JP2625302B2 - 培 地 - Google Patents

培 地

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、チャイニーズハムスタ
ー卵巣（ＣＨＯ）細胞系を培養するための、生化学的に
定義された培地、およびその培地で増殖するよう適応さ
せた細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨ
Ｏ）は、ｐｕｃｋ（Ｊ．Ｅｘｐ・Ｍｅｄ．１０８，９４
５，１９５８）により、メスのチャイニーズハムスター
からの卵巣生検から、最初に培養された。これらのオリ
ジナルの細胞から、多くの研究者は様々な欠陥を有する
多数の亜系（ｓｕｄ−ｌｉｎｅｓ）をクローン化した。
その一つであるＣＨＯ−Ｋｌはプロリン要求性であり、
ジハイドロフォレートリダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子
について２倍体である。この細胞系から、１つのｄｈｆ
ｒ遺伝子での変異および続いて起こる他の遺伝子の滅亡
の結果としての、ｄｈｆｒ機能が失われたことに特徴の
あるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞系（ＣＨＯＤＵＫ Ｂｌｌ）
が開発された（ＰＮＡＳ ７７ ，１９８０，４２１６
−４２２０）。これらの細胞は機能的にｄｈｆｒ−であ
る。表現型としてｄｈｆｒ−である他のＣＨＯ ＤＵＫ
亜系も誘導されている。ｄｈｆｒ−であるＣＨＯ細胞
は、チミジン、ヒポキサンチン、または同等のヌクレオ
シドのようなヌクレオチド前駆体なしには増殖できな
い。
【０００３】Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｘ ＧＰＲＴ遺伝子（Ｊ．
Ｍｏｌ．Ａｐｐ．Ｇｅｎ．１９８１，１，１６５〜１７
５）、ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーター（Ｍ
ｏｌ＆Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５，１７５０〜１７５９，
１９８５）、ヒト免疫（γ）インターフェロン（ＰＮＡ
Ｓ ８０、４６５４〜４６５８）、およびヒトβインタ
ーフェロン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ４，１６６〜１７２，１９８
４）を含む。様々なタンパク質が、そのようなＣＨＯ細
胞中で発現している。あるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞系は、
生産物遺伝子およひｄｈｆｒ＋表現型のＣＨＯ形質転換
細胞の選別を可能にするｄｈｆｒ遺伝子を、トランスフ
ェクトされる。選別は、チミジンおよびヒポキサンチン
のない媒地中でコロニーを培養することにより行われ、
それらがないことは形質転換されない細胞が増殖するの
を妨げる。形質転換細胞は、両方のトランスフェクトさ
れた遺伝子の共組込み（ｃｏ−ｉｎｔｅｇｒｕｔｉｏ
ｎ）のため、通常低レベルの生産物遺伝子を発現する。
生産物遺伝子の発現レベルは、メトトレキセートを用い
た増幅により増加する。この薬品は、ｄｈｆｒ酵素の直
接の阻害剤であり、そのｄｈｆｒ遺伝子コピー数を十分
に拡大し、これらの条件下で生き残る耐性コロニーの分
離ができる。ｄｈｆｒおよび生産物遺伝子は、もとの形
質転換細胞において、通常密接に結合しているので、通
常共存の増幅が存在し、所望の生産物遺伝子の発現を増
大させる。
【０００４】選択および増幅の別の系が、国際出願８７
／０４４６２号に記載されているグルタミン シンテタ
ーゼ選択マーカー（すなわちＧＳシステム）により供給
される。ＧＳ酵素および所望の抗体遺伝子をコードする
遺伝子をうまくトランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、
ＰＣＴ公開番号８７／０４４６２号に記載されているよ
うに、グルタミンのない媒地でコロニーを培養し、メチ
オニン スルホキシミン（Ｍｓｘ）を添加して増幅させ
ることにより、選別することができる。
【０００５】工学的に作り出されたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ
細胞系に生産物遺伝子と選択マーカー遺伝子をトランス
フェクトしたもの）は、血清を含む媒地中で通常増殖さ
せる。（文献：Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐ．Ｇｅｎ．１９８
１，１，１６５〜１７５；Ｍｏｌ＆Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．５， １７５０〜１７５９、１９８５；ＰＮＡＳ８
