白合成。
(2)本发明创造性的引入维生素C和Fe2+的结合；维生素C的还原性能够维持Fe2+不被氧化成有毒性的Fe3+，同时，维生素C的还原性还可以激活合成胶原蛋白过程中需要的脯氨酸羟化酶和赖氨酸羟化酶，促进胶原蛋白的生成。
(3)本发明结合优化维生素、微量元素和补充因子；微量元素参与细胞调节能量代谢、蛋白合成等多种过程，调节微量元素在特定浓度能促进细胞生长和蛋白表达。维生素是很多酶的组成部分，在细胞代谢中用作辅酶，辅基或辅因子，B族维生素及其衍生物、叶酸、生物素和4-氨基苯甲酸等在增加细胞生长和生产力方面起重要作用；同时，补充因子胆碱和乙醇胺是构成细胞膜的重要成分，腐胺能够有效地促进CHO细胞生长，α-酮戊二酸作为羟化酶P4H酶活因子，Pluronic F68作为表面活性剂，能够减少搅拌过程中泡沫生成，整体协同作用，提高细胞膜对流体动力剪切力的耐受性。
(4)本发明还引入了重组小分子胶原蛋白，重组小分子胶原蛋白调控CHO细胞的增殖和蛋白表达，作为胶原蛋白合成的底物进一步促进胶原蛋白的高效表达。
(5)本发明培养基所使用原料均为小分子物质，成本低；且所有组分化学结构已知，便于配制、储存；通过优化培养基中各种营养物质的合适配比和添加剂的有效浓度，有效促进了重组胶原蛋白的高效表达，具备产物质量好、安全性高、表达量高的优势。
(6)为了更有效表达重组胶原蛋白，使整个过程能支持高密度CHO细胞生长，维持活力时间长，本发明还创造性的提出了一种补加补料培养基，通过在培养过程中补加补料培养基，有效促进了表达重组胶原蛋白，从而显著提高其产量。
(7)本发明提供的无血清培养基及其补料培养基不含任何血清组分，避免了潜在的污染及风险，解决了生物安全性问题，具有极高的应用和经济价值，对提高大规模CHO细胞表达重组胶原蛋白技术有重要意义；同时为下游纯化提供了便利，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中不同培养基条件下的总细胞密度。
图2为实施例2中不同培养基条件下的活细胞密度。
图3为实施例2中不同培养基条件下的细胞活率。
图4为实施例3中不同培养基条件下COL3A1、P4Hα、P4Hβ蛋白表达的Western Blot检测；图中数字1指代本发明创健CHO培养基培养后目的蛋白表达；2指代国内商品化CHO培养基培养后目的蛋白表达；3指代国内商品化CHO培养基培养后目的蛋白表达。
图5实施例4中不同培养基条件下的活细胞密度。
图6实施例4中不同培养基条件下的细胞活率。
图7实施例4中不同培养基条件下的蛋白表达产量。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。同时本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
本发明提供的基础无血清培养基和补料培养基进行CHO细胞培养的工艺为：
(a)以0.5-1.0×106cells/mL接种，基础无血清培养基的体积为30mL，接种于125mL摇瓶中；
(b)当细胞生长到对数生长期，活细胞密度达到5.0-6.0×106cells/mL时，补加补料培养基继续培养。
(c)在本发明的培养基外，配制培养基进行培养时还要添加谷氨酰胺，谷氨酰胺所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的来源，是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，谷氨酰胺也作为能源及碳源被细胞利用。本培养基配方中不含谷氨酰胺，其在培养使用之前添加。
本发明所使用的对比培养基说明如下：
国内商品化CHO培养基为OPMMedium；
国外商品化CHO培养基为Gibco DynamisTM培养基。
实施例1：
用于CHO细胞高效表达重组胶原蛋白的无血清培养基，组分如下：
/>
培养方式：按上述配方制备CHO细胞无血清培养基，记为创健CHO培养基，进行细胞培养；在三个125mL摇瓶中分别对应加入30mL的创健CHO培养基、国内商品化CHO培养基和国外商品化CHO培养基，预热至37℃，细胞以0.6×106cells/mL分别接种到三种培养基中；在三种培养基中均加入终浓度为6mM的谷氨酰胺，在37℃，5％CO2，摇床转速120rpm条件下连续培养；每天计数，统计总细胞密度。
