CN110713980B - 一种组织培养体系及其在动物脑组织培养中的应用 - Google Patents
一种组织培养体系及其在动物脑组织培养中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110713980B CN110713980B CN201911049124.8A CN201911049124A CN110713980B CN 110713980 B CN110713980 B CN 110713980B CN 201911049124 A CN201911049124 A CN 201911049124A CN 110713980 B CN110713980 B CN 110713980B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture
- percent
- culture system
- tissue
- animal brain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/34—Sugars
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种组织培养体系，本发明中的组织培养体系主要用于动物脑组织的培养，包括以下体积百分比的组分：BME基础培养基23～26％，MEM基础培养基0.8～1.2％，Neurobasal基础培养基44～46％，马血清24～26％，B27无血清添加剂1～1.5％，葡萄糖糖液1.2～1.5％，谷氨酸0.8～1.2％和双抗0.8～1.2％。采用本发明的培养体系，可使动物脑组织在体外长期培养，可为癫痫、脑神经发育及多种退行性神经疾病研究提供研究模型。
Description
技术领域
本发明属组织培养于技术领域，具体涉及一种组织培养体系以及该培养体系在动物脑组织培养中的应用。
背景技术
1970年和1972年，Wolf和Hauw等第一次发表小脑组织培养的研究。1971年，Boyd报告了详细的组织培养技术，并在细胞培养玻片大量培养组织。1973年，Ansevin和Lipps改进此方法，可在组织培养板中培养组织。1981年至2001年
和Victorov研究组利用一种称为roller tube技术培养脑组织。1991年，Stoppini等利用半透膜培养脑组织。但是现有技术中还没有关于脑神经发育及多种退行性神经疾病研究模型专用培养基的记载。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种新组织培养体系，为动物脑组织在体外长期培养，脑神经发育及多种退行性神经疾病研究模型提供一套支撑体系。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种组织培养体系，包括以下体积百分比的组分：
BME基础培养基23～26％，MEM基础培养基0.8～1.2％，Neurobasal基础培养基44～46％，马血清24～26％，B27无血清添加剂1～1.5％，葡萄糖糖液1.2～1.5％，谷氨酸0.8～1.2％和双抗0.8～1.2％。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，本发明中的组织培养体系，包括以下体积百分比的组分：
BME基础培养基25％，MEM基础培养基1％，Neurobasal基础培养基45％，马血清25％，B27无血清添加剂1％，葡萄糖糖液1％，谷氨酸1％和双抗1％。
本发明中的组织培养基主要用于动物脑组织培养，进行动物脑组织培养时，具体操作如下：
S1：用组织切片机将动物脑组织切割成厚度为100～450μm的切片；
S2：将动物脑组织切片放入膜插件后，放入组织培养体系中培养；每两天更换一次组织培养体系；培养在37℃、5％CO2条件下进行。
本发明的有益效果是：采用本发明的培养体系，可使动物脑组织在体外长期培养，可以为癫痫、脑神经发育及多种退行性神经疾病研究模型制备提供新的途径。
附图说明
图1为动物脑组织用培养体系一体外培养28天后的神经轴突和髓鞘化免疫荧光图片；
图2为动物脑组织用培养体系一体外培养15天后制备的神经轴突脱髓鞘模型免疫荧光的图片；
图3为动物脑组织用培养体系一体外培养28天后的小胶质细胞免疫荧光图片；
图4为动物脑组织用培养体系一体外培养15天后制备的神经轴突脱髓鞘模型中小胶质细胞免疫荧光的图片；
图5为动物脑组织用培养体系四体外培养28天后的神经轴突和髓鞘化免疫荧光图片；
图6为动物脑组织用培养体系四体外培养15天后的神经轴突和髓鞘化免疫荧光图片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。1.本发明中所用MEM培养基的成分如表1所示：
表1 MEM培养基成分表
| 成分 | 含量(mg/L) |
| 氯化钙 | 200 |
| 氯化钾 | 400 |
| 无水硫酸镁 | 97.67 |
| 氯化钠 | 6800 |
| 无水磷酸二氢钠 | 121.74 |
| L-精氨酸盐酸盐 | 126 |
| L-胱氨酸盐酸盐 | 31.29 |
| L-谷氨酰胺 | 292 |
| L-组氨酸盐酸盐 | 42 |
| L-异亮氨酸 | 52 |
| L-亮氨酸 | 52 |
| L-赖氨酸盐酸盐 | 72.5 |
| L-蛋氨酸 | 15 |
| L-苯丙氨酸 | 32 |
| L-苏氨酸 | 48 |
| L-色氨酸 | 10 |
| L-络氨酸 | 36 |
| L-缬氨酸 | 46 |
| D-葡萄糖 | 1000 |
| 酚红 | 10 |
| D-泛酸钙 | 1 |
| 氯化胆碱 | 1 |
| 叶酸 | 1 |
| i-肌醇 | 2 |
| 烟酰胺 | 1 |
| 盐酸吡哆醛 | 1 |
| 核黄素 | 0.1 |
| 盐酸硫胺 | 1 |
| pH | 5.9±0.3 |
| 渗透压 | 250±5％ |
2.本发明中所用BME培养基的成分如表2所示：
表2 BME培养基成分表
3.本发明中所用BME培养基的成分如表3所示：
表2 BME培养基成分表
4.本发明中所用双抗为含有青霉素(10000IU)和链霉素(10000μg/mL)在100倍的工作浓度的混合液；其配制方法如下：
用20mL空针抽16mL三蒸水，溶160万单位/瓶的青霉素G钠一支，过滤除菌；用10mL空针抽10mL三蒸水，溶一支100万单位/瓶的硫酸链霉素一支，过滤除菌。双抗浓度：青霉素G钠，100～1000U/mL；硫酸链霉素，100～1000μg/mL(100万单位＝1g)。
