CN110835622A

CN110835622A - 用于调节哺乳动物细胞乳酸代谢的培养基及其应用

Info

Publication number: CN110835622A
Application number: CN201810933714.6A
Authority: CN
Inventors: 孙瑞强; 蒋媛媛; 傅亦德; 曹云; 唐亮
Original assignee: Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Current assignee: Wuxi Yaoming Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-08-16
Filing date: 2018-08-16
Publication date: 2020-02-25
Anticipated expiration: 2038-08-16
Also published as: CN110835622B; WO2020035050A1

Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种用于调节哺乳动物细胞乳酸代谢的培养基及其应用。所述培养基包含以下组分：(1)基础培养基，和(2)金精三羧酸或金精三羧酸铵盐，其中所述基础培养基无血清、无动物性蛋白和植物性蛋白，且不包含胰岛素、IGF‑1及转铁蛋白等成分。本发明提供的培养基能够有效改善哺乳动物细胞的乳酸代谢水平，同时能够提高哺乳动物细胞的活细胞密度、细胞活率以及外源蛋白表达。

Description

用于调节哺乳动物细胞乳酸代谢的培养基及其应用

技术领域

本发明涉及细胞培养和蛋白重组表达技术领域，尤其涉及一种用于调节哺乳动物细胞乳酸代谢的培养基及其应用。

背景技术

CHO细胞(Chinese hamster ovary cell，中国仓鼠卵巢细胞)是目前用于包括工程抗体和重组蛋白在内的生物技术药物研发和生产中最重要、最广泛的表达系统之一。与其他表达系统相比，它具有以下优势：作为一种转化细胞，理论上具有无限寿命，可以传代百代以上；属于成纤维细胞(fibroblast)，是一种非分泌型细胞，本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利；此外，该细胞还可形成有活性的二聚体，具有糖基化的功能，是表达复杂生物大分子的一种理想宿主。

用以培养CHO细胞的培养基含有丰富的营养物质，部分营养物质会被转化为具有细胞毒性的代谢副产物。其中，乳酸是细胞培养过程中的主要代谢副产物。CHO细胞在代谢旺盛的对数生长期通常会进行乳酸的快速累积，部分细胞株可以在稳定期发生代谢转变，能将这些乳酸代谢消耗掉，但部分细胞株却缺乏此代谢转变能力。大量乳酸的累积将严重影响蛋白表达及蛋白质量。乳酸的累积会导致培养体系的pH降低，为使pH回升添加的碱液往往会增加体系的渗透压，从而影响细胞正常生长代谢。而如果不通过添加碱液调节pH，低pH环境会影响酶活，从而影响细胞生长。

为了改善细胞的生长，提高蛋白产量及质量，获得稳定持续的培养过程，减少乳酸积累一直是细胞培养过程中的一个巨大挑战。现有技术中减少乳酸积累的方法包括：(1)对细胞进行基因改造可以降低乳酸积累，如敲除乳酸脱氢酶(LDH)基因、过表达丙酮酸羧化酶(PYC2)基因等，但操作性不强。(2)也可优化细胞培养策略进行乳酸调控。用代谢缓慢的糖类代替葡萄糖作为碳源可以降低乳酸的积累，如半乳糖、岩藻糖和麦芽糖的使用，但相对而言，都具有较大的副作用。而当乳酸有一定积累时，可以通过葡萄糖的浓度来改变细胞的代谢路径，从而减少乳酸累积。但这些乳酸调控策略会对细胞的生长及蛋白质量产生不利影响。(3)此外，铜离子(Cu²⁺)的添加曾在多种CHO细胞中被证实可以减少乳酸积累。Cu²⁺的加入可扩大线粒体的氧化容量，从而降低乳酸的积累。但目前大多数商用培养基中Cu²⁺的浓度设计比较均衡而合适，在额外添加时，很多情况下作用并不明显，同时Cu²⁺的添加会影响到蛋白的质量，如增加碱性峰的比例、降低高甘露糖型水平等。因此，目前市场急需开发一种能够调控乳酸代谢的更适宜的方法。