培养结果如图1所示：在培养的第四天，细胞密度达到最大值，用创健CHO培养基培养的最大细胞密度为9.06×106cells/mL；用国内商品化CHO培养基培养的最大细胞密度为7.72×106cells/mL；用国外商品化CHO培养基培养的最大细胞密度为7.68×106cells/mL。结果表明：与国内、外商品化培养基相比，按实施例1制备的创健CHO培养基能有效提高总细胞密度。
实施例2：
用于CHO细胞高效表达重组胶原蛋白的无血清培养基，组分如下：
/>
培养方式：按上述配方制备CHO细胞无血清培养基，记为创健CHO培养基，进行细胞培养；在三个125mL摇瓶中分别对应加入30mL的创健CHO培养基、国内商品化CHO培养基和国外商品化CHO培养基，预热至37℃，细胞以0.6×106cells/mL分别接种到三种培养基中；在三种培养基中均加入终浓度为6mM的谷氨酰胺，在37℃，5％CO2，摇床转速120rpm条件下连续培养；每天计数，统计活细胞密度和细胞活率。
培养结果如图2-3所示：用创健CHO培养基，在培养的第六天，活细胞密度达到最高，为8.99×106cells/mL，存活率93.33％；用国内商品化CHO培养基，在培养的第五天，活细胞密度达到最高，为6.47×106cells/mL，存活率89.28％，用国外商品化CHO培养基，在培养的第五天，活细胞密度达到最高，为6.41×106cells/mL，存活率87.76％。结果表明：与国内外商品化培养基相比，按实施例2制备的创健CHO培养基能有效提高活细胞密度和活率。实施例3：
用于CHO细胞高效表达重组胶原蛋白的无血清培养基，组分如下：
/>
培养条件：按上述配方制备CHO细胞无血清培养基，记为创健CHO培养基，进行细胞培养；在三个125mL摇瓶中分别对应加入30mL的创健CHO培养基、国内商品化CHO培养基和国外商品化CHO培养基，预热至37℃，细胞以0.6×106cells/mL分别接种到三种培养基中；在三种培养基中均加入终浓度为6mM的谷氨酰胺，在37℃，5％CO2，摇床转速120rpm条件下培养；培养后收集每种培养基培养后的样品进行COL3A1、P4Hα、P4Hβ蛋白表达的Western Blot检测；
培养结果如图4所示：从图中可以看出，本发明的创健CHO培养基更有利于胶原蛋白和P4Hα、P4Hβ蛋白表达，效果对比非常明显。
实施例4：
用于CHO细胞高效表达重组胶原蛋白的无血清培养基，组分如下：
/>
补料培养基配方：
/>
培养条件：按上述配方制备CHO细胞无血清培养基，记为创健CHO培养基，进行细胞培养；在三个125mL摇瓶中分别对应加入30mL的创健CHO培养基、国内商品化CHO和国外商品化CHO培养基，预热至37℃，细胞以0.5×106cells/mL分别接种到三种培养基中；在三种培养基中均加入终浓度为6mM的谷氨酰胺，在37℃，5％CO2，摇床转速120rpm条件下培养。当活细胞密度达到5.0-6.0×106cells/mL时开始补料(补加补料培养基)，补料培养基按照实施例四中补料培养基的配方配制。分别在第3、5、7、9、11、13天进行补料，补加用量按照初始培养基(创健CHO培养基)体积的4％(v/v)进行补料。
培养结果如图5-7所示：创健CHO培养基培养的第四天，细胞密度达到6.0×106cells/mL，用国内商品化CHO培养基培养的第四天，细胞密度为5.58×106cells/mL，用国外商品化CHO培养基培养的第四天，细胞密度为5.64×106cells/mL；经补加补料培养基培养后，创健CHO培养基培养可以达到的最大活细胞密度为10.04×106cells/mL，胶原蛋白表达量0.89/L；用国内商品化CHO补料培养基培养，可以达到的最大活细胞密度为7.5×106cells/mL，胶原蛋白表达量0.37g/L；用国外商品化补料培养基培养，可以达到的最大活细胞密度为7.9×106cells/mL，胶原蛋白表达量0.41g/L；结果表明：本发明所提供的培养基能够有效促进胶原蛋白的表达，取得了显著的技术效果。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (10)