０，４６５４〜４６５８；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ
Ｇｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ４， １６６〜１
７２，１９８４）。他の哺乳動物の血清も用いられる
が、牛胎児血清（ＦＢＳ）はおそらく哺乳動物の細胞培
養に最も広範囲に用いられる血清である。しかしながら
血清の使用は多くの問題を引き起こす。血清は、商業的
生産に必要な量を容易に入手できない高価な商品であ
る。それはまた生化学的にはっきりわかっていない材料
である。血清は、アルブミンやトランフェリンを含む多
くの主成分と、その多くが十分に確認されておらずその
作用が測定されていない少量成分を含むことが知られて
おり、かくて血清はバッチごとに異り、様々な成分のレ
ベルおよびそれらの細胞に及ぼす影響を決めるために試
験する必要がある。しばしば血清はウイルスやマイコブ
ラズマのような微生物で汚染され、その多くは無害であ
るが、付加的な未知の要因を加える。この問題は近年Ｂ
ｏｖｉｎｅ Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ Ｅｎｃｅｐｈａｌ
ｏｐａｔｈｙ（ＢＳＥ）の発生により深刻になってい
る。スクリーニングの改良にもかかわらず、取締当局は
（ＢＳＥ）感染のない地域からの牛生産物の出所を要求
する傾向がある。
【０００６】さらに培地中に動物タンパク質が存在する
と非常に長い精製工程を必要とし、特に牛血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）中の牛の抗体の存在は組換えＣＨＯ細胞系
により発現される所望の抗体の精製を非常に困難にす
る。使用に先立って媒地から牛の抗体を除去することは
可能であるが、このことおよび必要とされる付加的な生
産物の試験が、生産物の全体の生産コストに大いに加わ
る。したがって動物成分がなく、細胞、特にＣＨＯ細胞
の増殖を支援する培地を探索する多くの研究が行われて
いる。不幸なことにそのような培地の供給に伴う問題そ
のものが無数にある。ＣＨＯ細胞は血清のない状態では
容易に増殖しない。さらに血清を除くと細胞保護と解毒
活性を与える成分をも除去することになる。
【０００７】血清は含まないが動物成分は含む培地が、
ＣＨＯ Ｋｌ細胞の培養に用いるため、Ｍｅｎｄｉａｚ
等により記載されている（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ
ｕｌａｒ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ２２巻２号１９８６）。この培地は“ＨａｍのＦ１
２”として知られているＨａｍ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ５３，１９６５，２８８〜２９３）により開発され
た培地の改変である。他の培地の例は、例えばＥＰＡ３
９０３２７号およびＥＰ３２５１９０号に開示されてい
るようにＨａｍのＦ１２をベースにしている。これらの
培地は血清代替物としてトランフェリンを含むが、トラ
ンスフェリンは動物源に由来し、したがって生成した媒
地は血清の使用に伴う汚染問題を克服していない。
【０００８】血清を含まない培地を使用することから生
ずるさらなる問題は、組換えＣＨＯ細胞が増殖し生産物
を発現可能にするのを支援するという問題である。血清
を補わないＨａｍのＦ１２をベースにした培地は通常十
分な増殖と発現を支援するのに十分栄養に富んでいな
い。
【０００９】工学的に作り出されたＣＨＯ細胞はまた懸
濁液中で生育させるのが困難である。その細胞を用いた
時、懸濁液中での増殖を達成し、抗体のような生産物を
発現することが非常に望ましい。商業的なスケールでの
生物的タンパク質の生産のためには、１リットルのガラ
ス容器から、数千リットルのステンレススチールタンク
までの範囲のファーメンター中での増殖を支援できるこ
とが望ましい。適切な培地は、ブレードインペラーまた
はタービン、およびスパージング（すなわち空気、酸素
および炭酸ガスを泡の形で培地に供給する）の影響から
のせん断応力に対して細胞を支援できなければならな
い。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、血清を含ま
ず、生化学的に明確な培地であって、ＣＨＯ細胞をよく
増殖させ、細胞生産物をよく発現させる培地を提供する
ことを目的とする。本発明はまた、そのような培地で生
育するよう順応させたＣＨＯ細胞を提供することをも目
的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】したがって本発明は、動
物源から分離したタンパク質、脂質および炭水化物を本
