CN114164166A - 一种ata在用来培养cho细胞系细胞的基础培养基当中的新应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种ATA在用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的新应用，物质金精三羧酸可以用来添加进CHO细胞基础培养基促进细胞生长和滴度；ATA对于不同CHO细胞系具有普遍的促进作用，并且发现在对细胞的促进机制上与IGF存在某些相似的方式，因此可能作为IGF的部分替代或完全替代且在不影响细胞生长和表达的前提下降低生产原料的成本；其次ATA本身作为化学原料符合作为化学限制性培养基的要求，因此可以很好地运用于重组蛋白和疫苗的生产，降低生产成本，为适应未来工业化培养过程提供了很好的保障。

Description

一种ATA在用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的新 应用
技术领域
本发明涉及生物细胞技术领域，尤其涉及一种ATA在用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的新应用。
背景技术
目前CHO细胞作为主要的宿主细胞，广泛用于治疗蛋白药物的生产。一个高产、高效、稳健、低成本、高质量的生产工艺的开发对于治疗蛋白产品工业化生产至关重要。其中关键的上游技术平台包括：高亲和力全人源化抗体筛选平台、高表达的工程细胞株构建和筛选平台，个性化高效基础培养基和补料培养基的开发平台，支持细胞高密度生长和高表达的培养工艺开发平台等，其中低成本、高效的培养基开发对于治疗性蛋白工业化生产至关重要。
治疗性蛋白工业化生产成本主要来自于培养基和填料，因此在工业规模的动物细胞培养中，培养基的设计除了要考虑细胞的生长和抗体表达的基本要求外，过程的可行性和经济性也是重要的考虑因素。含血清培养基因成本、批次间差异、含杂蛋白和可能病毒污染源等问题已经不在工业生产中应用；含蛋白培养基因动物来源因素、成本问题以及监管要求，已被非动物来源培养基(Animal Component Free Medium，ACF)取代。目前商业化的培养基主要采用无蛋白培养基(可能含有水解物)和化学限定培养基(CD)两类。
高表达工程细胞的筛选和构建使得在某些CHO细胞系培养过程中类胰岛素(IGF)必不可少。IGF是Salmon和Daughaday在1957年研究生长激素的过程中首次发现的，曾被称为“硫化因子”。IGF主要包括IGF-1和IGF-2两类。与胰岛素相同，IGF家族蛋白在结构上具有进化保守性。IGF在组织或血液中均与IGF结合蛋白(IGF-binding protein)相结合，以复合物的形式存在。循环中的IGFs能够通过蛋白酶的水解作用从IGFBP上释放出来，自由的IGFs与细胞表面的胰岛素样生长因子受体结合，通过磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K/Akt)和促细胞分裂激活蛋白激酶(MAPK)途径刺激细胞增殖和抑制细胞凋亡。IGFs是一类多功能小分子多肽类生长因子，参与调节糖，脂类，蛋白质代谢，促进细胞增殖，分化，抑制细胞凋亡。IGF一般被设计在基础培养基的开发中，对于CHO细胞而言是细胞分裂素，主要通过增加DNA的合成和刺激细胞周期蛋白D1的表达实现的，可促进细胞从G1期进入S期。IGF-1通过增加Bcl蛋白的表达和抑制Bax蛋白的表达，使Bcl/Bax的比率增加而发挥抗凋亡的作用。
ATA(金精三羧酸)被应用于生物实验中，主要包括用作核酸抑制剂，病毒生产阻滞剂，基因转染增强剂。ATA已经被证明可以提高CHO细胞的增殖和细胞形态的改善(贴壁到悬浮)。在神经细胞的研究中也被证明具有抗凋亡的作用。除此之外，许多研究也表明ATA可以通过提高酪氨酸和丝氨酸残基相关的蛋白水平来实现对细胞信号传导系统的诱导。
CHO细胞常用的培养模式有分批培养(batch)、补料分批培养(Fed-batch)和灌流培养(perfusion)，三种培养方式需要含有丰富营养物质的基础培养基，包括氨基酸，无机盐，维生素，微量元素等。除此之外，根据细胞特性，添加其他一些物质例如IGF，ATA等。其中IGF作为某些CHO细胞的必需物质但是价格偏高，且我国培养基市场目前被Gibco和Hyclone等国外公司所垄断，培养基的价格十分高昂严重制约着生物药行业的发展。动物细胞培养基国产化，可以打破外国公司的垄断壁垒，带动国内上游原料供应商的发展；此外，培养基成本降低，药企能将更多的资金用于新药研发，提升自主的核心技术力量。培养基国产化必将推动单抗药物价格的下跌，缓解国家医保体系以及患者个人的经济负担，使更多的患者用上廉价高效的药物，提升人民的幸福感。