培养基是影响细胞生长代谢乃至生存的最直接、最重要的环境因素。在悬浮培养和无血清培养已成为动物细胞培养的理想模式和动物细胞表达产品工业化生产的首要选择的现阶段，本发明的发明人提供一种可显著降低乳酸累积的支持CHO细胞悬浮培养的无血清培养基。Hyclone公司生产的ActiPro培养基和Gibco公司生产的Dynamis培养基是针对CHO细胞悬浮培养较常用的无血清、无蛋白且化学成分限定的商品化培养基。以添加适宜浓度的金精三羧酸或金精三羧酸铵盐的ActiPro或Dynamis为基础培养基进行细胞培养，可有效调控乳酸的堆积问题。

金精三羧酸(Aurintricarboxylic acid，ATA)，分子式为C₂₂H₁₄O₉。金精三羧酸铵盐(Aurintricarboxylic acid ammonium salt，又称为Aluminon、Ammoniumaurintricarboxylate、ATA ammonium)，分子式为C₂₂H₁₄O₉·3NH₃。所述金精三羧酸铵盐在本公开中又可称为ATA铵盐。该培养基添加物具有以下优点：为成分明确的单一物质；易在下游纯化过程中去除；成本低廉；配制和使用方便等。虽然ATA在其它文献和涉及培养基配方的专利中有所提及，但是其使用方式、作用效果以及发挥生物学功能的原理均与本发明存在明显不同。现有技术公开的文献主要存在以下问题：ATA仅仅是作为胰岛素、IGF-1或者转铁蛋白(transferrin)的替代物，且不是以单独形式添加至商品化的培养基中。例如，公开号为US5,045,454的专利文献中公开了一种无血清生长培养基，该发明选择用铁螯合物(包括柠檬酸盐/柠檬酸和Fe/EDTA)、ATA以及碱金属EDTA的组合作为培养基中转铁蛋白的替代物。也就是说，在该专利文献中ATA并不是以单一组分的形式添加到无血清生长培养基中发挥作用的，而是以铁螯合物的作用的配合才能解决其声称的技术问题。另外，公开号为US6,338,964B1的专利文献中公开了一种适用于在低溶解CO₂浓度的条件下培养哺乳动物细胞的培养基，所述培养基中包含：浓度高于2mM的有机缓冲液、浓度高于5mM的金属络合剂(metal complexing agent)以及浓度小于1g/L的NaHCO₃，其中所述金属络合剂由组氨酸、亚氨基二乙酸、柠檬酸盐、磷酸丝氨酸、ATA和羟基赖氨酸组成。由此可见，该文献中所述ATA也不是以单一组分的形式添加到所述培养基中发挥作用并解决其声称的技术问题。

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的之一，在于提供一种用于调节哺乳动物细胞乳酸代谢的培养基。使用本发明所述的培养基能够同时对未经优化和筛选的快速稳定细胞群(fast stablepool，FSP)、稳定细胞群(stable pool)及存在乳酸代谢问题的克隆(clone)具有良好的调控乳酸代谢水平的作用。

本发明的另一目的，在于提供一种能够同时有效提高哺乳动物细胞的活细胞密度、细胞活率，降低培养液中的乳酸堆积，提高哺乳动物细胞表达外源蛋白产量的培养基。

用于解决问题的方案

本发明人鉴于上述现有技术中存在的问题，进行了深入的研究、反复试验，发现通过在细胞培养之初添加浓度优化的ATA或ATA铵盐于基础培养中，从而完成了本发明。即，本发明如下所述：

本发明首先提供了一种用于调节哺乳动物细胞乳酸代谢的培养基，其特征在于，所述培养基中包含以下组分：(1)基础培养基，和(2)ATA或ATA铵盐。其中所述基础培养基中无血清、无动物性蛋白和植物性蛋白，且不包含胰岛素、IGF-1及转铁蛋白等成分。其中所述的基础培养基中的所有成分都是明确的，又可称为成分培养基(Chemically definedmedium，CDM)，在所述培养基中不添加植物水解物；所述动物性蛋白包括但不限于牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)，所述植物性蛋白包括但不限于大豆蛋白或小麦蛋白。