質的に含まず、水、浸透圧調節剤、緩衝剤、エネルギー
源、Ｌ−グルタミンを含むアミノ酸類、無機また組換え
た鉄源、細換えまたは合成の成長因子、並びに任意的に
非鉄金属イオン、ビタミン類、および補因子類を含む、
工学的に作り出されたＣＨＯ細胞を培養するための、生
化学的に定義された培地を提供する。
【００１２】培地成分は大部分無機の、合成のまたは組
換えたものであり、動物源から直接得られるものではな
い。いくつかの成分は植物または細菌源から得られる。
組換成分は、その成分を作るのに用いられる細胞へ継代
する親の組織からの汚染の危険を最小限にするために非
常に純粋な状態の下で製造する。さらなる精製工程を、
細胞タンパク質を除去するために用いる。かくて動物源
から分離したタンパク質、脂質および炭水化物をすべ
て、本質的に含まない培地を達成できる。本発明の好ま
しい培地は、動物源から分離したタンパク質、脂質、お
よび炭水化物を含まない。
【００１３】浸透圧を２００〜３５０ｍＯｓｎの範囲
に、好ましくは２９０〜３５０ｍＯｓｍの範囲に維持す
るのが有利である。浸透圧調節剤は通常塩である。培地
に用いる塩にはＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＫＮＯ３がある。
【００１４】培地に用いる緩衝剤によりｐＨを６．５〜
７．５の範囲に、最も好ましくはｐＨ７．０付近に維持
する。培地に用いる緩衝剤は、ＮａＨＣＯ３のような炭
酸塩類、ＣａＣｌ２ ２Ｈ２ Ｏ，ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２
Ｏ，ＮａＨ２ ＰＯ４ ２Ｈ２ Ｏのような塩化物
類、硫酸塩類、リン酸塩類、またはピルビン酸ナトリウ
ムを含む。そのような緩衝剤は通常５０〜５００ｍｇ／
リットル存在させる。ＨＥＰＥＳとしても知られている
Ｎ−〔２−ヒドロキシエチル〕ピペラジン−Ｎ′−〔２
−エタンスルホン酸〕およびＭＯＰＳとして知られてい
る３−〔Ｎ−モルホリノ〕−プロパンスルホン酸のよう
な他の緩衝剤は通常１０００〜１０，０００ｍｇ／リッ
トル存在する。
【００１５】媒地に使用するエネルギー源は通常１００
０〜１０，０００ｍｇ／リットル存在し、好ましくはマ
ンノース、フラクトース、ガラクトースまたはマルトー
スの如き単糖類であり、最も好ましくはグルコース、特
にＤ−グルコースである。
【００１６】培地に任意的に用いる非鉄金属イオンには
マグネシウム、銅および亜鉛、またナトリウム、カリウ
ム、およびセレニウムがある。イオンは通常、塩化物、
硫酸塩のような塩の形で培地に加える。量は表１に示す
ＩＳＣＯＶＥＳ培地での量と典型的には同じであるが、
明らかに変化させてもよい。
【００１７】媒地に任意的に用いるビタミン類および酵
素補因子ビタミン類（補因子）には、０．０１〜０．５
ｍｇ／リットルのビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタ
ミンＢ１２（シアノコバラミン）およびビタミンＫ（ビ
オチン）、１０〜３０ｍｇ／リットルのビタミンＣ（ア
スコルビン酸）、０．１〜１．０ｍｇ／リットルのビタ
ミンＢ２（リボフラビン）、並びに０．２〜８．０ｍｇ
／リットルのビタミンＢ１（チアミン）、ニコチンアミ
ド、ビタミンＢ５（Ｄカルシウムペントテネート）、葉
酸、ｉ−イノシトールがある。
【００１８】基本的な培地にはコリンクロライド、リポ
酸、オレイン酸、ホスファチジルコリン、またはメチル
リネオレエートのような脂質因子を、通常０．０５〜
１０ｍｇ／リットル含ませることが好ましい。エタノー
ルアミンの如きアルコールアミンのような脂質生産に含
まれる化合物も加えてよい。
【００１９】培地中に、次のものから選択する付加的な
アミノ酸類を含有させることが好ましい。アミノ酸 好ましいｍｇ／リットル Ｌ−アラニン ２０− ５０ Ｌ−アルギニン（ＨＣｌ） ５０−１００ Ｌ−アスパラギン（Ｈ２ Ｏ） ２０− ５０ Ｌ−アスパラギン酸 ２０− ５０ Ｌ−シスチン（二ナトリウム塩） ５０−１００ Ｌ−グルタミン酸 ５０−１００ Ｌ−グルタミン ４００−６００ グリシン ２０− ５０ Ｌ−ヒスチジン（ＨＣｌ．Ｈ２ Ｏ） ３０− ６０ Ｌ−イソロイシン ５０−１５０ Ｌ−ロイシン ５０−１５０ Ｌ−リシン（ＨＣｌ） １００−２００ Ｌ−メチオニン ２０− ５０ Ｌ−フェニルアラニン ４０− ８０ Ｌ−プロリン ３０− ６０ Ｌ−セリン ３０− ６０ Ｌ−スレオニン ５０−１２０ Ｌ−トリプトファン １０− ２０ Ｌ−チロシン（二ナトリウム塩） ５０−１２０ Ｌ−バリン ８０−１２０ かっこ内の形が好ましい。
【００２０】アミノ酸類は好ましくは合成したものであ
る。通常含まれる量は各アミノ酸によって変るが、一般
的には１０〜１５０ｍｇ／ｍｌの範囲である。しかしＬ
−グルタミン酸は一般に高濃度で、好ましくは４００〜
６００ｍｇ／ｍｌ存在する。