发明内容
本发明提供了一种ATA在用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的新应用，以解决现有技术的上述问题。
本发明的方案是：
一种ATA在用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的新应用。
作为优选的技术方案，采用ATA代替用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的类胰岛素。
作为优选的技术方案，所述CHO细胞系细胞包括CHO-K1、CHO-1、CHO-2、CHO-3、CHO-4与CHO-5。
本发明还公开了一种用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基，其特征在于：所述基础培养基中用来作为促进细胞生长的营养物质为ATA。
作为优选的技术方案，所述ATA在所述基础培养基的浓度范围为10mg/L-500mg/L。
作为优选的技术方案，所述ATA在所述基础培养基的浓度范围为100mg/L。
由于采用了上述技术方案一种ATA在用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的新应用。根据本发明的实施例，在多个CHO细胞系细胞上测试ATA，均表现出不错的细胞生长表现，对于多个细胞系选定的ATA最优浓度为100mg/L。在培养CHO细胞系细胞中ATA与IGF相比较，IGF在不同细胞系上的生长表现出现差异，有些细胞系甚至没有促进生长的作用,反倒对细胞生长有明显的抑制存在。
根据本发明的实施例，通过添加几种对IGF在细胞通路中的激酶抑制剂(genistein，staurospodne，wortmannin，PD 98059)来判断是否在ATA条件下也同样存在抑制作用，从而判断ATA与IGF是否存在对细胞相似的作用。实验结果显示，选取的四种激酶抑制剂分别在单独ATA和IGF的条件下细胞生长情况都被抑制，由此说明IGF和ATA在CHO细胞上存在相似的促进作用和机制，可能的机制是相似的磷酸化，同样的目标或者激活共享的效应器。
本发明的优点：
发现ATA对于不同CHO细胞系具有普遍的促进作用，并且发现在对细胞的促进机制上与IGF存在某些相似的方式，因此可能作为IGF的部分替代或完全替代在不影响细胞生长和表达的前提下降低基础培养基的成本；其次ATA本身作为化学原料符合作为化学限制性培养基的要求，因此可以很好地运用于重组蛋白和疫苗的生产，降低生产成本，为适应未来工业化培养过程提供了很好的保障。
附图说明
图1是CHOK1细胞在CD基础培养基(Media C)的基础上添加不同浓度ATA(10mg/L,60mg/L,100mg/L,200mg/L,300mg/L,400mg/L,500mg/L)以及空白对照条件时活细胞密度-时间曲线图。
图2是CHOK1细胞在CD基础培养基(Media C)的基础上添加不同浓度ATA(10mg/L,60mg/L,100mg/L,200mg/L,300mg/L,400mg/L,500mg/L)以及空白对照条件时细胞活率-时间曲线图。
图3是CHOK1细胞在CD基础培养基(Media C)的基础上添加不同浓度IGF(0.01mg/L,0.05mg/L,0.2mg/L,0.5mg/L,1mg/L)以及空白对照条件时活细胞密度-时间曲线图。
图4是CHOK1细胞在CD基础培养基(Media C)的基础上添加不同浓度IGF(0.01mg/L,0.05mg/L,0.2mg/L,0.5mg/L,1mg/L)以及空白对照条件时细胞活率-时间曲线图。
图5是经过浓度筛选选取的ATA最优浓度100mg/L在不同细胞系(分别命名为CHO-1，CHO-2，CHO-3，CHO-4，CHO-5)活细胞密度-时间曲线图。
图6是经过浓度筛选选取的ATA最优浓度100mg/L在不同细胞系(分别命名为CHO-1，CHO-2，CHO-3，CHO-4，CHO-5)细胞活率-时间曲线图。
图7是经过浓度筛选选取的IGF最优浓度0.2mg/L在不同细胞系(分别命名为CHO-1，CHO-2，CHO-3，CHO-4，CHO-5)活细胞密度-时间曲线图。
图8是经过浓度筛选选取的IGF最优浓度0.2mg/L在不同细胞系(分别命名为CHO-1，CHO-2，CHO-3，CHO-4，CHO-5)细胞活率-时间曲线图。