1.一种用于CHO细胞高效表达重组胶原蛋白的无血清培养基，其特征在于，包括氨基酸组分、维生素组分、无机盐组分、微量元素组分及碳水化合物和补充因子组分；
氨基酸的组分和用量：
L-精氨酸240-360mg/L
L-组氨酸25-150mg/L
L-赖氨酸120-910mg/L
L-甲硫氨酸50-300mg/L
L-脯氨酸80-600mg/L
L-丝氨酸220-540mg/L
L-苏氨酸220-540mg/L
L-缬氨酸120-910mg/L
L-丙氨酸10-50mg/L
L-甘氨酸40-320mg/L
L-亮氨酸220-540mg/L
L-苯丙氨酸60-370mg/L
L-天冬氨酸200-1500mg/L
L-谷氨酸20-170mg/L
L-异亮氨酸150-390mg/L
L-色氨酸20-170mg/L
L-酪氨酸150-390mg/L
L-半胱氨酸40-260mg/L
L-天冬酰胺120-910mg/L
或/和羟脯氨酸90-750mg/L
维生素的组分和用量:
烟酰胺8-25mg/L
D-泛酸钙盐2-15mg/L吡哆素盐酸盐2-15mg/L维生素B1 22-15mg/L盐酸硫胺5-11mg/L生物素0.8-5.5mg/L腺嘌呤磷酸盐2-15mg/L叶酸10-20mg/L核黄素0.1-1.2mg/L烟酸0.2-1.5mg/L或/和维生素C 0.5-5mg/L无机盐的组分和用量：
NaHCO3 800-4000mg/LNaCl 1500-14500mg/LNa2HPO4 30-100mg/LNaH2PO4 30-100mg/LKCl 150-560mg/L
MgSO4 50-120mg/L
MgCl2 50-120mg/L
CaCl2 50-120mg/L微量元素的组分和用量：
ZnSO4·7H2O 0.2-2mg/L或/和FeSO4·7H2O 0.5-1.2mg/LCuSO4·5H2O 0.005-0.15mg/L
CoCl2·6H2O 0.18-0.56mg/L
AlCl3 0.001-0.05mg/L
TiCl4 0.01-0.15mg/L
NaVO3 0.0001-0.002mg/L
CrCl3 0.0001-0.005mg/L
NiCl2·6H2O 0.0001-0.002mg/L碳水化合物和补充因子的组分和含量如下葡萄糖4000-8000mg/L
丙酮酸钠25-150mg/L
延胡索酸0.05-0.711mg/L
琥珀酸0.01-0.5mg/L
α-酮戊二酸0.05-0.871mg/L腐胺二盐酸盐0.2-1.5mg/L乙醇胺盐酸盐2-50mg/L
精胺5-35mg/L
组胺0.05-0.95mg/L
次黄嘌呤钠5-35mg/L
胸苷0.1-1.2mg/L
肌醇40-200mg/L
硫辛酸0.01-0.5mg/L
亚油酸0.1-1.25mg/L
氯化胆碱40-200mg/L
Pluronic F68 200-2000mg/L和/或重组小分子胶原蛋白10-200mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种用于CHO细胞高效表达重组胶原蛋白的无血清培养基，其特征在于，
氨基酸的组分和用量：
L-精氨酸240-360mg/L
L-组氨酸25-150mg/L
L-赖氨酸120-910mg/L
L-甲硫氨酸50-300mg/L
L-脯氨酸80-600mg/L
L-丝氨酸220-540mg/L
L-苏氨酸220-540mg/L
L-缬氨酸120-910mg/L
L-丙氨酸10-50mg/L
L-甘氨酸40-320mg/L
L-亮氨酸220-540mg/L
L-苯丙氨酸60-370mg/L
L-天冬氨酸200-1500mg/L
L-谷氨酸20-170mg/L
L-异亮氨酸150-390mg/L
L-色氨酸20-170mg/L
L-酪氨酸150-390mg/L
L-半胱氨酸40-260mg/L
L-天冬酰胺120-910mg/L
羟脯氨酸90-750mg/L