【００２１】ｐＨ指示薬、例えばフェノールレッドナト
リウム塩を、例えば５〜５０ｍｇ／リットル、培地に含
ませることは有益である。
【００２２】表１に示した培地Ａは、本発明の培地のベ
ースとしての、好ましい量の水、浸透圧調節剤、緩衝
剤、エネルギー源、アミノ酸類、非鉄金属イオン、ビタ
ミン類、および補因子を提供する培地の一例である。こ
の培地はヒポキサンチンまたはチミジンを含有せず、Ｇ
ＩＢＣＯ（株）、ユニット４、カウリーミルＴｄ，Ｅｓ
ｔ，ユックスブリッジＵＢ８２ＹＧから、商業的に入手
できる。それは公表された培地（Ｉｓｃｏｖｅｓ ａｎ
ｄ Ｍｅｌｃｈｅｒ（１９７８）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ，１，４７，９２３）に似ているが、牛血清アルブミ
ン、純粋なヒトのトランスフェリンまたは大豆レシチン
を含まない。
【００２３】
【表１】
【表２】 Ｉｓｃｏｖｅｓ ＮおよびＭｅｌｃｈｅｒのＤＭＥＭ改
変（１９７８），Ｊ．Ｅｘｐ・Ｍｅｄ．１， ４７，９
２３．
【００２４】第一鉄または第二鉄イオンおよび酸素の毒
性効果の可能性を最小限にするのを助けるため、セレニ
ウム（任意的にソジウムセレナイトの形で）通常０．０
１〜０．２ｍｇ／リットル、またはＬ−アスコルビン酸
を２０〜５０ｍｇ／リットル、培地に加えるのが好まし
い。さらにクエン酸またはエチレンジアミンテトラ酢酸
（ＥＤＴＡ）のようなキレート剤、またはα−トセフェ
ロール（ビタミンＥ）のようなフリーラジカル捕捉剤を
使用することは、フリーラジカルによる損傷を少くする
のに有益である。
【００２５】ポリミキシン、ネオマイシン、ペニシリン
またはストレプトマイシンのような抗生物質を、細菌汚
染を防止するため培地に加えてもよい。これらは通常１
０，０００〜１００，０００Ｉｕ／リットル含まれる。
【００２６】基本的な培地に加える生長因子は合成の、
または組換えのものであり、インスリンを含む。血小板
由来生長因子（ＰＤＦＧ）、チロキシンＴ３，スロンビ
ン、１Ｌ２および１Ｌ６の如きインターロイキン類、プ
ロゲステロン、ハイドロコーチゾン、およびビタミンＥ
のような他の因子を含ませてもよい。葉酸経路に含まれ
る葉酸、ビタミンＢ６およびビタミンＢ１２を細胞の増
殖を促進するために加えてもよい。
【００２７】ペプチドホルモンインスリン（本文中では
ヌセリン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙの商標）のようなその類
似物を含む）は組換えＤＮＡの技術により有利に得られ
るが、動物源からは分離されない。それは培地に５μｇ
／リットル加えるのが好ましい。ヌセリンは本発明に用
いるための、インスリンの好ましい形態である。
【００２８】培地に補う動物に由来しない鉄源は、好ま
しくは無機のものであり、０．２５〜５ｍｇ／リットル
存在する。例としてはクエン酸第二鉄または硫酸第一鉄
のような第二および第一鉄塩がある。クエン酸第二鉄お
よびクエン酸第二鉄アンモニウムのようなキレート性塩
が好ましい。しかし、動物源から分離されない任意の鉄
源、例えば化学的鉄キレート化剤または組換えタンパク
質鉄担体、を使用してもよい。
【００２９】第二鉄または第一鉄イオンは媒地中にスー
パーオキサイドおよびフリーラジカルを発生するのを助
け、それらは細胞自体ばかりでなく、媒地成分や所望の
最終生産物に損傷を与えるので、その濃度は注意深く調
節すべきである。
【００３０】小胞体の構造を維持するのに役割を演じ、
増殖を支援するためにいくつかのＣＨＯ細胞系により必
要とされることが知られている、プトレシンのような化
合物を、有利にはＨＣｌのような塩として、媒地に加え
ることも好ましい。プトレシンまたはその塩は好ましく
は０．０１〜１．０ｍｇ／リットル加える。
【００３１】今日までに開示された、血清を含まない培
地はヒポキサンチンまたはチミジンを含有する。これは
ｄｈｆｒ選択に置かれた選択圧力と、以前に開示された
増殖システムを迂回する。その結果は生産物を指定する
遺伝性物質とｄｈｆｒ遺伝子の損失である。それ故、本
発明の他の側面においては、本質的にヒポキサンおよび
／またはチミジンを含まない、本発明の工学的に作りだ
されたｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞の増殖用の培地を提供す
る。
【００３２】本発明の培地はＣＨＯ細胞の増殖を支援
し、ｄｈｆｒ系に対しメトトレキセートのような適当な
薬剤を通常０．１〜５．０μＭ（またはＧＳシステムに
対しＭＳＸ）を補うと、十分な選択圧力が細胞に及ぼさ
れる。ｄｈｆｒシステムの選択を迂回するのには不十分
な濃度のヒポキサンチンおよびチミジンが培地中に存在
してもよいことは理解されるが、これら２つのヌクレオ
チド前駆体が存在することは本発明の使用には好ましく
ない。
