JP2023517682A - 細菌宿主株 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ベクターをプロポゲート（ｐｒｏｐｏｇａｔｅ）するために使用することができる特定の他の変異なしに、ＳｂｃＣ、ＳｂｃＤ、またはその両方のノックアウトを組み合わせる操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を提供する。そのような操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を使用する改良されたベクター産生の方法もまた提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月１１日に出願された「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｈｏｓｔ Ｓｔｒａｉｎｓ」と題する米国仮特許出願第６２／９８８，２２３号に対する優先権を主張し、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０２１年３月１１日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、８５５３５－３３４９８７＿ＳＬ．ｔｘｔという名前が付けられ、サイズが１１２，７９６バイトである。
参照による組み込み
ＷＯ２００８／１５３７３３、ＷＯ２０１４／０３５４５７、およびＷＯ２０１９／１８３２４８は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書で参照される全ての刊行物、特許、および特許出願刊行物は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミドは、長い間、研究者および業界によって使用される組換えＤＮＡ分子の重要な供給源であった。今日では、次世代のバイオテクノロジー製品（例えば、遺伝子医薬品およびＤＮＡワクチン）が臨床試験に進み、最終的には医薬品市場に入るにつれて、プラスミドＤＮＡがますます重要になりつつある。プラスミドＤＮＡワクチンは、ウイルス疾患、細菌疾患、または寄生虫疾患の予防ワクチンとして、高力価免疫グロブリン産物の調製のための免疫剤として、感染性疾患のための治療ワクチンとして、またはがんワクチンとして適用され得る。プラスミドは、遺伝子療法または遺伝子置換用途においても利用され、所望の遺伝子産物は、患者への投与後にプラスミドから発現される。プラスミドは、遺伝子療法または遺伝子置換用途のための非ウイルストランスポゾン（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃ、ＴＣＢｕｓｔｅｒなど）ベクターにおいても利用され、所望の遺伝子産物は、プラスミドからのトランスポジションおよびゲノム組み込み後にゲノムから発現される。プラスミドは、遺伝子編集（例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）／ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）においても、遺伝子療法または遺伝子置換用途のための非ウイルスベクターで利用され、所望の遺伝子産物は、プラスミドおよびゲノム組み込みからの切除後にゲノムから発現される。プラスミドはまた、遺伝子治療または遺伝子置換用途のためのウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ、レンチウイルス、レトロウイルスベクター）において利用され、所望の遺伝子産物は、産生細胞株のトランスフェクション後に形質導入ウイルス粒子にパッケージされ、次いでウイルス導入後に標的細胞においてウイルスから発現される。
非ウイルスおよびウイルスベクタープラスミドは、典型的には、ｐＭＢ１由来、ＣｏｌＥ１由来、またはｐＢＲ３２２由来の複製起点を含有する。一般的な高コピー数誘導体は、ＲＯＰ（プライマー遺伝子のリプレッサー）欠失およびコピー数を増加させる第２の部位変異（例えば、ｐＭＢ１ ｐＵＣのＧからＡへの点変異、またはＣｏｌＥ１ ｐＭＭ１）などのコピー数調節に影響を及ぼす変異を有する。より高い温度（４２℃）を用いて、ｐＵＣおよびｐＭＭ１複製起点を有する選択的プラスミド増幅を誘導することができる。
ＷＯ２０１４／０３５４５７は、ＲＮＡ－ＯＵＴ抗生物質フリー選択を利用し、大型１０００ｂｐのｐＵＣ複製起点を新規の３００ｂｐのＲ６Ｋ起点で置き換える最小化ベクター（Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄ（商標））を開示している。導入遺伝子発現カセットの５’および３’末端をＲ６Ｋ起点－ＲＮＡ－ＯＵＴ骨格で＜５００ｂｐに連結するスペーサー領域の減少は、従来のミニサークルＤＮＡベクターと比較して発現レベルを向上させる。
その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，９４３，３７７号は、流加（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ）発酵のための方法を記載し、この方法では、プラスミド含有Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、流加相の一部の間に低下させた温度で増殖させ、その間、増殖速度が制限され、その後、温度上昇シフトが続き、プラスミドを蓄積するために高温で継続的に増殖させており、制限された増殖速度での温度シフトは、プラスミド収率および純度を改善した。この発酵プロセスは、本明細書ではＨｙｐｅｒＧＲＯ発酵プロセスと称される。プラスミド産生のための他の発酵プロセスは、Ｃａｒｎｅｓ Ａ．Ｅ．２００５ ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｌ ３：３６－４４に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＷＯ２０１４／０３５４５７はまた、ＨｙｐｅｒＧＲＯ発酵プロセスにおけるＲ６Ｋ起点ベクター産生のための宿主株を開示する。
Ｓｃｈｎｏｄｔ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５ ｅ３５５とともに、Ｃｈａｄｅｕｆ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：７４４－５３およびＧｒａｙ，２０１７．ＷＯ２０１７／０６６５７９は、ＡＡＶヘルパープラスミド抗生物質耐性マーカーがウイルス粒子にパッケージ化され、ＡＡＶヘルパープラスミドならびにＡＡＶベクターから抗生物質マーカーを除去する必要性を示すことを教示する。ＷＯ２０１４／０３５４５７に開示されている抗生物質フリーＮａｎｏｐｌａｓｍｉｄ（商標）ベクターでは、抗生物質マーカー転写はない。
ＡＡＶなどのウイルスベクターは、末端にパリンドローム逆向き末端反復（ＩＴＲ）ＤＮＡ配列を含有する。
パリンドロームおよび逆向き反復は、ＤＨ１、ＤＨ５α、ＪＭ１０７、ＪＭ１０８、ＪＭ１０９、ＸＬ１Ｂｌｕｅなどの高収率Ｅ．ｃｏｌｉ製造宿主において本質的に不安定である。
ＡＡＶ ＩＴＲ含有ベクターの増殖は、多（ｍｕｌｔｉｐｌｙ）変異ｓｂｃＣノックアウト細胞株ＳＵＲＥ（ＳＲＢのｒｅｃＢ誘導体）またはＳＵＲＥ２で行うことが推奨される。
ＳＵＲＥ細胞株は、以下の遺伝子型を有する：Ｆ’［ｐｒｏＡＢ＋ ｌａｃＩｑ ｌａｃＺΔＭ１５ Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ］ｅｎｄＡ１ ｇｌｎＶ４４ ｔｈｉ－１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１ ｌａｃ ｒｅｃＢ ｒｅｃＪ ｓｂｃＣ ｕｍｕＣ：：Ｔｎ５ ＫａｎＲ ｕｖｒＣ ｅ１４－（ｍｃｒＡ－）Δ（ｍｃｒＣＢ－ｈｓｄＳＭＲ－ｍｒｒ）１７１（ここで、ＳＵＲＥ安定化変異は、ｒｅｃＢ ｒｅｃＪ ｕｍｕＣ ｕｖｒＣ－（ｍｃｒＡ－）ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒと組み合わせてｓｂｃＣを含む）。
ＳＲＢ細胞株は、以下の遺伝子型を有する：Ｆ’［ｐｒｏＡＢ＋ ｌａｃＩｑ ｌａｃＺΔＭ１５ ｅｎｄＡ１ ｇｌｎＶ４４ ｔｈｉ－１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１ ｌａｃ ｒｅｃＪ ｓｂｃＣ ｕｍｕＣ：：Ｔｎ５（ＫａｎＲ ｕｖｒＣ ｅ１４－（ｍｃｒＡ－）Δ（ｍｃｒＣＢ－ｈｓｄＳＭＲ－ｍｒｒ）１７１（ここで、ＳＲＢ安定化変異は、ｒｅｃＪ ｕｍｕＣ ｕｖｒＣ－（ｍｃｒＡ－）ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒと組み合わせてｓｂｃＣを含む）。
ＳＵＲＥ２細胞株は、以下の遺伝子型を有する：ｅｎｄＡ１ ｇｌｎＶ４４ ｔｈｉ－１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１ ｌａｃ ｒｅｃＢ ｒｅｃＪ ｓｂｃＣ ｕｍｕＣ：：Ｔｎ５ ＫａｎＲ ｕｖｒＣ ｅ１４－Δ（ｍｃｒＣＢ－ｈｓｄＳＭＲ－ｍｒｒ）１７１ Ｆ’［ｐｒｏＡＢ＋ ｌａｃＩｑ ｌａｃＺΔＭ１５ Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ）Ａｍｙ ＣｍＲ］（ここで、ＳＵＲＥ２安定化変異は、ｒｅｃＢ ｒｅｃＪ ｕｖｒＣ－（ｍｃｒＡ－）ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒと組み合わせてｓｂｃＣを含む。
ＳｂｃＣＤは、パリンドロームＤＮＡ配列を切断し、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるパリンドローム不安定性に寄与するヌクレアーゼである（Ｃｈａｌｋｅｒ ＡＦ，Ｌｅａｃｈ ＤＲ，Ｌｌｏｙｄ ＲＧ．１９８８ Ｇｅｎｅ ７１：２０１－５）。ｓｈＲＮＡまたはＡＡＶ ＩＴＲなどのパリンドロームは、Ｇｒａｙ ＳＪ，Ｃｈｏｉ，ＶＷ，Ａｓｏｋａｎ，Ａ，Ｈａｂｅｒｍａｎ ＲＡ，ＭｃＣｏｗｎ ＴＪ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ（２０１１）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｃｈａｐｔｅｒ ４：Ｕｎｉｔ ４．１７で、次の「ＡＡＶ ＩＴＲは、Ｅ．ｃｏｌｉでは不安定であり、ＩＴＲを失うプラスミドは、形質転換細胞において複製利点を有する」ように表示されるように、ＤＨ５αよりもＳＵＲＥ細胞などのＳｂｃＣノックアウト株において安定である。これらの理由から、ＩＴＲプラスミドを含有する細菌は、１２～１４時間を超えて増殖させてはならず、いかなる回収されたプラスミドも、ＩＴＲの保持について評価されるべきである……ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）（または他の同等の高効率株）を使用して、ＩＴＲ含有プラスミドクローニングのための連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応を形質転換することができる。ＩＴＲ完全性について陽性クローンをスクリーニングした後、良好なクローンを、プラスミドおよびグリセロールストックの産生のためにＳＵＲＥまたはＳＵＲＥ２細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換する必要がある。ＳＵＲＥ細胞は、不規則なＤＮＡ構造を維持するように操作されるが、ＤＨ１０Ｂと比較して低い形質転換効率を有する。さらに、Ｓｉｅｗ ＳＭ、２０１４組換えＡＡＶ媒介性遺伝子療法アプローチは、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症３型を治療するためのものである。２０１４年１２月３日にアップロードされたシドニー大学の論文では、「ＳＵＲＥ２細胞は、パリンドロームＡＡＶ ＩＴＲを含有するプラスミドを伝播するために一般的に使用されるｓｂｃＣ変異株である」と教示している。したがって、一般には、パリンドロームＡＡＶ ＩＴＲを含有するプラスミドを伝播するために、ＳＵＲＥまたはＳＵＲＥ２ ｓｂｃＣ変異株が好ましいと理解されている。
しかしながら、ＳＵＲＥまたはＳＵＲＥ２細胞株には限界がある。例えば、ＳＵＲＥおよびＳＵＲＥ２は、ｋａｎＲであるため、ｃＧＭＰ製造において典型的に使用される（アンピシリン耐性プラスミドではなく）カナマイシン耐性プラスミドを生成するために使用することはできない。さらに、当該技術分野は、パリンドローム配列のｓｂｃＣノックアウト安定化が、ｒｅｃＢ ｒｅｃＪ ｕｖｒＣ ｍｃｒＡ、またはｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒなどの他の遺伝子における変異をさらに必要とすることを教示する。Ｄｏｈｅｒｔｙ ＪＰ，Ｌｉｎｄｅｍａｎ Ｒ，Ｔｒｅｎｔ ＲＪ，Ｇｒａｈａｍ ＭＷ，Ｗｏｏｄｃｏｃｋ ＤＭ．１９９３．Ｇｅｎｅ １２４：２９－３５は、全てのパリンドローム配列がＳＵＲＥ（または関連するＳＲＢ細胞株）において安定化されてはいないことを報告している。彼らは、次の「しかしながら、パリンドローム配列含有ファージは、ＳＵＲＥ（ｒｅｃＢ ｓｂｃＣ ｒｅｃＪ ｕｍｕＣ ｕｖｒＣ）およびＳＲＢ（ｓｂｃＣ ｒｅｃＪ ｕｍｕＣ ｕｖｒＣ）上に妥当な効率でプレートされたが、これらの株から回収されたファージの大部分は、その後のプレートのためにｓｂｃＣ宿主をもはや必要としなくなった」のように、パリンドローム配列安定化のために追加の変異（ｒｅｃＣ）が必要であることを推奨した。これらの２つの株はまた、ヒトプラダー・ウィリー染色体領域からの低収率ファージクローンで、より不良な力価をもたらした。最適なファージ宿主は、ｍｃｒＡデルタ（ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒ）とｓｂｃＣプラスｒｅｃＢＣまたはｒｅｃＤの変異を組み合わせたものであるようだ。」
これと一致して、他のＳｂｃＣ宿主株もまた、例えば、ＰＭＣ１０３：ｍｃｒＡ Δ（ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｒｒ）１０２ ｒｅｃＤ ｓｂｃＣ（ここで、ＰＭＣ１０３安定化変異は、ｒｅｃＤ（ｍｃｒＡ－）ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒと組み合わせたｓｂｃＣを含む）、およびＰＭＣ１０７：ｍｃｒＡΔ（ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｒｒ）１０２ ｒｅｃＢ２１ ｒｅｃＣ２２ ｒｅｃＪ１５４ ｓｂｃＢ１５ ｓｂｃＣ２０１（ここで、ＰＭＣ１０７安定化変異は、ｒｅｃＢ ｒｅｃＪ ｓｂｃＢ（ｍｃｒＡ－）ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒ．と組み合わせたｓｂｃＣを含む）。
したがって、当該技術分野は、パリンドロームのｓｂｃＣノックアウト安定化が、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪにおける変異を、場合によっては、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡ、および／またはｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒにおける変異をさらに必要とすることを教示する。これは、これらの追加の変異を含まないＤＨ１、ＤＨ５α、ＪＭ１０７、ＪＭ１０８、ＪＭ１０９、ＸＬ１Ｂｌｕｅなどの標準的なＥ．ｃｏｌｉプラスミド産生株におけるパリンドローム安定性を改善するために、ｓｂｃＣノックアウトの適用とは離れて教示する。
例えば、いくつかの標準的なＥ．ｃｏｌｉプラスミド産生株の遺伝子型は以下のとおりである：
ＤＨ１：Ｆ－λ－ｅｎｄＡ１ ｒｅｃＡ１ ｒｅｌＡ１ ｇｙｒＡ９６ ｔｈｉ－１ ｇｌｎＶ４４ ｈｓｄＲ１７（ｒＫ －ｍＫ －）
ＤＨ５α：Ｆ－φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ Δ（ｌａｃＺＹＡ－ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒｋ－，ｍｋ＋）ｇａｌ－ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４ λ－ｔｈｉ－１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１
ＪＭ１０７：ｅｎｄＡ１ ｇｌｎＶ４４ ｔｈｉ－１ ｒｅｌＡ１ ｇｙｒＡ９６ Δ（ｌａｃ－ｐｒｏＡＢ）［Ｆ’ ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡＢ＋ ｌａｃＩｑ ｌａｃＺΔＭ１５］ｈｓｄＲ１７（ＲＫ －ｍＫ ＋）λ－
ＪＭ１０８：ｅｎｄＡ１ ｒｅｃＡ１ ｇｙｒＡ９６ ｔｈｉ－１ ｒｅｌＡ１ ｇｌｎＶ４４ Δ（ｌａｃ－ｐｒｏＡＢ）ｈｓｄＲ１７（ｒＫ －ｍＫ ＋）
ＪＭ１０９：ｅｎｄＡ１ ｇｌｎＶ４４ ｔｈｉ－１ ｒｅｌＡ１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｃＡ１ ｍｃｒＢ＋ Δ（ｌａｃ－ｐｒｏＡＢ）ｅ１４－［Ｆ’ ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡＢ＋ ｌａｃＩｑ ｌａｃＺΔＭ１５］ｈｓｄＲ１７（ｒＫ －ｍＫ ＋）
ＭＧ１６５５ Ｋ－１２ Ｆ－λ－ｉｌｖＧ－ｒｆｂ－５０ ｒｐｈ－１
ＸＬ１Ｂｌｕｅ：ｅｎｄＡ１ ｇｙｒＡ９６（ｎａｌＲ）ｔｈｉ－１ ｒｅｃＡ１ ｒｅｌＡ１ ｌａｃ ｇｌｎＶ４４ Ｆ’［：：Ｔｎ１０ ｐｒｏＡＢ＋ ｌａｃＩｑ Δ（ｌａｃＺ）Ｍ１５］ｈｓｄＲ１７（ｒＫ －ｍＫ ＋）
標準的なＥ．ｃｏｌｉプラスミド産生株は、ｅｎｄＡ、ｒｅｃＡである。しかしながら、標準産生株は、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪにおける必要な変異のいずれも含有せず、場合によっては、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡ、またはｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒを含有せず、したがって、ｓｂｃＣのノックアウトは、これらの追加の変異の非存在下で、パリンドロームまたは逆向き反復を効果的に安定化することは期待されない。
しかしながら、ＳＵＲＥおよびＳＵＲＥ２細胞株における複数の変異の存在は、Ｅ．ｃｏｌｉ発酵プラスミド産生プロセスにおける細胞株の生存率およびそれらの生産性を低下させる。例えば、表１は、ＳＵＲＥ２またはＸＬ１Ｂｌｕｅ（例示的な高収率Ｅ．ｃｏｌｉ製造宿主）におけるＨｙｐｅｒＧＲＯ発酵プラスミド収率および質を要約する。３つのプラスミドはいずれも、ＳＵＲＥ２では低収率で多量体化しやすかったが、ＸＬ１Ｂｌｕｅでは高収率（２～４倍）で高品質（低多量体化）であった。
Figure 2023517682000001
生存率および生産性の低下は、例えば、レンチウイルスベクターなどの直接的な反復を含有するベクターを安定化するために使用されるが、ＳｂｃＣノックアウトを含有しない、Ｓｔｂｌ２、Ｓｔｂｌ３、およびＳｔｂｌ４などの、多変異「安定化宿主」の一般的な特徴である。Ｓｔｂｌ２、Ｓｔｂｌ３、およびＳｔｂｌ４の遺伝子型を以下に示す。
Ｓｔｂｌ２：Ｆ－ｅｎｄＡ１ ｇｌｎＶ４４ ｔｈｉ－１ ｒｅｃＡ１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１ Δ（ｌａｃ－ｐｒｏＡＢ）ｍｃｒＡ Δ（ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｒｒ）λ－
Ｓｔｂｌ２安定化変異＝ ｍｃｒＡ Δ（ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｒｒ）（Ｔｒｉｎｈ，Ｔ．，Ｊｅｓｓｅｅ，Ｊ．，Ｂｌｏｏｍ，Ｆ．Ｒ．，ａｎｄ Ｈｉｒｓｃｈ，Ｖ．（１９９４）ＦＯＣＵＳ １６，７８。）
Ｓｔｂｌ３：Ｆ－ｍｃｒＢ ｍｒｒ ｈｓｄＳ２０（ｒＢ－，ｍＢ－）ｒｅｃＡ１３ ｓｕｐＥ４４ ａｒａ－１４ ｇａｌＫ２ ｌａｃＹ１ ｐｒｏＡ２ ｒｐｓＬ２０（Ｓｔｒｒ）ｘｙｌ－５ －ｌｅｕ ｍｔｌ－１
Ｓｔｂｌ３安定化変異＝ ｍｃｒＢＣ －ｍｒｒ
Ｓｔｂｌ４：ｅｎｄＡ１ ｇｌｎＶ４４ ｔｈｉ－１ ｒｅｃＡ１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１ Δ（ｌａｃ－ｐｒｏＡＢ）ｍｃｒＡ Δ（ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｒｒ）λ－ｇａｌ Ｆ’［ｐｒｏＡＢ＋ ｌａｃｋＩｑ ｌａｃＺΔＭ１５ Ｔｎ１０］
Ｓｔｂｌ４安定化変異＝ ｍｃｒＡ Δ（ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｒｒ）
したがって、低安定性または低生存率に悩まされないＩＴＲ欠失または再配列を伴わないパリンドロームおよび逆向き反復含有ベクターの高収率製造のための高収率Ｅ．ｃｏｌｉ産生株の必要性が存在する。
本開示は、宿主細菌株、そのような宿主細菌株を作製する方法、およびそのような宿主細菌株を使用してプラスミド産生を改善する方法に関する。
いくつかの実施形態では、ＳｂｃＣ、ＳｂｃＤ、またはその両方のノックアウトを有するが、特定の追加の変異を有さない、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を調製するための方法が提供される。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞においてベクターを複製するための方法が提供される。
本発明およびその利点のより完全な理解のために、以下の説明を添付の図面と併せて参照する。
ＰＣＲ断片を標的とするｐＫＤ４ ＳｂｃＣＤを表示する。 ＳｂｃＣＤ遺伝子座を表示する。 ＳｂｃＣＤをノックアウトする組み込まれたｐＫＤ４ ＰＣＲ産物を表示する。 ｐＫＤ４ ｋａｎＲマーカーのＦＲＴ媒介性切除後の瘢痕を表示する。
本開示は、細菌宿主株、細菌宿主株の改変するための方法、およびプラスミドの収率ならびに品質を改善することができる製造方法を提供する。
本開示の細菌宿主株および方法は、細胞療法、遺伝子療法または遺伝子置換用途のための、非ウイルス性トランスポゾンベクター（トランスポザーゼベクター、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼベクター、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼベクター、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼベクター、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼベクター、発現ベクターなど）または非ウイルス性遺伝子編集（例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）／ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）ベクター、ならびにウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター、ＡＡＶ ｒｅｐ ｃａｐベクター、ＡＡＶヘルパーベクター、Ａｄヘルパーベクター、レンチウイルスベクター、レンチウイルスエンベロープベクター、レンチウイルスパッケージングベクター、レトロウイルスベクター、レトロウイルスエンベロープベクター、レトロウイルスパッケージングベクターなど）などのベクターの改善された製造を可能にすることができる。
改善されたプラスミド製造は、当該技術分野において既知の代替宿主株を使用したプラスミド製造と比較して、改善されたプラスミド安定性（例えば、プラスミド欠失、逆向き、もしくは他の組換え生成物の低減）、および／または改善されたプラスミド品質（例えば、切断された、線状もしくは二量体化生成物の減少）、および／または改善されたプラスミド超コイリング（例えば、スーパーコイル状トポロジーアイソフォームの減少）を含むことができる。本明細書で引用される全ての参考文献は、それらの全体において参照により組み込まれることを理解されたい。
定義
本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈により特に明記されていない限り、複数形の指示対象が含まれる。
特許請求の範囲および本開示における「または」という用語の使用は、代替案のみを指すように明示的に示されない限り、または代替案が相互に排他的である場合を除き、「および／または」を意味するように使用される。
「約」という用語の使用は、数値とともに使用される場合、＋／－１０％を含むことが意図される。例として、限定するものではないが、アミノ酸の数が約２００と特定される場合、これは、１８０～２２０（プラスまたはマイナス１０％）を含む。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶベクター」は、アデノ随伴ウイルスベクターまたはエピソームウイルスベクターを指す。例として、「ＡＡＶベクター」としては、自己相補的アデノ関連ウイルスベクター（ｓｃＡＡＶ）および一本鎖アデノ関連ウイルスベクター（ｓｓＡＡＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ａｍｐ」は、アンピシリンを指す。
本明細書で使用される場合、「ａｍｐＲ」は、アンピシリン耐性遺伝子を指す。
本明細書で使用される場合、「細菌領域」は、細菌宿主における延長（ｐｒｏｒｏｇａｔｉｏｎ）および選択に必要なプラスミドなどのベクターの領域を指す。
本明細書で使用される場合、「ＣａｔＲ」は、クロラムフェニコール耐性遺伝子を指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｃｃ」または「ＣＣＣ」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列との関連で使用されない限り、「共有結合閉環状」を意味する。
本明細書で使用される場合、「ｃＩ」は、ラムダリプレッサーを意味する。
本明細書で使用される場合、「ｃＩＴｓ８５７」は、温度感受性を付与するＣからＴへの（ＡｌａからＴｈｒへの）変異をさらに組み込むラムダリプレッサーを指す。ｃＩＴｓ８５７は、２８～３０℃で機能性リプレッサーであるが、３７～４２℃ではほとんど不活性である。ｃＩ８５７またはｃＩ８５７ｔｓとも呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「ｃｍｖ」または「ＣＭＶ」は、サイトメガロウイルスを指す。