5.马血清、B27无血清添加剂、葡萄糖糖液和谷氨酸为商品化试剂。
实施例一：配制培养体系
取BME基础培养基、MEM基础培养基、Neurobasal基础培养基、马血清、B27无血清添加剂、葡萄糖糖液、谷氨酸和双抗，将它们按表4中的体积配比进行混合，得到不同的培养体系。
表4不同培养体系的组成
| 培养体系一 | 培养体系二 | 培养体系三 | 培养体系四 | |
| BME基础培养基 | 25 | 24 | 26 | 24 |
| MEM基础培养基 | 1 | 1.2 | 0.8 | 49 |
| Neurobasal基础培养基 | 45 | 45.8 | 43.2 | —— |
| 马血清 | 25 | 24 | 26 | 24 |
| B27无血清添加剂 | 1 | 1.5 | 1 | —— |
| 葡萄糖糖液 | 1 | 1.5 | 1 | 1 |
| 谷氨酸 | 1 | 0.8 | 1.2 | 1 |
| 双抗 | 1 | 1.2 | 0.8 | 1 |
实施例二：脑组织培养
1.将新生动物大脑利用组织切片机均匀切割成厚度为100～450μm的切片；
2.解剖显微镜下选取含有完整大脑结构的脑切片，放入组织培养插件，然后加入培养体系进行培养。培养分为以下三组：
组一：用培养体系四培养脑组织；培养方式为：在此培养体系中持续培养28天。
组二：用培养体系四培养脑组织；培养方式为：先将脑组织在培养体系中培养15天，然后加入溶血磷脂酰胆碱(50μg/mL)，继续培养17小时，然后更换培养体系继续培养12天。
组三：用培养体系一培养脑组织；培养方式为：在此培养体系中持续培养28天。
组四：用培养体系一培养脑组织；培养方式为：先将脑组织在培养体系中培养15天，然后加入溶血磷脂酰胆碱(50μg/mL)，继续培养17小时，然后更换培养体系继续培养12天。
实施例三：培养结果分析
髓鞘化的检测方法：
免疫荧光化学鉴定：神经丝蛋白(Neurofilament)和髓鞘碱蛋白(MBP)是轴突和髓鞘的标记物，抗Neurofilament和MBP抗体购买于Abcam和Millipore，二抗抗体488绿色和546红色标记山羊抗兔购买于Jackson。荧光化学鉴定结果如图1、2和5所示。
小胶质细胞的检测方法：
免疫荧光化学鉴定：Iba1是小胶质细胞的标记物，抗Iba1抗体购买于Abcam，二抗抗体488绿色标记山羊抗兔购买于Jackson。小胶质细胞检测结果如图3、4和6所示。
如图1所示，动物脑组织在培养体系一中培养28天后经免疫荧光化学染色，轴突成线型结构；髓鞘成线段式围绕轴突。
如图2所示，动物脑组织在培养体系一中培养并用溶血磷脂酰胆碱处理后，经免疫荧光化学染色，髓鞘包裹轴突数量减少，轴突表现为脱髓鞘。
如图3至图4所示，动物脑组织在培养体系一中培养后经小胶质细胞免疫荧光化学染色，小胶质细胞胞体较小，分枝较多。
如图5所示，动物脑组织在培养体系四中培养28天后经免疫荧光化学染色，轴突几乎未见；髓鞘未成线段式围绕轴突。
如图6所示，动物脑组织在培养体系四中培养并用溶血磷脂酰胆碱处理后，经免疫荧光化学染色后，轴突未见，髓鞘未见。
从上述结果可以得知，本发明所申请的培养体系可支持培养的脑组织髓鞘化及髓鞘再生，且小胶质细胞形态表现为支持髓鞘再生的细胞形态。
虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。
Claims (1)
1.一种用组织培养体系培养动物脑组织以促进髓鞘再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：用组织切片机将动物脑组织切割成厚度为100~450μm的切片；
S2：将动物脑组织切片放入膜插件后，放入组织培养体系中培养；每两天更换一次组织培养体系；培养在37℃、5% CO2条件下进行；所述组织培养体系包括以下体积百分比的组分：
BME基础培养基25%，MEM基础培养基1%，Neurobasal基础培养基45%，马血清25%，B27无血清添加剂1%，葡萄糖糖液1%，谷氨酸1%和双抗1%；所述双抗为含有10000 IU的青霉10000μg/mL的链霉素在100倍的工作浓度的混合液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911049124.8A CN110713980B (zh) | 2019-10-31 | 2019-10-31 | 一种组织培养体系及其在动物脑组织培养中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911049124.8A CN110713980B (zh) | 2019-10-31 | 2019-10-31 | 一种组织培养体系及其在动物脑组织培养中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110713980A CN110713980A (zh) | 2020-01-21 |
| CN110713980B true CN110713980B (zh) | 2023-04-18 |
Family
ID=69214618
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911049124.8A Active CN110713980B (zh) | 2019-10-31 | 2019-10-31 | 一种组织培养体系及其在动物脑组织培养中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110713980B (zh) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040147020A1 (en) * | 2002-11-01 | 2004-07-29 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Dopamine neurons from human embryonic stem cells |
-
2019
- 2019-10-31 CN CN201911049124.8A patent/CN110713980B/zh active Active