优选的，所述基础培养基为ActiPro培养基或Dynamis培养基。当所述基础培养基为ActiPro培养基时，所述培养基能够同时有效提高哺乳动物细胞的活细胞密度，降低培养液中的乳酸堆积，提高哺乳动物细胞的蛋白表达。

优选的，所述培养基中的ATA或ATA铵盐的浓度为0.05～0.8mM，更优选的浓度为0.1～0.4mM，最优选的浓度为0.2mM。

当所述ATA或ATA铵盐在基础培养中的浓度高于0.8mM时，会对细胞生长产生抑制；当所述ATA或ATA铵盐在基础培养中的浓度低于0.05mM时，将无法有效调节细胞乳酸堆积问题。

本发明还提供一种调节哺乳动物细胞乳酸代谢的方法，其特征在于：将表达外源蛋白的哺乳动物细胞在上文所述的培养基中进行培养，优选的，在所述哺乳动物细胞培养起始在所述培养基中进行培养。

在所述方法中，优选的，所述哺乳动物细胞为CHO细胞，所述外源蛋白为Fc融合蛋白或者抗体；更优选的，所述哺乳动物细胞为CHO-K1细胞，所述外源蛋白为单克隆抗体。

本发明进一步提供上文所述的培养基在哺乳动物细胞表达外源蛋白中的应用，优选的，在所述哺乳动物细胞培养起始选择所述培养基进行培养。

在所述应用中，优选的，所述哺乳动物细胞为CHO细胞，所述外源蛋白为Fc融合蛋白或者抗体；更优选的，所述哺乳动物细胞为CHO-K1细胞，所述外源蛋白为单克隆抗体。所述Fc融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有生物学活性的功能蛋白分子与Fc片段融合而产生的新型蛋白，Fc融合蛋白不仅具有融合蛋白的生物学活性，还具有类似抗体的特征。；所述单克隆抗体可以是任何适合利用CHO-K1细胞进行外源表达的单克隆抗体，其包括但不限于IgG1、IgG4单克隆抗体及双特异性抗体。

发明的效果

由本发明的技术方案可见，本发明的培养基与现有技术相比，具有以下

有益效果：

1)本发明首次将ATA或ATA铵盐作为单一组分添加到目前市场上最重要的几种常规商用培养基，有效改善了哺乳动物细胞的乳酸代谢水平，降低了由于乳酸堆积带来的工艺风险。使用本发明所述的培养基能够有效提高FSP、stable pool和克隆细胞的活细胞密度、细胞活率，同时提升哺乳动物细胞表达的外源蛋白的产量和质量。

2)本发明的培养基作为商用培养基的有益补充，改善了商用培养基的适用范围。

为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下：

附图说明

图1-1和图1-2为ATA及ATA铵盐对细胞生长的影响图(图1-1为活细胞密度随时间的变化曲线图；图1-2为细胞活率随时间的变化曲线图)；

图1-3和图1-4为ATA铵盐对抑制细胞凋亡的影响图(图1-3为活细胞密度随时间的变化曲线图；图1-4为细胞活率随时间的变化曲线图)；

图1-5至图1-7为ATA铵盐对细胞乳酸代谢的影响图(图1-5为活细胞密度随时间的变化曲线图；图1-6为细胞活率随时间的变化曲线图；图1-7为乳酸浓度随时间的变化曲线图)；

图2-1至图2-3分别为ATA铵盐添加浓度的研究图(图2-1为活细胞密度随时间的变化曲线图；图2-2为细胞活率随时间的变化曲线图；图2-3为乳酸浓度随时间的变化曲线图)；

图2-4至图2-6分别为ATA铵盐添加时间的研究图(图2-4为活细胞密度随时间的变化曲线图；图2-5为细胞活率随时间的变化曲线图；图2-6为乳酸浓度随时间的变化曲线图)。

具体实施方式

本发明实施例中所使用的细胞是由包含IgG1编码基因的双表达载体转染CHO-K1细胞所构建的能够稳定表达IgG1单克隆抗体的细胞株。其中，CHO-K1细胞株为申请人实验室所保存的细胞株。