本明細書で使用される場合、「コピーカッター宿主株」は、アラビノース誘導性ＣＩ８５７ｔｓ遺伝子のファージφ８０付着部位染色体組み込みコピーを含有するＲ６Ｋ起点産生株を指す。プレートまたは培地へのアラビノースの添加（例えば、０．２～０．４％の最終濃度まで）は、ｐＬプロモーターを発現するＲ６Ｋ Ｒｅｐタンパク質のＣＩ８５７ｔｓ媒介ダウンレギュレーションを通じて３０℃でコピー数を減少させるｐＡＲＡ媒介ＣＩ８５７ｔｓリプレッサー発現を誘導する［すなわち、３０℃でのｐＬ（ＯＬ１－Ｇ～Ｔ）プロモーターのより効果的なダウンレギュレーションを媒介する追加のＣＩ８５７ｔｓ］。３７～４２℃への温度シフト後のコピー数誘導は、ＣＩ８５７ｔｓリプレッサーがこれらの高温で不活性化されるため、損なわれない。コピーカッター宿主株は、３０℃でのコピー数を減少させることによって、Ｒ６Ｋベクター温度アップシフトコピー数誘導比を増加させる。これは、大きな、毒性のある、または二量体化しやすいＲ６Ｋ起点ベクターの産生に有利である。
本明細書で使用される場合、「ｄｃｍメチル化」は、第２のシトシンのＣ５位で配列ＣＣ（Ａ／Ｔ）ＧＧをメチル化するＥ．ｃｏｌｉメチルトランスフェラーゼによるメチル化を指す。
本明細書で使用される場合、「に由来する」は、細胞が特定の細胞株から子孫であることを意味する。例えば、ＤＨ５αに由来するとは、細胞がＤＨ５αまたはＤＨ５αの子孫から作製されることを意味する。したがって、誘導体細胞は、培養されるにつれて細胞株に生じる多型および他の変化を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「ＥＧＦＰ」は、高感度緑色蛍光タンパク質を指す。
本明細書で使用される場合、「操作されたＥ．ｃｏｌｉ株」は、ヒトの介入によって作製されたＳｂｃＣ、ＳｂｃＤ、またはその両方に遺伝子ノックアウト（またはノックダウン）を有する本開示のＥ．ｃｏｌｉ株を指すと理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、「操作された変異」は、天然には発生せず、代わりに直接的なヒトの介入の産物であった変異であると理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、「真核生物発現ベクター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩまたはＩＩＩプロモーターを使用して、標的真核生物におけるｍＲＮＡ、タンパク質抗原、タンパク質治療薬、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ遺伝子を発現するためのベクターを指す。
本明細書で使用される場合、「真核生物領域」は、標的生物におけるプラスミド機能に必要な真核生物配列および／または配列をコードするプラスミドの領域を指す。これには、ＲＮＡ ＰｏｌＩＩエンハンサー、プロモーター、導入遺伝子、およびポリＡ配列を含む、標的生物における１つ以上の導入遺伝子の発現に必要なプラスミドベクターの領域が含まれる。これには、ＲＮＡ ＰｏｌＩもしくはＲＮＡ ＰｏｌＩＩＩプロモーター、ＲＮＡ ＰｏｌＩもしくはＲＮＡ ＰｏｌＩＩＩ発現導入遺伝子、またはＲＮＡを使用した標的生物における１つ以上の導入遺伝子の発現に必要なプラスミドベクターの領域も含まれる。真核生物領域は、任意選択で、真核生物転写終結因子、スーパーコイル誘導ＤＮＡ二本鎖不安定化（ＳＩＤＤ）構造、Ｓ／ＭＡＲ、境界要素などの他の機能配列を含んでもよい。レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターでは、真核生物領域は、隣接直接反復ＬＴＲを含有し、ＡＡＶベクターでは、真核生物領域は、隣接逆向き末端反復を含有し、一方、トランスポゾンベクターでは、真核生物領域は、隣接トランスポゾン逆向き末端反復またはＩＲ／ＤＲ末端（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）を含有する。ゲノム組み込みベクターでは、真核生物領域はホモロジーアームをコードして、標的化組み込みを指示することができる。
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、標的生物におけるｍＲＮＡ、タンパク質抗原、タンパク質治療薬、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ遺伝子の発現のためのベクターを指す。
本明細書で使用される場合、「目的の遺伝子」は、標的生物において発現される遺伝子を指す。タンパク質またはペプチド抗原をコードするｍＲＮＡ遺伝子、タンパク質またはペプチド治療薬、およびＲＮＡ治療薬をコードするｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ、ならびにＲＮＡワクチンをコードするｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡまたはマイクロＲＮＡなどが含まれる。
本明細書で使用される場合、Ｒｅｐタンパク質およびプロモーターに関連する「ゲノム」とは、ＲＮＡ－ＩＮ調節された選択可能マーカー、抗生物質耐性マーカー、およびラムダリプレッサーを含むＲＮＡ－ＩＮが、細菌宿主株に組み込まれた核酸配列を指す。
本明細書で使用される場合、「高収率プラスミド製造宿主」とは、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪ、ならびに任意選択でｕｖｒＣ、ｍｃｒＡ、および／またはｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒにおける生存率または収率低下変異を含有しないｒｅｃＡ－、ｅｎｄＡ－細胞株、例えば、ＤＨ１、ＤＨ５α、ＪＭ１０７、ＪＭ１０８、ＪＭ１０９、ＭＧ１６５５およびＸＬ１Ｂｌｕｅを指す。
本明細書で使用される場合、「ＨｙｐｅｒＧＲＯ発酵プロセス」は、流加（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ）発酵を指し、この方法では、プラスミド含有Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、流加相の一部の間に低下させた温度で増殖させ、その間、増殖速度が制限され、その後、温度上昇シフトが続き、プラスミドを蓄積するために高温で継続的に増殖させており、制限された増殖速度での温度シフトは、プラスミド収率および純度を改善した。
本明細書で使用される場合、「逆向き反復」は、下流にその逆相補体が続くヌクレオチドの一本鎖配列を指す。初期配列と逆相補体との間のヌクレオチドの介在配列は、ゼロを含む任意の長さであり得る。介在長がゼロの場合、複合配列はパリンドロームである。逆向き反復は、二本鎖ＤＮＡ内で生じ得、他の逆向き反復は、介在配列内で生じ得ることが理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、「ＩＲ／ＤＲ」は、２回直接繰り返される逆向き反復を指す。例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンＩＲ／ＤＲ反復である。
本明細書で使用される場合、「イテロン」は、複製開始に必要な、複製起点における直接的に繰り返されるＤＮＡ配列を指す。Ｒ６Ｋ起点イテロン反復は、ＷＯ２０１９／１８３２４８の配列番号１９～２３（それぞれ、ａａａｃａｔｇａｇａ ｇｃｔｔａｇｔａｃｇ ｔｇ、ａａａｃａｔｇａｇａ ｇｃｔｔａｇｔａｃｇ ｔｔ、ａｇｃｃａｔｇａｇａ ｇｃｔｔａｇｔａｃｇ ｔｔ、ａｇｃｃａｔｇａｇｇ ｇｔｔｔａｇｔｔｃｇ ｔｔ、およびａａａｃａｔｇａｇａ ｇｃｔｔａｇｔａｃｇ ｔａ）などの２２ｂｐである。
本明細書で使用される場合、「ＩＴＲ」は、逆向き末端反復を指す。
本明細書で使用される場合、「ｋａｎ」は、カナマイシンを指す。
本明細書で使用される場合、「ｋａｎＲ」は、カナマイシン耐性遺伝子を指す。
本明細書で使用される場合、「ノックダウン」は、遺伝子産物の発現の減少および／または遺伝子産物の活性の減少をもたらす遺伝子の破壊を指す。
本明細書で使用される場合、「ノックアウト」は、遺伝子からの遺伝子発現のアブレーションをもたらす遺伝子の破壊、および／または発現遺伝子産物が非機能性であることを指す。
本明細書で使用される場合、「コザック配列」は、効率的な翻訳開始を確実にするＡＴＧ開始コドンのすぐ上流の最適化されたコンセンサスＤＮＡ配列ｇｃｃＲｃｃＡＴＧ（Ｒ＝ＧまたはＡ）を指す。ＡＴＧ開始コドン（ＧＴＣＧＡＣＡＴＧ）のすぐ上流のＳａｌＩ部位（ＧＴＣＧＡＣ）は、有効なコザック配列である。
本明細書で使用される場合、「レンチウイルスベクター」は、分裂細胞および非分裂細胞に感染できる組み込みウイルスベクターを指す。レンチウイルストランスファープラスミドとも呼ばれる。プラスミドは、レンチウイルスＬＴＲ隣接発現ユニットをコードする。トランスファープラスミドは、ウイルス粒子を作製するために必要なレンチウイルスエンベロープおよびパッケージングプラスミドとともに、産生細胞にトランスフェクトされる。
本明細書で使用される場合、「レンチウイルスエンベロープベクター」は、エンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドを指す。
本明細書で使用される場合、「レンチウイルスパッケージングベクター」は、レンチウイルスパッケージングベクターに必要なｇａｇ、ｐｏｌおよびＲｅｖ遺伝子機能を発現する１つまたは２つのプラスミドを指す。
本明細書で使用される場合、「ミニサークル」は、インビボまたはインビトロ部位特異的組換えまたはインビトロ制限消化／ライゲーションによって細菌領域が親プラスミドから除去された共有結合閉環状プラスミド誘導体を指す。ミニサークルベクターは、細菌細胞では複製能力がない。
本明細書で使用される場合、「ｍＳＥＡＰ」は、ネズミ分泌型アルカリホスファターゼを指す。
本明細書で使用される場合、「Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄ（商標）ベクター」は、ＲＮＡ選択可能マーカーをＲ６Ｋ、ＣｏｌＥ２またはＣｏｌＥ２関連複製起点と組み合わせるベクターを指す。例えば、ＮＴＣ９３８５Ｃ、ＮＴＣ９６８５Ｃ、ＮＴＣ９３８５Ｒ、ＮＴＣ９６８５Ｒベクター、およびＷＯ２０１４／０３５４５７に記載される改変型である。
本明細書で使用される場合、「変異」は、置換、付加、欠失などの任意の種類の変異を指し得る。
本明細書で使用される場合、ＳｂｃＣＤ複合体に関して「非機能性」とは、パリンドローム配列を切断できないＳｂｃＣＤ複合体を指す。
本明細書で使用される場合、「ＮＴＣ８シリーズ」は、ｋａｎＲなどの抗生物質耐性マーカーの代わりに短いＲＮＡ（ＲＮＡ－ＯＵＴ）選択可能マーカーを含有する、抗生物質フリーのｐＵＣ起源ベクターである、ＮＴＣ８３８５、ＮＴＣ８４８５およびＮＴＣ８６８５プラスミドなどのベクターを指す。これらのＲＮＡ－ＯＵＴベースの抗生物質フリーベクターの作成および適用は、ＷＯ２００８／１５３７３３に記載されている。
本明細書で使用される場合、「ＮＴＣ９３８５Ｒ」は、ＷＯ２０１４／０３５４５７に記載されるＮＴＣ９３８５Ｒ Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄ（商標）ベクターを指し、ＮｈｅＩ－ｔｒｐＡターミネーター－Ｒ６Ｋ起点ＲＮＡ－ＯＵＴ－ＫｐｎＩ細菌領域をコードするスペーサー領域を有し、隣接ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩ部位を介して真核生物領域に連結される。
本明細書で使用される場合、「ＯＤ６００」は、６００ｎｍにおける光学密度を指す。
本明細書で使用される場合、ＰＣＲは、「ポリメラーゼ連鎖反応」を指す。
本明細書で使用される場合、「ｐＤＮＡ」は、プラスミドＤＮＡを指す。
本明細書で使用される場合、「ｐｉｇｇｙｂａｃｋトランスポゾン」は、ＰＢトランスポザーゼによって媒介される単純な切断およびペースト機構によってＩＴＲ隣接ＰＢトランスポゾンをゲノムに組み込むトランスポゾン系を指す。トランスポゾンベクターは、典型的には、切除され、ゲノムに組み込まれる、ＰＢ ＩＴＲの間にプロモーター－導入遺伝子－ポリＡ発現カセットを含有する。
本明細書で使用される場合、「ｐＩＮＴ ｐＲ ｐＬベクター」は、ｐＩＮＴ ｐＲ ｐＬ ａｔｔＨＫ０２２組み込み発現ベクターを指し、これは、Ｌｕｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ４７：４３に記載され、参照により本明細書に含まれる。発現される標的遺伝子は、ｐＬプロモーターの下流にクローニングされる。ベクターは温度誘導性ｃＩ８５７リプレッサーをコードし、熱誘導性標的遺伝子発現を可能にする。
本明細書で使用される場合、「ＰＬプロモーター」は、左側のラムダプロモーターを指す。ＰＬは、ＯＬ１、ＯＬ２、およびＯＬ３リプレッサー結合部位へのｃＩリプレッサー結合によって抑制される強力なプロモーターである。温度感受性ｃＩ８５７リプレッサーは、３０℃ではｃＩ８５７リプレッサーが機能性であり、遺伝子発現を抑制するが、３７～４２℃ではリプレッサーが不活性化されるため、遺伝子の発現が生じるので、熱誘導による遺伝子発現の制御を可能にする。
本明細書で使用される場合、「ＰＬ（ＯＬ１Ｇ～Ｔ）プロモーター」は、ＯＬ１ＧのＴへの変異を有する左側のラムダプロモーターを指す。ＰＬは、ＯＬ１、ＯＬ２、およびＯＬ３リプレッサー結合部位へのｃＩリプレッサー結合によって抑制される強力なプロモーターである。温度感受性ｃＩ８５７リプレッサーは、３０℃ではｃＩ８５７リプレッサーが機能性であり、遺伝子発現を抑制するが、３７～４２℃ではリプレッサーが不活性化されるため、遺伝子の発現が生じるので、熱誘導による遺伝子発現の制御を可能にする。ＯＬ１へのｃＩリプレッサー結合は、ＷＯ２０１４／０３５４５７に記載されているように、ＯＬ１ＧからＴへの変異によって低減され、３０℃および３７～４２℃でのプロモーター活性の増加をもたらす。
本明細書で使用される場合、「プラスミド」は、染色体ＤＮＡから独立して複製することができる、染色体ＤＮＡから分離された余分な染色体ＤＮＡ分子を指す。
本明細書で使用される場合、「プラスミドコピー数」は、細胞当たりのプラスミドのコピー数を指す。プラスミドコピー数の増加は、プラスミド産生収率の増加を示す。
本明細書で使用される場合、「Ｐｏｌ」は、ポリメラーゼを指す。
本明細書で使用される場合、「ＰｏｌＩ」は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩを指す。
本明細書で使用される場合、「ＰｏｌＩＩＩ」は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩを指す。
本明細書で使用される場合、「ＰｏｌＩＩＩ依存性複製起点」は、ＰｏｌＩを必要としない複製起点、例えば、ｒｅｐタンパク質依存性Ｒ６Ｋガンマ複製起点を指す。多くの追加のＰｏｌＩＩＩ依存性複製起点が、当該技術分野において既知であり、その多くは、上記のｄｅｌ Ｓｏｌａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８に要約されており、これは、参照により本明細書に含まれる。
本明細書で使用される場合、「ポリＡ」は、ポリアデニル化シグナルまたは部位を指す。ポリアデニル化は、ポリ（Ａ）テイルをＲＮＡ分子に付加することである。ポリアデニル化シグナルは、ＲＮＡ切断複合体によって認識される配列モチーフを含有する。ほとんどのヒトポリアデニル化シグナルは、ＡＡＵＡＡＡモチーフと、それに対する保存された配列５’および３’を含有する。一般に利用されるポリＡシグナルは、ウサギβグロビン、ウシ成長ホルモン、ＳＶ４０早期、またはＳＶ４０後期のポリＡシグナルに由来する。
本明細書で使用される場合、「ポリＡ反復」は、直接反復としてのアデニンヌクレオチドの連続配列を指す。同様に、「ポリＧ反復」は、直接反復としてのグアニンヌクレオチドの連続配列を指し、「ポリＣ反復」は、直接反復としてのシトシンヌクレオチドの連続配列を指し、「ポリＴ反復」は、直接反復としてチミンヌクレオチドの連続配列を指す。「ｍＲＮＡベクター」は、ポリＡ反復を含有する。
本明細書で使用される場合、「ｐＵＣ起点」は、上昇した温度でコピー数を増加させ、ＲＯＰ陰性調節因子を欠失させるＧからＡへの転移を有する、ｐＢＲ３２２由来の複製起点を指す。
本明細書で使用される場合、「ｐＵＣフリー」は、ｐＵＣ起点を含有しないプラスミドを指す。
本明細書で使用される「ｐＵＣプラスミド」は、ｐＵＣ起点を含有するプラスミドを指す。
本明細書で使用される場合、「Ｒ６Ｋプラスミド」は、ＮＴＣ９３８５Ｒ、ＮＴＣ９６８５Ｒ、ＮＴＣ９３８５Ｒ２－Ｏ１、ＮＴＣ９３８５Ｒ２－Ｏ２、ＮＴＣ９３８５Ｒ２ａ－Ｏ１、ＮＴＣ９３８５Ｒ２ａ－Ｏ２、ＮＴＣ９３８５Ｒ２ｂ－Ｏ１、ＮＴＣ９３８５Ｒ２ｂ－Ｏ２、ＮＴＣ９３８５Ｒａ－Ｏ１、ＮＴＣ９３８５Ｒａ－Ｏ２、ＮＴＣ９３８５ＲａＦ、およびＮＴＣ９３８５ＲｂＦベクター、ならびにＷＯ２０１４／０３５４５７およびＷＯ２０１９／１８３２４８に記載されたＲ６Ｋ複製起点を含有する改変および代替ベクターなどのＲ６ＫまたはＲ６Ｋ由来の複製起点を有するプラスミドを指す。当該技術分野において既知の代替的なＲ６Ｋベクターとしては、ｐＣＯＲベクター（Ｇｅｎｃｅｌｌ）、ｐＣｐＧフリーベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）、およびｐＧＭ１６９を含むオックスフォード大学のＣｐＧフリーベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「Ｒ６Ｋ複製起点」は、Ｒ６Ｋ Ｒｅｐタンパク質によって特異的に認識されてＤＮＡ複製を開始する領域を指し、これには、ＷＯ２０１９／１８３２４８で配列番号１、配列番号２、配列番号４、および配列番号１８として開示されるＲ６Ｋガンマ複製起点配列（それぞれ配列番号４３～４４、４６、および６０）が挙げられるが、これらに限定されない。また、Ｄｒｏｃｏｕｒｔ ｅｔ ａｌ．，米国特許第７２４４６０９号に記載されるＣｐＧフリー変形型（配列番号３）も含まれ、これは、参照により本明細書に組み込まれる（配列番号６３）。
本明細書で使用される場合、「Ｒ６Ｋ複製起点－ＲＮＡ－ＯＵＴ細菌起点」は、伝播のためのＲ６Ｋ複製起点と、ＷＯ２０１９／１８３２４８（それぞれ、配列番号５０～５９）に開示されるＲＮＡ－ＯＵＴ選択可能マーカー（例えば、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７）とを含む。
本明細書で使用される場合、「Ｒｅｐタンパク質依存性プラスミド」は、複製がトランスで提供される複製（Ｒｅｐ）タンパク質に依存するプラスミドを指す。例えば、Ｒ６Ｋ複製起点、ＣｏｌＥ２－Ｐ９複製起点、およびＲｅｐタンパク質が宿主株ゲノムから発現される、ＣｏｌＥ２関連複製起点プラスミドである。多数の追加のＲｅｐタンパク質依存性プラスミドが当該技術分野において既知であり、その多くは、参照により本明細書に組み込まれる、上記のｄｅｌ Ｓｏｌａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：４４～４６４に要約されている。
本明細書で使用される場合、「レトロウイルスベクター」は、分裂細胞に感染できる組み込みウイルスベクターを指す。トランスファープラスミドとも呼ばれる。プラスミドは、レトロウイルスＬＴＲ隣接発現ユニットをコードする。トランスファープラスミドは、ウイルス粒子を作製するために必要なエンベロープおよびパッケージングプラスミドとともに、産生細胞にトランスフェクトされる。
本明細書で使用される場合、「レトロウイルスエンベロープベクター」は、エンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドを指す。
本明細書で使用される場合、「レトロウイルスパッケージングベクター」は、レトロウイルストランスファーベクターをパッケージするために必要なレトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をコードするプラスミドを指す。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ－ＩＮ」は、ＲＮＡの一部のＲＮＡ－ＯＵＴに対してＲＮＡ相補的かつアンチセンスである、ＲＮＡ－ＩＮをコードする挿入配列１０（ＩＳ１０）を指す。ＲＮＡ－ＩＮがｍＲＮＡの非翻訳リーダーにクローニングされると、ＲＮＡ－ＩＮのＲＮＡ－ＯＵＴへのアニーリングは、ＲＮＡ－ＩＮの下流にコードされる遺伝子の翻訳を低減する。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ－ＩＮ調節された選択可能マーカー」は、ゲノム発現されたＲＮＡ－ＩＮ調節された選択可能マーカーを指す。プラスミド保有ＲＮＡ－ＯＵＴアンチセンスリプレッサーＲＮＡ（例えば、ＷＯ２０１９／１８３２４８（配列番号４８）に開示されている配列番号６）の存在下で、ＲＮＡ－ＩＮ（例えば、配列ｇｃｃａａａａａｔｃａａｔａａｔｃａｇａｃａａｃａａｇａｔｇを有する）の下流にコードされているタンパク質の発現が抑制される。ＲＮＡ－ＩＮ調節された選択可能マーカーは、ＲＮＡ－ＩＮが、１）当該細胞に対して致死的または毒性のタンパク質そのもの、または毒性物質（例えば、ＳａｃＢ）を生成することによって、または２）当該細菌細胞に対して致死的または毒性のリプレッサータンパク質のいずれかを、当該細胞の増殖に不可欠な遺伝子（例えば、ＲＮＡ－ＩＮ ｔｅｔＲリプレッサー遺伝子によって調節されるｍｕｒＡ必須遺伝子）の転写を抑制することによって調節するように構成される。例えば、ＲＮＡ－ＯＵＴプラスミド選択／伝播のためのゲノム発現ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ細胞株は、ＷＯ２００８／１５３７３３に記載されている。当技術分野で記載される代替の選択マーカーは、ＳａｃＢに置き換えられ得る。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ－ＯＵＴ」は、ＲＮＡ－ＩＮの下流に発現されるトランスポゾン遺伝子にハイブリダイズし、翻訳を低減するアンチセンスＲＮＡである、挿入配列１０（ＩＳ１０）にコードされるＲＮＡ－ＯＵＴを指す。ＷＯ２０１９／１８３２４８（配列番号４８）に開示されているＲＮＡ－ＯＵＴ ＲＮＡ（配列番号６）および相補的ＲＮＡ－ＩＮ ＳａｃＢゲノム的に発現されたＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ細胞株の配列は、Ｍｕｔａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ８：４４７に記載されているような代替の機能性ＲＮＡ－ＩＮ／ＲＮＡ－ＯＵＴ結合対を組み込むように改変されてもよく、これには、ＲＮＡ－ＯＵＴ Ａ０８／ＲＮＡ－ＩＮ Ｓ４９対、ＲＮＡ－ＯＵＴ Ａ０８／ＲＮＡ－ＩＮ Ｓ０８対、ならびにＲＮＡ－ＯＵＴ
Figure 2023517682000002
配列のＣＧを非ＣｐＧ配列に改変するＲＮＡ－ＯＵＴ Ａ０８のＣｐＧフリーの改質が含まれるが、これらに限定されない。２つのＣｐＧモチーフを除去するための多数の代替的置換（各ＣｐＧをＣｐＡ、ＣｐＣ、ＣｐＴ、ＡｐＧ、ＧｐＧ、またはＴｐＧのいずれかに変異させる）を利用して、ＣｐＧを含まないＲＮＡ－ＯＵＴを作製してもよい。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ－ＯＵＴ選択可能マーカー」とは、ＲＮＡ－ＯＵＴ ＲＮＡに隣接するＥ．ｃｏｌｉ転写プロモーターおよびターミネーター配列を含むＲＮＡ－ＯＵＴ選択可能マーカーＤＮＡ断片を指す。ＤｒａＩＩＩおよびＫｐｎＩ制限酵素部位に隣接するＲＮＡ－ＯＵＴプロモーターおよびターミネーター配列を利用したＲＮＡ－ＯＵＴ選択可能マーカー、ならびにＲＮＡ－ＯＵＴプラスミド伝播のためにゲノム発現されたデザイナーＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ細胞株は、ＷＯ２００８／１５３７３３に記載されており、参照により本明細書に含まれる。ＲＮＡ－ＯＵＴ ＲＮＡに隣接するＲＮＡ－ＯＵＴプロモーターおよびターミネーター配列は、異種プロモーターおよびターミネーター配列で置き換えられ得る。例えば、ＲＮＡ－ＯＵＴプロモーターは、当該技術分野において既知のＣｐＧ非含有プロモーター、例えば、Ｉ－ＥＣ２Ｋプロモーター、またはＷＯ２００８／１５３７３３に記載され、参照により本明細書に含まれるＰ５／６ ５／６またはＰ５／６ ６／６プロモーターで置換され得る。ＲＮＡ－ＯＵＴプロモーター内の２つのＣｐＧモチーフが除去された２ＣｐＧ ＲＮＡ－ＯＵＴ選択可能マーカーを、ＷＯ２０１９／１８３２４８（配列番号４９）の配列番号７として与えた。ＣｐＧを含まないＲＮＡ－ＯＵＴ選択可能マーカーを組み込むベクターは、ＷＯ２００８／１５３７３３に記載のＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ細胞株を使用して、またはＷＯ２００８／１５３７３３に記載のＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢを有する任意の細胞株を使用して、スクロース耐性のために選択され得る。あるいは、これらの細胞株におけるＲＮＡ－ＩＮ配列は、ＲＮＡ－ＩＮに相補的なＣｐＧフリーＲＮＡ－ＯＵＴ領域と完全に一致するために必要な１ｂｐ変化を組み込むように改変され得る。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ選択可能マーカー」は、選択をもたらすように染色体発現標的遺伝子を調節する、プラスミド保有発現非翻訳ＲＮＡを指す。これは、参照により本明細書に含まれるＣｒｏｕｚｅｔ Ｊ ａｎｄ Ｓｏｕｂｒｉｅｒ Ｆにより２００５年に米国特許第６，９７７，１７４号に記載されるように、ナンセンス抑制可能な選択可能な染色体標的を調節するナンセンス抑制ｔＲＮＡであり得る。これはまた、プラスミド保有アンチセンスリプレッサーＲＮＡであってもよく、参照により本明細書に含まれる非限定的なリストには、ＲＮＡ－ＩＮ調節標的を抑制するＲＮＡ－ＯＵＴ（ＷＯ２００８／１５３７３３）、ＲＮＡＩＩ調節標的を抑制するｐＭＢ１プラスミド起点コードＲＮＡＩ（Ｇｒａｂｈｅｒｒ Ｒ，Ｐｆａｆｆｅｎｚｅｌｌｅｒ Ｉ．２００６米国特許出願第２００６／００６３２３２号；Ｃｒａｎｅｎｂｕｒｇｈ ＲＭ．２００９；米国特許第７，６１１，８８３号）、ＲＮＡＩＩ調節標的を抑制するＩｎｃＢプラスミド起点ｐＭＵ７２０起点コードＲＮＡＩ（Ｗｉｌｓｏｎ ＩＷ，Ｓｉｅｍｅｒｉｎｇ ＫＲ，Ｐｒａｓｚｋｉｅｒ Ｊ，Ｐｉｔｔａｒｄ ＡＪ．１９９７．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ１７９：７４２－５３）、Ｈｏｋ調節標的を抑制するプラスミドＲ１のＰａｒＢ遺伝子座Ｓｏｋ、ｆｌｍＡ調節標的を抑制するＦプラスミドのＦｌｍ遺伝子座ＦｌｍＢ（Ｍｏｒｓｅｙ ＭＡ，１９９９米国特許第５９２２５８３号）が挙げられる。ＲＮＡ選択可能マーカーは、Ｗａｇｎｅｒ ＥＧＨ，Ａｌｔｕｖｉａ Ｓ，Ｒｏｍｂｙ Ｐ．２００２．Ａｖｄ Ｇｅｎｅｔ４６：３６１－９８およびＦｒａｎｃｈ Ｔ、ならびにＧｅｒｄｅｓ Ｋ．２０００．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３：１５９－６４に記載されるものなどの当該技術分野において既知の別の天然アンチセンスリプレッサーＲＮＡであってもよい。ＲＮＡ選択可能マーカーは、Ｎａ Ｄ、Ｙｏｏ ＳＭ，Ｃｈｕｎｇ Ｈ，Ｐａｒｋ Ｈ，Ｐａｒｋ ＪＨ，Ｌｅｅ ＳＹ．２０１３．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１：１７０－４に記載されるようなＳｇｒＳ、ＭｉｃＣまたはＭｉｃＦスキャフォールドで発現される合成スモールＲＮＡなどの操作されたリプレッサーＲＮＡであってもよい。ＲＮＡ選択可能マーカーはまた、ＵＳ２０１５／０２７５２２１に記載されるように、ＳａｃＢ等の調節される標的遺伝子に融合した標的ＲＮＡを抑制する選択可能マーカーの一部としての操作されたリプレッサーＲＮＡであってもよい。
