JP2625302B2 - 培 地 - Google Patents

培 地

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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、チャイニーズハムスタ
ー卵巣(CHO)細胞系を培養するための、生化学的に
定義された培地、およびその培地で増殖するよう適応さ
せた細胞に関する。
【0002】
【従来の技術】チャイニーズハムスター卵巣細胞(CH
O)は、puck(J.Exp・Med.108,94
5,1958)により、メスのチャイニーズハムスター
からの卵巣生検から、最初に培養された。これらのオリ
ジナルの細胞から、多くの研究者は様々な欠陥を有する
多数の亜系(sud−lines)をクローン化した。
その一つであるCHO−Klはプロリン要求性であり、
ジハイドロフォレートリダクターゼ(dhfr)遺伝子
について2倍体である。この細胞系から、1つのdhf
r遺伝子での変異および続いて起こる他の遺伝子の滅亡
の結果としての、dhfr機能が失われたことに特徴の
あるdhfrCHO細胞系(CHODUK Bll)
が開発された(PNAS 77 ,1980,4216
−4220)。これらの細胞は機能的にdhfrであ
る。表現型としてdhfrである他のCHO DUK
亜系も誘導されている。dhfrであるCHO細胞
は、チミジン、ヒポキサンチン、または同等のヌクレオ
シドのようなヌクレオチド前駆体なしには増殖できな
い。
【0003】E.Coli X GPRT遺伝子(J.
Mol.App.Gen.1981,,165〜17
5)、ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーター(M
ol&Cell Biol.,1750〜1759,
1985)、ヒト免疫(γ)インターフェロン(PNA
S 80、4654〜4658)、およびヒトβインタ
ーフェロン(Molecular and Cellu
lar Biology,166〜172,198
4)を含む。様々なタンパク質が、そのようなCHO細
胞中で発現している。あるdhfrCHO細胞系は、
生産物遺伝子およひdhfr表現型のCHO形質転換
細胞の選別を可能にするdhfr遺伝子を、トランスフ
ェクトされる。選別は、チミジンおよびヒポキサンチン
のない媒地中でコロニーを培養することにより行われ、
それらがないことは形質転換されない細胞が増殖するの
を妨げる。形質転換細胞は、両方のトランスフェクトさ
れた遺伝子の共組込み(co−integrutio
n)のため、通常低レベルの生産物遺伝子を発現する。
生産物遺伝子の発現レベルは、メトトレキセートを用い
た増幅により増加する。この薬品は、dhfr酵素の直
接の阻害剤であり、そのdhfr遺伝子コピー数を十分
に拡大し、これらの条件下で生き残る耐性コロニーの分
離ができる。dhfrおよび生産物遺伝子は、もとの形
質転換細胞において、通常密接に結合しているので、通
常共存の増幅が存在し、所望の生産物遺伝子の発現を増
大させる。
【0004】選択および増幅の別の系が、国際出願87
/04462号に記載されているグルタミン シンテタ
ーゼ選択マーカー(すなわちGSシステム)により供給
される。GS酵素および所望の抗体遺伝子をコードする
遺伝子をうまくトランスフェクトされたCHO細胞は、
PCT公開番号87/04462号に記載されているよ
うに、グルタミンのない媒地でコロニーを培養し、メチ
オニン スルホキシミン(Msx)を添加して増幅させ
ることにより、選別することができる。
【0005】工学的に作り出されたCHO細胞(CHO
細胞系に生産物遺伝子と選択マーカー遺伝子をトランス
フェクトしたもの)は、血清を含む媒地中で通常増殖さ
せる。(文献:J.Mol.App.Gen.198
1,,165〜175;Mol&Cell Bio
l., 1750〜1759、1985;PNAS
,4654〜4658;Molecular and
Gellular Biology, 166〜1
72,1984)。他の哺乳動物の血清も用いられる
が、牛胎児血清(FBS)はおそらく哺乳動物の細胞培
養に最も広範囲に用いられる血清である。しかしながら
血清の使用は多くの問題を引き起こす。血清は、商業的
生産に必要な量を容易に入手できない高価な商品であ
る。それはまた生化学的にはっきりわかっていない材料
である。血清は、アルブミンやトランフェリンを含む多
くの主成分と、その多くが十分に確認されておらずその