本发明实施例中所使用的培养基和培养基添加物均可市购获得：

ActiPro培养基：购自Hyclone公司；

Dynamis培养基：购自Gibco公司；

ATA、ATA铵盐、胰岛素、类胰岛素样生长因子、丁酸钠：购自Sigma公司。

实施例1：含金精三羧酸或金精三羧酸铵盐培养基的制备

1.1金精三羧酸或金精三羧酸铵盐贮存液的制备方法

选择注射用水(water for injection，WFI)来制备所有溶液。100×贮存液的组成成分如表1所示。

表1中所述贮存液的制备方法如下所示：

步骤1)选择合适大小的容器，盛装表1中所述质量的注射用水；

步骤2)将表1中所述质量的ATA或ATA铵盐粉末加入到步骤1)中所述的容器中；

步骤3)ATA需在碱性条件下溶解：加入适量10N NaOH调节pH值至12.2±0.2后，在室温下混合均匀；ATA铵盐在室温、水中即可溶解。待充分溶解后，添加注射用水至最终质量并再次混合均匀；

步骤4)使用0.1μm或者0.2μm孔径的滤膜对所述溶液进行过滤；

步骤5)置于4～8℃保存。

表1 20mM ATA及ATA铵盐贮存液的成分(1.0kg)

成分	期望含量(g)	最小含量(g)	最大含量(g)	可接受误差
					注射用水<sup>#1</sup>	800.00	784.00	816.00	±2％
金精三羧酸	8.45	8.28	8.62	±2％
					金精三羧酸铵盐	9.47	9.28	9.66	±2％
最终质量(g)	1000.00	980.00	1020.00	±2％

#1：所述注射用水的量为原始添加量，未示出注射用水的最终添加量。

1.2用于细胞培养的含有金精三羧酸或金精三羧酸铵盐培养基的制备方法

1)将本实施例1.1节中所述的贮存液置于37℃进行预热；

2)取一定体积预热后的贮存液加入到ActiPro培养基或Dynamis培养基中，混合均匀，从而得到含有特定浓度的ATA或ATA铵盐培养基。

实施例2：金精三羧酸及金精三羧酸铵盐的功能研究

2.1金精三羧酸及金精三羧酸铵盐对细胞生长的影响

采用分批培养(batch culture)的方法，研究ATA及ATA铵盐在ActiPro细胞培养基中对细胞生长的影响。

选择ActiPro培养基作为基础培养基，分别配制以下五组细胞培养基：(1)对照组(Ctrl)，即在ActiPro培养基中不额外添加其它物质；(2)胰岛素组(Insulin)，即在ActiPro培养基中添加0.2mg/L的胰岛素；(3)类胰岛素样生长因子组(IGF-1)，即在ActiPro培养基中添加20μg/L的IGF-1；(4)金精三羧酸组(ATA)，即根据实施例1所述的方法配制含有0.2mMATA的ActiPro培养基；(5)ATA铵盐组(ATA Ammonium)，即实施例1中所述的含有0.2mM ATA铵盐的ActiPro培养基。

将细胞按照0.4×10⁶cells/mL的密度分别接种到装有上述五组细胞培养基的250mL摇瓶中，培养体积50mL，置于36.5℃，125rpm的摇床中进行分批培养。在培养的过程中，对活细胞密度及细胞活率进行监测。

试验结果：和对照组相比，ATA和ATA铵盐组能显著提高细胞的活细胞密度；而胰岛素组和类胰岛素样生长因子组中的活细胞密度均低于对照组(如图1-1所示)。另外，ATA和ATA铵盐组的培养基还能有效提高细胞的细胞活率(如图1-2所示)。

由此可见，ATA和ATA铵盐在细胞培养过程中显示出了不同于胰岛素和类胰岛素生长因子的促生长作用。

2.2金精三羧酸铵盐对抑制细胞凋亡的影响

由于ATA铵盐与ATA结构及功能相似，且ATA铵盐更易制备，因此在以下的实施案例中仅使用ATA铵盐进行试验。

相关研究表明，丁酸钠可以提高多种外源蛋白在CHO细胞中的表达量，但同时会抑制细胞生长、阻断细胞周期，诱导细胞凋亡。此处试验采用流加培养(fed-batch culture)的方法，通过添加丁酸钠诱导细胞凋亡，验证ATA铵盐的抑制细胞凋亡作用。

