CN110669734A - 一种用于解救纤粘连蛋白聚合体抑制髓鞘再生的培养体系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于解救纤粘连蛋白聚合体抑制髓鞘再生的培养体系及其应用。培养体系包括基础培养液、葡萄糖、Poly(I)·Poly(C)和bFGF‑2，培养体系的pH值为7.0～7.5；基础培养液包括MEM培养基、马血清、BME培养基、谷氨酸、双抗和两性霉素B；本发明中上述培养体系主要用于解救前脑组织培养中纤粘连蛋白聚合体抑制的髓鞘再生。采用本发明的培养体系，可解救被纤粘连蛋白聚合体抑制的髓鞘再生，可以为脑神经发育及多种脱髓鞘性神经疾病研究模型制备和促进髓鞘再生提供新的研究模型。

Description

一种用于解救纤粘连蛋白聚合体抑制髓鞘再生的培养体系及 其应用

技术领域

本发明涉及一种培养体系，具体涉及一种用于解救纤粘连蛋白聚合体抑制髓鞘再生的培养体系及其应用。

背景技术

1989年Sobel和Mitchel，2005年van Horssen等，2013年Stoffels等发现，纤粘连蛋白在多发性硬化症病灶组织中会聚合形成纤粘连蛋白聚合体。2013年Stoffels等，2017年秦晋等，2018年王鹏等发现纤粘连蛋白聚合体抑制少突胶质细胞磷脂膜的形成；少突胶质细胞前体细胞的分化和髓鞘再生。2013年Stoffels等，2017年秦晋等注射纤粘连蛋白聚合体在脱髓鞘动物模型脑胼胝体中，少突胶质细胞的分化和髓鞘再生被抑制。2018年王鹏等发现，纤粘连蛋白聚合体可以诱导骨髓源巨噬细胞和小胶质细胞抑制少突胶质细胞前体细胞的成熟和分化。2017年秦晋等发现神经节苷脂可以解救纤粘连蛋白聚合体抑制的髓鞘再生。但是，现有技术中没有专门的培养体系来培养与髓鞘再生抑制相关的组织，严重制约脱髓鞘性神经疾病的研究。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种用于解救纤粘连蛋白聚合体抑制髓鞘再生的培养体系及应用，培养体系可促使髓鞘再生，为脑神经发育及多种脱髓鞘性神经疾病研究模型和治疗手段提供一套支撑体系。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种用于解救纤粘连蛋白聚合体抑制髓鞘再生的培养体系，培养体系包括基础培养液、葡萄糖、PI:C和bFGF-2；基础培养液包括以下质量百分比的组分：

MEM培养基47％～52％，马血清22％～26％，BME培养基23％～26％，谷氨酸0.8％～1.2％，双抗0.8％～1.2％和两性霉素B 0.8％～1.2％；

葡萄糖的浓度为1.5～2.5mM，PI:C的浓度为190～220μg/mL，bFGF-2的浓度为8～12ng/mL；

培养体系的pH值为7.0～7.5。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，基础培养液包括以下质量百分比的组分：