作用が測定されていない少量成分を含むことが知られて
おり、かくて血清はバッチごとに異り、様々な成分のレ
ベルおよびそれらの細胞に及ぼす影響を決めるために試
験する必要がある。しばしば血清はウイルスやマイコブ
ラズマのような微生物で汚染され、その多くは無害であ
るが、付加的な未知の要因を加える。この問題は近年B
ovine Spongiform Encephal
opathy(BSE)の発生により深刻になってい
る。スクリーニングの改良にもかかわらず、取締当局は
(BSE)感染のない地域からの牛生産物の出所を要求
する傾向がある。
【0006】さらに培地中に動物タンパク質が存在する
と非常に長い精製工程を必要とし、特に牛血清アルブミ
ン(BSA)中の牛の抗体の存在は組換えCHO細胞系
により発現される所望の抗体の精製を非常に困難にす
る。使用に先立って媒地から牛の抗体を除去することは
可能であるが、このことおよび必要とされる付加的な生
産物の試験が、生産物の全体の生産コストに大いに加わ
る。したがって動物成分がなく、細胞、特にCHO細胞
の増殖を支援する培地を探索する多くの研究が行われて
いる。不幸なことにそのような培地の供給に伴う問題そ
のものが無数にある。CHO細胞は血清のない状態では
容易に増殖しない。さらに血清を除くと細胞保護と解毒
活性を与える成分をも除去することになる。
【0007】血清は含まないが動物成分は含む培地が、
CHO Kl細胞の培養に用いるため、Mendiaz
等により記載されている(In Vitro Cell
ular & Development Biolog
y22巻2号1986)。この培地は“HamのF1
2”として知られているHam(Microbiolo
gy53,1965,288〜293)により開発され
た培地の改変である。他の培地の例は、例えばEPA3
90327号およびEP325190号に開示されてい
るようにHamのF12をベースにしている。これらの
培地は血清代替物としてトランフェリンを含むが、トラ
ンスフェリンは動物源に由来し、したがって生成した媒
地は血清の使用に伴う汚染問題を克服していない。
【0008】血清を含まない培地を使用することから生
ずるさらなる問題は、組換えCHO細胞が増殖し生産物
を発現可能にするのを支援するという問題である。血清
を補わないHamのF12をベースにした培地は通常十
分な増殖と発現を支援するのに十分栄養に富んでいな
い。
【0009】工学的に作り出されたCHO細胞はまた懸
濁液中で生育させるのが困難である。その細胞を用いた
時、懸濁液中での増殖を達成し、抗体のような生産物を
発現することが非常に望ましい。商業的なスケールでの
生物的タンパク質の生産のためには、1リットルのガラ
ス容器から、数千リットルのステンレススチールタンク
までの範囲のファーメンター中での増殖を支援できるこ
とが望ましい。適切な培地は、ブレードインペラーまた
はタービン、およびスパージング(すなわち空気、酸素
および炭酸ガスを泡の形で培地に供給する)の影響から
のせん断応力に対して細胞を支援できなければならな
い。
【0010】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、血清を含ま
ず、生化学的に明確な培地であって、CHO細胞をよく
増殖させ、細胞生産物をよく発現させる培地を提供する
ことを目的とする。本発明はまた、そのような培地で生
育するよう順応させたCHO細胞を提供することをも目
的とする。
【0011】
【課題を解決するための手段】したがって本発明は、動
物源から分離したタンパク質、脂質および炭水化物を本
質的に含まず、水、浸透圧調節剤、緩衝剤、エネルギー
源、L−グルタミンを含むアミノ酸類、無機また組換え
た鉄源、細換えまたは合成の成長因子、並びに任意的に
非鉄金属イオン、ビタミン類、および補因子類を含む、
工学的に作り出されたCHO細胞を培養するための、生
化学的に定義された培地を提供する。
【0012】培地成分は大部分無機の、合成のまたは組
換えたものであり、動物源から直接得られるものではな
い。いくつかの成分は植物または細菌源から得られる。
組換成分は、その成分を作るのに用いられる細胞へ継代
する親の組織からの汚染の危険を最小限にするために非
常に純粋な状態の下で製造する。さらなる精製工程を、
細胞タンパク質を除去するために用いる。かくて動物源
から分離したタンパク質、脂質および炭水化物をすべ
て、本質的に含まない培地を達成できる。本発明の好ま
しい培地は、動物源から分離したタンパク質、脂質、お
よび炭水化物を含まない。
【0013】浸透圧を200〜350mOsnの範囲
に、好ましくは290〜350mOsmの範囲に維持す
るのが有利である。浸透圧調節剤は通常塩である。培地
に用いる塩にはNaCl,KCl,KNOがある。
【0014】培地に用いる緩衝剤によりpHを6.5〜
7.5の範囲に、最も好ましくはpH7.0付近に維持
する。培地に用いる緩衝剤は、NaHCOのような炭
酸塩類、CaCl 2H O,MgSO 7H
O,NaH PO 2H Oのような塩化物
類、硫酸塩類、リン酸塩類、またはピルビン酸ナトリウ
ムを含む。そのような緩衝剤は通常50〜500mg/
リットル存在させる。HEPESとしても知られている
N−〔2−ヒドロキシエチル〕ピペラジン−N′−〔2
−エタンスルホン酸〕およびMOPSとして知られてい
る3−〔N−モルホリノ〕−プロパンスルホン酸のよう
な他の緩衝剤は通常1000〜10,000mg/リッ
トル存在する。
【0015】媒地に使用するエネルギー源は通常100
0〜10,000mg/リットル存在し、好ましくはマ
ンノース、フラクトース、ガラクトースまたはマルトー
スの如き単糖類であり、最も好ましくはグルコース、特
にD−グルコースである。
【0016】培地に任意的に用いる非鉄金属イオンには
マグネシウム、銅および亜鉛、またナトリウム、カリウ
ム、およびセレニウムがある。イオンは通常、塩化物、
硫酸塩のような塩の形で培地に加える。量は表1に示す
ISCOVES培地での量と典型的には同じであるが、
明らかに変化させてもよい。
【0017】媒地に任意的に用いるビタミン類および酵
素補因子ビタミン類(補因子)には、0.01〜0.5
mg/リットルのビタミンB(ピリドキシン)、ビタ
ミンB12(シアノコバラミン)およびビタミンK(ビ
オチン)、10〜30mg/リットルのビタミンC(ア
スコルビン酸)、0.1〜1.0mg/リットルのビタ
ミンB(リボフラビン)、並びに0.2〜8.0mg
/リットルのビタミンB(チアミン)、ニコチンアミ
ド、ビタミンB(Dカルシウムペントテネート)、葉
酸、i−イノシトールがある。
【0018】基本的な培地にはコリンクロライド、リポ
酸、オレイン酸、ホスファチジルコリン、またはメチル
リネオレエートのような脂質因子を、通常0.05〜
10mg/リットル含ませることが好ましい。エタノー
ルアミンの如きアルコールアミンのような脂質生産に含
まれる化合物も加えてよい。
【0019】培地中に、次のものから選択する付加的な
アミノ酸類を含有させることが好ましい。アミノ酸 好ましいmg/リットル L−アラニン 20− 50 L−アルギニン(HCl) 50−100 L−アスパラギン(H O) 20− 50 L−アスパラギン酸 20− 50 L−シスチン(二ナトリウム塩) 50−100 L−グルタミン酸 50−100 L−グルタミン 400−600 グリシン 20− 50 L−ヒスチジン(HCl.H O) 30− 60 L−イソロイシン 50−150 L−ロイシン 50−150 L−リシン(HCl) 100−200 L−メチオニン 20− 50 L−フェニルアラニン 40− 80 L−プロリン 30− 60 L−セリン 30− 60 L−スレオニン 50−120 L−トリプトファン 10− 20 L−チロシン(二ナトリウム塩) 50−120 L−バリン 80−120 かっこ内の形が好ましい。
【0020】アミノ酸類は好ましくは合成したものであ
る。通常含まれる量は各アミノ酸によって変るが、一般
的には10〜150mg/mlの範囲である。しかしL
−グルタミン酸は一般に高濃度で、好ましくは400〜
600mg/ml存在する。
【0021】pH指示薬、例えばフェノールレッドナト
リウム塩を、例えば5〜50mg/リットル、培地に含
ませることは有益である。
【0022】表1に示した培地Aは、本発明の培地のベ
ースとしての、好ましい量の水、浸透圧調節剤、緩衝
剤、エネルギー源、アミノ酸類、非鉄金属イオン、ビタ
ミン類、および補因子を提供する培地の一例である。こ
の培地はヒポキサンチンまたはチミジンを含有せず、G
IBCO(株)、ユニット4、カウリーミルTd,Es
t,ユックスブリッジUB82YGから、商業的に入手
できる。それは公表された培地(Iscoves an
d Melcher(1978)、J.Exp.Me
d,1,47,923)に似ているが、牛血清アルブミ
ン、純粋なヒトのトランスフェリンまたは大豆レシチン
を含まない。
【0023】
【表1】
【表2】 Iscoves NおよびMelcherのDMEM改
変(1978),J.Exp・Med.1, 47,9
23.
【0024】第一鉄または第二鉄イオンおよび酸素の毒
性効果の可能性を最小限にするのを助けるため、セレニ
ウム(任意的にソジウムセレナイトの形で)通常0.0
1〜0.2mg/リットル、またはL−アスコルビン酸
を20〜50mg/リットル、培地に加えるのが好まし
い。さらにクエン酸またはエチレンジアミンテトラ酢酸
(EDTA)のようなキレート剤、またはα−トセフェ
ロール(ビタミンE)のようなフリーラジカル捕捉剤を
使用することは、フリーラジカルによる損傷を少くする
のに有益である。
【0025】ポリミキシン、ネオマイシン、ペニシリン
またはストレプトマイシンのような抗生物質を、細菌汚
染を防止するため培地に加えてもよい。これらは通常1
0,000〜100,000Iu/リットル含まれる。
【0026】基本的な培地に加える生長因子は合成の、
または組換えのものであり、インスリンを含む。血小板
由来生長因子(PDFG)、チロキシンT,スロンビ
ン、1L2および1L6の如きインターロイキン類、プ
ロゲステロン、ハイドロコーチゾン、およびビタミンE
のような他の因子を含ませてもよい。葉酸経路に含まれ
る葉酸、ビタミンBおよびビタミンB12を細胞の増
殖を促進するために加えてもよい。
【0027】ペプチドホルモンインスリン(本文中では
ヌセリン(Eli Lillyの商標)のようなその類
似物を含む)は組換えDNAの技術により有利に得られ
るが、動物源からは分離されない。それは培地に5μg
/リットル加えるのが好ましい。ヌセリンは本発明に用
いるための、インスリンの好ましい形態である。
【0028】培地に補う動物に由来しない鉄源は、好ま
しくは無機のものであり、0.25〜5mg/リットル
存在する。例としてはクエン酸第二鉄または硫酸第一鉄
のような第二および第一鉄塩がある。クエン酸第二鉄お
よびクエン酸第二鉄アンモニウムのようなキレート性塩
が好ましい。しかし、動物源から分離されない任意の鉄
源、例えば化学的鉄キレート化剤または組換えタンパク
質鉄担体、を使用してもよい。
【0029】第二鉄または第一鉄イオンは媒地中にスー
パーオキサイドおよびフリーラジカルを発生するのを助
け、それらは細胞自体ばかりでなく、媒地成分や所望の
最終生産物に損傷を与えるので、その濃度は注意深く調
節すべきである。
【0030】小胞体の構造を維持するのに役割を演じ、
増殖を支援するためにいくつかのCHO細胞系により必
要とされることが知られている、プトレシンのような化
合物を、有利にはHClのような塩として、媒地に加え
ることも好ましい。プトレシンまたはその塩は好ましく
は0.01〜1.0mg/リットル加える。
【0031】今日までに開示された、血清を含まない培
地はヒポキサンチンまたはチミジンを含有する。これは
dhfr選択に置かれた選択圧力と、以前に開示された
増殖システムを迂回する。その結果は生産物を指定する
遺伝性物質とdhfr遺伝子の損失である。それ故、本
発明の他の側面においては、本質的にヒポキサンおよび
/またはチミジンを含まない、本発明の工学的に作りだ
されたdhfrCHO細胞の増殖用の培地を提供す
る。
【0032】本発明の培地はCHO細胞の増殖を支援
し、dhfr系に対しメトトレキセートのような適当な
薬剤を通常0.1〜5.0μM(またはGSシステムに
対しMSX)を補うと、十分な選択圧力が細胞に及ぼさ
れる。dhfrシステムの選択を迂回するのには不十分
な濃度のヒポキサンチンおよびチミジンが培地中に存在
してもよいことは理解されるが、これら2つのヌクレオ
チド前駆体が存在することは本発明の使用には好ましく
ない。
【0033】ラージスケールのファーメンターでは、哺
乳動物の細胞は、容器をガスでスパージンクし、インペ
ラーで攪拌することにより生ずるせん断応力の影響を受
けやすい。細胞の損傷の発生を最小限にするために、培
地にポリエチレングリコール、ポリピニルアルコール
類、またはプルロニックポリオール類のような細胞保護
剤を含有させるのが有益である。これらの中でプルロニ
ック(BASF Wyandotte(株)の商標)ポ
リオールF68が、ポリビニルアルコールと異り無毒性
の物質であり、ポリエチレングリコールと異り後の精製
を妨害しないので、好ましい。
【0034】CHO細胞増殖におけるさらなる改良は、
