CN110484552A - 无动物源性质粒dna的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种无动物源性质粒DNA的制备方法，包括如下步骤：步骤1，获得无动物源性试剂，包括无动物源性培养基，化学合成的抗生素；步骤2，使用无动物源性培养基制备无动物源的感受态细胞；步骤3，制备无动物源性RNaseA。本发明方法能够为生物医药领域提供无动物源的质粒DNA，更好的满足法规的需求；可以适用大量提取质粒DNA，通过使用自己生产的RNaseA使最终提取的质粒DNA无内毒素及动物源性污染。

Description

无动物源性质粒DNA的制备方法
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种质粒DNA的制备方法，尤其涉及一种无动物源性质粒DNA的制备方法。
背景技术
质粒DNA制备是生物制药领域，特别是抗体药生产过程中必不可少的材料,它的制备处于生物医药产业链的最前端，承载了编码药物蛋白的关键性序列。质粒制备完成后会被转染进入哺乳动物细胞（如CHOK1,HEK293T,NS0等），进而表达相应的抗体或蛋白，因此保证质粒DNA的无动物源性是基因治疗、DNA疫苗和病毒生产以及生物大分子药物生产等领域所必须的。
传统的质粒DNA制备一般分为以下几个步骤：1. 质粒DNA的转化；2. 质粒在大肠杆菌Ecoli中扩增；3. 质粒的分离纯化。目前关于质粒制备的专利主要集中于通过不同的方法来提高质粒纯度或者增加质粒产量，而没有关于生产制备无动物性质粒DNA的方案。
经典的质粒DNA制备方法是使用碱裂解的方法，碱裂解法的原理是利用宿主菌染色体DNA与闭环双链质粒DNA的结构状态的差异来提取质粒DNA。当同时碱变性时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当条件恢复时（酸中和），质粒DNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋分子，而线状DNA则与破裂的细胞壁，细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS(十二烷基磺酸钠)包盖从而形成沉淀被离心除去。该方法由于需要完全的人为操作，抽提得到质粒纯度不高，存在RNA污染，没有去除内毒素等原因主要用于科研用途。
目前已具有商业化的质粒抽提试剂盒，其原理与碱裂解法一致，但通过使用特殊的滤膜来去除内毒素，并通过硅基质吸附柱来纯化质粒DNA，试剂盒能够较快速获得高质量的质粒DNA，但试剂盒中使用RnaseA酶来去除RNA的污染，这些RnaseA都来自于牛胰腺，导致最终纯化得到的质粒DNA也不是无动物源性的，不能满足相关法规的要求。
不论是传统的碱裂解法还是商品化的提取试剂盒，上述两种方法除了在提取过程中引入了动物源性成分，在质粒转化和大肠感觉培养过程中也都使用了动物源性的培养基、固体平板、抗生素等，导致纯化得到的质粒DNA完全达不到生物医药领域无动物源的要求。
中国发明专利申请CN201510529938公开了一种质粒DNA提取方法，主要用于科研用途，缺点如下：
1、该方法适用于小量提取质粒DNA,每次提取的菌液量为3-4 ml；
2、提取的质粒未去除内毒素；
3、该方法提取的质粒DNA不是无动物源性的，因为中间使用了普通的抗生素、培养基和RNaseA,该方法获得的质粒DNA无法满足生物医药领域无动物源的需求。
目前国内没有无动物源质粒制备的技术和平台，而在生物医药领域，FDA和中国生物制品申报资料中均要求使用原料的无动物源性。因此，本领域亟需研发一种无动物源性质粒DNA的制备方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种无动物源性质粒DNA的制备方法，该方法可以适用大量提取质粒DNA，使最终提取的质粒DNA无内毒素及动物源性污染。
质粒的制备具有多个步骤，且在该过程中涉及多种试剂使用。要制备无动物源性质粒DNA，需要将该过程所涉及的试剂和材料全部使用无动物源性。其中，大肠杆菌培养涉及的试剂有抗生素，无动物源性液体培养基和固体平板，以及无动物源性的感受态细胞。质粒DNA提取过程中需要无动物源性的RnaseA。上述这些试剂和材料需要确认均无动物源性，而无动物源性感受态细胞无商业化生产，需要制定方法并测定效率。无动物源性的RnaseA也需要设计方案在Ecoli中表达和纯化，并测定有无酶活。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种无动物源性质粒DNA的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，获得无动物源性试剂，包括无动物源性培养基，化学合成的抗生素；