本明細書で使用される場合、「ＳａｃＢ」は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓレバンスクラーゼをコードする構造遺伝子を指す。グラム陰性菌におけるＳａｃＢの発現は、スクロースの存在下で毒性である。
本明細書で使用される場合、「ＳＥＡＰ」は、分泌型アルカリホスファターゼを指す。
本明細書で使用される場合、「選択可能マーカー」または「選択マーカー」とは、選択可能マーカー、例えば、カナマイシン耐性遺伝子またはＲＮＡ選択可能マーカーを指す。
本明細書で使用される場合、「配列同一性」という用語は、任意の所与のクエリー配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）配列とサブジェクト配列（ｓｕｂｊｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）との間の同一性の程度を指す。サブジェクト配列は、例えば、所与のクエリー配列と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。配列同一性パーセントを決定するために、クエリー配列（例えば、核酸配列）は、当該技術分野において周知である任意の好適な配列アラインメントプログラム、例えば、核酸配列のアラインメントがそれらの全長にわたって行われることを可能にするコンピュータプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（バージョン１．８３、デフォルトパラメータ）を使用して、１つ以上のサブジェクト配列にアラインメントする（グローバルアラインメント）。Ｃｈｅｍａ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３１：３４９７－５００。好ましい方法では、配列アラインメントプログラム（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ）は、クエリー配列と１つ以上のサブジェクト配列との間の最良の一致を計算し、同一性、類似性、および差異を決定できるようにそれらをアラインメントする。１つ以上のヌクレオチドのギャップは、配列アラインメントを最大化するために、クエリー配列、サブジェクト配列、またはその両方に挿入することができる。核酸配列の高速ペアワイズアラインメントのために、特定のアラインメントプログラムに適した好適なデフォルトパラメータを選択することができる。出力は、配列間の関係を反映した配列アラインメントである。サブジェクト核酸配列のクエリー配列に対する同一性パーセントをさらに決定するために、配列をアラインメントプログラムを使用してアラインメントし、アラインメント内の同一の一致の数をクエリー配列の長さで割り、結果を１００を掛ける。同一性パーセント値は、少数第２位で四捨五入することができることに留意されたい。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、および７８．１４は７８．１に切り捨てられ、７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８、および７８．１９は７８．２に切り上げられる。
本明細書で使用される場合、「ｓｈＲＮＡ」は、短鎖ヘアピンＲＮＡを指す。
本明細書で使用される場合、「Ｓ／ＭＡＲ」は、核マトリックスへのＤＮＡ付着を媒介する真核生物配列を含む、スキャフォールド／マトリックス付着領域を指す。
本明細書で使用される場合、「Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン」は、ＳＢトランスポザーゼによって媒介される単純な切断およびペースト機構によってＩＲ／ＤＲ隣接ＳＢトランスポゾンをゲノムに組み込むトランスポゾン系を指す。トランスポゾンベクターは、典型的には、切除され、ゲノムに組み込まれる、ＩＲ／ＤＲの間にプロモーター－導入遺伝子－ポリＡ発現カセットを含有する。
本明細書で使用される場合、「スペーサー領域」とは、真核生物領域配列の５’末端と３’末端を連結する領域を指す。真核生物領域５’および３’末端は、典型的には、プラスミドベクター（細菌領域）における細菌複製起点および細菌選択可能マーカーによって分離されるため、多くのスペーサー領域は、細菌領域からなる。本発明の複製ベクターのＰｏｌＩＩＩ依存性起点では、このスペーサー領域は、好ましくは、１０００ｂｐ未満である。
本明細書で使用される場合、「構造化ＤＮＡ配列」は、複製阻害二次構造を形成することができるＤＮＡ配列を指す（Ｍｉｒｋｉｎ ａｎｄ Ｍｉｒｋｉｎ，２００７．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ７１：１３－３５）。これには、逆向き反復、パリンドローム、直接反復、ＩＲ／ＤＲ、真核生物プロモーターエンハンサーを含有するホモポリマー反復もしくは真核生物プロモーターエンハンサーを含有する反復、または真核生物複製起点を含有する反復が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ＳＶ４０起点」は、複製起点を含有するシミアンウイルス４０ゲノムＤＮＡを指す。
本明細書で使用される場合、「ＳＶ４０エンハンサー」は、７２ｂｐおよび任意選択で２１ｂｐエンハンサー反復を含有するシミアンウイルス４０ゲノムＤＮＡを指す。
本明細書で使用される場合、「ＴＥ緩衝液」は、約１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８および１ｍＭのＥＤＴＡを含有する溶液を指す。
本明細書で使用される場合、「ＴｅｔＲ」は、テトラサイクリン耐性遺伝子を指す。
本明細書で使用される場合、「転写ターミネーター」は、（１）細菌の関連において、転写のための遺伝子またはオペロンの末端をマークするＤＮＡ配列を指す。これは、固有の転写終結因子またはＲｈｏ依存性転写終結因子であり得る。ｔｒｐＡターミネーターなどの固有のターミネーターの場合、ヘアピン構造は、ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ＲＮＡポリメラーゼ三元複合体を破壊する転写物内に形成される。あるいは、Ｒｈｏ依存性転写ターミネーターは、新生ｍＲＮＡ－ＤＮＡ－ＲＮＡポリメラーゼ三元複合体を破壊するためにＲｈｏ因子、ＲＮＡヘリカーゼタンパク質複合体、または（２）真核生物に関連して、ポリＡシグナルは「ターミネーター」ではなく、代わりに、ポリＡ部位での内部切断は、ヌクレアーゼ消化のために３’ＵＴＲ ＲＮＡ上にキャップされていない５’末端を残す。ヌクレアーゼはＲＮＡ ＰｏｌＩＩに追いつき、終結を引き起こす。終結は、ＲＮＡ ＰｏｌＩＩ一時停止部位（真核生物転写ターミネーター）の導入によって、ポリＡ部位の短い領域内で促進されてもよい。ＲＮＡ ＰｏｌＩＩの一時停止により、ＰｏｌｙＡ切断後に３’ＵＴＲ ｍＲＮＡに導入されたヌクレアーゼが、一時停止部位でＲＮＡ ＰｏｌＩＩに追いつくことができる。当該技術分野において既知の真核生物転写ターミネーターの非限定的なリストとして、Ｃ２ｘ４およびガストリンターミネーターが挙げられる。真核生物転写ターミネーターは、ｍＲＮＡの適切な３’末端プロセシングを増強することによって、ｍＲＮＡレベルを上昇させ得る。
本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」は、当該技術分野において既知であり、参照により本明細書に含まれるように、核酸を細胞に送達するための方法［例えば、ポリ（ラクチド－コグリコライド）（ＰＬＧＡ）、ＩＳＣＯＭ、リポソーム、ニオソーム、ビロソーム、ブロックコポリマー、プルロニックブロックコポリマー、キトサン、および他の生分解性ポリマー、マイクロ粒子、マイクロスフィア、リン酸カルシウムナノ粒子、ナノ粒子、ナノカプセル、ナノスフィア、ポロキサミンナノスフィア、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、圧電透過化、ソノポレーション、イオントフォレシス、超音波、ＳＱＺ高速細胞変形媒介膜破壊、コロナプラズマ、プラズマ促進送達、組織耐性プラズマ、レーザーマイクロポレーション、衝撃波エネルギー、磁場、非接触磁気透過化、遺伝子ガン、マイクロニードル、マイクロダーマブレイジョン、流体力学的送達、高圧尾静脈注射など］を指す。一般に形質転換と呼ばれる、Ｅ．ｃｏｌｉへのＤＮＡのトランスフェクションは、典型的には、当該技術分野において既知であり、参照により本明細書に含まれる標準的な方法論を使用して、化学的に有能なＥ．ｃｏｌｉまたは電気有能なＥ．ｃｏｌｉ細胞を使用して行われる。
本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」は、標的生物における発現のためにベクター内にクローニングされる目的の遺伝子を指す。
本明細書で使用される場合、「トランスポザーゼベクター」は、トランスポザーゼをコードするベクターを指す。
本明細書で使用される場合、「トランスポゾンベクター」は、トランスポザーゼ媒介遺伝子組み込みのための基質であるトランスポゾンをコードするベクターを指す。
本明細書で使用される場合、「ｔｓ」は温度感受性を意味する。
本明細書で使用される場合、「ＵＴＲ」は、ｍＲＮＡの非翻訳領域（コード領域に対して５’または３’）を指す。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、ウイルス（例えば、アルファウイルス、ポックスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルスなど）および非ウイルス（例えば、プラスミド、ＭＩＤＧＥ、転写活性ＰＣＲ断片、ミニサークル、バクテリオファージ、Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄ（商標）など）ベクターを含む遺伝子送達ビヒクルを指す。これらは、当技術分野において周知であり、参照により本明細書に含まれる。
本明細書で使用される場合、「ベクター骨格」は、導入遺伝子または標的抗原コード領域を含まない、ベクターの真核生物および細菌領域を指す。
いくつかの実施形態では、操作されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞であって、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、ＳｂｃＣおよびＳｂｃＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子ノックアウトを含み、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪのうちのいずれか、ならびに任意選択で、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒおよびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つにおいて操作された生存率または収率低下変異を含まない、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞である。いくつかの実施形態では、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪのうちのいずれか、および任意選択で、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒおよびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つにおいていかなる操作された変異も含まない。いくつかの実施形態では、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪのうちのいずれか、および任意選択で、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒおよびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つにおいていずれの変異も含まない。
ＳｂｃＣおよびＳｂｃＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子ノックアウト（またはノックダウン）を含む操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が本開示の範囲内にあり、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、ｒｅｃＪ、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡおよびｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒのうちの少なくとも１つにおいて、操作された生存率もしくは収率低下変異を含まないか、またはいくつかの実施形態では、操作された変異もしくはいかなる変異も含まないことを理解されたい。また、ＳｂｃＣおよびＳｂｃＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子ノックアウトを含む操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が本開示の範囲内にあり、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪのうちの少なくとも１つにおいて、操作された生存率もしくは収率低下変異を含まないか、またはいくつかの実施形態では、操作された変異もしくはいかなる変異も含まないことを理解されたい。いくつかの実施形態では、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ＳｂｃＣおよびＳｂｃＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子ノックアウトを含むが、ｍｃｒＡにおいて、生存率または収率低下変異を含まないか、またはいくつかの実施形態では、操作された変異もしくはいかなる変異も含まない。いくつかの実施形態では、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ＳｂｃＣおよびＳｂｃＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子ノックアウトを含み、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪのいずれにも操作された生存率または収率低下変異を含まないか、またはいくつかの実施形態では、操作されたもしくはいかなる変異も含まない。
他の実施形態では、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ＳｂｃＣおよびＳｂｃＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子ノックアウトを含み、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、ｒｅｃＪ、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡおよびｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒのうちの少なくとも１つにおいて、いかなる操作された生存率または収率低下変異も含まない。他の実施形態では、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ＳｂｃＣおよびＳｂｃＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子ノックアウトを含み、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、ｒｅｃＪ、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡおよびｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒのうちの少なくとも１つにおいて、いかなる操作された変異も含まない。他の実施形態では、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ＳｂｃＣおよびＳｂｃＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子ノックアウトを含み、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、ｒｅｃＪ、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡおよびｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒのうちの少なくとも１つにおいて、いかなる変異も含まない。いくつかの実施形態では、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ＳｂｃＣおよびＳｂｃＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子ノックアウトを含み、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、ｒｅｃＪ、およびｕｖｒＣにおいて、いかなる変異も含まない。いくつかの実施形態では、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ＳｂｃＣおよびＳｂｃＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子ノックアウトを含み、ｍｃｒＡにおいて、いかなる変異も含まない。
いくつかの実施形態では、ＳｂｃＣおよびＳｂｃＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子ノックアウトを含む操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が提供され、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪのいずれにも操作された生存率または収率低下変異を含まない。前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪにおいていかなる操作された変異も含むことができない。前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪのうちのいずれにもいかなる変異も含むことができない。いくつかの実施形態では、ＳｂＣおよびＳｂｃＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子ノックアウトを含む、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が提供され、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、それが由来する株に対して同質遺伝子的（ｉｓｏｇｅｎｉｃ）であり、それが由来する株は、ＤＨ５α、ＤＨ１、ＪＭ１０７、ＪＭ１０８、ＪＭ１０９、ＭＧ１６５５およびＸＬ１Ｂｌｕｅからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＳｂＣおよびＳｂｃＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子ノックアウトを含む、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が提供され、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、それが由来する株に対して同質遺伝子的であり、それが由来する株は、ＤＨ５α（ｄｃｍ－）、ＮＴＣ４８６２、ＮＴＣ４８６２－ＨＦ、ＮＴＣ１０５０８１１、ＮＴＣ１０５０８１１－ＨＦ、ＮＴＣ１０５０８１１－ＨＦ（ｄｃｍ－）、ＨＢ１０１、ＴＧ１、およびＮＥＢ Ｔｕｒｂｏからなる群から選択される。
前述の実施形態のいずれとも矛盾しない範囲で、操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞は、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒ、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つにおいて、操作された生存率または収率低下変異を含まないことがさらに可能である。前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡ、ｍｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒ、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つにおいて、いかなる操作された変異も含まないことがさらに可能である。前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡ、ｍｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒ、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つにおいて、いかなる変異も含まないことがさらに可能である。したがって、いくつかの実施形態では、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ｕｖｒＣにおいて、操作された生存率もしくは収率低下変異、操作された変異、またはいかなる変異も含まないことがさらに可能である。他の実施形態では、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ｍｃｒＡにおいて、操作された生存率もしくは収率低下変異、操作された変異、またはいかなる変異も含まないことがさらに可能である。なお他の実施形態では、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒにおいて、操作された生存率もしくは収率低下変異、操作された変異、またはいかなる変異も含まないことがさらに可能である。さらに他の実施形態では、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ｍｃｒＡおよびｍｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒにおいて、操作された生存率もしくは収率低下変異、操作された変異、またはいかなる変異も含まないことがさらに可能である。本開示全体を通して、ｍｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒは、配列番号１６～２１の配列を含む配列を指すことを理解されたい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、非機能性ＳｂｃＣＤ複合体を含むことができるか、または言い換えれば、機能性ＳｂｃＣＤ複合体を含むことができない。あるいは、いくつかの実施形態では、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ＳｂｃＣＤ複合体を含むことができない。
前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞の遺伝子ノックアウトは、ＳｂｃＣのノックアウトであり得る。あるいは、いくつかの実施形態では、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞の遺伝子ノックアウトは、ＳｂｃＤのノックアウトであり得る。前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞の遺伝子ノックアウトは、ＳｂｃＣおよびＳｂｃＤの両方のノックアウトであり得る。
前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ＤＨ５α、ＤＨ１、ＪＭ１０７、ＪＭ１０８、ＪＭ１０９、ＭＧ１６５５およびＸＬ１Ｂｌｕｅからなる群から選択される細胞株に由来し得る。前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ＤＨ５α（ｄｃｍ－）、ＮＴＣ４８６２、ＮＴＣ４８６２－ＨＦ、ＮＴＣ１０５０８１１、ＮＴＣ１０５０８１１－ＨＦ、またはＮＴＣ１０５０８１１－ＨＦ（ｄｃｍ－）に由来し得る。前述の実施形態のいずれにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ＨＢ１０１、ＴＧ１、およびＮＥＢ Ｔｕｒｂｏからなる群から選択される細胞株に由来し得る。これらの細胞株の遺伝子型は次のとおりである：
ＤＨ５α（ｄｃｍ－）：ＤＨ５α ｄｃｍ－
ＮＴＣ４８６２：ＤＨ５α ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ
ＮＴＣ４８６２－ＨＦ：ＤＨ５α ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔφ８０：：ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｔｅｔＲ
ＮＴＣ１０５０８１１：ＤＨ５α ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ；ａｔｔφ８０：：ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ，ｔｅｔＲ
ＮＴＣ１０５０８１１－ＨＦ：ＤＨ５α ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ；ａｔｔφ８０：：ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｔｅｔＲ
ＮＴＣ１０５０８１１－ＨＦ（ｄｃｍ－）：ＤＨ５α ｄｃｍ－ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ；ａｔｔφ８０：：ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｔｅｔＲ
ＨＢ１０１：Ｆ－ｍｃｒＢ ｍｒｒ ｈｓｄＳ２０（ｒＢ －ｍＢ －）ｒｅｃＡ１３ ｌｅｕＢ６ ａｒａ－１４ ｐｒｏＡ２ ｌａｃＹ１ ｇａｌＫ２ ｘｙｌ－５ ｍｔｌ－１ ｒｐｓＬ２０（ＳｍＲ）ｇｌｎＶ４４ λ－
ＴＧ１：Ｋ－１２ ｇｌｎＶ４４ ｔｈｉ－１ Δ（ｌａｃ－ｐｒｏＡＢ）Δ（ｍｃｒＢ－ｈｓｄＳＭ）５（ｒＫ －ｍＫ －）Ｆ’［ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡＢ＋ ｌａｃＩｑ ｌａｃＺΔＭ１５］