维生素的组分和用量:
烟酰胺8-25mg/LD-泛酸钙盐2-15mg/L吡哆素盐酸盐2-15mg/L维生素B1 22-15mg/L盐酸硫胺5-11mg/L生物素0.8-5.5mg/L腺嘌呤磷酸盐2-15mg/L叶酸10-20mg/L核黄素0.1-1.2mg/L烟酸0.2-1.5mg/L维生素C 0.5-5mg/L无机盐的组分和用量：
NaHCO3 800-4000mg/LNaCl 1500-14500mg/LNa2HPO4 30-100mg/LNaH2PO4 30-100mg/LKCl 150-560mg/LMgSO4 50-120mg/LMgCl2 50-120mg/LCaCl2 50-120mg/L微量元素的组分和用量：ZnSO4·7H2O 0.2-2mg/LFeSO4·7H2O 0.5-1.2mg/LCuSO4·5H2O 0.005-0.15mg/L
CoCl2·6H2O 0.18-0.56mg/L
AlCl3 0.001-0.05mg/L
TiCl4 0.01-0.15mg/L
NaVO3 0.0001-0.002mg/L
CrCl3 0.0001-0.005mg/L
NiCl2·6H2O 0.0001-0.002mg/L碳水化合物和补充因子的组分和含量如下葡萄糖4000-8000mg/L
丙酮酸钠25-150mg/L
延胡索酸0.05-0.711mg/L
琥珀酸0.01-0.5mg/L
α-酮戊二酸0.05-0.871mg/L腐胺二盐酸盐0.2-1.5mg/L乙醇胺盐酸盐2-50mg/L
精胺5-35mg/L
组胺0.05-0.95mg/L
次黄嘌呤钠5-35mg/L
胸苷0.1-1.2mg/L
肌醇40-200mg/L
硫辛酸0.01-0.5mg/L
亚油酸0.1-1.25mg/L
氯化胆碱40-200mg/L
Pluronic F68 200-2000mg/L重组小分子胶原蛋白10-200mg/L。
3.根据权利要求2所述的一种用于CHO细胞高效表达重组胶原蛋白的无血清培养基，其特征在于，氨基酸的组分和用量：
L-精氨酸240-360mg/L
L-组氨酸25-150mg/L
L-赖氨酸120-910mg/L
L-甲硫氨酸50-300mg/L
L-脯氨酸190-510mg/L
L-丝氨酸220-540mg/L
L-苏氨酸220-540mg/L
L-缬氨酸120-910mg/L
L-丙氨酸10-50mg/L
L-甘氨酸55-275mg/L
L-亮氨酸220-540mg/L
L-苯丙氨酸60-370mg/L
L-天冬氨酸200-1500mg/L
L-谷氨酸20-170mg/L
L-异亮氨酸150-390mg/L
L-色氨酸20-170mg/L
L-酪氨酸150-390mg/L
L-半胱氨酸40-260mg/L
L-天冬酰胺120-910mg/L
羟脯氨酸500-750mg/L
维生素的组分和用量:
烟酰胺8-25mg/LD-泛酸钙盐2-15mg/L吡哆素盐酸盐2-15mg/L维生素B1 22-15mg/L盐酸硫胺5-11mg/L生物素0.8-5.5mg/L腺嘌呤磷酸盐2-15mg/L叶酸10-20mg/L核黄素0.1-1.2mg/L烟酸0.2-1.5mg/L维生素C 0.5-5mg/L无机盐的组分和用量：
NaHCO3 800-4000mg/LNaCl 1500-14500mg/LNa2HPO4 30-100mg/LNaH2PO4 30-100mg/LKCl 150-560mg/L
MgSO4 50-120mg/L
MgCl2 50-120mg/L
CaCl2 50-120mg/L微量元素的组分和用量：
ZnSO4·7H2O 0.2-2mg/LFeSO4·7H2O 0.5-1.2mg/LCuSO4·5H2O 0.005-0.15mg/LCoCl2·6H2O 0.18-0.56mg/L
AlCl3 0.001-0.05mg/L
TiCl4 0.01-0.15mg/L
NaVO3 0.0001-0.002mg/L
CrCl3 0.0001-0.005mg/L
NiCl2·6H2O 0.0001-0.002mg/L碳水化合物和补充因子的组分和含量如下葡萄糖4000-8000mg/L