步骤2，使用无动物源性培养基制备无动物源的感受态细胞；
步骤3，制备无动物源性RNaseA。
作为本发明优选的技术方案，步骤1和步骤2中，所述无动物源性培养基为无动物源LB液体培养基或无动物源固体LB培养基；所述无动物源LB液体培养基由以下重量份原料组成：10份大豆蛋白胨，5份酵母粉，10份NaCl；LB液体培养基加入10 M NaOH 调至pH 7.0-7.2，高压除菌即得；所述无动物源固体LB培养基采用如下方法制得: 向上述无动物源LB液体培养基加入琼脂，高压除菌。
作为本发明优选的技术方案，步骤2具体包括如下步骤：
第1步，用无动物源固体LB培养基取感受态细胞进行划线，37°C培养16-20 h；
第2步，挑取单菌落到无动物源LB液体培养基中，37°C摇床过夜培养；
第3步，取过夜菌液加入到无动物源LB液体培养基中，37°C摇床培养，使菌液OD600nm为0.3-0.6；
第4步，将菌液转移到BD管中，冰上放置10 min；
第5步，4°C，离心10 min倒出培养液，倒置1 min；
第6步，用0.1M CaCl2-MgCl2溶液重悬细胞沉淀，冰上放置30 min；
第7步，4°C，离心5 min倒出培养液，倒置1 min；
第8步，用预冷0.1M CaCl2-15%甘油重悬细胞沉淀，将其按100µL/管分装到灭菌EP管中，分装后得到无动物源性感受态细胞，立即放入液氮中，最后冻存于-80°C；
第9步，感受态细胞获得后测定无动物源性感受态细胞的效价。
作为本发明优选的技术方案，第2步中，所述37°C摇床过夜培养，摇床的转速为220rpm。
作为本发明优选的技术方案，第3步中，所述37°C摇床培养，摇床的转速为280rpm；所述使菌液OD600nm 为0.4。
作为本发明优选的技术方案，第5步和第7步中，所述离心速度为4000 rpm。
作为本发明优选的技术方案，步骤3具体包括如下步骤：
步骤A，构建RNaseA表达载体；
步骤B，将质粒在Ecoli 菌株中转化进行表达；
步骤C，纯化获得RNaseA；
步骤D，验证RNaseA酶的活性。
作为本发明优选的技术方案，步骤A中，采用特异的信号肽来介导该RNaseA的表达，所述特异的信号肽的序列如SEQ ID NO:1所示；所述RNaseA表达载体的序列如SEQ IDNO:2所示, RNaseA的理论分子量为15357.0612。
作为本发明优选的技术方案，步骤C中，通过镍柱和重力柱两步纯化后获得RNaseA。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、能够为生物医药领域提供无动物源的质粒DNA，更好的满足法规的需求；
2、能够为后续病毒包装，基因治疗提供强有力的支撑；
3、低成本，高标准，提供公司竞争力；
本发明与中国发明专利申请CN201510529938的区别在于：
1、本发明方法使用了无动物源性的抗生素和培养基；
2、本发明提取方法使用了MN 试剂盒中的溶液,通过滤膜将内毒素去除，且通过使用自己生产的RNaseA使最终提取的质粒DNA无内毒素及动物源性污染。
附图说明
图1为本发明实施例1中无动物源性感受态细胞效价测定结果示意图；其中，Negative control代表未进行质粒转化的感受态直接涂板，无菌落生长说明感受态细胞无污染；Made by WuXi代表使用本发明方法获得的感受态细胞质粒转化后的结果。
图2是本发明实施例2中RNaseA酶活性测定结果示意图；其中，M代表DNA marker；1代表质粒: 提取时未加RNaseA；2代表质粒: 提取时加入100ug/ml商品化有动物源性RNaseA；3代表质粒: 提取时加入20ug/ml 该方法制备的无动物源性RNaseA；4代表质粒:提取时加入50ug/ml该方法制备的无动物源性RNaseA。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特列举以下具体实施例详细说明。然而，具体实施例仅仅是用于举例说明，而不是对本发明的限制。
实施例所用材料：
整个过程必须使用无动物源性试剂，包括植物性培养基，化学合成的抗生素。
1、植物性培养基即无动物源培养基，包括无动物源LB液体培养基和无动物源固体LB培养基
试剂配置：
A无动物源LB液体培养基：（1L pH 7.0-7.2)
大豆蛋白胨 10g
酵母粉 5g
NaCl 10g
每1L无动物源LB液体培养基加入10 M NaOH 200 µL调至pH 7.0-7.2，高压除菌。
B无动物源固体LB培养基: 向1L无动物源LB液体培养基加入琼脂15g，高压除菌。
2、化学合成的氨苄抗生素于Sigma购买,货号为A9578。将氨苄抗生素溶解于无菌水中，浓度为50mg/ml,然后使用0.22μm滤膜进行过滤除菌，使用时工作浓度为50μg/ml。
实施例1 无动物源性感受态细胞的制备
需要建立方法制备无动物源的感受态细胞。具体技术方法如下：
1.取感受态细胞进行划线（选择无动物源的LB平板），37°C培养16-20 h；
2.挑取单菌落到5 mL无动物源LB培养液中，37°C 220 rpm摇床过夜培养；
3.取1mL过夜菌液加入到100 mL无动物源LB培养液中，37°C 280 rpm摇床培养，使菌液OD600nm 为0.4（最佳），适宜范围在0.3-0.6，）
4.将菌液转移到2个50 mL BD管中，冰上放置10 min；
5.4°C，4000 rpm，10 min倒出培养液，倒置1 min；
6.用0.1M CaCl2-MgCl2（80mmol/L MgCl2，20mmol/L CaCl2）溶液30mL重悬细胞沉淀，冰上放置30 min；
7.4°C，4000 rpm，5 min倒出培养液，倒置1 min；
8.用2 mL预冷0.1M CaCl2-15%甘油重悬细胞沉淀，将其按100µL/管分装到灭菌EP管中，分装后得到无动物源性感受态细胞，立即放入液氮中，最后冻存于-80°C。
9.感受态细胞获得后测定无动物源性感受态细胞的效价。
按照上述技术方法进行无动物源性感受态细胞的制备，制备完成后，取1ng质粒进行转化，和未转化板（仅感受态细胞）过夜培养，然后统计菌落数目，在转化过程中使用的固体平板加入了50μg/ml的化学合成的氨苄抗生素。如图1显示： 未转化板（Negativecontrol）无任何菌落产生，说明制作的感受态细胞无任何污染；1ng质粒转化平板（Made byWuXi）共有120个转化子产生，所以该次无动物源感受态细胞的效价为1.2x105 Cfu/μg。
实施例2 无动物源性RNaseA的制备及效率测定
一、设计并表达纯化重组RNaseA
首先要构建RNaseA表达载体，在Ecoli 菌株中进行表达，然后纯化获得RNaseA，并验证RNaseA酶的活性。具体技术方案如下：
1.构建RNaseA表达载体，序列如下：（下划线部分为信号肽phoA，斜体粗体部分为His-Tag序列）RNaseA理论分子量为15357.0612。
MKQSTIALALLPLLFTPVTKAKETAAAKFERQHMDSSTSAASSSNYCNQMMKSRNLTKD
RCKPVNTFVHESLADVQAVCSQKNVACKNGQTNCYQSYSTMSITDCRETGSSKYPNCAY
KTTQANKHIIVACEGNPYVPVHFDASVENLYFQGHHHHHH（如SEQ ID NO:2所示）
我们使用了特异的信号肽MKQSTIALALLPLLFTPVTKA（如SEQ ID NO:1所示）来介导该酶的表达。
2.将质粒在Ecoli中转化进行表达，通过镍柱和重力柱两步纯化后获得RNaseA。
3.纯化后的RNaseA经过MS 质谱验证和SDS-PAGE验证大小是否正确及纯度。
4.纯化得到的RNaseA进行酶活性测定。
二、无动物源性RNaseA的效率测定
按照上述方法进行RNaseA的表达和纯化，然后进行酶活性的测定，方法如下：
分别使用商品化的RNaseA（100μg/mL），按照本发明方法生产的无动物源性RNaseA（20μg/mL）；（50μg/mL）加入质粒提取溶液I(来自MN试剂盒)中进行质粒DNA制备，未加RNaseA作为对照组。
如图2显示：第1列未加RNaseA提取得到的质粒，具有明显的RNA污染；第2列使用商品化有动物源性的RNaseA（100μg/mL）获得的质粒无任何RNA；使用本发明方法获得的RNaseA（20μg/mL，第3列）和（50μg/mL，第4列）均可以有效去除RNA。
以上实验数据表明，本发明方法得到的RNaseA具有高活性，是商品化活性的5倍以上（如图2所示，本发明方法产生的RNaseA 20ug/ml(第3列)能够达到和商品化RNaseA100ug/ml(第2列)一致的效果），并且来源清晰，无任何动物源性。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。