ＮＥＢ Ｔｕｒｂｏ：Ｆ’ ｐｒｏＡ＋Ｂ＋ ｌａｃＩｑ ΔｌａｃＺＭ１５／ｆｈｕＡ２ Δ（ｌａｃ－ｐｒｏＡＢ）ｇｌｎＶ ｇａｌＫ１６ ｇａｌＥ１５ Ｒ（ｚｇｂ－２１０：：Ｔｎ１０）ＴｅｔＳ ｅｎｄＡ１ ｔｈｉ－１ Δ（ｈｓｄＳ－ｍｃｒＢ）５
前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ゲノム抗生物質耐性マーカーをさらに含むことができる。一例として、限定するものではないが、ゲノム抗生物質耐性マーカーは、配列番号２３（ｋａｎＲ、７９５ｂｐ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むｋａｎＲであり得る。さらなる例として、限定するものではないが、ゲノム抗生物質耐性マーカーは、配列番号３６（ｋａｎＲ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする配列を含むｋａｎＲであり得る。なおさらなる例として、ゲノム抗生物質耐性マーカーは、クロラムフェニコール耐性マーカー、ゲンタマイシン耐性マーカー、カナマイシン耐性マーカー、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシン耐性マーカー、トリメトプリム耐性マーカー、またはテトラサイクリン耐性マーカーであり得る。あるいは、前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ゲノム抗生物質耐性マーカーを含まないことが可能である。
前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、Ｒｅｐタンパク質依存性プラスミドの培養に好適なＲｅｐタンパク質をさらに含むことができる。例として、限定するものではないが、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、配列番号２６（Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ－Ｐ１１３Ｓ、９１８ｂｐ）、配列番号２７（Ｐ４２Ｌ－Δ１０６－１０７－Ｐ１１３Ｓ、９１２ｂｐ）、配列番号２８（Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｌ－Ｆ１０７Ｓ、９１８ｂｐ）、および配列番号：２９（Ｐ４２Ｌ－Ｐ１１３Ｓ、９１８ｂｐ）からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するゲノム核酸配列を含むことができる。さらなる例として、限定するものではないが、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、配列番号３９（Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ－Ｐ１１３Ｓ）、配列番号４０（Ｐ４２Ｌ－Δ１０６－１０７－Ｐ１１３Ｓ）、配列番号４２（Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｌ－Ｆ１０７Ｓ）、配列番号４１（Ｐ４２Ｌ－Ｐ１１３Ｓ）、配列番号３４（ＣｏｌＥ２野生型）、配列番号３５（ＣｏｌＥ２変異体Ｇ１９４Ｄ）からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＲｅｐタンパク質をコードするゲノム核酸配列を含むことができる。例として、限定するものではないが、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、配列番号３９（Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ－Ｐ１１３Ｓ）、配列番号４０（Ｐ４２Ｌ－Δ１０６－１０７－Ｐ１１３Ｓ）、配列番号４２（Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｌ－Ｆ１０７Ｓ、３０５ａａ）、配列番号４１（Ｐ４２Ｌ－Ｐ１１３Ｓ、３０５ａａ）、配列番号：３４（ＣｏｌＥ２野生型）、配列番号：３５（ＣｏｌＥ２変異体Ｇ１９４Ｄ）からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＲｅｐタンパク質を含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおけるＲｅｐタンパク質をコードする核酸配列が、ＰＬプロモーターの制御下にあり得、そのようなＰＬプロモーターが、ｃＩＴｓ８５７などのゲノムに存在するラムダリプレッサーがある場合、Ｒｅｐタンパク質の温度感受性発現を可能にし得ることを理解されたい。例として、限定するものではないが、ＰＬプロモーターは、ｔｔｇａｃａｔａａａ ｔａｃｃａｃｔｇｇｃ ｇｇｔｇａｔａｃｔ（ＰＬプロモーター（－３５～－１０））、ｔｔｇａｃａｔａａａ ｔａｃｃａｃｔｇｇｃ ｇｔｇａｔａｃｔ（ＰＬプロモーターＯＬ１－Ｇ（－３５～－１０））、またはｔｔｇａｃａｔａａａ ｔａｃｃａｃｔｇｇｃ ｇｔｔｇａｔａｃｔ（ＰＬプロモーターＯＬ１－Ｇ～Ｔ（－３５～－１０））と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を有することができる。Ｒｅｐタンパク質が、配列番号３９～４２などのＲ６Ｋ Ｒｅｐタンパク質である場合、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞にトランスフェクトされたベクターは、Ｒ６Ｋの複製起点を含み得、あるいは、Ｒｅｐタンパク質がＣｏｌＥ２ Ｒｅｐタンパク質である場合、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞にトランスフェクトされたベクターは、ＣｏｌＥ２の複製起点を含み得ることをさらに理解されたい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ゲノム発現ＲＮＡ－ＩＮ調節された選択可能マーカーをコードするゲノム核酸配列をさらに含むことができる。例として、限定するものではないが、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、配列番号２５（ＳａｃＢ、１４２２ｂｐ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するゲノム核酸配列（選択可能マーカーをコードする）を含むことができる。さらなる例として、限定するものではないが、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、配列番号３８（ＳａｃＢ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する選択可能マーカーをコードするゲノム核酸配列を含むことができる。なおさらなる例として、限定するものではないが、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、配列番号３８（ＳａｃＢ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＲＮＡ－ＩＮ調節された選択可能マーカーを含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、ＲＮＡ－ＩＮ調節された選択可能マーカーは、ｇｃｃａａａａａｔｃａａｔａａｔｃａｇａｃａａｃａａｇａｔｇの配列を有するＲＮＡ－ＩＮの下流にあり得、このＲＮＡ－ＩＮが使用される実施形態では、ベクター中の対応するＲＮＡ－ＯＵＴは、ＷＯ２０１９／１８３２４８（配列番号４８）の配列番号６のものであり得る。したがって、ＳａｃＢに関して、ＲＮＡ－ＩＮ ＳａｃＢ配列は、
Figure 2023517682000003
であり得る。任意の好適なＲＮＡ－ＩＮ調節された選択マーカーおよびＲＮＡ－ＩＮを使用することができ、これらは当該技術分野において既知であることを理解されたい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、温度感受性ラムダリプレッサーをコードするゲノム核酸配列をさらに含むことができる。
限定するものではないが、例として、温度感受性ラムダリプレッサーは、ｃＩＴｓ８５７であり得る。例として、限定するものではないが、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、配列番号２４（ｃＩＴｓ８５７、７１４ｂｐ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するゲノム核酸配列（温度感受性ラムダリプレッサーをコードする）を含むことができる。さらなる例として、限定するものではないが、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、配列番号３７（ｃＩＴｓ８５７）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するｃＩＴｓ８５７をコードするゲノム核酸配列をさらに含むことができる。なおさらなる例として、限定するものではないが、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、配列番号３７（ｃＩＴｓ８５７）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する温度感受性ラムダリプレッサーをさらに含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、温度感受性ラムダリプレッサーをコードするゲノム核酸配列をさらに含む場合、温度感受性ラムダリプレッサーは、アラビノース誘導性ＣＩＴｓ８５７遺伝子のファージφ８０結合部位染色体組み込みコピーであり得る。例として、限定するものではないが、ｃＩＴｓ８５７遺伝子は、ｐＢＡＤプロモーターの制御下にあり、アラビノース誘導性（ｐＢＡＤプロモーター、
Figure 2023517682000004
）を提供することができる。
いくつかの実施形態では、以下の遺伝子型：Ｆ－φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ Δ（ｌａｃＺＹＡ－ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒｋ－，ｍｋ＋）ｇａｌ－ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４ λ－ｔｈｉ－１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１ ΔＳｂｃＤＣ：：ｋａｎＲを有する操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、以下の遺伝子型：Ｆ－φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ Δ（ｌａｃＺＹＡ－ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒｋ－，ｍｋ＋）ｇａｌ－ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４ λ－ｔｈｉ－１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１ ΔＳｂｃＤＣを有する、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、以下の遺伝子型：ＤＨ５α ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ；ΔＳｂｃＤＣ：：ｋａｎＲを有する、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、以下の遺伝子型：ＤＨ５α ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ；ΔＳｂｃＤＣを有する、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、以下の遺伝子型：Ｆ－φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ Δ（ｌａｃＺＹＡ－ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒｋ－，ｍｋ＋）ｇａｌ－ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４ λ－ｔｈｉ－１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１；ΔＳｂｃＤＣ：：ｋａｎＲを有する操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、以下の遺伝子型：ＤＨ５α ｄｃｍ－；ΔＳｂｃＤＣを有する操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、以下の遺伝子型：ＤＨ５α ｄｃｍ－；ΔＳｂｃＤＣ：：ｋａｎＲを有する操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、以下の遺伝子型：ＤＨ５α ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ΔＳｂｃＤＣを有する操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、以下の遺伝子型：ＤＨ５α ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ΔＳｂｃＤＣ：：ｋａｎＲを有する操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、以下の遺伝子型：ＤＨ５α ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔφ８０：：ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｔｅｔＲ；ΔＳｂｃＤＣを有する操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、以下の遺伝子型：ＤＨ５α ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔφ８０：：ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｔｅｔＲ；ΔＳｂｃＤＣ：：ｋａｎＲを有する操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、以下の遺伝子型：ＤＨ５α ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ；ａｔｔφ８０：：ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ，ｔｅｔＲ；ΔＳｂｃＤＣを有する操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、以下の遺伝子型：ＤＨ５α ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ；ａｔｔφ８０：：ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ，ｔｅｔＲ；ΔＳｂｃＤＣ：：ｋａｎＲを有する操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、以下の遺伝子型：ＤＨ５α ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ；ａｔｔφ８０：：ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｔｅｔＲ；ΔＳｂｃＤＣを有する操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、以下の遺伝子型：ＤＨ５α ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ；ａｔｔφ８０：：ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｔｅｔＲ；ΔＳｂｃＤＣ：：ｋａｎＲを有する操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、以下の遺伝子型：ＤＨ５α ｄｃｍ－ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ；ａｔｔφ８０：：ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｔｅｔＲ；ΔＳｂｃＤＣを有する操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、以下の遺伝子型：ＤＨ５α ｄｃｍ－ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ；ａｔｔφ８０：：ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｔｅｔＲ；ΔＳｂｃＤＣ：：ｋａｎＲを有する操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が提供される。
前述の実施形態のいずれかにおいて、ＳｂｃＣ遺伝子は、配列番号９と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、ＳｂｃＤ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。これは、ノックアウトもしくはノックダウンの前、または後に、すなわち、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞内の遺伝子に適用することができることを理解されたい。参照のために、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２についての、ＮＣＢＩからのＳｂｃＣの野生型配列（参照配列：ＷＰ＿２０６０６１８０８．１）は、
Figure 2023517682000005
によって与えられ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２についての、ＧｅｎＢａｎｋからのＳｂｃＤ野生型配列（ＡＡＢ１８１２２．１）は、
Figure 2023517682000006
によって与えられる。これらのアミノ酸配列は、例示的なものであり、当業者は、相同性に基づいて、他の株および細胞株中のＳｂｃＣおよびＳｂｃＤ遺伝子、ならびに複合体を含むタンパク質を同定することができることを理解されたい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、ｓｂｃＢ遺伝子は、配列番号１１と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、ｒｅｃＢ遺伝子は、配列番号１２と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、ｒｅｃＤ遺伝子は、配列番号１３と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、ｒｅｃＪ遺伝子は、配列番号６５と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、ｕｖｒＣ遺伝子は、配列番号１４と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、ｍｃｒＡ遺伝子は、配列番号１５と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。前述の実施形態のうちのいずれかにおいて、ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒ遺伝子は、配列番号１６～２１と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ベクターをさらに含むことができる。例として、限定するものではないが、ベクターは、非ウイルストランスポゾンベクター、例えば、トランスポザーゼベクター、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンベクター、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼベクター、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクター、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼベクター、発現ベクターなど、非ウイルス遺伝子編集ベクター、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）／ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベクターなど、またはウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター、ＡＡＶ ｒｅｐ ｃａｐベクター、ＡＡＶヘルパーベクター、Ａｄヘルパーベクター、レンチウイルスベクター、レンチウイルスエンベロープベクター、レンチウイルスパッケージングベクター、レトロウイルスベクター、レトロウイルスエンベロープベクター、レトロウイルスパッケージングベクター、ｍＲＮＡベクターなどであり得る。
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞がベクターをさらに含む前述の実施形態のいずれかにおいて、ベクターは、パリンドロームを有する核酸配列を含み得る。パリンドローム配列は、一本鎖上の特定の方向での読み取りが、相補鎖上の反対方向での配列読み取りと一致し、それにより一本鎖に沿って相補部分が存在し、相補部分間に介在配列が存在しない、二本鎖ＤＮＡ分子内の核酸配列として理解され得る。例として、限定するものではないが、パリンドロームの相補配列は、各々、約１０～約２００塩基対、約１５～約２００塩基対、約２０～約２００塩基対、約２５～約２００塩基対、約３０～約２００塩基対、約４０～約２００塩基対、約５０～約２００塩基対、約７５～約２００塩基対、約１００～約２００塩基対、約１５～約２００塩基対、約１０～約１５０塩基対、約１５～約１５０塩基対、約２０～約１５０塩基対、約２５～約１５０塩基対、約３０～約１５０塩基対、約３０～約１５０塩基対、約４０～約１５０塩基対、約５０～約１５０塩基対、約１００～約１５０塩基対、約１０～約１４０塩基対、約１５～約１４０塩基対、約２０～約１４０塩基対、約２５～約１４０塩基対、約３０～約１４０塩基対、約３０～約１４０塩基対、約４０～約１４０塩基対、約５０～約１４０塩基対、約１００～約１４０塩基対、約１０～約１００塩基対、約１５～約１００塩基対、約２０～約１００塩基対、約２５～約１００塩基対、約３０～約１００塩基対、約４０～約１００塩基対、約５０～約１００塩基対、または約１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００塩基対を含み得る。
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞がベクターをさらに含む前述の実施形態のいずれかにおいて、ベクターは、少なくとも１つの直接反復を有する核酸配列を含み得る。例として、限定するものではないが、少なくとも１つの直接反復は、約４０～１５０ヌクレオチド、約６０～約１２０ヌクレオチド、または約９０ヌクレオチドを含み得る。さらなる例として、限定するものではないが、少なくとも１つの直接反復は、ポリＡ反復、ポリＴ反復、ポリＣ反復、またはポリＧ反復などの単一塩基の複数の繰り返しからなるＤＮＡの短い配列を含む単純反復であってもよく、単純反復は、約４０～約１５０個の同じ塩基の連続反復、約６０～約１２０個の同じ塩基の連続反復、または約９０個の同じ塩基の連続反復を含む。さらなる例として、限定するものではないが、ポリＡ反復は、４０～１５０個の連続アデニンヌクレオチド、６０～１２０個の連続アデニンヌクレオチド、または約９０個のアデニンヌクレオチドを含み得る。
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞がベクターをさらに含む前述の実施形態のいずれかにおいて、ベクターは、逆方向反復配列、直接反復配列、ホモポリマー反復配列、真核生物の複製起点、および真核生物プロモーターエンハンサー配列を含み得る。さらなる例として、ベクターは、ポリＡ反復、ＳＶ４０複製起点、ウイルスＬＴＲ、レンチウイルスＬＴＲ、レトロウイルスＬＴＲ、トランスポゾンＩＲ／ＤＲ反復、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンＩＲ／ＤＲ反復、ＡＡＶ ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、およびＳＶ４０エンハンサーからなる群から選択される配列を含み得る。例として、限定するものではないが、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲを含有し得る。Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞がベクターをさらに含むいくつかの実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの逆向き反復配列を有する核酸配列を含むことができ、これはまた、例として、限定するものではないが、ＡＡＶ ＩＴＲなどの逆向き末端反復であり得る。したがって、前述の実施形態のいずれかにおいて、ベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲを含み得る。逆向き反復配列は、下流にその逆相補体が続くヌクレオチドの一本鎖配列であることを理解されたい。一本鎖配列は、二本鎖ベクターの一部であり得ることをさらに理解されたい。初期配列と逆相補体との間のヌクレオチドの介在配列は、ゼロを含む任意の長さであり得る。介在長がゼロの場合、複合配列はパリンドロームである。介在長がゼロを超える場合、複合配列は逆向き反復である。前述の実施形態のいずれかにおいて、介在配列は、１～約２０００塩基対であり得る。例として、限定するものではないが、逆向き末端反復であり得る逆向き反復は、約１～約２０００塩基対、約５～約２０００塩基対、約１０～約２０００塩基対、約２５～約２０００塩基対、約５０～約２０００塩基対、約１００～約２０００塩基対、約２５０～約２０００塩基対、約５００～約２０００塩基対、約７５０～約２０００塩基対、約１０００～約２０００塩基対、約１２５０～約２０００塩基対、約１５００～約２０００塩基対、約１７５０～約２０００塩基対、約１～約１００塩基対、約１～約５０塩基対、約１～約２５塩基対、約１～約２０塩基対、約１～約１０塩基対、約１～約５塩基対、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、もしくは２０００塩基対を含む介在配列によって分離され得る。例として、限定するものではないが、逆向き反復の相補的部分は、各々、約１０～約２００塩基対、約１５～約２００塩基対、約２０～約２００塩基対、約２５～約２００塩基対、約３０～約２００塩基対、約４０～約２００塩基対、約５０～約２００塩基対、約７５～約２００塩基対、約１００～約２００塩基対、約１５～約２００塩基対、約１０～約１５０塩基対、約１５～約１５０塩基対、約２０～約１５０塩基対、約２５～約１５０塩基対、約３０～約１５０塩基対、約３０～約１５０塩基対、約４０～約１５０塩基対、約５０～約１５０塩基対、約１００～約１５０塩基対、約１０～約１４０塩基対、約１５～約１４０塩基対、約２０～約１４０塩基対、約２５～約１４０塩基対、約３０～約１４０塩基対、約３０～約１４０塩基対、約４０～約１４０塩基対、約５０～約１４０塩基対、約１００～約１４０塩基対、約１０～約１００塩基対、約１５～約１００塩基対、約２０～約１００塩基対、約２５～約１００塩基対、約３０～約１００塩基対、約４０～約１００塩基対、約５０～約１００塩基対、または約１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００塩基対を含み得る。例として、限定するものではないが、少なくとも１つの逆向き反復は、ｔｔｇｇｃｃａｃｔｃｃｃｔｃｔｃｔｇｃｇｃｇｃｔｃｇｃｔｃｇｃｔｃａｃｔｇａｇｇｃｃｇｇｇｃｇａｃｃａａａｇｇｔｃｇｃｃｃｇａｃｇｃｃｃｇｇｇｃｔｔｔｇｃｃｃｇｇｇｃｇｇｃｃｔ ｃａｇｔｇａｇｃｇａｇｃｇａｇｃｇｃｇｃａｇａｇａｇｇｇａｇｔｇｇｃｃａａｃｔｃｃａｔｃａｃｔａｇｇｇｇｔｔｃｃｔ（５’ＡＡＶ ＩＴＲ）およびａｇｇａａｃｃｃｃｔａｇｔｇａｔｇｇａｇｔｔｇｇｃｃａｃｔｃｃｃｔｃｔｃｔｇｃｇｃｇｃｔｃｇｃｔｃｇｃｔｃａｃｔｇａｇｇｃｃｇｇｇｃｇａｃｃａａａｇｇｔｃｇｃｃｃｇａｃｇｃｃｃ ｇｇｇｃｔｔｔｇｃｃｃｇｇｇｃｇｇｃｃｔｃａｇｔｇａｇｃｇａｇｃｇａｇｃｇｃｇｃａｇａｇａｇｇｇａｇｔｇｇｃｃａａ（３’ＡＡＶ ＩＴＲ）と少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むＡＡＶ ＩＴＲ反復を含むことができる。