丙酮酸钠25-150mg/L
延胡索酸0.05-0.711mg/L
琥珀酸0.01-0.5mg/L
α-酮戊二酸0.05-0.871mg/L腐胺二盐酸盐0.2-1.5mg/L乙醇胺盐酸盐2-50mg/L
精胺5-35mg/L
组胺0.05-0.95mg/L
次黄嘌呤钠5-35mg/L
胸苷0.1-1.2mg/L
肌醇40-200mg/L
硫辛酸0.01-0.5mg/L
亚油酸0.1-1.25mg/L
氯化胆碱40-200mg/L
Pluronic F68 1000-2000mg/L重组小分子胶原蛋白75-200mg/L。
4.根据权利要求3所述的一种用于CHO细胞高效表达重组胶原蛋白的无血清培养基，其特征在于，
L-精氨酸317-360mg/L
L-组氨酸89-150mg/L
L-赖氨酸825-910mg/L
L-甲硫氨酸210-300mg/L
L-脯氨酸510-600mg/L
L-丝氨酸310-540mg/L
L-苏氨酸235-540mg/L
L-缬氨酸565-910mg/L
L-丙氨酸24-50mg/L
L-甘氨酸57-275mg/L
L-亮氨酸423-540mg/L
L-苯丙氨酸150-370mg/L
L-天冬氨酸921-1500mg/L
L-谷氨酸109-170mg/L
L-异亮氨酸280-390mg/L
L-色氨酸67-170mg/L
L-酪氨酸250-390mg/L
L-半胱氨酸65-260mg/L
L-天冬酰胺427-910mg/L
羟脯氨酸540-750mg/L
维生素的组分和用量:
烟酰胺19-25mg/L
D-泛酸钙盐4.4-15mg/L吡哆素盐酸盐8.7-15mg/L维生素B12 6.5-15mg/L盐酸硫胺10-11mg/L生物素1.5-5.5mg/L腺嘌呤磷酸盐6.5-15mg/L叶酸14-20mg/L核黄素0.5-1.2mg/L烟酸0.5-1.5mg/L维生素C 0.8-5mg/L无机盐的组分和用量：
NaHCO3 2400-4000mg/LNaCl 2000-14500mg/LNa2HPO4 71-100mg/LNaH2PO4 62-100mg/LKCl 310-560mg/L
MgSO4 70-120mg/L
MgCl2 100-120mg/L
CaCl2 116-120mg/L微量元素的组分和用量：
ZnSO4·7H2O 0.3-2mg/LFeSO4·7H2O 0.7-1.2mg/LCuSO4·5H2O 0.005-0.15mg/LCoCl2·6H2O 0.28-0.56mg/LAlCl3 0.01-0.05mg/L
TiCl4 0.020.15mg/L
NaVO3 0.0005-0.002mg/L
CrCl3 0.0018-0.005mg/L
NiCl2·6H2O 0.00012-0.002mg/L
碳水化合物和补充因子的组分和含量如下
葡萄糖7000-8000mg/L
丙酮酸钠91-150mg/L
延胡索酸0.211-0.711mg/L
琥珀酸0.03-0.5mg/L
α-酮戊二酸0.557-0.871mg/L
腐胺二盐酸盐0.7-1.5mg/L
乙醇胺盐酸盐35-50mg/L
精胺14-35mg/L
组胺0.35-0.95mg/L
次黄嘌呤钠7-35mg/L
胸苷0.2-1.2mg/L
肌醇168-200mg/L
硫辛酸0.08-0.5mg/L
亚油酸0.21-1.25mg/L
氯化胆碱162-200mg/L
Pluronic F68 1500-2000mg/L
重组小分子胶原蛋白75-200mg/L。
5.根据权利要求4所述的一种用于CHO细胞高效表达重组胶原蛋白的无血清培养基，其特征在于，包括以下组分及用量：
L-精氨酸317.044mg/LL-组氨酸89.6767mg/LL-赖氨酸825.105mg/LL-甲硫氨酸210.3861mg/LL-脯氨酸510.55905mg/LL-丝氨酸411.42735mg/LL-苏氨酸235.8576mg/LL-缬氨酸565.24875mg/LL-丙氨酸35.90327mg/LL-甘氨酸270.71705mg/LL-亮氨酸423.69mg/LL-苯丙氨酸150.81847mg/LL-天冬氨酸921.68mg/LL-谷氨酸109.538285mg/LL-异亮氨酸280.04795mg/LL-色氨酸67.19167mg/LL-酪氨酸250.94815mg/LL-半胱氨酸65.96235mg/LL-天冬酰胺427.88mg/L羟脯氨酸540mg/L烟酰胺19.9mg/L