MEM培养基50％，马血清23％，BME培养基24％，谷氨酸1％，双抗1％和两性霉素B1％。

进一步，葡萄糖的浓度为2mM，Poly(I)·Poly(C)的浓度为200μg/mL，bFGF-2的浓度为10ng/mL。

进一步，培养体系的pH值为7.2。

本发明中上述培养体系主要用于解救前脑组织培养中纤粘连蛋白聚合体抑制的髓鞘再生，应用具体包括以下步骤：

S1：用组织切片机将动物脑组织切割成厚度为100～450μm的切片；

S2：将动物脑组织切片放入膜插件后，放入基础培养液中培养；每两天更换一次细胞培养液，培养在37℃、5％CO₂条件下进行；

S3：培养15天后，加入溶血磷脂酰胆碱，继续培养17h，以诱导培养的脑组织脱髓鞘；

S4：脑组织脱髓鞘后更换新的基础培养液，并加入PI:C诱导脱髓鞘的脑组织产生纤粘连蛋白聚合体；

S5：在纤粘连蛋白聚合体产生2天后，加入bFGF-2，继续培养脑组织2天，之后更换新鲜基础培养液，继续培养8天。

本发明的有益效果是：采用本发明的培养体系，可解救被纤粘连蛋白聚合体抑制的髓鞘再生，可以为脑神经发育及多种脱髓鞘性神经疾病研究模型制备和促进髓鞘再生提供新的途径。

附图说明

图1为动物脑组织体外培养28d的神经轴突和髓鞘化免疫荧光图片；

图2为动物脑组织体外培养中加入PI:C诱导纤粘连蛋白聚合体后的神经轴突和髓鞘化免疫荧光图片；

图3为动物脑组织体外培养中加入溶血磷脂酰胆碱的脱髓鞘后的神经轴突和髓鞘化免疫荧光图片；

图4为动物脑组织体外培养加入溶血磷脂酰胆碱后，再加入PI:C诱导纤粘连蛋白聚合体后的神经轴突和髓鞘化免疫荧光图片；

图5为动物脑组织体外培养加入溶血磷脂酰胆碱后，再加入PI:C诱导纤粘连蛋白聚合体后，加入bFGF-2后的神经轴突和髓鞘化免疫荧光图片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

材料准备：

1.本发明中所用MEM培养基的成分如表1所示：

表1 MEM培养基成分表

2.本发明中所用BME培养基的成分如表2所示：

表2 BME培养基成分表

3.本发明中所用双抗为含有青霉素(10000IU)和链霉素(10000μg/mL)在100倍的工作浓度的混合液；其配制方法如下：

用20mL空针抽16mL三蒸水，溶160万单位/瓶的青霉素G钠一支，过滤除菌；用10mL空针抽10mL三蒸水，溶100万单位/瓶的硫酸链霉素一支，过滤除菌。双抗浓度：青霉素G钠，100～1000U/mL；硫酸链霉素，100～1000μg/mL(100万单位＝1g)。

4.Poly(I)·Poly(C)别名聚肌胞苷酸；聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸，聚肌苷酸-聚胞苷酸为一种干扰素诱导剂。在体内细胞诱导下产生干扰素，有类似干扰素的作用，故有广谱抗病毒和免疫调节功能。用于病毒感染性疾病和肿瘤的辅助治疗。

实施例一：组织培养

本发明中组织培养包括以下步骤：

1.将新生动物大脑利用组织切片机均匀切割成100～450μm的薄片；

2.解剖显微镜下选取含有完整大脑结构的脑切片，放入组织培养插件，然后加入培养体系进行培养。组织培养分为四组，具体如下：

组一，此组为对照组，培养体系由基础培养液和葡糖糖构成，具体组成如下：

基础培养液：50％MEM培养基，24％马血清，23％BME培养基，1％谷氨酸，1％双抗，1％两性霉素B；

葡萄糖(Sigma)2mM；

调节培养体系的pH为7.2。该组中脑组织培养时间为28天。

组二：此组为诱导脱髓鞘组，培养体系的组成如下：

50％MEM培养基(Life Technologies)，24％马血清(Invitrogen)，23％BME培养基(Life Technologies)，1％谷氨酸，1％双抗(Life Technologies)，1％两性霉素B(LifeTechologies)和2mM葡萄糖(Sigma)；调节培养液的pH为7.2。脑组织培养15天后向培养液中加入溶血磷脂酰胆碱(50μg/mL)，继续培养17小时后，更换基础培养液继续培养12天。

组三：此组为诱导脱髓鞘产生纤粘连蛋白聚合体组，培养液的组成如下：

加入50％MEM(Life Technologies)，24％马血清(Invitrogen)，23％BME基础培养基(Life Technologies)，1％谷氨酸，1％双抗(Life Technologies)，1％两性霉素B(LifeTechologies)和2mM葡萄糖(Sigma)；调节培养液的pH为7.2。脑组织培养15天后加入溶血磷脂酰胆碱(50μg/mL)，继续培养17小时后，加入PI:C(200μg/mL)诱导培养脑组织2天；然后更换基础培养液继续培养10天。

组四：此组为脑组织克服纤粘连蛋白聚合体抑制的髓鞘再生组，培养液的组成如下：

50％MEM(Life Technologies)，25％马血清(Invitrogen)，25％BME基础培养基(Life Technologies)，1％谷氨酸，1％双抗(Life Technologies)，1％两性霉素B(LifeTechologies)和2mM葡萄糖(Sigma)；调节培养液的pH为7.2。脑组织培养15天后加入溶血磷脂酰胆碱(50μg/mL)，继续培养17小时后，加入PI:C(200μg/mL)诱导培养脑组织2天；然后添加bFGF-2(10ng/mL)继续培养2天；再更换基础培养液继续培养8天。

实施例二：髓鞘化的检测

免疫荧光化学鉴定：神经丝蛋白(Neurofilament)和髓鞘碱蛋白(MBP)是轴突和髓鞘的标记物，抗Neurofilament和MBP抗体购买于Abcam和Millipore，二抗抗体488绿色和546红色标记山羊抗兔购买于Jackson。荧光化学鉴定结果如下：