あるいは、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞がベクターをさらに含む前述の実施形態のいずれかにおいて、ベクターは、パリンドローム、直接反復、または逆向き反復を有する核酸配列を含むことができない。
前述の実施形態のいずれかにおいて、ベクターは、ＡＡＶベクターであり得る。ベクターがＡＡＶベクターであるいくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲを含む。他の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクター、レンチウイルスエンベロープベクター、またはレンチウイルスパッケージングベクターであり得る。さらに他の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、レトロウイルスエンベロープベクター、またはレトロウイルスパッケージングベクターであり得る。さらに他の実施形態では、ベクターは、トランスポザーゼベクターまたはトランスポゾンベクターであり得る。なおさらなる実施形態では、ベクターは、ｍＲＮＡベクターであり得る。例として、限定するものではないが、ｍＲＮＡベクターは、本開示に記載されるポリＡ反復を含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、ベクターは、プラスミドであり得る。前述の実施形態のいずれかにおいて、ベクターは、Ｒｅｐタンパク質依存性プラスミドであり得る。
前述の実施形態のいずれかにおいて、ベクターは、ＲＮＡ選択可能マーカーをさらに含むことができる。例として、限定するものではないが、ＲＮＡ選択可能マーカーは、ＲＮＡ－ＯＵＴであり得る。さらなる例として、限定するものではないが、ＲＮＡ－ＯＵＴは、ＷＯ２０１９／１８３２４８（それぞれ、配列番号４７および４９）の配列番号５（ｇｔａｇａａｔｔｇｇ ｔａａａｇａｇａｇｔ ｃｇｔｇｔａａａａｔ ａｔｃｇａｇｔｔｃｇ ｃａｃａｔｃｔｔｇｔ ｔｇｔｃｔｇａｔｔａ ｔｔｇａｔｔｔｔｔｇ ｇｃｇａａａｃｃａｔ ｔｔｇａｔｃａｔａｔ ｇａｃａａｇａｔｇｔ ｇｔａｔｃｔａｃｃｔ ｔａａｃｔｔａａｔｇ ａｔｔｔｔｇａｔａａ ａａａｔｃａｔｔａ）および配列番号７（ｇｔａｇａａｔｔｇｇ ｔａａａｇａｇａｇｔ ｔｇｔｇｔａａａａｔ ａｔｔｇａｇｔｔｃｇ ｃａｃａｔｃｔｔｇｔ ｔｇｔｃｔｇａｔｔａ ｔｔｇａｔｔｔｔｔｇ ｇｃｇａａａｃｃａｔ ｔｔｇａｔｃａｔａｔ ｇａｃａａｇａｔｇｔ ｇｔａｔｃｔａｃｃｔ ｔａａｃｔｔａａｔｇ ａｔｔｔｔｇａｔａａ ａａａｔｃａｔｔａ）からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ＲＮＡ－ＯＵＴによる下流マーカーの調節を可能にするために対応するＲＮＡ－ＩＮ配列を含むことができ、そのＲＮＡ－ＯＵＴ配列は、ＲＮＡ－ＩＮに相当する。
前述の実施形態のいずれかにおいて、ベクターは、ＲＮＡ－ＯＵＴアンチセンスリプレッサーＲＮＡをさらに含むことができる。一例として、限定するものではないが、ＲＮＡ－ＯＵＴアンチセンスリプレッサーＲＮＡは、ＷＯ２０１９／１８３２４８（配列番号４８）の配列番号６と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を有し得る。
前述の実施形態のいずれかにおいて、ベクターは細菌複製起点をさらに含むことができる。例として、限定するものではないが、最近の複製起点は、Ｒ６Ｋ、ｐＵＣ、およびＣｏｌＥ２からなる群から選択され得る。さらなる例として、限定するものではないが、細菌複製起点は、ＷＯ２０１９／１８３２４８（それぞれ配列番号４３～４６および６０）の配列番号１（ｇｇｃｔｔｇｔｔｇｔ ｃｃａｃａａｃｃｇｔ ｔａａａｃｃｔｔａａ ａａｇｃｔｔｔａａａ ａｇｃｃｔｔａｔａｔ ａｔｔｃｔｔｔｔｔｔ ｔｔｃｔｔａｔａａａ ａｃｔｔａａａａｃｃ ｔｔａｇａｇｇｃｔａ ｔｔｔａａｇｔｔｇｃ ｔｇａｔｔｔａｔａｔ ｔａａｔｔｔｔａｔｔ ｇｔｔｃａａａｃａｔ ｇａｇａｇｃｔｔａｇ ｔａｃｇｔｇａａａｃ ａｔｇａｇａｇｃｔｔ ａｇｔａｃｇｔｔａｇ ｃｃａｔｇａｇａｇｃ ｔｔａｇｔａｃｇｔｔ ａｇｃｃａｔｇａｇｇ ｇｔｔｔａｇｔｔｃｇ ｔｔａａａｃａｔｇａ ｇａｇｃｔｔａｇｔａ ｃｇｔｔａａａｃａｔ ｇａｇａｇｃｔｔａｇ ｔａｃｇｔａｃｔａｔ ｃａａｃａｇｇｔｔｇ ａａｃｔｇｃｔｇａｔ ｃ）、配列番号２（ｇｇｃｔｔｇｔｔｇｔ ｃｃａｃａａｃｃａｔ ｔａａａｃｃｔｔａａ ａａｇｃｔｔｔａａａ ａｇｃｃｔｔａｔａｔ ａｔｔｃｔｔｔｔｔｔ ｔｔｃｔｔａｔａａａ ａｃｔｔａａａａｃｃ ｔｔａｇａｇｇｃｔａ ｔｔｔａａｇｔｔｇｃ ｔｇａｔｔｔａｔａｔ ｔａａｔｔｔｔａｔｔ ｇｔｔｃａａａｃａｔ ｇａｇａｇｃｔｔａｇ ｔａｃｇｔｇａａａｃ ａｔｇａｇａｇｃｔｔ ａｇｔａｃａｔｔａｇ ｃｃａｔｇａｇａｇｃ ｔｔａｇｔａｃａｔｔ ａｇｃｃａｔｇａｇｇ ｇｔｔｔａｇｔｔｃａ ｔｔａａａｃａｔｇａ ｇａｇｃｔｔａｇｔａ ｃａｔｔａａａｃａｔ ｇａｇａｇｃｔｔａｇ ｔａｃａｔａｃｔａｔ ｃａａｃａｇｇｔｔｇ ａａｃｔｇｃｔｇａｔ ｃ）、配列番号３（ａａａｃｃｔｔａａａ ａｃｃｔｔｔａａａａ ｇｃｃｔｔａｔａｔａ ｔｔｃｔｔｔｔｔｔｔ ｔｃｔｔａｔａａａａ ｃｔｔａａａａｃｃｔ ｔａｇａｇｇｃｔａｔ ｔｔａａｇｔｔｇｃｔ ｇａｔｔｔａｔａｔｔ ａａｔｔｔｔａｔｔｇ ｔｔｃａａａｃａｔｇ ａｇａｇｃｔｔａｇｔ ａｃａｔｇａａａｃａ ｔｇａｇａｇｃｔｔａ ｇｔａｃａｔｔａｇｃ ｃａｔｇａｇａｇｃｔ ｔａｇｔａｃａｔｔａ ｇｃｃａｔｇａｇｇｇ ｔｔｔａｇｔｔｃａｔ ｔａａａｃａｔｇａｇ ａｇｃｔｔａｇｔａｃ ａｔｔａａａｃａｔｇ ａｇａｇｃｔｔａｇｔ ａｃａｔａｃｔａｔｃ ａａｃａｇｇｔｔｇａ ａｃｔｇｃｔｇａｔｃ）、配列番号４（ｔｇｔｃａｇｃｃｇｔ ｔａａｇｔｇｔｔｃｃ ｔｇｔｇｔｃａｃｔｇ ａａａａｔｔｇｃｔｔ ｔｇａｇａｇｇｃｔｃ ｔａａｇｇｇｃｔｔｃ ｔｃａｇｔｇｃｇｔｔ ａｃａｔｃｃｃｔｇｇ ｃｔｔｇｔｔｇｔｃｃ ａｃａａｃｃｇｔｔａ ａａｃｃｔｔａａａａ ｇｃｔｔｔａａａａｇ ｃｃｔｔａｔａｔａｔ ｔｃｔｔｔｔｔｔｔｔ ｃｔｔａｔａａａａｃ ｔｔａａａａｃｃｔｔ ａｇａｇｇｃｔａｔｔ ｔａａｇｔｔｇｃｔｇ ａｔｔｔａｔａｔｔａ ａｔｔｔｔａｔｔｇｔ ｔｃａａａｃａｔｇａ ｇａｇｃｔｔａｇｔａ ｃｇｔｇａａａｃａｔ ｇａｇａｇｃｔｔａｇ ｔａｃｇｔｔａｇｃｃ ａｔｇａｇａｇｃｔｔ ａｇｔａｃｇｔｔａｇ ｃｃａｔｇａｇｇｇｔ ｔｔａｇｔｔｃｇｔｔ ａａａｃａｔｇａｇａ ｇｃｔｔａｇｔａｃｇ ｔｔａａａｃａｔｇａ ｇａｇｃｔｔａｇｔａ ｃｇｔｇａａａｃａｔ ｇａｇａｇｃｔｔａｇ ｔａｃｇｔａｃｔａｔ ｃａａｃａｇｇｔｔｇ ａａｃｔｇｃｔｇａｔ ｃｔｔｃａｇａｔｃ）、および配列番号１８（ｇｇｃｔｔｇｔｔｇｔ ｃｃａｃａａｃｃｇｔ ｔａａａｃｃｔｔａａ ａａｇｃｔｔｔａａａ ａｇｃｃｔｔａｔａｔ ａｔｔｃｔｔｔｔｔｔ ｔｔｃｔｔａｔａａａ ａｃｔｔａａａａｃｃ ｔｔａｇａｇｇｃｔａ ｔｔｔａａｇｔｔｇｃ ｔｇａｔｔｔａｔａｔ ｔａａｔｔｔｔａｔｔ ｇｔｔｃａａａｃａｔ ｇａｇａｇｃｔｔａｇ ｔａｃｇｔｇａａａｃ ａｔｇａｇａｇｃｔｔ ａｇｔａｃｇｔｔａｇ ｃｃａｔｇａｇａｇｃ ｔｔａｇｔａｃｇｔｔ ａｇｃｃａｔｇａｇｇ ｇｔｔｔａｇｔｔｃｇ ｔｔａａａｃａｔｇａ ｇａｇｃｔｔａｇｔａ ｃｇｔｔａａａｃａｔ ｇａｇａｇｃｔｔａｇ ｔａｃｇｔｔａａａｃ ａｔｇａｇａｇｃｔｔ ａｇｔａｃｇｔａｃｔ ａｔｃａａｃａｇｇｔ ｔｇａａｃｔｇｃｔｇ ａｔｃ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＲ６Ｋガンマ複製起点、配列番号３０（ＣｏｌＥ２起点（＋７）、４５ｂｐ）、配列番号３１（ＣｏｌＥ２起点（＋７、ＣｐＧフリー）、４５ｂｐ）、配列番号３２（ＣｏｌＥ２起点（Ｍｉｎ）、３８ｂｐ）、配列番号３３（ＣｏｌＥ２起点（＋１６）、６０ｂｐ）、ならびに配列番号２２（ｐＵＣ、７８４ｂｐ）であり得る。
前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、（ｉ）目的の遺伝子をコードし、５’および３’の末端を有する真核生物領域配列と、（ｉｉ）真核生物領域配列の５’および３’の末端を連結し、Ｒ６Ｋ細菌複製起点およびＲＮＡ選択可能マーカーを含む、１０００未満、好ましくは５００未満の長さの塩基対を有するスペーサー領域と、を含むことができる真核生物ｐＵＣフリーミニサークル発現ベクターをさらに含み得る。例として、限定するものではないが、Ｒ６Ｋ細菌複製起点およびＲＮＡ選択可能マーカーは、本開示に記載され、当該技術分野において既知の配列を有することができる。あるいは、前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞は、ＰｏｌＩＩＩ依存性Ｒ６Ｋ複製起点およびＲＮＡ－ＯＵＴ選択可能マーカーを含む骨格であって、１０００ｂｐ未満、好ましくは５００ｂｐ未満である骨格と、構造化ＤＮＡ配列を含むインサートと、を有する共有結合閉環状プラスミドをさらに含み得る。例として、限定するものではないが、構造化ＤＮＡ配列は、逆向き反復配列、直接反復配列、ホモポリマー反復配列、真核生物複製起点、および真核生物プロモーターエンハンサー配列からなる群から選択される配列を含み得る。さらなる例として、構造化ＤＮＡ配列は、ポリＡ反復、ＳＶ４０複製起点、ウイルスＬＴＲ、レンチウイルスＬＴＲ、レトロウイルスＬＴＲ、トランスポゾンＩＲ／ＤＲ反復、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンＩＲ／ＤＲ反復、ＡＡＶ ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、およびＳＶ４０エンハンサーからなる群から選択される配列を含み得る。例として、限定するものではないが、インサートは、トランスポザーゼベクター、ＡＡＶベクター、またはレンチウイルスベクターであり得る。例として、限定するものではないが、ｐｏｌＩＩＩ依存性Ｒ６Ｋ複製起点は、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、および配列番号６０（ＷＯ２０１９／１８３２４８の配列番号１～４および１８からの）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を有し得る。一例として、限定するものではないが、ＲＮＡ－ＯＵＴ選択可能マーカーは、配列番号４７または配列番号４９（ＷＯ２０１９／１８３２４８の配列番号５および７からの）と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＲＮＡ－ＩＮ調節ＲＮＡ－ＯＵＴ機能性バリアントであり得る。さらなる例として、ＲＮＡ－ＯＵＴ選択可能マーカーは、ＲＮＡ－ＯＵＴアンチセンスリプレッサーＲＮＡであり得る。一例として、限定するものではないが、ＲＮＡ－ＯＵＴアンチセンスリプレッサーＲＮＡは、ＷＯ２０１９／１８３２４８（配列番号４８）の配列番号６と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を有し得る。
生存率または収率低下変異とは、変異した細胞株が由来する細胞株に関して、同じ培養条件下でそれぞれ細胞株の生存率または収率を低下させる変異を指すことが理解されたい。そのような変異は、操作することができるか、または自然に生じることができることを理解されたい。
本明細書に開示されるように、遺伝子をノックアウトまたはノックダウンするための方法は、当該技術分野において既知であり、例として、限定されるものではないが、本明細書の実施例に開示される方法（組換え）、ならびにＰ１ファージ形質導入、ゲノム物質移動、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が挙げられる。遺伝子ノックアウトは、タンパク質の発現の廃止または非機能性タンパク質の発現のいずれかをもたらすことができることが理解されたい。したがって、ＳｂｃＣＤ複合体は、本開示の細菌宿主株に存在する場合も、存在しない場合もあるが、存在するならば、ノックアウトの場合は非機能性であるか、またはノックダウンの場合はヌクレアーゼとしての活性が低下している。本開示の実施形態は、ＳｂｃＣ、ＳｂｃＤ、またはその両方のノックアウトもしくはノックダウンを含むことができることを理解されたい。
理論に束縛されるものではないが、ＳｂｃＣまたはＳｂｃＤ単独のノックアウトは、両方のタンパク質がＳｂｃＣＤヌクレアーゼの必須サブユニットであるため、本発明の所望の効果を達成するのに十分であると予想される（Ｃｏｎｎｅｌｌｙ ＪＣ ａｎｄ Ｌｅａｃｈ ＤＲ，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：２８５，１９９６）。Ｅ．ｃｏｌｉのｓｂｃＣおよびｓｂｃＤ遺伝子は、パリンドローム不活性化および遺伝子組換えに関与するヌクレアーゼをコードする。（Ｃｏｎｎｅｌｌｙ ＪＣ ａｎｄ Ｌｅａｃｈ ＤＲ，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：２８５，１９９６）。
本開示内では、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、本明細書に記載されるようなベクターを含むことができることを理解されたい。ベクターは、参照により本明細書に組み込まれるそれらの参照に記載されるものを含む、任意の好適なベクターを含むことができる。例えば、場合によっては、ベクターは、構造化ＤＮＡ配列を含むことができる。他の場合では、ベクターは、構造化ＤＮＡ配列を含むことができない。
いくつかの実施形態では、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、本開示において理解されるようなベクターをさらに含むことができる。そのようなベクターは、自然に生じるか、または操作することができる。本開示の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞に含まれるベクターは、本明細書および参照により組み込まれる文書で考察される特徴のうちのいずれかを含むことができる。本開示の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞に含まれるベクターは、例えば、逆向き末端反復またはパリンドロームなどの少なくとも１つの逆向き反復、直接反復、または前述の構造化ＤＮＡ配列のいずれも含まれないことができる。
操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞の産生方法
いくつかの実施形態では、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪのいずれにも操作された生存率または収率低下変異を含まない、出発Ｅ．ｃｏｌｉ細胞内のＳｂｃＣおよびＳｂｃＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子をノックアウトして、操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞を得ることを含む、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を産生するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪのいずれにおいてもいかなる操作された変異も含まない出発Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において、ＳｂｃＣおよびＳｂｃＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子をノックアウトして、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を得るステップを含む、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を産生するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪのいずれにおいてもいかなる変異も含まない出発Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において、ＳｂｃＣおよびＳｂｃＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子をノックアウトして、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を得るステップを含む、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を産生するための方法が提供される。
前述の実施形態のいずれかにおいて、出発Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒ、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つにおいて、操作された生存率または収率低下変異を含まないことがさらに可能である。前述の実施形態のいずれかにおいて、出発Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒ、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つにおいて、いかなる変異も含まないことがさらに可能である。前述の実施形態のいずれかにおいて、出発Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒ、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つにおいて、いかなる変異も含まないことがさらに可能である。
前述の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの遺伝子をノックアウトするステップは、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪのいかなる変異ももたらすことはできない。前述の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの遺伝子をノックアウトするステップは、ｕｖｒＣ、ｍｃＲＡ、ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒ、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つにおいていかなる変異ももたらさない。
前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞は、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒ、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つにおいて、操作された生存率または収率低下変異を含まないことがさらに可能である。前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒ、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つにおいて、操作された変異を含まないことがさらに可能である。前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒ、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つにおいて、いかなる変異も含まないことが可能である。
前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪにおいて操作された生存率または収率低下変異を含むことができない。前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪにおいて操作された変異を含むことができない。前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪにおいていかなる変異も含むことができない。
前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、機能性ＳｂｃＣＤ複合体を含まない。前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ＳｂｃＣＤ複合体を産生しない。あるいは、いくつかの実施形態では、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、非機能性ＳｂｃＣＤ複合体を産生する。
前述の方法の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、本開示のいずれかのＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞であり得ることを理解されたい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、ＳｂｃＣ遺伝子は、配列番号９と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、ＳｂｃＤ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。これは、ノックアウトもしくはノックダウンの前、または後に、すなわち、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞内の遺伝子に適用することができることを理解されたい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、ｓｂｃＢ遺伝子は、配列番号１１と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、ｒｅｃＢ遺伝子は、配列番号１２と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、ｒｅｃＤ遺伝子は、配列番号１３と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、ｒｅｃＪ遺伝子は、配列番号６５と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、ｕｖｒＣ遺伝子は、配列番号１４と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、ｍｃｒＡ遺伝子は、配列番号１５と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒ遺伝子は、配列番号１６～２１と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。
ベクター産生の方法
いくつかの実施形態では、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞をベクターでトランスフェクトして、トランスフェクトされた宿主細胞を得て、ベクターを複製するのに十分な条件下でトランスフェクトされた宿主細胞をインキュベートするステップを含む、改善されたベクター産生のための方法が提供され、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪのいずれにも操作された生存率または収率低下変異を含まない。操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞をトランスフェクションするために使用されるベクターが、本開示の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞がベクターを含む開示される実施形態を含む、本開示に記載の任意のベクターであることができることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、ベクターを含み、ベクターを含むｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪのうちのいずれかにおいて、操作された生存率または収率低下変異を含まない、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞であるトランスフェクトされた宿主細胞をインキュベートするステップと、ベクターを複製するのに十分な条件下でトランスフェクトされた宿主細胞をインキュベートするステップと、を含む、改善されたベクター産生のための方法が提供される。