分别配制以下四组培养基：(1)ActiPro对照组(Ctrl)，即在ActiPro培养基中不额外添加其它物质；(2)ATA铵盐组(ATA Ammonium)，即参照实施例1所述的方法配制含0.2mMATA铵盐的ActiPro培养基；(3)丁酸钠组(NaBu)，即在ActiPro培养基中添加2mM丁酸钠；(4)ATA铵盐/丁酸钠组(ATA铵盐/NaBu)，即在0.2mM ATA铵盐组的基础上，在细胞培养的第五天添加2mM丁酸钠。

将细胞按照0.4×10⁶cells/mL的密度分别接种到装有上述四组细胞培养基的250mL摇瓶中，培养体积50mL，置于36.5℃，125rpm的摇床中进行培养，并于第5天移至31.0℃，125rpm的摇床中。在培养的过程中，对活细胞密度、细胞活率及抗体表达量进行监测。

试验结果：(1)四组不同培养基对于活细胞密度的影响程度依次为：ATA铵盐组＞ATA铵盐/丁酸钠组＞ActiPro対照组>丁酸钠组。由此可见，在基础培养基中添加ATA铵盐能够提高细胞的活细胞密度，而添加丁酸钠会降低细胞的活细胞密度(如图1-3所示)。

(2)在基础培养基中添加ATA铵盐能够有效提高细胞的细胞活率，而在基础培养基中添加NaBu会影响细胞的活率(如图1-4所示)。

(4)四组不同培养基对于抗体表达量的影响程度依次为：ATA铵盐组＞ATA铵盐/丁酸钠组＞ActiPro対照组>丁酸钠组。由此可见，在基础培养基中添加ATA铵盐能够提高细胞抗体表达的能力，而添加丁酸钠会降低细胞表达抗体的能力(如表2所示)。

表2 不同ATA铵盐添加时间的抗体表达对比

(5)根据本实施例的结果可以看出：ATA铵盐能够明显抑制由丁酸钠诱导的细胞凋亡，更适合作为提高CHO细胞外源蛋白表达量的单一组分添加到基础培养基中；结合实施例2.1的结果可见：ATA及ATA铵盐均具有有效保持细胞活率、明显抑制细胞凋亡的作用。

2.3金精三羧酸铵盐对细胞乳酸代谢的影响

采用流加培养(fed-batch culture)的方法，研究ATA铵盐在ActiPro及Dynamis基础培养基中对CHO细胞乳酸代谢的影响。

选择ActiPro和Dynamis培养基作为基础培养基，分别配制以下四组细胞培养基：(1)ActiPro对照组(ActiPro)，即在ActiPro培养基中不额外添加其它物质；(2)ActiPro+ATA铵盐试验组(ActiPro+ATA Ammonium)，即根据实施例1所述的方法配制含0.2mM ATA铵盐的ActiPro培养基。(3)Dynamis对照组(Dynamis)，即在Dynamis培养基中不额外添加其它物质；(4)Dynamis+ATA铵盐试验组(Dynamis+ATA Ammonium)，即根据实施例1所述的方法配制含0.2mM ATA铵盐的Dynamis培养基。

参照本实施例2.2节中所述的接种及培养条件进行培养，对细胞的活细胞密度、细胞活率和乳酸浓度进行监测。

试验结果：如图1-5至1-7所示，ATA铵盐的添加未对细胞的活细胞密度以及细胞活率产生不良作用，且可有效解决乳酸的堆积问题。

实施例3：金精三羧酸铵盐添加浓度及添加时间的研究

3.1金精三羧酸铵盐添加浓度的研究

采用流加培养(fed-batch culture)的方法，研究不同浓度的ATA铵盐对细胞的活细胞密度、细胞活率、乳酸浓度和抗体表达的影响。

参照实施例1中所述的方法，分别配制以下四组培养基：(1)ActiPro对照组(ActiPro)，即在ActiPro培养基中不额外添加其它物质；(2)0.1mM ATA铵盐组，即参照实施例1所述的方法配制含0.1mM ATA铵盐的ActiPro培养基；(3)0.2mM ATA铵盐组，即按照实施例1所述的方法配制含0.2mM ATA铵盐的ActiPro培养基；(4)0.4mM ATA铵盐组，即参照实施例1所述的方法配制含0.4mM ATA铵盐的ActiPro培养基。