图1为动物脑组织体外培养28天后的神经轴突和髓鞘化免疫荧光图片。从中可以看出，经免疫荧光化学染色后，轴突成线型结构，髓鞘成线段式围绕轴突。

图2为动物脑组织体外培养中加入Poly(I)·Poly(C)诱导纤粘连蛋白聚合体后的神经轴突和髓鞘化免疫荧光图片。从中可以看出，在未脱髓鞘的脑组织培养中，加入Poly(I)·Poly(C)不会诱导脱髓鞘。

图3为动物脑组织体外培养中加入溶血磷脂酰胆碱的脱髓鞘后的神经轴突和髓鞘化免疫荧光图片。从中可以看出，用溶血磷脂酰胆碱处理后，经免疫荧光化学染色后，髓鞘包裹轴突数量减少，轴突多表现为脱髓鞘。

图4为动物脑组织体外培养加入溶血磷脂酰胆碱后，再加入PI:C诱导纤粘连蛋白聚合体后的神经轴突和髓鞘化免疫荧光图片。从中可以看出，经免疫荧光化学染色后，轴突几乎未见；髓鞘未成线段式围绕轴突。

图5为动物脑组织体外培养加入溶血磷脂酰胆碱后，再加入PI:C诱导纤粘连蛋白聚合体后，加入bFGF-2后的神经轴突和髓鞘化免疫荧光图片。从中可以看出，用bFGF-2处理后，经免疫荧光化学染色后，轴突多为髓鞘化。

已有研究表明Poly(I)·Poly(C)可以诱导脱髓鞘的脑组织产生纤粘连蛋白聚合体。在诱导脱髓鞘后的脑组织培养中加入Poly(I)·Poly(C)髓鞘再生被阻滞，表明纤粘连蛋白聚合体产生后，可以阻滞髓鞘再生；通过孵育bFGF-2两天后，髓鞘再生可恢复，表明bFGF-2可解除Poly(I)·Poly(C)阻滞的髓鞘再生。

虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

Claims (6)

1.一种用于解救纤粘连蛋白聚合体抑制髓鞘再生的培养体系，其特征在于，所述培养体系包括基础培养液、葡萄糖、Poly(I)·Poly(C)和bFGF-2；所述基础培养液包括以下质量百分比的组分：

MEM培养基47％～52％，马血清22％～26％，BME培养基23％～26％，谷氨酸0.8％～1.2％，双抗0.8％～1.2％和两性霉素B 0.8％～1.2％；

所述葡萄糖的浓度为1.5～2.5mM，所述Poly(I)·Poly(C)的浓度为190～220μg/mL，所述bFGF-2的浓度为8～12ng/mL；

所述培养体系的pH值为7.0～7.5。

2.根据权利要求1所述的用于解救纤粘连蛋白聚合体抑制髓鞘再生的培养体系，其特征在于，所述基础培养液包括以下质量百分比的组分：

MEM培养基50％，马血清23％，BME培养基24％，谷氨酸1％，双抗1％和两性霉素B1％。

3.根据权利要求1所述的用于解救纤粘连蛋白聚合体抑制髓鞘再生的培养体系，其特征在于：所述葡萄糖的浓度为2mM，所述Poly(I)·Poly(C)的浓度为200μg/mL，所述bFGF-2的浓度为10ng/mL。

4.根据权利要求1所述的用于解救纤粘连蛋白聚合体抑制髓鞘再生的培养体系，其特征在于：所述培养体系的pH值为7.2。

5.如权利要求1～4任一项所述的培养体系在解救脑组织培养中纤粘连蛋白聚合体抑制的髓鞘再生中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

S1：用组织切片机将动物脑组织切割成厚度为100～450μm的切片；

S2：将动物脑组织切片放入膜插件后，放入基础培养液中培养；每两天更换一次细胞培养液，培养在37℃、5％CO₂条件下进行；

S3：培养15天后，加入溶血磷脂酰胆碱，继续培养17h，以诱导培养的脑组织脱髓鞘；

S4：脑组织脱髓鞘后更换新的基础培养液，并加入Poly(I)·Poly(C)诱导脱髓鞘的脑组织产生纤粘连蛋白聚合体；

S5：在纤粘连蛋白聚合体产生2天后，加入bFGF-2，继续培养脑组织2天，之后更换新鲜基础培养液，继续培养8天。

Images