D-泛酸钙盐4.485mg/L吡哆素盐酸盐8.74mg/L维生素B12 6.56mg/L盐酸硫胺10.51mg/L生物素1.505mg/L腺嘌呤磷酸盐6.575mg/L叶酸14.55mg/L核黄素0.54mg/L烟酸0.503mg/L维生素C 0.89mg/LNaHCO3 2400mg/LNaCl 2000mg/L
Na2HPO4 71mg/LNaH2PO4 62mg/LKCl 310mg/L
MgSO4 70mg/L
MgCl2 100mg/L
CaCl2 116mg/L
ZnSO4·7H2O 0.349mg/LFeSO4·7H2O 0.754mg/LCuSO4·5H2O 0.005mg/LCoCl2·6H2O0.281mg/LAlCl3 0.0142mg/LTiCl4 0.0211mg/LNaVO3 0.00054mg/LCrCl3 0.0018mg/LNiCl2·6H2O 0.00012mg/L葡萄糖7000mg/L
丙酮酸钠91.85mg/L
延胡索酸0.211mg/L
琥珀酸0.03315mg/L
α-酮戊二酸0.557
腐胺二盐酸盐0.762
乙醇胺盐酸盐35.25
精胺14.25mg/L
组胺0.3555mg/L
次黄嘌呤钠7.91mg/L
胸苷0.289mg/L
肌醇168.5mg/L
硫辛酸0.084mg/L
亚油酸0.21mg/L
氯化胆碱162.5mg/L
Pluronic F68 1500mg/L
重组小分子胶原蛋白75mg/L。
6.根据权利要求1-5任一项所述的无血清培养基种用于培养CHO细胞高效表达重组胶原蛋白的用途。
7.根据权利要6所述的用途，其特征在于，包括以下步骤：
首先按照配方配制无血清培养基，取无血清培养基进行预热，然后接种CHO细胞，并加入谷氨酰胺进行培养，实现CHO细胞高效表达重组胶原蛋白的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述预热的温度条件为37℃，接种CHO细胞的浓度为0.5-1.0×106cells/mL；所述谷氨酰胺的终浓度为6mM；所述培养的条件为：温度37℃，5％CO2，摇床转速120rpm。
9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，在加入谷氨酰胺进行培养至活细胞密度达到5.0-6.0×106cells/mL时，利用补料培养基进行补料，每间隔一段时间在无血清培养基中补加补料培养基后继续按照相同条件培养；
所述补料培养基组分如下：
氨基酸的组分和用量：
L-丙氨酸0.1-5.86g/L
L-精氨酸1.2-12.54g/L
L-天冬氨酸2.6-14.6g/L
L-半胱氨酸3.77-11.8g/L
·L-甘氨酸1.26-15.4g/L
L-组氨酸0.1-7.94g/L
L-亮氨酸2.1-23.6g/L
L-异亮氨酸2.25-14.6g/L
L-赖氨酸1.2-24.7g/L
L-甲硫氨酸0.1-8.683g/L
L-苯丙氨酸1.5-15.2g/L
L-脯氨酸4.6-28.14g/L
L-丝氨酸2.56-16.13g/L
L-苏氨酸1.5-26.5g/L
L-酪氨酸4.5-30.5g/L
L-缬氨酸1.2-14.26g/L
L-色氨酸0.5-17.9g/L
L-瓜氨酸0.1-12g/L
L-鸟氨酸0.1-12g/L
L-天冬酰胺3.5-21.87g/L
羟脯氨酸8-32.16g/L维生素的组分和用量:
核黄素0.001-0.054g/L烟酰胺0.05-0.69g/L吡哆素盐酸盐0.215-1.8g/L生物素0.005-0.14g/L叶酸0.01-1.19g/L维生素B12 0.01-1.03g/LD-泛酸钙盐0.01-3.62g/L维生素C 0.0001-0.009g/L盐酸硫胺0.05-0.89g/L烟酸0.001-0.0412g/L无机盐的组分和用量：