参照实施例2的2.2节中所述的接种及培养条件进行培养，对活细胞密度、细胞活率、乳酸浓度和抗体表达量进行监测。

试验结果：(1)如图2-1中所示的曲线图可以看出，和对照组相比，0.1～0.4mM浓度的ATA铵盐组均能显著提高细胞的活细胞密度。浓度为0.1mM及0.2mM相对于0.4mM更能够提高活细胞密度。

(2)如图2-2所示的曲线图可以看出，在ActiPro培养基中添加0.1～0.4mM浓度的ATA铵盐能够显著维持细胞的细胞活率。浓度为0.2mM及0.4mM相对于0.1mM能够在经历较长的培养时间后依然维持较高的细胞活率。

(3)如图2-3中所示的曲线图可以看出，不同浓度的ATA铵盐均能够有效降低培养液中的乳酸堆积。浓度为0.1mM及0.2mM相较于0.4mM的效果更加。

(4)如表3所示，不同浓度的ATA铵盐均能显著提升抗体表达量，以0.1mM及0.2mM的浓度添加效果更加。

表3 不同ATA铵盐添加浓度的抗体表达量对比

(5)综上结果，0.2mM ATA铵盐为最优选的添加浓度。

3.2金精三羧酸铵盐添加时间的研究

为了确定ATA铵盐的添加时间，设计以下试验：

采用流加培养(fed-batch culture)的方法进行培养。选择ActiPro培养基作为基础培养基并将其设置为对照组(ActiPro)，分别于细胞培养的起始阶段(即第0天，简称为D0)以及培养的中期(即第6天，简称为D6)在所述基础培养基中添加0.2mM ATA铵盐。

试验结果：(1)如图2-4至2-6及表4所示，不同的ATA铵盐添加时间未对活细胞密度、细胞活率以及抗体表达量产生影响，但乳酸浓度曲线之间存在差异。虽然不同的添加时间均可抑制培养后期的乳酸生成，但在培养初始阶段加入ATA铵盐可降低培养前期的乳酸积累。

(2)综上结果，最为优选的ATA铵盐的添加时间为培养的初始阶段。

表4 不同ATA铵盐添加时间的抗体表达量对比

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种用于调节哺乳动物细胞乳酸代谢的培养基，其特征在于，所述培养基包含以下组分：(1)基础培养基，和(2)金精三羧酸或金精三羧酸铵盐，其中所述基础培养基中无血清、无动物性蛋白和植物性蛋白，且不包含胰岛素、IGF-1及转铁蛋白等成分。

2.如权利要求1所述的培养基，其中所述基础培养基为ActiPro培养基或Dynamis培养基，优选的，所述基础培养基为ActiPro培养基。

3.如权利要求1或2所述的培养基，其中所述金精三羧酸或金精三羧酸铵盐的浓度为0.05～0.8mM，更优选的浓度为0.1～0.4mM，最优选的浓度为0.2mM。

4.一种调节哺乳动物细胞乳酸代谢的方法，其特征在于：将表达外源蛋白的哺乳动物细胞在权利要求1～3中任一项所述的培养基中进行培养，优选的，在所述哺乳动物细胞培养起始在所述培养基中进行培养。

5.如权利要求4所述的方法，优选的，其中所述哺乳动物细胞为CHO细胞，更优选的，所述哺乳动物细胞为CHO-K1细胞。

6.如权利要求4或5所述的方法，其中所述外源蛋白为Fc融合蛋白或者抗体，优选的，所述抗体为单克隆抗体。

7.权利要求1～3任一项所述的培养基在哺乳动物细胞表达外源蛋白中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，在所述哺乳动物细胞培养起始选择所述培养基进行培养。

9.如权利要求7或8所述的应用，优选的，其中所述哺乳动物细胞为CHO细胞，更优选的，所述哺乳动物细胞为CHO-K1细胞。

10.如权利要求7或8所述的应用，其中所述外源蛋白为Fc融合蛋白或者抗体，优选的，所述抗体为单克隆抗体。