前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、本開示の任意の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞であり得ることが理解されたい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、方法は、トランスフェクトされた宿主細胞からベクターを単離することをさらに含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、トランスフェクトされた宿主細胞をインキュベートするステップは、トランスフェクトされた細胞またはベクターによるトランスフェクション後のいずれであっても、流加発酵によって行われ、流加発酵が、流加相の第１の部分の間に低下した温度で、（増殖制限条件下であり得る）、続いて、流加相の第２の部分の間により高い温度に温度を上昇させて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を増殖させることを含む。例として、低下した温度は、約２８～３０℃であり得、より高い温度は、約３７～４２℃であり得る。例示として、第１の部分は約１２時間であり得、第２の部分は約８時間であり得る。温度上昇を伴う流加発酵が使用される場合、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、温度感受性であり得るラムダリプレッサーによって調節され得るＰＬプロモーターの制御下にあるラムダリプレッサーおよびＲｅｐタンパク質を有することができることを理解されたい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、ベクターを複製するのに十分な条件下でトランスフェクトされた宿主細胞をインキュベートした後のプラスミド収率は、同じ条件下で処理された操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞が由来する細胞株よりも高くすることができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、ベクターを複製するのに十分な条件下でトランスフェクトされた宿主細胞をインキュベートした後のプラスミド収率は、同じ条件下で処理されたＳＵＲＥ２、ＳＵＲＥ Ｓｔｂｌ２、Ｓｔｂｌ３、またはＳｔｂｌ４細胞よりも高くすることができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、ＳｂｃＣ遺伝子は、配列番号９と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、ＳｂｃＤ遺伝子は、配列番号１０と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。これは、ノックアウトもしくはノックダウンの前、または後に、すなわち、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞内の遺伝子に適用することができることを理解されたい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、ｓｂｃＢ遺伝子は、配列番号１１と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、ｒｅｃＢ遺伝子は、配列番号１２と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、ｒｅｃＤ遺伝子は、配列番号１３と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、ｒｅｃＪ遺伝子は、配列番号６５と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、ｕｖｒＣ遺伝子は、配列番号１４と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、ｍｃｒＡ遺伝子は、配列番号１５と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒ遺伝子は、配列番号１６～２１と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞にトランスフェクトされるベクターは、本明細書に記載されるいずれかのベクターであり得ることを理解されたい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ノックアウトではなく、ＳｂｃＣ、ＳｂｃＤ、またはその両方のノックダウンを含み得ることを理解されたい。ノックダウンは、ＳｂｃＣＤ複合体の発現の低下および／または活性の低下をもたらし得る。低下は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上であり得る。
ここで、以下の非限定的な実施例を参照して、本開示の細菌宿主株および方法を説明する。
治療用プラスミドの大部分は、ｐＭＢ１起点の高コピー誘導体であるｐＵＣ起点（ＣｏｌＥ１起点と密接に関連している）を使用する。ｐＭＢ１複製のために、プラスミドＤＮＡ合成は一方向性であり、プラスミド保有イニシエータータンパク質を必要としない。ｐＵＣ起点は、アクセサリーＲＯＰ（ｒｏｍ）タンパク質を欠失させるｐＭＢ１起点のコピーアップ誘導体であり、ＲＮＡＩ／ＲＮＡＩＩ相互作用を不安定化する追加の温度感受性変異を有する。これらの起点を含む培養物を３０℃から４２℃にシフトさせることにより、プラスミドコピー数が増加する。ｐＵＣプラスミドは、多数のＥ．ｃｏｌｉ細胞株において産生され得る。
以下の実施例では、振盪フラスコ産生用に独自のプラスミド＋振盪培養培地を使用した。種培養をグリセロールストックまたはコロニーから開始し、５０μｇ／ｍＬの抗生物質（ａｍｐＲまたはｋａｎＲ選択プラスミド）または６％のスクロース（ＲＮＡ－ＯＵＴ選択プラスミド）を含むＬＢ培地寒天プレートに画線した。プレートを３０～３２℃で増殖させ、細胞を培地中に再懸濁し、約２．５ＯＤ６００の接種材料を、５００ｍＬのプラスミド＋振盪フラスコに提供するために使用した。このフラスコには、ａｍｐＲまたはｋａｎＲ選択プラスミドのための５０μｇ／ｍＬの抗生物質、またはＲＮＡ－ＯＵＴプラスミドのための選択のための０．５％のスクロースが含まれていた。フラスコを、示されるように増殖温度で飽和するように振盪しながら増殖させた。
以下の実施例において、ＨｙｐｅｒＧＲＯ発酵は、記載されるようにＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ＢｉｏＦｌｏ １１０バイオリアクターにおいて独自の流加培地（ＮＴＣ３０１９、ＨｙｐｅｒＧＲＯ培地）を使用して行った（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９４３，３７７号）。種培養をグリセロールストックまたはコロニーから開始し、５０μｇ／ｍＬの抗生物質（ａｍｐＲまたはｋａｎＲ選択プラスミド）または６％のスクロース（ＲＮＡ－ＯＵＴ選択プラスミド）を含むＬＢ培地寒天プレートに画線した。プレートを３０～３２℃で増殖させ、細胞を培地中に再懸濁し、発酵様の約０．１％の接種材料を提供するために使用し、この接種材料には、ａｍｐＲまたはｋａｎＲ選択プラスミドのための５０μｇ／ｍＬの抗生物質、またはＲＮＡ－ＯＵＴプラスミドのための０．５％のスクロースが含まれていた。ＨｙｐｅｒＧＲＯ温度シフトは、示されるとおりであった。
以下の実施例では、全ての発酵の間に、重要なポイントおよび規則的な間隔で培養試料を採取した。試料を、直ちにバイオマス（ＯＤ６００）およびプラスミド収率について分析した。プラスミド収率を決定した場合、分析を、米国特許第７，９４３，３７７号に記載されるように、Ｑｉａｇｅｎ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ調製物から得られたプラスミドの定量化によって行った。簡潔に言えば、細胞をアルカリ溶解し、清澄化し、プラスミドをカラム精製し、溶出させた後に定量化した。プラスミドの品質を、アガロースゲル電気泳動分析（ＡＧＥ）によって決定し、米国特許第７，９４３，３７７号に記載されるように、０．８～１％のＴｒｉｓ／酢酸塩／ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）ゲル上で実施した。
以下の実施例で使用される株には、以下のものが含まれた。
ＲＮＡ－ＱＵＴ抗生物質フリーの選択可能マーカーの背景：抗生物質不使用の選択は、例えば、ＷＯ２００８／１５３７３３に記載されているように、ＮＴＣ４８６２などのファージラムダ結合部位染色体組み込みｐＣＡＨ６３－ＣＡＴ ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ（Ｐ５／６ ６／６）を含有するＥ．ｃｏｌｉ株において実施する。ＳａｃＢ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ）は、スクロースの存在下でＥ．ｃｏｌｉ細胞に対して致死的である逆選択可能マーカーである。ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ転写産物からのＳａｃＢの翻訳は、プラスミドコードＲＮＡ－ＯＵＴによって阻害される。これは、スクロースの存在下で、ＳａｃＢ媒介致死性の阻害によってプラスミド選択を促進する。
Ｒ６Ｋ起点ベクター複製の背景：Ｒ６Ｋガンマプラスミド複製起点には、複製開始モノマーとして複数の反復「イテロン」部位（ＴＧＡＧＮＧコンセンサスを含有する７個のコア反復）に結合し、複製阻害二量体として抑制部位（ＴＧＡＧＮＧ）および低減された親和性のイテロンに結合する単一のプラスミド複製タンパク質πが必要である。複製には、ＩＨＦ、ＤｎａＡ、およびプライモソームアセンブリタンパク質ＤｎａＢ、ＤｎａＣ、ＤｎａＧを含む複数の宿主因子が必要である（Ａｂｈｙａｎｋａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：４５４７６－４５４８４）。Ｒ６Ｋコア起点は、π、ＩＨＦおよびＤｎａＡが相互作用して複製を開始するので、プラスミド複製に影響を及ぼすＤｎａＡおよびＩＨＦの結合部位を含有する。
Ｒ６Ｋγ複製起点の異なるバージョンは、様々な真核生物発現ベクター、例えば、ｐＣＯＲベクター（Ｓｏｕｂｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１４８２－８８）、およびｐＣｐＧｆｒｅｅベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）、およびｐＧＭ１６９（オックスフォード大学）におけるＣｐＧフリーバージョンにおいて利用されている。複製に必要なコア配列を含有する、高度に最小化された６個のイテロンＲ６Ｋガンマ由来複製起点（ＤｎａＡボックスおよびｓｔｂ１～３部位を含む；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７７：６３３８－６３４５）が、上流π二量体リプレッサー結合部位および下流πプロモーターが（イテロンの１つのコピーを除去することによって）欠失した状態で、ＷＯ２０１４／０３５４５７に記載され、参照により本明細書に含まれる（ＷＯ２０１９／１８３２４８（配列番号４３）からの配列番号１）。このＲ６Ｋ起点には６つのタンデム直接反復イテロンが含まれている。この最小化されたＲ６Ｋ起点およびスペーサー領域におけるＲＮＡ－ＯＵＴ ＡＦ（抗生物質非含有）選択可能マーカーを含むＮＴＣ９３８５Ｒ Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄ（商標）ベクターは、ＷＯ２０１４／０３５４５７に記載されており、参照により本明細書に含まれる。７つのタンデム直接反復イテロンを含有するＲ６Ｋ起点および６つのタンデム直接反復イテロンおよび単一のＣｐＧ残基を含有するＲ６Ｋ起点は、ＷＯ２０１９／１８３２４８に記載され、参照により本明細書に含まれる。伝播に特化した細胞株を必要とするＲ６Ｋγなどの条件付き複製起点の使用は、ベクターが患者の内因性細菌叢に移行した場合に複製されないため、安全マージンを追加する。
典型的なＲ６Ｋ産生株は、コピー数を増加させるＰ１０６Ｌ置換を含有するπタンパク質誘導体ＰＩＲ１１６をゲノムから発現する（π二量体化を低減することによって；πモノマーは活性化するが、π二量体は抑制される）。ｐＣＯＲによる発酵結果（Ｓｏｕｂｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（上記）１９９９）およびｐＣｐＧプラスミド（Ｈｅｂｅｉ ＨＬ，Ｃａｉ Ｙ，Ｄａｖｉｅｓ ＬＡ，Ｈｙｄｅ ＳＣ，Ｐｒｉｎｇｌｅ ＩＡ，Ｇｉｌｌ ＤＲ．２００８．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６：Ｓ１１０）は低く、ＰＩＲ１１６細胞株において約１００ｍｇ／Ｌであった。
ｐｉｒ－１１６複製タンパク質の突然変異誘発および増加したコピー数の選択は、新しい産生株を作製するために使用されている。例えば、ＴＥＸ２ｐｉｒ４２株は、Ｐ１０６ＬおよびＰ４２Ｌの組み合わせを含有する。Ｐ４２Ｌ変異は、ＤＮＡループ複製抑制を妨げる。ＴＥＸ２ｐｉｒ４２細胞株は、２０５ｍｇ／Ｌの収量で報告されているｐＣＯＲプラスミドでコピー数および発酵収率を改善した（Ｓｏｕｂｒｉｅｒ Ｆ．２００４．国際特許出願第Ｗ０２００４／０３３６６４号を参照されたい）。
コピー数を改善するπコピー数変異体の他の組み合わせとしては、「Ｐ４２ＬおよびＰ１１３Ｓ」ならびに「Ｐ４２Ｌ、Ｐ１０６ＬおよびＦ１０７Ｓ」が挙げられる（Ａｂｈｙａｎｋａｒ ｅｔ ａｌ．，２００４．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：６７１１－６７１９）。
ＷＯ２０１４／０３５４５７は、Ｒ６Ｋ起点のＮａｎｏｐｌａｓｍｉｄ（商標）ベクターの選択および伝播のための、ファージＨＫ０２２結合部位統合ｐＬプロモーター熱誘導性πＰ４２Ｌ、Ｐ１０６ＬおよびＦ１０７Ｓ高コピー変異体複製（Ｒｅｐ）タンパク質を発現する宿主株を記載している。
ＷＯ２０１４／０３５４５７に記載されているＲＮＡ－ＯＵＴ選択可能マーカー－Ｒ６Ｋプラスミドの伝播および発酵は、ＤＨ５α宿主株ＮＴＣ７１１７７２＝ＤＨ５α ｄｃｍ－ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｌ－Ｆ１０７Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲなどの熱誘導性「Ｐ４２Ｌ、Ｐ１０６ＬおよびＦ１０７Ｓ」πコピー数変異体細胞株を使用して実施された。最大６９５ｍｇ／Ｌの産生収率が報告された。
さらなるＲ６Ｋ起点の「コピーカッター」宿主細胞株を作成し、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ２０１９ ＶＩＲＡＬ ＡＮＤ ＮＯＮ－ＶＩＲＡＬ ＮＡＮＯＰＬＡＳＭＩＤ ＶＥＣＴＯＲＳ ＷＩＴＨ ＩＭＰＲＯＶＥＤ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ 国際特許出願第ＷＯ２０１９／１８３２４８号に開示し、これは
ＮＴＣ１０５０８１１ ＤＨ５α ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ；ａｔｔφ８０：：ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ，ｔｅｔＲ＝ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ（ＮＴＣ９４０２１１の誘導体）を含む。この「コピーカッター」宿主株は、アラビノース誘導性ＣＩ８５７ｔｓ遺伝子のファージφ８０付着部位の染色体組み込みコピーを含有する。プレートまたは培地へのアラビノースの添加（例えば、０．２～０．４％の最終濃度まで）は、ｐＬプロモーターを発現する。Ｒｅｐタンパク質のＣＩ８５７ｔｓ媒介ダウンレギュレーションを通じて３０℃でコピー数を減少させるｐＡＲＡ媒介ＣＩ８５７ｔｓリプレッサー発現を誘導する［すなわち、３０℃でのｐＬ（ＯＬ１－Ｇ～Ｔ）プロモーターのより効果的なダウンレギュレーションを媒介する追加のＣＩ８５７ｔｓ］。３７～４２℃への温度シフト後のコピー数誘導は、ＣＩ８５７ｔｓリプレッサーがこれらの高温で不活性化されるため、損なわれない。ｄｃｍ－誘導体（ＮＴＣ１０５０８１１ ｄｃｍ－）は、ｄｃｍメチル化が望ましくない場合に使用される。ＮＴＣ１０５０８１１－ＨＦは、ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ発現カセットの第２のコピーを含むＮＴＣ１０５０８１１細胞株の誘導体であり、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、ｒｅｃＪ、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡまたはｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒに変異を有さない。
各場合において、両方の株（ＮＴＣ１０５０８１１およびＮＴＣ１０５０８１１－ＨＦ）は、アラビノース誘導性ＣＩ８５７ｔｓ遺伝子のファージφ８０付着部位染色体組み込みコピーを含有する。プレートまたは培地へのアラビノースの添加（例えば、０．２～０．４％の最終濃度まで）は、ｐＬプロモーターを発現する。Ｒｅｐタンパク質のＣＩ８５７ｔｓ媒介ダウンレギュレーションを通じて３０℃でコピー数を減少させるｐＡＲＡ媒介ＣＩ８５７ｔｓリプレッサー発現を誘導する［すなわち、３０℃でのｐＬ（ＯＬ１－Ｇ～Ｔ）プロモーターのより効果的なダウンレギュレーションを媒介する追加のＣＩ８５７ｔｓ］。３７～４２℃への温度シフト後のコピー数誘導は、ＣＩ８５７ｔｓリプレッサーがこれらの高温で不活性化されるため、損なわれない。これらの「コピーカッター宿主株」は、３０℃でのコピー数を減少させることによって、Ｒ６Ｋベクター温度アップシフトコピー数誘導比を増加させる。これは、大きな、毒性のある、または二量体化しやすいＲ６Ｋ起点ベクターの産生に有利である。
Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄ（商標）産生収率は、ＷＯ２０１４／０３５４５７に記載の三重変異体熱誘導性ｐＬ（ＯＬ１－ＧからＴ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｌ－Ｆ１０７Ｓ（Ｐ３－）と比較して、ＷＯ２０１９／１８３２４８に記載の四重変異体熱誘導性ｐＬ（ＯＬ１－ＧからＴ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－）で改善される。２ｇ／ＬのＮａｎｏｐｌａｓｍｉｄ（商標）を超える収率は、四重変異体ＮＴＣ１０５０８１１細胞株（ＷＯ２０１９／１８３２４８）で得られている。
伝播に特化した細胞株を必要とするこれらのＲ６Ｋ起点などの条件付き複製起点の使用は、ベクターが患者の内因性細菌叢に移行した場合に複製されないため、安全マージンを追加する。
ＷＯ２０１９／１８３２４８に記載されているＲＮＡ－ＯＵＴ産生宿主は、ＨＦ宿主を作成するように改変された。ＳａｃＢ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ）は、スクロースの存在下でＥ．ｃｏｌｉ細胞に対して致死的である逆選択可能マーカーである。ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ転写産物からのＳａｃＢの翻訳は、プラスミドコードＲＮＡ－ＯＵＴによって阻害される。これは、スクロースの存在下で、ＳａｃＢ媒介致死性の阻害によってプラスミド選択を促進する。ＳａｃＢ発現を排除するＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ発現カセットの染色体コピーの変異は、スクロース耐性である（プラスミドの不在下で）。ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ発現カセットの第２のコピーの存在は、各個々のＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ発現カセットコピーが、プラスミドの欠如下でスクロースの致死性を媒介し、両方のＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ発現カセットの染色体コピーに対するプラスミドの非常に希少な変異の欠如下でスクロースの致死性を媒介するので、スクロース耐性コロニーの数を劇的に減少させる（プラスミドの不在下で）。
ＮＴＣ１０１１５９２ Ｓｔｂｌ４ ａｔｔｋ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ（ＷＯ２０１９／１８３２４８）も使用した。
以下の実施例では、改変されなかった産生株が含まれる：ＤＨ５α、Ｓｕｒｅ２、Ｓｔｂｌ２、Ｓｔｂｌ３、またはＳｔｂｌ４。
実施例１：ＳｂｃＣＤノックアウト菌株の調製
ＳｂｃＣＤノックアウト株は、Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９７：６６４０－６６４５（２０００）に記載されるように、Ｒｅｄ Ｇａｍ組換えクローニングを使用して作製した。ｐＫＤ４プラスミド（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，２０００）を、以下のプライマーでＰＣＲ増幅して、相同性アームを標的とするＳｂｃＣおよびＳｂｃＤを導入した。
配列番号１（ＳｂｃｃＲ－ｐＫＤ４）：
ＣＣＣＴＣＴＧＴＡＴＴＣＡＴＴＡＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＧＴＴＡＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＡＡＣＧＴＡＣＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧ
配列番号２（ＳｂｃｄＦ－ｐＫＤ４）：
ＴＣＴＧＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＡＴＣＧＣＧＣＣＣＡＴＧＣＴＴＴＴＴＣＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＧＴＴＡＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＧ
１．６ｋｂのＰＣＲ産物（配列番号５、
Figure 2023517682000007
）（図１Ａ）を精製し、ＤｐｎＩを（鋳型プラスミドを排除するために）消化した。ＳｂｃＣＤ遺伝子がノックアウトされる宿主株を、ｐＫＤ４６－ＲｅｃＡｐａ組換えプラスミド（ＷＯ２００８／１５３７３１、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）およびアンピシリン耐性のために選択された形質転換体で形質転換した。形質転換細胞株のエレクトロコンピテント細胞を、約０．０５のＯＤ６００で５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地での増殖によって作製し、アラビノースを０．２％に添加して組換え遺伝子発現を誘導し、細胞を中間対数相まで増殖させて、１／２００の元の体積で１０％のグリセロール中で遠心分離および再懸濁にすることによってエレクトロコンピテント細胞を作製した。５μＬのＤｐｎＩ消化精製ＰＣＲ産物を、２５μＬのエレクトロコンピテント細胞にエレクトロポレーションし、その後、１ｍＬのＳＯＣ培地を添加した。細胞を３０℃で２時間増殖させ、２０μｇのカナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上にプレートし、３７℃で一晩増殖させた。個々のｋａｎＲコロニーを、以下に記載されるように、ＳｂｃＤＦおよびＳｂｃＣＲプライマーを使用して、ΔＳｂｃＤＣ：：ｋａｎＲについてスクリーニングした。
配列番号３（ＳｂｃＤＦプライマー）：ｃｇｔｃｔｃｇｃｃａｔｇａｔｔｔｇｃｃｃｔｇ
配列番号４（ＳｂｃＣＲプライマー）：ｃｇｔｔａｔｇｃｇｃｃａｇｃｔｃｃｇｔｇａｇ
宿主：ＳｂｃＤＦおよびＳｂｃＣＲプライマーの産物＝４．８ｋｂ（図１Ｂ）（配列番号６、
Figure 2023517682000008
Figure 2023517682000009
Figure 2023517682000010
）
宿主ΔＳｂｃＤＣ：：ｋａｎＲ：ＳｂｃＤＦおよびＳｂｃＣＲプライマーの産物＝１．９ｋｂ（図１Ｃ）（配列番号７、
Figure 2023517682000011
Figure 2023517682000012
）
温度感受性ｐＫＤ４６－ｒｅｃＡｐａプラスミドを、３７～４２℃で増殖させることによって細胞株からキュアリングした。個々のｋａｎＲコロニーのアンピシリン感受性も検証した。
抗生物質耐性プラスミド（例えば、ｐＵＣ複製起点；抗生物質選択；Ｒ６Ｋ複製起点；抗生物質選択）の宿主株については、記載されているように、ＦＲＴ組換えを使用して、ΔＳｂｃＤＣ：：ｋａｎＲからｋａｎＲ染色体マーカーを除去した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，（上記），２０００）。簡単に述べると、ΔＳｂｃＤＣ：：ｋａｎＲ細胞株を、ｐＣＰ２０ ＦＲＴプラスミド（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，（上記），２０００）および３０℃で増殖させ、アンピシリン耐性について選択した形質転換体で形質転換した。個々のコロニーを（アンピシリンなしで）ＬＢ培地プレート上の単一コロニーについてストリーキングし、４３℃で増殖させて、温度感受性のｐＣＰ２０プラスミドをキュアリングした。４３℃のＬＢプレート上の単一コロニーをＬＢ ａｍｐおよびＬＢ ｋａｎプレート上に画線し、それぞれａｍｐＲ ｐＣＰ２０プラスミドおよびｋａｎＲ切除の損失を検証した。個々のａｍｐおよびｋａｎ感受性コロニーを、ＳｂｃＤＦおよびＳｂｃＣＲプライマーを使用してＰＣＲによってΔＳｂｃＤＣについてスクリーニングした（図１Ｄ）。ＳｂｃＤＦプライマーおよびＳｂｃＣＲプライマーのＰＣＲ産物については、図１Ｄ（配列番号８）に示すように、サイズは０．５３ｋｂであった。
ＤＨ５αについて、出発株は以下の遺伝子型：Ｆ－φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ Δ（ｌａｃＺＹＡ－ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒｋ－，ｍｋ＋）ｇａｌ－ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４ λ－ｔｈｉ－１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１を有していた。ＳｂｃＣＤのノックアウトおよびｋａｎＲ切除後、ノックアウト株（ＤＨ５α［ＳｂｃＣＤ－］）は、以下の遺伝子型：Ｆ－φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ Δ（ｌａｃＺＹＡ－ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒｋ－，ｍｋ＋）ｇａｌ－ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４ λ－ｔｈｉ－１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１ ΔＳｂｃＤＣを有する。