【００３３】ラージスケールのファーメンターでは、哺
乳動物の細胞は、容器をガスでスパージンクし、インペ
ラーで攪拌することにより生ずるせん断応力の影響を受
けやすい。細胞の損傷の発生を最小限にするために、培
地にポリエチレングリコール、ポリピニルアルコール
類、またはプルロニックポリオール類のような細胞保護
剤を含有させるのが有益である。これらの中でプルロニ
ック（ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ（株）の商標）ポ
リオールＦ６８が、ポリビニルアルコールと異り無毒性
の物質であり、ポリエチレングリコールと異り後の精製
を妨害しないので、好ましい。
【００３４】ＣＨＯ細胞増殖におけるさらなる改良は、
トリプトン、カゼイン加水分解物、酵母抽出物、または
好ましくはパパイン消化ソヤペプトンのような、ペプチ
ド消化物、加水分解物または抽出物を培地に補うことに
よって得られるかもしれない。好ましい量は１〜０．０
２５％（重量／容量）、最も好ましくは０．２５％（重
量／容量）である。
【００３５】組換えＣＨＯ細胞を培養するための本発明
の培地は、小スケールおよび大スケールのファーメンタ
ー、静置培養および／またはスピンナー中の懸濁液にお
ける増殖と、そのような細胞からの生産物の分泌を支援
することができる。本発明の培地はまた、高細胞濃度
の、すなわち１×１０５細胞／ｍｌ以上で、１．５×１
０６細胞／ｍｌまでまたは以上、増殖、および３０ｍｇ
／リットル〜１５０ｍｇ／リットル以上の生産物分泌を
支援することができる。本発明の培地はまた、６か月ま
でまたはそれ以上続く多数回の継代にわたって、増殖と
生産物分泌を支援することもできる。
【００３６】この培地は、天然のまたは改変されたすべ
ての型の抗体の生産用に好ましい。したがって本発明
は、ＨおよびＬ鎖のアミノ酸配列が、ヒトのリンパ細胞
によりインビホであるいはハイブリドーマによりインビ
トロで作られる抗体のこれらの配列と一致する、ヒトの
抗体の生産を含む。またＨおよびＬ鎖は天然の抗体に一
致するが、天然に起らない方法で結合しているハイブリ
ッド抗体をも提供する。例えば二特異性の抗体は一以上
の抗体に特異的な抗原結合部位を有する。抗体の定常領
域は抗原結合部位の一つまたは他と関係し、あるいは別
の抗体からのものである。改変された抗体、例えばキメ
ラ抗体は、一つの抗体からの可変領域と他の抗体からの
定常領域を有する。このようにしてキメラ抗体は種／種
のキメラ、またはクラス／クラスのキメラでありうる。
そのようなキメラ抗体は、抗原結合能を改良し、あるい
はエフエクター機能を変えるため、一以上のさらなる改
変を有するかも知れない。人体適応化またはＣＤＲグラ
フト抗体（ＥＰ２３９４００号）は本発明に包含され
る。特にカンパス１Ｈ（ＥＰ３２８４０４号（カンパス
はＷｅｌｌｃｏｍｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの商標であ
る）も複合の抗体であり、ＣＤＲｓに加えて超可変領域
の一部もヒトのフレームワークに移される。そのような
抗体のフレームワークまたは定常領域中の他のアミノ酸
も変えられるかも知れない。本発明はさらに、Ｈおよび
Ｌ鎖のＹブランチ部分とほぼ同等なＦａｂフラグメント
の製造を含む。これは不完全なフラグメントまたはＦｃ
領域の一部分を含むフラグメントを含む。
【００３７】本発明の更なる側面において、本発明の媒
地中で増殖するよう適応させた工学的に作り出されたＣ
ＨＯ細胞を提供する。特にＣＨＯ細胞が、組織プラスミ
ノーゲンアクティベーターまたは上に定義した抗体のよ
うなタンパク質を発現するよう作り出された。特に本発
明は、生物的に活性なタンパク質をコードする遺伝子お
よびｄｈｆｒ選択マーカー遺伝子をトランスフェクト
し、本発明の培地で増殖するよう適応させたｄｈｆｒ−
ＣＨＯ細胞系を提供する。
【００３８】培地成分は任意の順序で加えてよいが、沈
澱を避けるため、鉄源および、使用する場合にはチロシ
ンは最後に加えるのが望ましい。
【００３９】
【実施例】実施例１培地ＷＣＭ４用の調合物 媒地Ａ：（表１に示したＢＳＡ、トランスフェリン、レ
シチンを除いたＤＭＥＭのＩｓｃｏｖｅｓ改変） ＋ ５ｍｌ／リットル ２００ｍＭ Ｌグルタミン ＋ ５０ｍｇ／リットル Ｌプロリン ＋ ５０ｍｇ／リットル Ｌスレオニン ＋ ５０ｍｇ／リットル Ｌメチオニン ＋ ５０ｍｇ／リットル Ｌシステイン ＋ ５０ｍｇ／リットル Ｌチロシン ＋ ２５ｍｇ．リットル アスコルビン酸 ＋ ０．０６２ｍｇ．リットル ビタミンＢ６ ＋ １．３６ｍｇ．リットル ビタミンＢ１２ ＋ ０．２ｍｇ／リットル リポ酸 ＋ ０．０８８ｍｇ／リットル リノレン酸メチル ＋ １μＭ メトトレキセート ＋ １ ｍｇ／リットル ＦｅＳＯ４ ＋ １ ｍｇ／リットル ＺｎＳＯ４ ＋ ０．００２５ｍｇ／リットル ＣｕＳＯ４ ＋ ５ ｍｇ／リットル 組換えインスリン（ヌセリン） ＋ ５０，０００Ｉｕ／リットル ポリミキシン ＋ ２０，０００Ｉｕ／リットル ネオマイシン ＋ ０．１６ｍｇ／リットル プトレシン−２ＨＣＬ．
【００４０】この培地は、メトトレキセート選択を迂回
する、ヒポキサンチン、チミジン、またはフォリン酸を
含有しない。この培地は単独で選択を迂回するグリシン
を含まない。したがってこの培地はメトトレキセート低
抗性のための完全な選択を保持する。
【００４１】実施例２培地ＷＣＭ５用の調合物 培地Ａ：（ＢＳＡ、トランスフェリンまたはレシチンを
除いたＤＭＥＭのＩｓｃｏｖｅｓ改変） ＋ ５ｍｌ／リットル ２００ｍＭ Ｌグルタミン ＋ ５０ｍｇ／リットル Ｌプロリン ＋ ５０ｍｇ／リットル Ｌスレオニン ＋ ５０ｍｇ／リットル Ｌメチオニン ＋ ５０ｍｇ／リットル Ｌシステイン ＋ ５０ｍｇ／リットル Ｌチロシン ＋ ２５ｍｇ／リットル Ｌアスコルビン酸 ＋ ０．０６２ｍｇ．リットル ビタミンＢ６ ＋ １．３６ｍｇ．リットル ビタミンＢ１２ ＋ ２ ｍｇ／リットル クエン酸第二鉄 ＋ １ ｍｇ／リットル 硫酸亜鉛 ＋ ０．００２５ｍｇ．リットル 硫酸銅 ＋ ５０，０００ＩＵ／リットル ポリミキシン ＋ ２０，０００ＩＵ／リットル ネオマイシン ＋ ３μｌ／リットル エタノールアミン ＋ ０．１６ｍｇ／リットル プトレシン ＋ ５ ｍｇ／リットル 組換えインスリン（ヌセリン）
【００４２】実施例３ＷＣＭ４中でのＣＩＨ ３ＤＩＩ＊の増殖とそれからの
生産 ＣＩＨ ３ＤＩＩ＊は遺伝子的に作り出したＣＨＯ Ｄ
ＵＫ ＢＩＩ細胞（ＶｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ
（１９８０）ＰＮＡＳ７７，７ ｐｐ ４２１６〜４２
２０）である。ＣＨＯ ＤＵＫ ＢＩＩ細胞はジヒドロ
フォレート レダクターゼ（ｄｈｆｒ）を生産すること
ができない。この細胞を、ＨおよびＬ鎖およびマウスの
ｄｈｆｒを発現するプラスミド コンストラクトを用い
て、人体適応化ＩｇＧ抗体、カンパス１Ｈ（Ｗｉｎｔｅ
ｒ等、Ｎａｔｕｒｅ，１９８８、３２２、３２３〜３２
７）を生産するよう作り出した。発現は葉酸拮抗剤メト
トレートを用いて増幅し維持した。Ｉｓｃｏｖｅｓ＋１
０％ＦＢＳフロー、非必須アミノ酸、１０−６Ｍメトト
レキセートおよび抗生物質中で単層として増殖したＣＩ
Ｈ ３ＤＩＩ＊細胞は９０％集密的であった。これらの
細胞をトリプシン／ベルセンによりプラスチックから除
去し、補充しないＩｓｃｏｖｅｓ媒地で洗浄し、遠心分
離し、メトトレキセート（ＭＴＸ）を含まない、ＷＣＭ
４媒地＋０．２５％ペプトン＋０．１％ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）１０，０００＋０．５％牛胎児血清
（ＦＢＳ）中に５×１０４／ｍｌで再懸濁させた。細胞
懸濁液＋ヒポキサンチン（Ｈ）、チミジン（Ｔ）、また
はＨＴの１０ｍｌを入れた、３個の２５ｃｍ２フラスコ
を準備した。これらのフラスコを３６．５℃で５％ＣＯ
２インキュベーター中で培養した。
【００４３】６日後フラスコをプールし、ペプトンまた
はＰＥＧを含まない等体積のＷＣＭ４＋ＭＴＸに加え、
７５ｃｍ２フラスコに移した。
【００４４】これらの細胞を、３６．５℃で培養し、４
０ｒｐｍでスピンする５００ｍｌテヒナースピンナーに
接種するのに用いた。細胞は５か月以上の期間、血清な
しで増殖を続け、細胞は適応期間を必要とすることがわ
かったが、増殖速度と生存率は着実に改良された。集団
倍加時間は、約７週間にわたって７３．１時間であると
計算された。これは次の２０日にわたって４７．４時間
に減少し、次に安定化した。抗体の分泌は６０μｇ／ｍ
ｌ以上のレベルで高く維持された。これらの細胞中の遺
伝子コピー数は、ノーサンブロット分析を用いたバンド
強度によると減少しなかった。
【００４５】ファーメンターではこれらの細胞は７０μ
ｇ／ｍｌ以上の抗体を生産し、１００μｇ／ｍｌ以上の
レベルに達した。その細胞をＣＩＨ ３ＤＩＩ＊４４と
表示する。
【００４６】実施例４１リットルファーメンターでのＷＣＭ５中でのＣＩＨ
３ＤＩＩ＊の増殖と生産 ２か月にわたって血清なしで増殖していた実施例３のＣ
ＩＨ ３ＤＩＩ＊４４細胞を、７０ｒｐｍで回転するス
テンレススチールの曲がったバドルを有するＳＧｉの１
リットルのファーメンターに移した。温度を３７℃に、
ｄＯ２を１０％に、ｐＨコントロールを７〜７．２にセ
ットした。ファーメンターに０日目に、０．１％のポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）１０，０００および０．
２５％のソイペプトンを含むＷＣＭ４（実施例１）中に
０．２２×１０６細胞／ｍｌ接種し酸素ガスを頂部に供
給した。細胞は新鮮な培地を用いてルーティンに培養
し、スプリット比は典型的には１対２および１対４の間
であった。
【００４７】３３日目に、頂部ガス供給を、細胞により
大きい物理的損傷を起こすと予期される深部スパージン
グに切り換えた。
【００４８】５０日目以降、ＷＣＭ４の代りに、ＷＣＭ
５（実施例２）をペプトンおよびＰＥＧと共に用いた。
【００４９】５３日目にＰＥＧを０．１％のプルロニッ
クＦ６８に置換した。生じた増殖および抗体のレベルを
添付図面（図１および２）に示すが、ファーメンター中
で１００μｇ／ｍｌ以上の抗体をタンパク質なしで生産
できる本発明の能力を示している。
【００５０】実施例５ＷＣＭ４中でのＣＨＯ ＡＪ１９ ＭＣＢＩの増殖と血
清を含有する培地中で生育したＣＨＯ ＡＪ１９ ＭＣ
ＢＩとの比較 ＣＨＯ ＤＵＫ細胞から誘導するチャイニーズハムスタ
ー卵巣細胞、ＣＨＯＡＪ１９ ＭＣＢＩ（Ｖｒｌａｕｂ
およびＣｈａｓｉｎ ＰＮＡＳ，７７，７，ｐｐ ４２
１６〜４２２０，１９８０）を、メトトレキセート選択
下にｔＰＡを生産するよう遺伝子的に作り出した。この
細胞系は、ＲＰＭＩ １６４０培地（ＧＩＢＣＯ）、
２．５％酸加水分解成牛血清（Ｉｍｐｅｒｉａｌ）、
０．５％トリプトン、５０ＩＶ／ｍｌポリマイシン、２
０ＩＶ／ｍｌネオマイシン、５００ｎＭメトトレキセー
ト（ＭＴＸ）よりなる正常増殖培地を用いて、懸濁培養
としてファーメンター中でルーティンに増殖させてあっ
た。
【００５１】次のものを加えた培地ＷＣＭ４を調合し
た。 ４６Ｂ ０．２５％（重量／体積）ソイペプトン（Ｓｉｇｍａ Ｐ １２６５ ）、０．１％（重量／体積）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２０ ，０００（Ｓｅｒｖａ Ｃａｒｂｏｗａｘ ２０Ｍ）、１μｍ ＭＴ Ｘ ４６Ｃ ０．２５％（重量／体積）イーストエクストラクト（Ｓｉｇｍａ Ｙ Ｏ５００）、０．１％（重量／体積）ＰＥＧ２０，０００、１μＭ ＭＴＸ この培地ではＣＭ４中のＩｓｃｏｖｅｓ′をＲＰＭｌ １６４０培地 （ＩＣＮ ＦＩＯＷ）で置き換えた。 ４６Ｄ ０．２５％（重量／体積）イーストエクストラクト、０．１％（重量 ／体積）ＰＥＧ２０，０００、１μＭ ＭＴＸ ４６Ｅ ０．２５％（重量／体積）イーストエクストラクト、０．１％（重量 ／体積）ＰＥＧ２０，０００、０．２５％牛胎児血清（Ｉｍｐｅｒｉ ａｌ）、１μＭ ＭＴＸ
【００５２】イーストエクストラクト、ペプトンおよび
ＰＥＧは水（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ媒地製造ユニット）で１
０％（重量／体積）として調製し、０．２μｍの使い捨
てフィルター（Ｇｅｌｍａｎ、Ｓｕｐｏｒ Ｖａｃ）で
濾過し、次に使用のために希釈した。細胞を５％のＣＯ
２を含有する調湿したインキュベーター中で３７℃で培
養した。
【００５３】正常増殖培地で増殖した細胞は、１２００
ｇ、＋４℃での５分間の遠心分離によりペレット化し、
補充物のないＲＰＭＩ ｌ６４０中で洗浄し、再びペレ
ット化した。その細胞を、正常増殖培地（４６Ａ）およ
び他の培地（４６Ｂ、４６Ｃ、４６Ｄまたは４６Ｅ）中
で、１０５細胞／ｍｌに再懸濁した。２４ウェルプレー
ト（Ｃｏｓｔａｒ １６ｍｍウェル）に１ｍｌ／ウェ
ル、接種し、５％ＣＯ２を有するインキュベート中で３
７℃で培養した。３、４、５および６日目に、それぞれ
の一つのウェルを血球計数器およびトリパンブルー排除
を用いて細胞数を算えた。それぞれのさらに二つのウェ
ルを収穫し、プールし、１２００ｇ、＋４℃、５分でペ
レットにした。上清液を分離し、−２０℃で貯蔵した。
これらの試料を次にｔＰＡに関し分析した。６日目には
４６Ａおよび４６Ｄからの試料のみを収穫した。
【００５４】結果 様々な粗収穫物中のｔＰＡ比活性 ５つの異る培地中で生産された粗物質を、ｔＰＡに対す
るポリクローナル抗体への結合を用いるｔＰＡ抗原濃度
を測定するＱＡ確証ＥＬＩＳＡ分析、およびｔＰＡ活性
をＩＵ／ｍｌで測定する血餅溶解（ｃｌｏｔ ｌｙｓｉ
ｓ）を用いて、試験した。これらの結果（表２）から、
比活性を計算した。
【００５５】
【表３】
【００５６】上表より、５つの異った粗生産物中での比
活性の変化はない。タンパク質を含まない媒地Ｂ、Ｃ、
およびＤからのｔＰＡの収量は、グループＡおよびＥの
標準増殖培地からのｔＰＡの収量にほぼ等しい。
【００５７】実施例６ＷＣＭ４中でのＣＨＯ ＡＪ１９ ＭＣＢＩの連続増殖 正常増殖培地中で増殖するＷＣＭ４系ＣＨＯ ＡＪ１９
ＭＣＢＩを、実施例５のようにしてペレットにし洗浄
し、５００ｍｌの媒地４６Ｂ中に７×１０４／ｍｌで再
懸濁させた。様々な時間間隔で細胞の数を算え、同じ媒
地を用いて二次培養した。試料をｔＰＡ分析のために取
り、実施例５のように処理した。
【００５８】様々な細胞二次培養中のｔＰＡ比活性 ペプトンおよび０．１％ＰＥＧ ２０Ｋを有するＷＣＭ