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| A Low Permeability Microfuidic Blood-Brain Barrier Platform with Direct Contact between Perfusable Vascular Network and Astrocytes;Seokyoung Bang等;《SCIENtIfIC RepoRts》;20170814;第7卷;第1-10页 * |
| Effects of Noradrenaline on Neuronal NOS2 Expression and Viability;JOSE L.M. MADRIGAL等;《ANTIOXIDANTS & REDOX SIGNALING》;20061231;第8卷(第5期);第886页右栏第1段 * |
| On the role of macrophages,microglia and the extracellular matrix in remyelination;Wang,Peng;《University of Groningen/UMCG research database》;20181231;第191页最后1段-第192页第1段 * |
| Serum-Free B27lNeurobasal Medium Supports Differentiated Growth of Neurons From the Striatum, Substantia Nigra, Septum,Cerebral Cortex, Cerebellum, and Dentate Gyrus;G.J. Brewer;《Journal of Neuroscience Research》;19951231;第42卷;第 674-683 页 * |
| 脑组织切片培养技术及其应用;赵善廷;《神经解剖学杂志》;19981231;第14卷;第88-90页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110713980A (zh) | 2020-01-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101760442B (zh) | 适于mdck细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无血清培养基 | |
| CN101864393B (zh) | 一种用于Vero细胞微载体培养的无动物来源成分无血清培养基 | |
| US11104726B2 (en) | Methods of replicating a large scale eculizumab production cell culture | |
| EP3417053B1 (en) | Chemically defined medium for the culture of cancer stem cell (csc) containing cell populations | |
| US20200385683A1 (en) | Composition and method for culturing organoids | |
| CN107858326B (zh) | 小鼠前脂肪细胞3t3-l1的诱导分化剂及诱导分化方法 | |
| CN111484970B (zh) | 一种低蛋白含量的无血清无饲养层胚胎与多能干细胞培养基 | |
| KR102141641B1 (ko) | 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 모유두세포로의 분화방법 | |
| CN101245335A (zh) | 无血清植物蛋白肽通用细胞培养基 | |
| CN110713980B (zh) | 一种组织培养体系及其在动物脑组织培养中的应用 | |
| CN110229784A (zh) | 一种去除死肝细胞的分离液及利用其去除死肝细胞的方法 | |
| TW201908479A (zh) | 藉由利用地標轉錄因子之幹細胞分化誘導神經先驅細胞、寡樹突細胞先驅細胞及寡樹突細胞 | |
| US20160051586A1 (en) | Methods of growing and preparing stem cells and methods of using the same | |
| US20180135023A1 (en) | Induction of hepatocytes by stem cell differentiation with rna | |
| RU2377295C1 (ru) | Питательная среда для культивирования клеток млекопитающих | |
| JP6108170B2 (ja) | 細胞培養用培地 | |
| US20230059873A1 (en) | Expansion of stem cells in suspension in a bioreactor | |
| CN107034176A (zh) | 一种提高体外培养猪卵母细胞发育潜力的培养液及其培养方法 | |
| CA3164358A1 (en) | Process for kidney cell manufacture and treatment | |
| Mahoney et al. | Cultures of cells from fetal rat brain: methods to control composition, morphology, and biochemical activity | |
| CN110669734A (zh) | 一种用于解救纤粘连蛋白聚合体抑制髓鞘再生的培养体系及其应用 | |
| JP2021029142A (ja) | 動物細胞の増殖促進方法、連続培養方法及び連続培養装置 | |
| CN1914313A (zh) | 胚胎干细胞用喂食细胞培育培养基及喂食细胞 | |
| CN115161262A (zh) | 一种硫酸葡聚糖用来培养cho细胞系细胞的基础培养基当中的新应用 | |
| CN116478914A (zh) | 无血清细胞培养体系及其细胞消化终止液 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |