JP5112866B2 - プラスミドdna醗酵プロセス - Google Patents
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Description
適用されない。
本発明は、プラスミド、コスミド、バクテリア人工染色体(BACs)、バクテリオファージ、ウイルス性ベクタ及びこれらのハイブリッド等の閉環状(covalently closed circular:ccc)組み換え型DNA分子の生産に関し、より具体的には、醗酵培養における高レベルでのDNA分子の生産方法である。
本発明は、閉環状(ccc)組み換え型DNA分子の生産に関する。このような分子は、バイオテクノロジ、遺伝子組み換え生物、遺伝子治療、治療上のワクチン接種、農業及びDNAワクチンに有益である。
安定した媒体の型は、細胞のエネルギィ所要量及び基本的な組成に基づいている。一般的に、栄養学的な所要量は、最少培地又は半合成培地によって満たされる。
増殖速度
減少した増殖速度の使用が、高品質、高収率プラスミド醗酵の統一原理である。高増殖速度は、酢酸生成物、プラスミド不安定性、及びスーパーコイル状のプラスミドのより低い割合と関連している。減少した増殖速度は、細胞分裂と同期したプラスミド複製のための時間を提供することによって、増殖速度依存プラスミド不安定性を緩和する。
醗酵は、プラスミドの質及び収率に影響する多くのパラメータを制御及び監視する可能性を与える。スーパーコイル形成は、酸素及び温度によって影響されることが知られている(Dorman CJ et al.1988 J.Bacteriol.179:2816−2826)、(Goldstein E,Drlica K.1984 Proc Natl Acad Sci USA.81:4046−4050)。酸素は、プラスミド安定性において重要な役割を演じることが示されている。ある研究(Hopkins DJ,Betenbaugh MJ,Dhurjati P.1987 Biotechnol Bioeng.29:85−91)では、5%の空気飽和率に対する溶存酸素濃度中の1滴が、プラスミド安定化の急速な減少を導くことを発見した。別の研究(Namdev PK,Irwin N,Thompson BG,Gray MR.1993 Biotechnol Bioeng.41:666−670)では、酸素導入の変動が、プラスミドの不安定化をまねくことを示した。更に、ニックプラスミド及び多重体の形成は、温度、pH、溶存酸素、栄養素濃度、及び増殖速度を含む多くのパラメータによって影響を受け得る(Durland RH,Eastman EM.1998 Adv Drug Deliver Rev.30:33−48)。大腸菌増殖の最適温度は、37℃である。しかしながら、回分醗酵では、より低い温度(30から48℃)を用いて、最大比増殖速度を低くすることができる。また、より高い温度を用いて、pUC、及びpMM1(Wong EM,Muesing MA,Polisky,B.1982 Proc Natl Acad Sci USA.79:3570−3574)、(Lin−Chao S,Chen WT,Wong TT.1992 MoI Microbio.6:3385−3393)及びランアウェイレプリコンRプラスミド等の複製起源を伴う選択的なプラスミド増幅を誘発することもできる。Hamann et.al.2000(Hamann CW,Nielsen J,Ingerslev E.2000 World Patent Application WO0028048)は、プラスミド生産を(低温度によって)低レベルに維持して、プラスミドDNA合成による増殖の遅延を避けるRプラスミドの生産方法を報告している。ここでは、宿主細胞集団が高くなると、温度変化によってプラスミド生産が誘発される。
回分醗酵は、簡単であるという主な利点を有する。培養期間を通して細胞増殖及びプラスミド生産に用いられる全栄養素が、植菌時に存在する。回分醗酵は、誘導期、指数増殖期、及び静止期を有する。好適な植菌材料(1から5%の培養液量)は、誘導期の長さを低減させる。指数増殖期間には、全栄養素が過剰であり;従って、この比増殖速度は、本質的にモノ−キネティックスによって予測される最大比増殖速度、μmaxになる。上述したように、増殖速度が減少することは、プラスミド生産にとって望ましい。回分醗酵において、増殖速度は、μmaxを減少させることによってのみ低減する。これは、より低い温度での増殖によって、及びグルコースの代わりにグリセロール上で増殖することによって達成される。グリセロールを用いた30℃での回分醗酵は、一般的にμmax <0.3h−1となり、このことは、有害な酢酸蓄積及びプラスミド不安定に関する増殖速度を妨ぐのに十分である(Thatcher DR,Hitchcock A,Hanak JAJ,Varley DL.2003 U.S Patent No6503738)。また、阻害されることのなくグルコースよりずっと高い濃度でグリセロールを、使用することができ、より高いバイオマス収率にすることができる。一般的に、60g/L DCW以上のバイオマス収率を、回分醗酵で得ることができる。
流加培養醗酵は、プラスミド生産に特に有益である。制限栄養素を制御して加えることは、率<μmaxでの増殖速度の制御を可能にする。また、流加培養醗酵は、収率をより高くする結果となる。流加培養醗酵の鍵は、完全に消費されるような比率で基質を供給することである。結果として、残留基質濃度は、ほぼ0であり、基質の最大転換が得られる。過剰の基質からの代謝過剰を回避し、阻害酢酸の形成を低減する。
現行の収率の試験により、一般的なラボの振盪フラスコ培養は1から5mgのプラスミドDNA/Lの培地を作るが、コンピュータ制御の醗酵装置は、一般的に、10から250mg/LのプラスミドDNA/Lの培地を作ることが明らかである。
本発明は、プラスミド生産用の改善された回分及び流加培養プロセスを用いるDNAレプリコンの生産方法である。特に、流加培養醗酵方法が開示されており、ここでは、プラスミド含有大腸菌(E.coli)細胞が、流加培養期中に低い温度で増殖し、この増殖中は増殖速度が制限され、次いで、プラスミドを蓄積するために温度をアップシフト(up−shift)し、段階的に温度を高くして継続的に増殖させることによって、温度シフトと制限された増殖速度が、プラスミドの収率及び純度を改善する。好ましい実施例では、低減した増殖速度をほぼ2mg/L/OD以下のプラスミド収率を維持するように決定する。別の好ましい実施例では、この低減した温度はおよそ30℃である。別の好ましい実施例では、温度のアップシフトは、ほぼ36から45℃までである。別の好ましい実施例では、プラスミドはColE1誘導複製起源を含む。更にもう1つの好ましい実施例では、プラスミドはpUCGからpUCAまでの突然変異を含むpMB1複製起源を含む。更に別の実施例では、プラスミドは、VR1012バックボーンから誘導される。一の極めて好ましい実施例では、醗酵媒体が、実質的に半合成グリセロール媒体である。更に最後の好ましい実施例では、pBR322−誘導プラスミドは、増殖速度が流加培養期間で制限され、増殖がプラスミド生産物を継続して蓄積する間に、流加培養醗酵の大腸菌(E.coli)中で増殖する。要約すれば、これらのプロセスは、新規の増殖と誘発期の温度シフトとを組み合わせた、高い細胞密度培養戦略を特徴とする。DNAレプリコンを含有するpBR322−誘導起源の生産において、流加培養醗酵は、制限された細胞増殖速度で実施される。温度誘導DNAレプリコン(例えば、プラスミド含有pUC又はpMM1起源)の生産において、流加培養醗酵は、増殖期中の制限された細胞増殖速度と低減された温度で実施され;次いで、プラスミド生産は、温度をアップシフトすることによって誘発される。これらのプロセスは、プラスミドDNA醗酵収率を劇的に改善し、その一方で、従来技術のプロセスと比較して、プラスミドの完全性を維持又は改善する。
本発明の目的及び/又は対象は、プラスミドDNAの生産のための醗酵プロセスを提供することである。本発明のもう一つの対象及び/又は目的は、醗酵培養のプラスミドDNA生産収率を改善することである。本発明の更に別の対象及び/又は目的は、醗酵培養のプラスミドDNAの品質を改善することである。本発明の更に別の対象及び/又は目的は、精製プラスミドDNA中の不純物を低減することである。別の開示は、従来技術に記載されたプロセスと比較して改善された改善醗酵プロセスであり、バイオマス生産後のプラスミドレベルの誘導によってプラスミドの増加した収量;バイオマス生産中の低プラスミドレベルの維持による毒性又は不安定プラスミドと共に増加した収量及び完全性;プラスミドのニック(開環)又は直鎖バージョンの低減したレベルによってプラスミドの質を向上すること;プラスミドのパーセントモノマ(percent monomer)の増加によってプラスミドの質を向上すること;ロバスト、自動制御パラメータ及び供給を用いる簡略化した生産;増殖中に必要な増殖制御及び低減した酸素補給によって簡略化したスケーリング;ダウンストリームプロセシング内へのフィードストリームのプラスミドの濃縮レベルによるプラスミド精製後の不純物の低減したレベル;及び全ての動物性生成物誘導成分の除去によって、改善した標準コンプライアンス;によって改善される。
図面を参照すると、図1は、NTC3019培地を用いた大腸菌(E.coli)中のpBR322−誘導プラスミド流加培養醗酵を示し、これは(a)NTC3019培地を用いた流加培養中の、大腸菌(E.coli)中のpBR322−誘導プラスミドの一般的な増殖及びプラスミド生産性プロファイルと;(b)高スーパーコイル状であり、ギザギザで開環したアイソフォームを含まないNTC3019培地流加培養醗酵プロセスによって生産されたプラスミドDNAと;を明らかにしている。
pBR322−誘導プラスミドを生産する1つの好ましい実施例では、流加培養醗酵を制限された細胞増殖速度で実施する。このプロセスは、プラスミドDNA醗酵収率を劇的に改善するにも関わらず、従来技術に記載されているプロセスと比較して、プラスミドの完全性を維持又は改善する。
本発明を実施する上で、例示的な動物由来成分を含まない醗酵培地配合、NTC3018(回分)、NTC3019(流加培養)を用いることができる。これらの培地は、グリセロール炭素源、イースト抽出窒素源、及び微量金属、塩及び緩衝液を含む半合成増殖培地である。従来技術に記載された培地を、この培地で代用することも本明細書に記載されているような醗酵プロセスを用いた改善されたプラスミド生産性をもたらす。
改善されたプラスミド生産のための流加培養及び回分プロセスが、本明細書に開示されている。これらは、新規な増殖及び誘発期温度シフトと組み合わせて、指数関数的供給戦略を特徴付けるものである。
我々は、高コピー、低コピー及び中程度のコピーのいずれかであり、温度誘導性であるか温度誘導性ではない種々の起源の複製を伴うプラスミドの生産において本発明を使用することを意図している。いくつかの好ましい複製の起源、及びこれらを組み込んだプラスミドが、表1に記されている。これらの起源の変更はこの分野において公知であり、また、使用を意図している。
誘導性流加培養プロセスにおけるプラスミドDNA(>6mg/L/OD600)の実際の増加した収量についての根底にある機構は知られていない。遅い増殖及び低下した温度でのバイオマス生産中に、DNA凝縮剤(例えば、dps遺伝子生産物等のヒストン状タンパク質、又はその他のクロマチン結合タンパク質)に潜在的に起因する。
我々は、例示的なプラスミド精製プロセス中に記載された醗酵培地からのプラスミド濃縮供給ストリームを用いることを意図している。このようなプロセスは、技術的によく知られている。高収量醗酵と例示的な精製プロセスの組み合わせは、費用対効果のある方法論を提供し、ゲノミックDNAを更に遺伝子治療及びDNAワクチン接種適用に許容されるレベルにまで減らす。
本発明の方法を、以下の例において更に説明する。これらは、例示によって提供され、本発明の範囲を限定するものではない。
次の基準はプラスミドDNAを製造するための最適化醗酵プロセスの評価として確立された:
1) プラスミドの高い比収量(g細胞質量当たりのmgプラスミドDNA);
2) 高バイオマス収量;
3) 高度のスーパーコイル状のプラスミドを保つであろう;
4) ダウンストリームプロセシング中に生じる問題が最小になる;
5) 調整要求条件を満足する;
6) プラスミド構造を保持する(例えば、遺伝子欠失がない、又はその他の再配列);
37℃での、New Brunswick BioFlo 110 fermentor中で流加培養醗酵を実施した。30%の水酸化アンモニウム又は10%のリン酸を自動的に添加することによって、pHを制御した。窒素ガス散布によって0%に、及び空気飽和で100%に溶存酸素プローブを調節した。容器を1VVMで通気し、溶存酸素を攪拌の比例積分制御によって30%に維持した。また、約20OD600以上の細胞密度で、30%の飽和を維持するためにO2補給を必要とした。
μ=流加培養期中の所望の比増殖速度、
XB=回分期の終わりのバイオマス濃度、gDCW/L、
VB=培地の初期液体体積、L、
Sf=栄養素供給培地の制限基質濃度、g/L、
YX/S=基質からのバイオマスの収量係数、g/g
t=流加培養期の開始からの時間、
である。
pUC起源プラスミドを用いたNTC3018培地回分培養を実施した。以下のプラスミド含有pUC起源を使用した:
1)pW2.0、変質ポリリンカーシークエンスを有するpUC19の誘導体
2)pMaxGFP
3)pEGFP−C1
Vical VR1012ベクタの誘導体を含有するGFP遺伝子であるプラスミドgWiz GFP(Gene Therapy Systems)を、流加培養醗酵評価用に選択した。これは、5757bpの大きさの広く用いられているDNAワクチンプラスミド含有カナマイシン耐性(kanR)pUC起源である。このプラスミドgWiz GFP(Gene Therapy Systems)を、大腸菌(E.coli)DH5αに変質させた。また、pMaxGFPを、流加培養培地内で試験し;両方のプラスミドについて、同様の結果を得た。
Claims (2)
- 閉環状スーパーコイル状のpUC起源プラスミドのDNAの流加培養醗酵生産方法において:
A)流加培養の増殖期に25℃ないし35℃の低温で前記閉環状スーパーコイル状のpUC起源プラスミドのDNAを含む細菌性細胞を増殖するが、炭素源の栄養素を制限することによって、前記流加培養期中の増殖速度を制限するステップと;
B)36℃ないし45℃への温度上昇によってプラスミド生産を誘発するステップと;
C)36℃ないし45℃で増殖を継続して、プラスミド産物を蓄積するステップと;
を具え、該方法によってプラスミド収量が増えることを特徴とする方法。 - 請求項1に記載の方法において、該醗酵用の培地が、半合成グリセロール培地であることを特徴とする方法。
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