图9是ATA和IGF联合添加(浓度分别是50mg/L,0.5mg/L和150mg/L,0.1mg/L)，各自单独添加100mg/LATA，0.2mg/LIGF时以及空白对照活细胞密度-时间曲线图。
图10是ATA和IGF联合添加(浓度分别是50mg/L,0.5mg/L和150mg/L,0.1mg/L)，各自单独添加100mg/LATA，0.2mg/LIGF时以及空白对照细胞活率-时间曲线图。
图11是各自添加激酶抑制剂(genistein，staurospodne，wortmannin，PD98059)分别在ATA和IGF添加条件下活细胞密度-时间曲线图。
图12是各自添加激酶抑制剂(genistein，staurospodne，wortmannin，PD98059)分别在ATA和IGF添加条件下细胞活率-时间曲线图。
具体实施方式
为了弥补以上不足，本发明提供了一种ATA在用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的新应用以解决上述背景技术中的问题。
一种ATA在用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的新应用。
采用ATA代替用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的类胰岛素。
所述CHO细胞系细胞包括CHO-K1、CHO-1、CHO-2、CHO-3、CHO-4与CHO-5。
本发明还公开了一种用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基，其特征在于：所述基础培养基中用来作为促进细胞生长的营养物质为ATA。
所述ATA在所述基础培养基的浓度范围为10mg/L-500mg/L。
所述ATA在所述基础培养基的浓度范围为100mg/L。
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
按照本发明指导的最优浓度范围，对两种物质各自选取了5个浓度范围点进行细胞实验，培养方式是流加培养(fed-batch)，选用多宁自主开发的商用基础培养基(MediaC)，补料选用多宁自主开发的补料培养基Feed 2+feed B2。
试验方式：流加培养(加入补料培养基)
试验程序：在细胞培养至对数生长期中期进行补料，到Day13全部收获。
培养环境：37℃，5％二氧化碳
摇瓶培养过程：在超净台内向两个2L(1号和2号)和一个125mL3号摇瓶内加入已无菌过滤好的基础培养基，接种密度为5×105细胞/ml，培养体积为200ml，培养至第3天计数：活细胞密度为30.05×105细胞/ml，细胞活率为98.36％。在无菌操作台中均匀分装1号1L摇瓶30mL培养液至125ml摇瓶中，标记为2～6，在无菌操作台中均匀分装2号1L摇瓶30mL培养液至125ml摇瓶中，标记为7～11。1号即3号摇瓶为空白对照，2-6号分别各自添加10mg/L,60mg/L,100mg/L,200mg/L,300mg/L,400mg/L,500mg/LATA，7-11号分别各自添加0.01mg/L,0.05mg/L,0.2mg/L,0.5mg/L,1mg/LIGF。
按照表1所示进行补料操作。1号作为对照实验；2-11号为实验组。补料策略选用隔天补料，补料量是3％+0.3％，从Day 3开始，D11最后一次补料。
表2：培养结果
Figure BDA0003414691140000051
Figure BDA0003414691140000061
注:培养过程中分别在Day 3，5，7，9，11测定并添加葡萄糖至8g/L。
实施例2
通过筛选实验筛选出ATA和IGF最优浓度，分别是100mg/L,0.2mg/L(具体筛选方法不具体描述)。选用五种不同的CHO细胞系(其中包括CHOK-1)，分别命名为CHO-1，CHO-2，CHO-3，CHO-4，CHO-5。培养方式是流加培养(fed-batch)，选用多宁自主开发的商用基础培养基(Media C)，补料选用多宁自主开发的补料培养基Feed 2+feed B2。
试验方式：流加培养(加入补料培养基)
试验程序：在细胞培养至对数生长期中期进行补料，到Day13全部收获。
培养环境：37℃，5％二氧化碳
