CN115161262A

CN115161262A - 一种硫酸葡聚糖用来培养cho细胞系细胞的基础培养基当中的新应用

Info

Publication number: CN115161262A
Application number: CN202210962008.0A
Authority: CN
Inventors: 王龙; 朱冠臣; 王猛
Original assignee: Wuxi Duoning Biotechnology Co ltd
Current assignee: Wuxi Duoning Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-08-11
Filing date: 2022-08-11
Publication date: 2022-10-11

Abstract

本发明公开了一种在用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的新应用，所述硫酸葡聚糖(DS)与精胺(SPM)添加入培养基中促进CHO细胞系细胞的生长；本发明可以在下游生产过程中在不影响培养基对细胞生长和表达的作用下解决溶解度问题，降低企业生产成本；另外DS在细胞培养中可以减少细胞聚集，促进CHO细胞生长，提高活率以及重组蛋白产量。

Description

一种硫酸葡聚糖用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的新应用

技术领域

本发明涉及生物细胞培养基技术领域，尤其涉及一种硫酸葡聚糖用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的新应用。

背景技术

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是重组治疗性蛋白(RTP)生产的首选表达系统，目前近70％的RTP由CHO细胞生成。特别是，CHO细胞用于生产重组治疗性蛋白和单克隆抗体(mAb)，如阿达木单抗、贝洛托单抗等。最早的动物源性细胞培养物中使用的培养基由血清(人或者胎牛)，血浆或者组织提取物营养样的组件，其过程复杂且成分不明确，易增加污染风险，普通CHO细胞培养通常需要10％胎牛血清，这会增加污染风险，不利于下游工艺中的蛋白纯化。因此，用于CHO培养的无血清培养基(SFM)是RTP生产所必需的。

不添加血清的情况下，培养基含有碳水化合物，氨基酸，维生素，微量金属和盐。这些组分在细胞生长中发挥关键作用。胰岛素，化学定义的脂质等蛋白质甚至于也通常是培养基的一部分。多胺是生物体代谢过程中产生的小分子脂肪族含氮碱，是腐胺，亚精胺，精胺和尸胺等的总称，它们广泛的参与细胞的基础代谢。精胺作为多胺的一种，在成分限定的培养基中起到提高表达支持细胞高密度生长的作用。精胺可以特异性的激活两种分裂原促蛋白激酶：水杨酸诱导性蛋白激酶和损伤诱导性蛋白激酶的活性。这一激活过程与线粒体功能的紊乱有关，并且依赖活性氧自由基的产生和Ca2+的外流，因为这种激活作用可以被抗氧化剂，多胺氧化酶抑制剂和Ca2+通道阻断剂所阻止。这两种基因蛋白酶主要参与防御基因的激活和抑制细胞凋亡作用。在生理PH条件下，精胺多为多聚阳离子，容易与细胞中的多聚阴离子如DNA，RNA，酸性磷脂，酸性蛋白质和细胞壁组分相结合，因此精胺在成分限定培养基中对细胞影响主要体现在调节酶蛋白，翻译转录以及细胞代谢水平的调节上。

硫酸葡聚糖(DS)是一种抗凝血剂、抗病毒药物和佐剂。硫酸葡聚糖可以通过减少细胞聚集，促进CHO细胞生长、提高活率以及重组蛋白产量。研究发现硫酸葡聚糖也具有抗凋亡特性，可以延长发生自噬的CHO细胞存活。硫酸葡聚糖可以通过降低星形孢菌素诱导的线粒体跨膜电位的破坏，来防止星形孢菌素处理过的CHO细胞凋亡。此外，硫酸葡聚糖也能减少释放到细胞质中的细胞色素C的量，抑制caspase-9前体和caspase-3前体。硫酸葡聚糖通过线粒体途径抑制CHO细胞的凋亡，未涉及caspase-8的活化。硫酸葡聚糖的抗凋亡作用是非特异性的，因为硫酸葡聚糖可同时减少细胞色素C释放入细胞质和线粒体跨膜电位破坏。预测硫酸葡聚糖在典型的细胞培养条件下也可能显示抗凋亡作用，其中凋亡因素可以是氧化应激，渗透压应激，代谢副产物积累以及营养或生长因子耗竭。

研究发现硫酸葡聚糖与精胺共同存在于同一种化学限定培养基时如果硫酸葡聚糖浓度过高会产生浊度过高，甚至沉淀现象，这大大影响成分限定培养基功效。并且在下游生产过程中掌握不好两者比例将产生严重的经济效益损失。