序列表
<110>上海药明生物技术有限公司
<120>无动物源性质粒DNA的制备方法
<130> WH-NP-19-100253
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(未知)
<400> 1
MKQSTIALAL LPLLFTPVTK A 21
<210> 2
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列(未知)
<400> 2
MKQSTIALAL LPLLFTPVTK AKETAAAKFE RQHMDSSTSA ASSSNYCNQM MKSRNLTKDR 60
CKPVNTFVHE SLADVQAVCS QKNVACKNGQ TNCYQSYSTM SITDCRETGS SKYPNCAYKT 120
TQANKHIIVA CEGNPYVPVH FDASVENLYF QGHHHHHH 158

Claims (9)

1.一种无动物源性质粒DNA的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，获得无动物源性试剂，包括无动物源性培养基，化学合成的抗生素；
步骤2，使用无动物源性培养基制备无动物源的感受态细胞；
步骤3，制备无动物源性RNaseA。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1和步骤2中，所述无动物源性培养基为无动物源LB液体培养基和无动物源固体LB培养基；所述无动物源LB液体培养基由以下重量份原料组成：10份大豆蛋白胨，5份酵母粉，10份NaCl；LB液体培养基加入10 M NaOH 调至pH7.0-7.2，高压除菌即得；所述无动物源固体LB培养基采用如下方法制得: 向上述无动物源LB液体培养基加入琼脂，高压除菌。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2具体包括如下步骤：
第1步，用无动物源固体LB培养基取感受态细胞进行划线，37°C培养16-20 h；
第2步，挑取单菌落到无动物源LB液体培养基中，37°C摇床过夜培养；
第3步，取过夜菌液加入到无动物源LB液体培养基中，37°C摇床培养，使菌液OD600nm为0.3-0.6；
第4步，将菌液转移到BD管中，冰上放置10 min；
第5步，4°C，离心10 min倒出培养液，倒置1 min；
第6步，用0.1M CaCl2-MgCl2溶液重悬细胞沉淀，冰上放置30 min；
第7步，4°C，离心5 min倒出培养液，倒置1 min；
第8步，用预冷0.1M CaCl2-15%甘油重悬细胞沉淀，将其按100µL/管分装到灭菌EP管中，分装后得到无动物源性感受态细胞，立即放入液氮中，最后冻存于-80°C；
第9步，感受态细胞获得后测定无动物源性感受态细胞的效价。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，第2步中，所述37°C摇床过夜培养，摇床的转速为220 rpm。
5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，第3步中，所述37°C摇床培养，摇床的转速为280 rpm；所述使菌液OD600nm 为0.4。
6. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，第5步和第7步中，所述离心速度为4000rpm。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3具体包括如下步骤：
步骤A，构建RNaseA表达载体；
步骤B，将质粒在Ecoli 菌株中转化进行表达；
步骤C，纯化获得RNaseA；
步骤D，验证RNaseA酶的活性。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤A中，采用特异的信号肽来介导该RNaseA的表达，所述特异的信号肽的序列如SEQ ID NO:1所示；所述RNaseA表达载体的序列如SEQ ID NO:2所示, RNaseA的理论分子量为15357.0612。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤C中，通过镍柱和重力柱两步纯化后获得RNaseA。
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