摇瓶培养过程：在超净台内向15个125mL摇瓶内加入已无菌过滤好的基础培养基，接种密度为5×105细胞/ml，培养体积为30ml，培养至第3天计数：活细胞密度为30.05×105细胞/ml，细胞活率为97.67％。摇瓶序号从1-15标记，1-5号为不同细胞系的空白组，6-10是分别添加100mg/LATA，从6-10分别选用CHO 1-5细胞，11-15是分别添加0.2mg/LIGF，从11-15分别选用CHO 1-5细胞。
按照表2所示进行补料操作。补料策略选用隔天补料，补料量是3％+0.3％，从Day3开始，D11最后一次补料。
Figure BDA0003414691140000062
Figure BDA0003414691140000071
实施例3
为确定ATA与IGF存在相互替代的可能性，开展该实施例。选用CHO K-1细胞，ATA和IGF联合添加(浓度分别是50mg/L，0.5mg/L和150mg/L，0.1mg/L)，各自单独添加100mg/LATA和0.2mg/LIGF。培养方式是流加培养(fed-batch)，选用多宁自主开发的商用基础培养基(Media C)，补料选用多宁自主开发的补料培养基Feed 2+feed B2。
试验方式：流加培养(加入补料培养基)
试验程序：在细胞培养至对数生长期中期进行补料，到Day13全部收获。
培养环境：37℃，5％二氧化碳
摇瓶培养过程：在超净台内向5个125mL摇瓶内加入已无菌过滤好的基础培养基，接种密度为5×105细胞/ml，培养体积为30ml，培养至第3天计数：活细胞密度为30.05×105细胞/ml，细胞活率为99.21％。摇瓶序号从1-5标记，1-5分别是空白组，联合添加50mg/LATA，0.5mg/LIGF,联合添加150mg/LATA,0.1mg/LIGF,单独添加100mg/L ATA,单独添加0.2mg/L IGF。
按照表3所示进行补料操作。补料策略选用隔天补料，补料量是3％+0.3％，从Day3开始，D11最后一次补料。
Figure BDA0003414691140000081
实施例4
为确定ATA与IGFs存在可能的互相替代作用，需要针对两种物质对于细胞的代谢通路是否存在相同的地方。选用CHO K-1细胞，分别添加几种对IGF在细胞通路中的激酶抑制剂(genistein，staurospodne，wortmannin，PD 98059)。培养方式是传代培养，选用多宁自主开发的商用基础培养基(Media C)，
试验方式：Batch
试验程序：隔天传代，每组重复测试，取平均数作出柱状图进行比对。
培养环境：37℃，5％二氧化碳
摇瓶培养过程：在超净台内向26个125mL摇瓶内加入已无菌过滤好的基础培养基，传代密度为5×105细胞/ml，培养体积为30ml：活细胞密度为30.05×105细胞/ml，细胞活率为98.45％。摇瓶序号从1-26标记，1，2分别是空白组，3-26分别在ATA和IGF的添加条件下，添加不同浓度的IGF激酶抑制剂(genistein，staurospodne，wortmannin，PD 98059)。(细胞生长情况见图11，图12)。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种ATA在用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的新应用。
2.如权利要求1所述的ATA在用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的新应用，其特征在于：采用ATA代替用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的类胰岛素。
3.如权利要求1所述的ATA在培养CHO细胞系细胞的基础培养基当中的新应用，其特征在于：所述CHO细胞系细胞包括CHO-K1、CHO-1、CHO-2、CHO-3、CHO-4与CHO-5。
4.一种如权利要求1至3所述的用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基，其特征在于：所述基础培养基中用来作为促进细胞生长的营养物质为ATA。
5.如权利要求4所述的用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基，其特征在于：所述ATA在所述基础培养基的浓度范围为10mg/L-500mg/L。
6.如权利要求5所述的用来培养CHO细胞系细胞的基础培养基，其特征在于：所述ATA在所述基础培养基的浓度范围为100mg/L。
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