发明内容

本发明提供了一种硫酸葡聚糖用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的新应用，以解决现有技术的上述问题。

本发明的方案是：

一种硫酸葡聚糖与精胺联合添加用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的新应用，所述硫酸葡聚糖添加入培养基中促进CHO细胞系细胞的生长。

作为优选的技术方案，所述硫酸葡聚糖与精胺替换所述CHO细胞系细胞的基础培养基中的精胺使用。

作为优选的技术方案，CHO细胞系细胞包括CHO-K1、CHO-1、CHO-2、CHO-3、CHO-4与CHO-5。

本发明还公开了一种用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基，所述基础培养基中用来作为促进细胞生长的营养物质为硫酸葡聚糖。

作为优选的技术方案，促进细胞生长的营养物质还包括精胺。

作为优选的技术方案，所述促进细胞生长的营养物质包括硫酸葡聚糖与所述精胺，所述硫酸葡聚糖与所述精胺的浓度比为7～8.5:1。

由于采用了上述技术方案一种在用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的新应用，所述硫酸葡聚糖添加入培养基中促进CHO细胞系细胞的生长。

本发明的优点：

解决了精胺与DS在基础培养基中的溶解度问题，并且发现精胺与DS在培养基中存在最适比例，DS可以适当增加浓度而对培养基浊度没有影响，因此发明可以在下游生产过程中在不影响培养基对细胞生长和表达的作用下降低企业生产成本。另外DS在细胞培养中可以减少细胞聚集，促进CHO细胞生长，提高活率以及重组蛋白产量。

具体实施方式

为了弥补以上不足，本发明提供了一种在用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的新应用以解决上述背景技术中的问题。

所述硫酸葡聚糖与精胺联合替换所述CHO细胞系细胞的基础培养基中的精胺使用。

CHO细胞系细胞包括CHO-K1、CHO-1、CHO-2、CHO-3、CHO-4与CHO-5。

促进细胞生长的营养物质还包括精胺。

所述促进细胞生长的营养物质包括硫酸葡聚糖与所述精胺，所述硫酸葡聚糖与所述精胺的浓度比为7～8.5:1。

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：

配置溶解多宁自主开发的商用基础培养基Highpro-200液体，基础培养基包含氨基酸,无机盐，C源,缓冲buffer,DS；不含水溶性维生素，微量元素等。然后依次添加可能发生沉淀的11种物质(1.对氨基苯甲酸2.生物素3.泛酸钙4.叶酸5.烟酰胺6.吡哆醇7.核黄素8.硫胺素9.硫辛酸10.腐胺11.精胺)，判断何种物质发生反应。

实验方式：普通实验

实验程序:依次添加11种物质，搅拌5分钟，记录浊度。

实验环境：室温

实验过程：在磁力搅拌机上准备1个烧杯，配置好不含11种需要添加物质的Highpro-200液体，搅拌至完全溶解。记录此时液体培养基浊度为0.03.依次添加提前配置好的1-11号物质液体，11号物质为精胺，每个物质添加之后搅拌5分钟然后记录浊度，实验结果如下表所示：

注：1至11号物质依次添加。

实施例2：

通过实施例1确定1-10号物质无明显浊度影响，11号物质精胺加入后浊度大幅度上升超过合理范围，可确定此时精胺与DS发生反应。为排除不是其它10种物质与精胺交互影响，此次实验单独添加11种物质。

实验方式：：普通实验

实验程序：单独添加11种物质，每个搅拌5分钟，记录浊度。

实验环境：室温

实验过程：准备11个烧杯，每个烧杯里准备好相应浓度的DS,按序摆放在磁力搅拌器上，记录此时的每个烧杯中的浓度为0.03.单独添加11种物质，搅拌5分钟，然后记录浊度。结果如下表所示：

注：1至11号物质单独添加。

实施例3：

通过实施例2确定精胺与DS独立发生反应，因此本实施例需确定反应条件。在此选择PH和温度。

在室温下测试PH不同对溶解度的影响，分别为原始PH下，酸性条件下和碱性条件下。记录浊度，结果如下

PH	NTU
		5.82	22
6.69(原始)	15.6
		7.94	11.9
8.28	6.21
		8.53	1.51
8.61	1.08
		8.7	0.97

结果表明，精胺与DS反应形成沉淀的PH环境条件需要在中性或者偏酸条件下进行，碱性条件反应减慢甚至终止。

在原始PH下测试不同温度对溶解度的影响，记录浊度结果如下:

结果表明加热可以使沉淀物分解。

实施例4：

以上3个实施案例可以表明精胺与DS在中性或酸性条件下发生反应，且此沉淀物可以通过加热溶解，且过程不可逆。本案例则需要探寻精胺与DS在培养基中的具体比例。

原始比例：DS：精胺＝6.25：1

实验结果表明，当DS与精胺比例在8：1时，浊度在合理范围内；当DS与精胺比例小于7：1时，浊度逐渐上升，超过合理范围。

因此，二者反应存在比例形式。

实施例5：

以上四个案例确定DS与精胺在培养基中具体浓度比例，本案例探究培养基中DS和精胺浓度调整前后对细胞生长以及最终蛋白产量的影响。选取CHO-K1细胞进行细胞实验，培养方式是流加培养(Fed-batch)，选用多宁自主开发的商用基础培养基(Media C)，且对DS和精胺进行浓度调整,记为Media C(浓度调整前)，Media C(浓度调整后)，补料选用多宁自主开发的补料培养基Feed 2+Feed B2。实验方式：流加培养(Fed-batch)

实验程序：在细胞培养至对数生长中期进行补料，到Day 13全部收获。

摇床培养环境：37℃，5％二氧化碳，110rpm

摇瓶培养过程：在超净工作台向两个125mL摇瓶中加入已过滤好的无菌的基础培养基，分别记为1号(浓度调整前)2号(浓度调整后)，接种密度为5×10⁵细胞/mL，细胞活率为98.13％，培养体积为30mL。补料策略采用隔天补料，补料量为3％+0.3％，从Day 3天开始，Day 11最后一次补料。

培养结果：

注：培养过程分别在Day 3，5,7,9,11测定并将葡糖糖补至8g/L。

实验结果表明，在CHO-K1细胞上，基础培养基Media C中DS与精胺的比例调整不会影响细胞的生长，且对最终的蛋白产量有一定程度上的促进作用。

实施例6：

通过实施例5确定DS与精胺浓度调整不会影响细胞生长且对最终蛋白产量有促进作用。本案例探究该浓度比例调整对不同细胞系的影响。选用五种不同的CHO细胞系(其中包括CHOK-1)，分别命名为CHO-1，CHO-2，CHO-3，CHO-4，CHO-5。培养方式是流加培养(fed-batch)，选用浓度调整后多宁自主开发的商用基础培养基Media C，补料选用多宁自主开发的补料培养基Feed 2+feed B2。

实验方式：流加培养(Fed-batch)

摇床培养环境：37℃，5％二氧化碳，110rpm

摇瓶培养过程：在超净台内向10个125mL摇瓶内加入已无菌过滤好的基础培养基，接种密度为5×10⁵细胞/ml，培养体积为30ml，培养至第3天计数：活细胞密度为30.05×10⁵细胞/ml，细胞活率为97.67％。摇瓶序号从1-10标记，1-5号为不同细胞系的空白组，采用浓度调整前的基础培养基，6-10是采用DS和精胺浓度比例调整后的基础培养基，从6-10分别选用CHO 1-5细胞。补料策略采用隔天补料，补料量为3％+0.3％，从Day 3天开始，Day 11最后一次补料。

实验结果：

注：培养过程分别在Day 3，5,7,9,11测定并将葡糖糖补至8g/L。

实验结果表明，基础培养基Media C中DS与精胺的浓度比例调整，对细胞生长无明显影响，且对最终蛋白产量有促进作用，并且在各细胞上具有普适性。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.一种硫酸葡聚糖与精胺联合用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的新应用，其特征在于：所述硫酸葡聚糖添加入培养基中促进CHO细胞系细胞的生长。

2.如权利要求1所述硫酸葡聚糖与精胺用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的新应用，其特征在于：所述硫酸葡聚糖与精胺联合替换所述CHO细胞系细胞的基础培养基中的精胺使用。

3.如权利要求1或2所述硫酸葡聚糖与精胺联合用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的新应用，其特征在于：CHO细胞系细胞包括CHO-K1、CHO-1、CHO-2、CHO-3、CHO-4与CHO-5。

4.一种如权利要求1所述的用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基，其特征在于：所述基础培养基中用来作为促进细胞生长的营养物质为硫酸葡聚糖。

5.如权利要求4所述的一种用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基，其特征在于：促进细胞生长的营养物质还包括精胺。

6.如权利要求4所述的一种用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基，其特征在于：所述促进细胞生长的营养物质包括硫酸葡聚糖与所述精胺，所述硫酸葡聚糖与所述精胺的浓度比为7～8.5:1。