４中で増殖した様々な継代レベルからの上清の比活性
を、ＥＬＩＳＡおよび血餅溶解を組み合わせて測定し
た。異った細胞継代の比活性を表３に要約する。
【００５９】
【表４】
【００６０】４８日の期間にわたって、上記スプリット
比に基づくと、一つの細胞は分裂して３．７７×１０８
の細胞になった。これは倍加時間３６時間の３１．８集
団倍価に相当する
【００６１】実施例５およびせ６で行った実験結果は、
本発明の血清を含有しない培地が、血清含有培地で達成
されるのと比較できる細胞増殖とｔＰＡ収量を支援する
ことができることを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】９０日にわたって細胞数／ｍｌとして測定し
た、１リットルファーメンター中でのＷＣＭ５（タンパ
ク質を含まない培地）中でのＣＩＨ ３ＤＩＩ＊４４の
増殖を示す。
【図２】８０日にわたって抗体のｍｇ／ｍｌとして測定
した、１リットルファーメンター中でのＷＣＭ５中での
ＣＩＨ ３ＤＩＩ＊４４細胞からの抗体生産を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−196268（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−5859（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−500946（ＪＰ，Ａ) 欧州公開 390327（ＥＰ，Ａ１) 欧州公開 389786（ＥＰ，Ａ２)

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生物学的に活性な蛋白質をコードする遺
    伝子及びｄｈｆｒ選択マーカー遺伝子で形質転換された
    ｄｈｆｒ−ＣＨＯセルラインを培養するための生化学的
    に定義された培地であって、 本質的にヒポキサンチンおよびチミジンを含まず、 動物源から分離したタンパク質、脂肪および炭水化物を
    本質的に含まず、水、浸透圧調節剤、緩衝剤、エネルギ
    ー源、Ｌ−グルタミンを含むアミノ酸類、無機または組
    換え鉄源、組換えまたは合成の成長因子、並びに必要に
    より非鉄金属イオン、ビタミン類、および補因子類を含
    む、上記培地。
  2. 【請求項２】 浸透圧調節剤が培地を２００〜３５０ｍ
    Ｏｓｍに維持する、請求項１に記載の培地。
  3. 【請求項３】 緩衝剤が培地をｐＨ域６．５〜７．５に
    維持する、請求項１に記載の培地。
  4. 【請求項４】 エネルギー源が１，０００〜１０，００
    ０ｍｇ／リットル存在する、請求項１に記載の培地。
  5. 【請求項５】 エネルギー源が単糖類である、請求項４
    に記載の培地。
  6. 【請求項６】 アミノ酸類が、Ｌ−アラニン、Ｌ−アル
    ギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−
    シスチン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジ
    ン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ
    −メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、
    Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ
    −チロシン、Ｌ−バリンから選択される１以上のもので
    ある、請求項１に記載の培地。
  7. 【請求項７】 Ｌ−グルタミンが４００〜６００ｍｇ／
    リットル存在する、請求項１に記載の培地。
  8. 【請求項８】 培地がさらに脂質因子を０．０５〜１０
    ｍｇ／リットル含む、請求項１に記載の培地。
  9. 【請求項９】 鉄源が０．２５〜５ｍｇ／リットルの無
    機第二または第一鉄塩である、請求項１から８のいずれ
    かに記載の培地。
  10. 【請求項１０】 生長因子を、インシュリン、ＰＤＧ
    Ｆ、チロキシンＴ３、スロンビン、インターロイキン、
    ブロゲステロン、ハイドロコーチゾン、およびビタミン
    Ｅから選択する、請求項１から９のいずれかに記載の培
    地。
  11. 【請求項１１】 生長因子がヌセリンである、請求項１
    ０に記載の培地。
  12. 【請求項１２】 ペプチド消化物、加水分解物または抽
    出物を含む、請求項１から１１のいずれかに記載の培
    地。
  13. 【請求項１３】 メトトレキセートを含む、請求項１か
    ら１２のいずれかに記載の培地。
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