NaHCO3 0.52-12.8g/LNaCl 3.6-25.5g/L
Na2HPO4 0.1-3.6g/LKCl 0.1-7.48g/L
MgSO4 0.08-6.38g/LMgCl2 0.01-5.73g/LCaCl2 0.001-0.12g/L微量元素的组分和用量：
ZnSO4·7H2O 0.02-1.68g/LFeSO4·7H2O 0.19-8.9g/LCuSO4·5H2O 0.001-2.3g/LCoCl2·6H2O 0.0005-0.053g/L
TiCl4 0.00001-0.0211g/L
NaVO3 0.000001-0.0045g/L
CrCl3 0.000001-0.00338g/L
NiCl2·6H2O 0.00000001-0.0005g/LMnCl2 0.00001-0.0056g/L
Na2SeO3 0.00001-0.73g/L
碳水化合物和补充因子的组分和含量如下：葡萄糖10-150g/L
蔗糖0.001-0.56g/L
丙酮酸钠0.6-15.03g/L
琥珀酸0.00001-0.87g/L
腐胺二盐酸盐0.001-0.52g/L乙醇胺盐酸盐0.01-5.28g/L
精胺0.001-3.54g/L
组胺0.00015-0.269g/L
腺嘌呤0.0023-0.583g/L
牛磺酸0.00035-0.098g/L
肌醇0.12-15.61g/L
氯化胆碱0.47-13.49g/L
4-氨基苯甲酸0.00068-0.589g/L亚油酸0.00012-0.653g/L
硫辛酸0.00048-0.897g/L
重组小分子胶原蛋白0.1-5g/L。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述每间隔一段时间为2天，所述补料培养基的添加量为初始培养基体积的4％；
所述补料培养基的组分及用量如下：
L-丙氨酸0.869g/L
L-精氨酸4.985g/L
L-天冬氨酸7.641g/L
L-半胱氨酸5.771g/L
L-甘氨酸6.265g/L
L-组氨酸1.8g/L
L-亮氨酸9.363g/L
L-异亮氨酸5.142g/L
L-赖氨酸4.795g/L
L-甲硫氨酸1.984g/L
L-苯丙氨酸5.055g/L
L-脯氨酸8.11g/L
L-丝氨酸6.137g/L
L-苏氨酸6.409g/L
L-酪氨酸8.17g/L
L-缬氨酸5.26g/L
L-色氨酸3.571g/L
L-瓜氨酸0.208g/L
L-鸟氨酸0.265g/L
L-天冬酰胺7.491g/L
羟脯氨酸10.6g/L
核黄素0.0374g/L
烟酰胺0.192g/L
吡哆素盐酸盐0.158g/L
生物素0.0104g/L
叶酸0.193g/L
维生素B12 0.229g/L
D-泛酸钙盐0.195g/L
维生素C 0.00177g/L盐酸硫胺0.351g/L烟酸0.00422g/L
NaHCO3 1.98g/L
NaCl 6.5g/L
Na2HPO4 0.48g/L
KCl 0.52g/L
MgSO4 0.863g/L
CaCl2 0.365g/L
ZnSO4·7H2O 0.01154g/LFeSO4·7H2O 0.005851g/LCuSO4·5H2O 0.0023g/LCoCl2·6H2O 0.00953g/LTiCl4 0.00008211g/LNaVO3 0.000054g/LCrCl3 0.0000038g/LNiCl2·6H2O 0.0000012g/LMnCl2 0.000084g/LNa2SeO3 0.000339g/L葡萄糖61.3g/L蔗糖0.0344g/L丙酮酸钠3.04g/L琥珀酸0.000801g/L腐胺二盐酸盐0.0159g/L乙醇胺盐酸盐0.47g/L精胺0.152g/L组胺0.00298g/L腺嘌呤0.0682g/L牛磺酸0.001356g/L肌醇1.295g/L氯化胆碱1.25g/L
4-氨基苯甲酸0.01g/L亚油酸0.0078g/L硫辛酸0.0362g/L重组小分子胶原蛋白0.125g/L。
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