ＷＯ２０１４／０３５４５７に記載されるように、熱誘導性Ｒ６Ｋ Ｒｅｐタンパク質カセット（ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ）を宿主ゲノムに組み込むことにより、ＤＨ５α［ＳｂｃＤ－］から追加の株を産生して、新しい株、ＤＨ５α Ｒ６Ｋ Ｒｅｐ［ＳｂｃＣＤ－］を得て、これは遺伝子型：ＤＨ５α ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ；ΔＳｂｃＤＣを有する。この株は、Ｒ６Ｋ細菌複製起点を有するプラスミドの産生のために使用され得る。
ＲＮＡ－ＯＵＴ選択によるＲ６Ｋ複製起点。さらに、ＷＯ２０１９／１８３２４８に開示される遺伝子型ＤＨ５α ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ；ａｔｔφ８０：：ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ，ｔｅｔＲを有するＮＴＣ１０５０８１１も、ＳｂｃＤＣをノックアウトするのと同じ方法で処理したが、ｋａｎＲ切除せずに、ＤＨ５α ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ；ａｔｔφ８０：：ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ，ｔｅｔＲ ΔＳｂｃＤＣ：：ｋａｎＲ（ＳｂｃＣＤノックアウトコピーカッター宿主株誘導体）の遺伝子型を有するＮＴＣ１３００４４１（ＤＨ５αΔＳｂｃＤＣ）を得た。ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、ｒｅｃＪ、ｕｖｒＣおよびｍｃｒＡに変異を有さないＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ発現カセットの第２のコピーを含むＮＴＣ１０５０８１１の誘導体であるＮＴＣ１０５０８１１－ＨＦもまた、同じ方法によってノックアウト株を生成するために使用して、ｋａｎＲを切除しないＮＴＣ１０５０８１１－ＨＦ［ＳｂｃＣＤ－］を得た。
ＲＮＡ－ＯＵＴ選択によるｐＵＣ複製起点。さらに、ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ発現カセットの第２のコピーを含み、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、ｒｅｃＪ、ｕｖｒＣおよびｍｃｒＡに変異を有さないＷＯ２００８／１５３７３３に開示されているＮＴＣ４８６２の誘導体であるＮＴＣ４８６２－ＨＦを使用して、同じ方法によってノックアウト株を生成し、ｋａｎＲを切除しないＮＴＣ４８６２－ＨＦ［ＳｂｃＣＤ－］を得た。
実施例２：大型パリンドロームベクターを使用したＳｂｃＣＤノックアウト株の性能
ＳｂｃＣＤノックアウト株を、振盪フラスコおよびＨｙｐｅｒＧＲＯ産生の評価を含む、大型パリンドロームベクターを用いた性能について評価した。
ＮＴＣ１０１１６４１（遺伝子型：Ｓｔｂｌ４ ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｌ－Ｆ１０７Ｓ（Ｐ３－）ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ、ＷＯ２０１９／１８３２４８に開示されている）およびＮＴＣ１３００４４１（遺伝子型：ＤＨ５α ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ；ａｔｔφ８０：：ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ，ｔｅｔＲ ΔＳｂｃＤＣ：：ｋａｎＲ）を、Ｒ６Ｋ細菌複製起点およびＲＮＡ－ＯＵＴ選択、ならびにパリンドロームＡＡＶ ＩＴＲおよびｐＡＡＶ－ＧＦＰミニイントロンプラスミド（ｐＡＡＶ－ＧＦＰ ＭＩＰ）を含むスペーサー領域を含むＡＡＶベクターｐＡＡＶ－ＧＦＰ Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄ（商標）（ｐＡＡＶ－ＧＦＰ ＮＰ）、ならびにイントロンＲ６Ｋ細菌複製起点およびＲＮＡ－ＯＵＴ選択、ならびに４塩基対の介在配列を有する１４０塩基対逆向き反復で形質転換した。
Ｌｕ Ｊ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＪＡ，Ｌｕｋｅ Ｊ，Ｚｈａｎｇ Ｆ，Ｃｈｕ Ｋ，ａｎｄ Ｋａｙ ＭＡ．２０１７。ヒト遺伝子療法２８：１２５～３４は、抗生物質フリーのミニイントロンプラスミド（ＭＩＰ）ＡＡＶベクターを開示し、ＭＩＰイントロンＡＡＶベクターは、ベクター骨格を除去して短い骨格ＡＡＶベクターを作製することができることを示唆する。イントロンＲ６Ｋ起点およびＲＮＡ－ＯＵＴ選択マーカー（イントロンＮａｎｏｐｌａｓｍｉｄベクター）を有するミニイントロンプラスミドＡＡＶベクターにおいてミニサークル様スペーサー領域を作製しようとする試みは、ＡＡＶ ＩＴＲ（例えば、ｐＡＡＶ－ＧＦＰ ＭＩＰ；表２を参照）のこのような密接な並置によって、長い１４０ｂｐの逆向き反復を作製したことに起因して、毒性であると推測された。対照的に、ｐＡＡＶ－ＧＦＰ ＭＩＰは、ＤＨ５α ΔＳｂｃＤＣ宿主株において回収可能であり、優れた振盪フラスコ産生収率を有した（表２を参照）。各ＡＡＶ ＩＴＲについて、ＡＡＶ ＩＴＲは、４３ｂｐで分離された２６ｂｐのパリンドローム配列を有した。
Figure 2023517682000013
ＤＨ５α ΔＳｂｃＤＣ宿主株におけるこの生存率回復は、Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄ（商標）ベクターに限定されない。これは、ＤＨ５α ΔＳｂｃＤＣ中の１７塩基対の介在配列を有する８５ｂｐの逆向き反復を含有するｐＵＣ起点ｋａｎＲ選択ＡＡＶヘルパープラスミドの堅牢な増殖およびＨｙｐｅｒＧＲＯプラスミド産生によって実証されるが、ＤＨ５α中では実証されない（表３）。
Figure 2023517682000014
実施例３：ＡＡＶ ＩＴＲベクターを使用したＳｂｃＣＤノックアウト株の性能：ＩＴＲ安定性および振盪フラスコ産生
ＡＡＶ ＩＴＲ含有ベクターを安定化するためのＤＨ５α ΔＳｂｃＤＣ宿主株の適用を、ＡＡＶベクター形質転換細胞株および産生ロットの次世代配列確認によって評価した。
ＡＡＶ ＩＴＲは、従来の配列決定（Ｄｏｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（上記），１９９３）が、次世代配列決定を使用して正確に配列決定することができる（Ｓａｖｅｌｉｅｖ Ａ Ｌｉｕ Ｊ，Ｌｉ Ｍ，Ｈｉｒａｔａ Ｌ，Ｌａｔｓｈａｗ Ｃ，Ｚｈａｎｇ Ｊ，Ｗｉｌｓｏｎ ＪＭ．２０１８．Ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｌａｓｍｉｄ ｂｙ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９：２０１－２１１）。
ＤＨ５α ΔＳｂｃＤＣ宿主株を評価してＡＡＶ ＩＴＲを安定化させるために、２．４～５．４ｋｂの９つの異なるＡＡＶ ＩＴＲ Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄベクターを、ＮＴＣ１０５０８１１－ＨＦ［ＳｂｃＣＤ－］に形質転換した。個々のコロニーを、Ｓｍａｌ消化によってインタクトなＩＴＲについてスクリーニングし、次いで、単一の正しいクローンを、次世代配列決定による完全なプラスミド配列決定のために、Ｍａｓｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＭＧＨ）ＣＣＩＢ ＤＮＡ Ｃｏｒｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）に提出した。結果を以下の表４に要約し、形質転換中のＩＴＲ安定性（Ｓｍａｌ消化によって正しい２５／２６スクリーニングされたコロニー、これらの９／１０（９つのＮａｎｏｐｌａｓｍｉｄベクターの各々の１つ）が、完全なプラスミド配列決定によって正しいことを実証している。ＩＴＲ安定性は、振盪フラスコ内での製造中に維持された（完全なプラスミド配列決定によって５／５調製物が正しい）。これは、ＤＨ５α ΔＳｂｃＤＣ宿主株が形質転換および産生中にＡＡＶ ＩＴＲを安定化することを実証する。
Figure 2023517682000015
次いで、異なる細菌骨格を有する標準化ＧＦＰ ＡＡＶ２ ＥＧＦＰ導入遺伝子ベクターを用いて、ＡＡＶ ＩＴＲ含有ベクター産生を改善するためのＤＨ５α ΔＳｂｃＤＣ宿主株の適用を評価した。
ｐＵＣ起点－抗生物質選択ＡＡＶベクター（表５）；
ｐＵＣ起点－ＲＮＡ－ＯＵＴ選択ＡＡＶベクター（表６）；または
Ｒ６Ｋ起点－ＲＮＡ－ＯＵＴ選択ＡＡＶ Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄベクター（表７）
Figure 2023517682000016
Figure 2023517682000017
Figure 2023517682000018
３つのより大きな４．８～５．２ｋｂのＡＡＶ Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄベクターの追加のパネルを、ＤＨ５α ＳｂｃＣＤ ＮＰ宿主と比較してＳｔｂｌ４で評価した（表８）。ＤＨ５α ＳｂｃＣＤ宿主を用いて、劇的な収率および品質改善が観察された。
Figure 2023517682000019
概要：ＤＨ５α ＳｂＣＤ宿主は、ＡＡＶ ＩＴＲベクターを有するＳｔｂｌ４宿主と比較して、特にＡＡＶ ＩＴＲベクターをコードするより大きな治療用導入遺伝子を有するＳｔｂｌ４宿主と比較して、改善されたプラスミド産生および／またはプラスミドの質を示した（表８）。
実施例４：ＡＡＶ ＩＴＲベクターを使用したＳｂｃＣＤノックアウト株の性能：ＨｙｐｅｒＧＲＯ発酵
次いで、ＤＨ５α ΔＳｂｃＤＣ宿主株の適用がＡＡＶ ＩＴＲ含有ベクター産生を改善することを、Ｓｔｂｌ４ Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄ宿主と比較した、ＤＨ５α ΔＳｂｃＤＣ Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄ宿主における３．３ｋｂのＡＡＶ２ ＥＧＦＰ導入遺伝子Ｒ６Ｋ起点－ＲＮＡ－ＯＵＴマーカーＮａｎｏｐｌａｓｍｉｄベクターｐＡＡＶ－ＧＦＰ Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄ（実施例３の振盪フラスコで評価された）；およびｓｔｂｌ３と比較したＤＨ５α ΔＳｂｃＤＣにおける１２ｋｂのｐＵＣ起点－ｋａｎＲ ＡＡＶベクターを用いたたＨｙｐｅｒＧＲＯ発酵において評価した。結果を、表９および１０に要約する。
Figure 2023517682000020
Figure 2023517682000021
概要：ＤＨ５α ＳｂｃＣＤ宿主は、ＡＡＶ ＩＴＲベクターを有するＳｔｂｌ３またはＳｔｂｌ４宿主と比較して、特にＡＡＶ ＩＴＲベクターをコードするより大きな治療用導入遺伝子を有するＳｔｂｌ３またはＳｔｂｌ４宿主と比較して、改善されたプラスミド産生および／またはプラスミドの質を示した（表１０）。
実施例５：非パリンドローム含有ベクターを使用したＳｂｃＣＤノックアウト株の性能
ＤＨ５α［ＳｂｃＣＤ－］を、標準ベクター（１２ｋｂ ｐＨｅｌｐｅｒベクター、ｐＵＣ起点－ｋａｎＲ選択）の産生収率についてＤＨ５αと比較して評価した。結果は、標準的なプラスミドの産生に関してＤＨ５α［ＳｂｃＣＤ－］がＤＨ５αよりも優れていることを示した。
Figure 2023517682000022
これは、ＳｂｃＣＤノックアウトがパリンドロームを安定させることができるが、パリンドロームを含有しない標準的なプラスミドの収率を改善することは期待されないため、予想外であった。
実施例６：Ｓｔｂｌ４と比較した、ＤＨ５α ＴＳｂｃＤ－１における改善されたプラスミドポリＡ反復安定性
Ａ９０反復をコードするｐＵＣ－ＡｍｐＲプラスミドベクターを、Ｓｔｂｌ４またはＤＨ５α［ＳｂｃＣＤ－］に形質転換し、各形質転換からの４つの個々のコロニーにおけるＡ９０反復の安定性を配列決定によって決定した。Ｓｔｂｌ４コロニーの４つ全てが、少なくとも２０ｂｐｓのＡ９０反復を欠失していた（すなわち、４つのコロニー全てが＜Ａ７０）であったが、ＤＨ５α［ＳｂｃＣＤ－］コロニーは、＞Ａ７０であり、２／４は、無傷のＡ９０反復を有していた。これは、当該技術分野における安定化宿主と比較して、ＤＨ５α［ＳｂｃＣＤ－］が単純な配列反復を安定化することを実証する。これは、ＳｂｃＣＤノックアウトが単純な反復を安定化することが期待されないため、予想外であった。
Ａ１１７反復をコードするプラスミドベクターを、ＤＨ５α［ＳｂｃＣＤ－］およびＮＴＣ１０５０８１１－ＨＦ［ＳｂｃＣＤ－］に形質転換し、配列決定によってＡ１１７反復の安定性を決定した。細胞を３０℃で１２時間培養し、ＯＤが低下するかまたは溶解が観察されるまで２４ＥＦＴで３７℃にランプさせ、その後、実施例４のようにＨｙｐｅｒＧｒｏ条件下で、細胞を２５℃に保持した。形質転換細胞株（２ＤＨ５α［ＳｂｃＣＤ－］、２ＮＴＣ１０５０８１１－ＨＦ［ＳｂｃＣＤ－］）の全ては、以下の表１２に示すように、無傷のＡ１１７反復および高収率を有した。これは、ＳｂｃＣＤノックアウトが単純な反復を安定化することが期待されないため、予想外であった。
Figure 2023517682000023
Ａ９８－１００およびＡ９９－１００反復をコードするプラスミドベクターについて、同じ手順を、ＤＨ５α［ＳｂｃＣＤ－］、ＮＴＣ４８６２－ＨＦ［ＳｂｃＣＤ－］およびＮＴＣ１０５０８１１－ＨＦ［ＳｂｃＣＤ－］で使用した。全ての形質転換細胞株が、無傷の反復を有した。全ての形質転換細胞株は、無傷の反復および高い収率を有した。これは、ＳｂｃＣＤノックアウトが単純な反復を安定化することが期待されないため、予想外であった。
Figure 2023517682000024
実施例７：細胞株
前述の実施例は、ＤＨ１、ＪＭ１０７、ＪＭ１０８、ＪＭ１０９、ＭＧ１６５５、ＸＬ１Ｂｌｕｅおよび同様の細胞株を使用して繰り返してもよく、ＳＵＲＥ、ＳＵＲＥ２、Ｓｔｂｌ２、Ｓｔｂｌ３、Ｓｔｂｌ４および非ＳｂｃＣ、ＳｂｃＤならびに／またはＳｂｃＣＤノックアウト株を使用してもよい。
刊行物、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が、参照により組み込まれることが個別に具体的に示され、その全体が本明細書に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
「含む」、「有する」、「含む」、および「含有する」という用語は、別段の記載がない限り、オープンエンド用語（すなわち、「含むがこれらに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に別段の指示がない限り、単に、範囲内に含まれる各個別の値を個別に参照する簡略法として機能することのみを意図しており、各個別の値は、本明細書に個別に列挙されるかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実行され得る。本明細書に提供される任意のおよび全ての実施例、または例示的な言語（例えば、「例えば」）の使用は、単に本発明をより良く明らかにすることを意図しており、特に別段の請求がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいかなる言語も、任意の請求されていない要素を本発明の実施に不可欠であると示すものとして解釈されるべきではない。
本発明を実施するための発明者に知られている最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態を本明細書で説明する。これらの好ましい実施形態の変形は、前述の説明を読めば当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者がかかる変形を適切に用いることを期待し、本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載される以外の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用される法律によって許可されるように、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙された主題の全ての修正および等価物を含む。さらに、本明細書に別段に示さない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、それらの全ての可能な変形における上述の要素の任意の組み合わせは、本発明によって包含される。

Claims (100)

  1. 操作されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞であって、前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、ＳｂｃＣおよびＳｂｃＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子ノックアウトを含み、前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪのいずれにも操作された生存率または収率低下変異を含まない、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  2. 前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪのいずれにもいかなる操作された変異も含まない、請求項１に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  3. 前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪのいずれにもいかなる変異も含まない、請求項１に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  4. 前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主が、ＳｂｃＣＤ複合体を含まないか、または産生しない、請求項１～３のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  5. 前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主が、機能性ＳｂｃＣＤ複合体を含まない、請求項１～３のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  6. 前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主が、ＳｂｃＣＤ複合体を含み、前記ＳｂｃＣＤ複合体が、非機能性である、請求項１～３のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  7. 前記遺伝子ノックアウトが、ＳｂｃＣのノックアウトを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  8. 前記遺伝子ノックアウトが、ＳｂｃＤのノックアウトを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  9. 前記遺伝子ノックアウトが、ＳｂｃＣおよびＳｂｃＤのノックアウトを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  10. 前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、ＤＨ５α、ＤＨ１、ＪＭ１０７、ＪＭ１０８、ＪＭ１０９、ＭＧ１６５５、およびＸＬ１Ｂｌｕｅからなる群から選択される細胞株に由来する、請求項１～９のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  11. 前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、ゲノム抗生物質耐性マーカーをさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  12. 前記ゲノム抗生物質耐性マーカーが、配列番号２３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１１に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  13. 前記ゲノム抗生物質耐性マーカーが、配列番号３６と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする配列を含むｋａｎＲである、請求項１１に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  14. 前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、ゲノム抗生物質耐性マーカーを含まない、請求項１～１０のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  15. 前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、Ｒｅｐタンパク質依存性プラスミドの培養に好適なＲｅｐタンパク質をさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  16. 前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するゲノム核酸配列をさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  17. 前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号３４、および配列番号３５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＲｅｐタンパク質をコードするゲノム核酸配列をさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  18. 前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号３４、および配列番号３５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するＲｅｐタンパク質をさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  19. 温度感受性ラムダリプレッサーをコードするゲノム核酸配列をさらに含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  20. 前記温度感受性ラムダリプレッサーが、ｃＩＴｓ８５７である、請求項１９に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  21. 前記温度感受性ラムダリプレッサーをコードする前記ゲノム核酸配列が、配列番号２４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項１９に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  22. 前記温度感受性ラムダリプレッサーをコードする前記ゲノム核酸配列が、配列番号３７と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、請求項１９に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  23. 前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、前記温度感受性ラムダリプレッサーを含み、前記温度感受性ラムダリプレッサーが、配列番号３７と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１９に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  24. 前記温度感受性ラムダリプレッサーが、アラビノース誘導性ＣＩＴｓ８５７遺伝子のファージφ８０結合部位染色体組み込みコピーである、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  25. ゲノム発現ＲＮＡ－ＩＮ調節された選択可能マーカーをコードするゲノム核酸配列をさらに含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  26. 前記ゲノム発現ＲＮＡ－ＩＮ調節された選択可能マーカーをコードする前記ゲノム核酸配列が、配列番号２５と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２４に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  27. 前記ＲＮＡ－ＩＮ調節された選択可能マーカーをコードする前記ゲノム核酸配列が、配列番号３８と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする、請求項２４に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  28. 前記ＲＮＡ－ＩＮ調節された選択可能マーカーが、配列番号３８と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項２４に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  29. 以下の遺伝子型：Ｆ－φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ Δ（ｌａｃＺＹＡ－ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒｋ－，ｍｋ＋）ｇａｌ－ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４ λ－ｔｈｉ－１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１ ΔＳｂｃＤＣ：：ｋａｎＲを有する、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  30. 以下の遺伝子型：Ｆ－φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ Δ（ｌａｃＺＹＡ－ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒｋ－，ｍｋ＋）ｇａｌ－ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４ λ－ｔｈｉ－１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１ ΔＳｂｃＤＣを有する、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  31. 以下の遺伝子型：ＤＨ５α ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ；ΔＳｂｃＤＣ：：ｋａｎＲを有する、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  32. 以下の遺伝子型：ＤＨ５α ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ；ΔＳｂｃＤＣを有する、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  33. 以下の遺伝子型：ＤＨ５α ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ；ａｔｔφ８０：：ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｔｅｔＲ；ΔＳｂｃＤＣ：：ｋａｎＲを有する、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  34. 以下の遺伝子型：ＤＨ５α ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ；ａｔｔφ８０：：ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｔｅｔＲ；ΔＳｂｃＤＣを有する、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  35. 以下の遺伝子型：ＤＨ５α ｄｃｍ－ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ；ａｔｔφ８０：：ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｔｅｔＲ；ΔＳｂｃＤＣを有する、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  36. 以下の遺伝子型：ＤＨ５α ｄｃｍ－ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔＨＫ０２２：：ｐＬ（ＯＬ１－Ｇ ｔｏ Ｔ）Ｐ４２Ｌ－Ｐ１０６Ｉ－Ｆ１０７Ｓ Ｐ１１３Ｓ（Ｐ３－），ＳｐｅｃＲ ＳｔｒｅｐＲ；ａｔｔφ８０：：ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｔｅｔＲ；ΔＳｂｃＤＣ：：ｋａｎＲを有する、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  37. 以下の遺伝子型：ＤＨ５α ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔφ８０：：ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｔｅｔＲ；ΔＳｂｃＤＣを有する、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  38. 以下の遺伝子型：ＤＨ５α ａｔｔλ：：Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｃａｔＲ；ａｔｔφ８０：：ｐＡＲＡ－ＣＩ８５７ｔｓ Ｐｃ－ＲＮＡ－ＩＮ－ＳａｃＢ，ｔｅｔＲ；ΔＳｂｃＤＣ：：ｋａｎＲを有する、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  39. 前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒ、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つにおけるいかなる操作された生存率または収率低下変異も含まない、請求項１～３８のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  40. 前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒ、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つにおけるいかなる操作された突然変異も含まない、請求項３９に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  41. 前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒ、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つにおけるいかなる突然変異も含まない、請求項３９に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  42. ｓｂｃＢ遺伝子が、配列番号１１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含み、前記ｒｅｃＢ遺伝子が、配列番号１２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含み、前記ｒｅｃＤ遺伝子が、配列番号１３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含み、前記ｒｅｃＪ遺伝子が、配列番号６５と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  43. ＳｂｃＣおよびＳｂｃＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子ノックアウトを含む、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞であって、前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、それが由来する株に対して同質遺伝子的（ｉｓｏｇｅｎｉｃ）であり、前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が由来する株が、ＤＨ５α、ＤＨ１、ＪＭ１０７、ＪＭ１０８、ＪＭ１０９ＭＧ１６５５およびＸＬ１Ｂｌｕｅからなる群から選択される、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  44. 前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、出発Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に由来し、前記出発Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のｓｂｃＣ遺伝子が、配列番号９と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含み、前記出発Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のｓｂｃＤ遺伝子が、配列番号１０と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１～４３のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  45. ベクターをさらに含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  46. 前記ベクターが、逆向き反復を有する核酸配列を含む、請求項４５に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  47. 前記逆向き反復が、ｔｔｇｇｃｃａｃｔｃｃｃｔｃｔｃｔｇｃｇｃｇｃｔｃｇｃｔｃｇｃｔｃａｃｔｇａｇｇｃｃｇｇｇｃｇａｃｃａａａｇｇｔｃｇｃｃｃｇａｃｇｃｃｃｇｇｇｃｔｔｔｇｃｃｃｇｇｇｃｇｇｃｃｔｃ ａｇｔｇａｇｃｇａｇｃｇａｇｃｇｃｇｃａｇａｇａｇｇｇａｇｔｇｇｃｃａａｃｔｃｃａｔｃａｃｔａｇｇｇｇｔｔｃｃｔおよびａｇｇａａｃｃｃｃｔａｇｔｇａｔｇｇａｇｔｔｇｇｃｃａｃｔｃｃｃｔｃｔｃｔｇｃｇｃｇｃｔｃｇｃｔｃｇｃｔｃａｃｔｇａｇｇｃｃｇｇｇｃｇａｃｃａａａｇｇｔｃｇｃｃｃｇａｃｇｃｃｃｇ ｇｇｃｔｔｔｇｃｃｃｇｇｇｃｇｇｃｃｔｃａｇｔｇａｇｃｇａｇｃｇａｇｃｇｃｇｃａｇａｇａｇｇｇａｇｔｇｇｃｃａａを含むＡＡＶ ＩＴＲを含む、請求項４６に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  48. 前記ベクターが、少なくとも１つの直接反復を有する核酸配列を含む、請求項４５に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  49. 前記少なくとも１つの直接反復が、約４０～約１５０個の連続ヌクレオチド、約６０～１２０個の連続ヌクレオチド、または約９０個の連続ヌクレオチドのポリＡ、ポリＧ、ポリＣまたはポリＴ反復を含む、請求項４８に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  50. 前記ベクターが、少なくとも１つの逆向き反復を有する核酸配列を含む、請求項４５に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  51. 前記ベクターが、パリンドローム、直接反復、または逆向き反復を含まない核酸配列を含む、請求項４５に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  52. 前記ベクターが、ＡＡＶベクターであり、任意選択で、前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ ＩＴＲを含む、請求項４５～５１のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  53. 前記ベクターが、レンチウイルスベクター、レンチウイルスエンベロープベクター、またはレンチウイルスパッケージングベクターである、請求項４５～５１のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  54. 前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レトロウイルスエンベロープベクター、またはレトロウイルスパッケージングベクターである、請求項４５～５１のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  55. 前記ベクターが、ポリＡ反復を含有するｍＲＮＡベクターである、請求項４５～５１のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  56. ベクターが、プラスミドである、請求項４５～５５のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  57. 前記ベクターが、ＲＮＡ選択可能マーカーをさらに含む、請求項４５～５６のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  58. 前記ＲＮＡ選択可能マーカーが、ＲＮＡ－ＯＵＴである、請求項５７に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  59. 前記ＲＮＡ－ＯＵＴが、配列番号４７および配列番号４９からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項５８に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  60. 前記ベクターが、ＲＮＡ－ＯＵＴアンチセンスリプレッサーＲＮＡをさらに含む、請求項５７に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  61. 前記ＲＮＡ－ＯＵＴアンチセンスリプレッサーＲＮＡが、配列番号４８と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項６０に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  62. 前記ベクターが、細菌複製起点をさらに含む、請求項４５～６１のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  63. 前記細菌複製起点が、Ｒ６Ｋ、ｐＵＣ、およびＣｏｌＥ２からなる群から選択される、請求項６２に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  64. 前記細菌複製起点が、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号２２からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される、請求項６３に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  65. 前記ベクターが、Ｒｅｐタンパク質依存性プラスミドである、請求項４５～６４のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  66. 前記ベクターが、（ｉ）目的の遺伝子をコードし、５’および３’の末端を有する真核生物領域配列と、（ｉｉ）前記真核生物領域配列の前記５’および３’の末端を連結し、Ｒ６Ｋ細菌複製起点およびＲＮＡ選択可能マーカーを含む、１０００未満、好ましくは５００未満の長さの塩基対を有するスペーサー領域と、を含むことができる真核生物ｐＵＣフリーミニサークル発現ベクターである、請求項４５～６５のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  67. 前記ベクターが、ＰｏｌＩＩＩ依存性Ｒ６Ｋ複製起点およびＲＮＡ－ＯＵＴ選択可能マーカーを含む骨格であって、１０００ｂｐ未満である骨格と、構造化ＤＮＡ配列を含むインサートと、を有する共有結合閉環状プラスミドである、請求項４５～６５のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  68. 前記構造化ＤＮＡ配列が、逆向き反復配列、直接反復配列、ホモポリマー反復配列、真核生物複製起点、および真核生物プロモーターエンハンサー配列からなる群から選択される、請求項６７に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  69. 前記構造化ＤＮＡ配列が、ポリＡ反復、ＳＶ４０複製起点、ウイルスＬＴＲ、レンチウイルスＬＴＲ、レトロウイルスＬＴＲ、トランスポゾンＩＲ／ＤＲ反復、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンＩＲ／ＤＲ反復、ＡＡＶ ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、およびＳＶ４０エンハンサーからなる群から選択される、請求項６７に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  70. 前記ＰｏｌＩＩＩ依存性Ｒ６Ｋ複製起点が、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、および配列番号６０からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  71. 前記ＲＮＡ－ＯＵＴ選択可能マーカーが、配列番号４７または配列番号４９と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＲＮＡ－ＩＮ調節ＲＮＡ－ＯＵＴ機能性バリアントである、請求項６７～７０のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  72. 前記ＲＮＡ－ＯＵＴアンチセンスリプレッサーＲＮＡが、配列番号４８と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を有し得る、請求項６７～７０のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
  73. 操作されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を産生するための方法であって、
    ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪのいずれにも操作された生存率または収率低下変異を含まない、出発Ｅ．ｃｏｌｉ細胞内のＳｂｃＣおよびＳｂｃＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子をノックアウトして、前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞を得ることを含む、方法。
  74. 前記出発Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪのいずれにもいかなる操作された変異も含まない、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記出発Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪのいずれにもいかなる変異も含まない、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記少なくとも１つの遺伝子をノックアウトするステップが、前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞におけるｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪのいずれにもいかなる変異ももたらさない、請求項７３～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 出発Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒ、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つにおける操作された生存率または収率低下変異を含まない、請求項７３～７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記出発Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒ、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つにおけるいかなる操作された変異も含まない、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記出発Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒ、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つにおけるいかなる変異も含まない、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記少なくとも１つの遺伝子をノックアウトする前記ステップが、ｕｖｒＣ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ－ｈｓｄ－ｍｒｒ、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つにおいていかなる変異ももたらさない、請求項７３～７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. 改善されたベクター産生のための方法であって、
    操作されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞をベクターでトランスフェクトして、トランスフェクトされた宿主細胞を得ることと、
    前記ベクターを複製するのに十分な条件下で前記トランスフェクトされた宿主細胞をインキュベーションすることと、を含み、
    前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、ＳｂｃＣ、ＳｂｃＤ、およびＳｂｃＣＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子ノックアウトを含み、前記宿主細胞が、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪのいずれにも生存率または収率低下変異を含まない、方法。
  82. 前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞が、請求項１～４４のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記操作されたベクターを複製するのに十分な条件下で前記トランスフェクトされた宿主細胞をインキュベートした後に、
    前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞から前記ベクターを単離することをさらに含む、請求項８１または８２に記載の方法。
  84. 前記操作されたベクターを複製するのに十分な条件下で前記トランスフェクトされた宿主細胞をインキュベートする前記ステップが、流加発酵によって行われ、前記流加発酵が、前記流加相の第１の部分の間に低下した温度で、続いて、前記流加相の第２の部分の間により高い温度に温度を上昇させて、前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞を増殖させることを含む、請求項８１～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記低下した温度が、約３０℃である、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記より高い温度が、約３７～４２℃である、請求項８４または８５に記載の方法。
  87. 前記第１の部分が、約１２時間である、請求項８４～８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記第２の部分が、約８時間である、請求項８４～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記操作されたベクターを複製するのに十分な条件下で前記トランスフェクトされた宿主細胞をインキュベートした後の前記プラスミド収率が、同じ条件下で処理された前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞が由来する前記細胞株よりも高い、請求項８４～８８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記操作されたベクターを複製するのに十分な条件下で前記トランスフェクトされた宿主細胞をインキュベートした後の前記プラスミド収率が、同じ条件下で処理されたＳＵＲＥ２、ＳＵＲＥ Ｓｔｂｌ２、Ｓｔｂｌ３、またはＳｔｂｌ４細胞よりも高い、請求項８４～８９のいずれか一項に記載の方法。
  91. 改善されたベクター産生のための方法であって、
    ＳｂｃＣ、ＳｂｃＤ、およびＳｂｃＣＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子ノックアウトを含むトランスフェクトされた宿主細胞を提供することであって、前記トランスフェクトされた宿主細胞が、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＤ、およびｒｅｃＪのいずれにも生存率または収率低下変異を含まず、前記トランスフェクトされた宿主細胞が、ベクターを含む操作されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞である、提供することと、
    前記トランスフェクトされた宿主細胞を、前記ベクターを複製するのに十分な条件下でインキュベートすることと、を含む、方法。
  92. 前記トランスフェクトされた、操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、請求項４５～７２のいずれか一項に記載の操作されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞である、請求項９１に記載の方法。
  93. 前記ベクターを複製するのに十分な条件下で前記トランスフェクトされた宿主細胞をインキュベートした後に、
    前記トランスフェクトされた宿主細胞から前記ベクターを単離することをさらに含む、請求項９１または９２に記載の方法。
  94. 前記操作されたベクターを複製するのに十分な条件下で前記トランスフェクトされた宿主細胞をインキュベートする前記ステップが、流加発酵によって行われ、前記流加発酵が、前記流加相の第１の部分の間に低下した温度で、続いて、前記流加相の第２の部分の間により高い温度に温度を上昇させて、前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞を増殖させることを含む、請求項９１～９３のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記低下した温度が、約３０℃である、請求項９４に記載の方法。
  96. 前記より高い温度が、約３７～４２℃である、請求項９１～９５のいずれか一項に記載の方法。
  97. 前記第１の部分が、約１２時間である、請求項９１～９６のいずれか一項に記載の方法。
  98. 前記第２の部分が、約８時間である、請求項９１～９７のいずれか一項に記載の方法。
  99. 前記操作されたベクターを複製するのに十分な条件下で前記トランスフェクトされた宿主細胞をインキュベートした後の前記プラスミド収率が、同じ条件下で処理された前記操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞が由来する前記細胞株よりも高い、請求項９１～９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記操作されたベクターを複製するのに十分な条件下で前記トランスフェクトされた宿主細胞をインキュベートした後の前記プラスミド収率が、同じ条件下で処理されたＳＵＲＥ２、ＳＵＲＥ、Ｓｔｂｌ２、Ｓｔｂｌ３、またはＳｔｂｌ４細胞よりも高い、請求項９１～９９のいずれか一項に記載の方法。
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