トリプトン、カゼイン加水分解物、酵母抽出物、または
好ましくはパパイン消化ソヤペプトンのような、ペプチ
ド消化物、加水分解物または抽出物を培地に補うことに
よって得られるかもしれない。好ましい量は1〜0.0
25%(重量/容量)、最も好ましくは0.25%(重
量/容量)である。
【0035】組換えCHO細胞を培養するための本発明
の培地は、小スケールおよび大スケールのファーメンタ
ー、静置培養および/またはスピンナー中の懸濁液にお
ける増殖と、そのような細胞からの生産物の分泌を支援
することができる。本発明の培地はまた、高細胞濃度
の、すなわち1×10細胞/ml以上で、1.5×1
細胞/mlまでまたは以上、増殖、および30mg
/リットル〜150mg/リットル以上の生産物分泌を
支援することができる。本発明の培地はまた、6か月ま
でまたはそれ以上続く多数回の継代にわたって、増殖と
生産物分泌を支援することもできる。
【0036】この培地は、天然のまたは改変されたすべ
ての型の抗体の生産用に好ましい。したがって本発明
は、HおよびL鎖のアミノ酸配列が、ヒトのリンパ細胞
によりインビホであるいはハイブリドーマによりインビ
トロで作られる抗体のこれらの配列と一致する、ヒトの
抗体の生産を含む。またHおよびL鎖は天然の抗体に一
致するが、天然に起らない方法で結合しているハイブリ
ッド抗体をも提供する。例えば二特異性の抗体は一以上
の抗体に特異的な抗原結合部位を有する。抗体の定常領
域は抗原結合部位の一つまたは他と関係し、あるいは別
の抗体からのものである。改変された抗体、例えばキメ
ラ抗体は、一つの抗体からの可変領域と他の抗体からの
定常領域を有する。このようにしてキメラ抗体は種/種
のキメラ、またはクラス/クラスのキメラでありうる。
そのようなキメラ抗体は、抗原結合能を改良し、あるい
はエフエクター機能を変えるため、一以上のさらなる改
変を有するかも知れない。人体適応化またはCDRグラ
フト抗体(EP239400号)は本発明に包含され
る。特にカンパス1H(EP328404号(カンパス
はWellcome Foundationの商標であ
る)も複合の抗体であり、CDRに加えて超可変領域
の一部もヒトのフレームワークに移される。そのような
抗体のフレームワークまたは定常領域中の他のアミノ酸
も変えられるかも知れない。本発明はさらに、Hおよび
L鎖のYブランチ部分とほぼ同等なFabフラグメント
の製造を含む。これは不完全なフラグメントまたはF
領域の一部分を含むフラグメントを含む。
【0037】本発明の更なる側面において、本発明の媒
地中で増殖するよう適応させた工学的に作り出されたC
HO細胞を提供する。特にCHO細胞が、組織プラスミ
ノーゲンアクティベーターまたは上に定義した抗体のよ
うなタンパク質を発現するよう作り出された。特に本発
明は、生物的に活性なタンパク質をコードする遺伝子お
よびdhfr選択マーカー遺伝子をトランスフェクト
し、本発明の培地で増殖するよう適応させたdhfr
CHO細胞系を提供する。
【0038】培地成分は任意の順序で加えてよいが、沈
澱を避けるため、鉄源および、使用する場合にはチロシ
ンは最後に加えるのが望ましい。
【0039】
【実施例】実施例1培地WCM4用の調合物 媒地A:(表1に示したBSA、トランスフェリン、レ
シチンを除いたDMEMのIscoves改変) + 5ml/リットル 200mM Lグルタミン + 50mg/リットル Lプロリン + 50mg/リットル Lスレオニン + 50mg/リットル Lメチオニン + 50mg/リットル Lシステイン + 50mg/リットル Lチロシン + 25mg.リットル アスコルビン酸 + 0.062mg.リットル ビタミンB6 + 1.36mg.リットル ビタミンB12 + 0.2mg/リットル リポ酸 + 0.088mg/リットル リノレン酸メチル + 1μM メトトレキセート + 1 mg/リットル FeSO + 1 mg/リットル ZnSO + 0.0025mg/リットル CuSO + 5 mg/リットル 組換えインスリン(ヌセリン) + 50,000Iu/リットル ポリミキシン + 20,000Iu/リットル ネオマイシン + 0.16mg/リットル プトレシン−2HCL.
【0040】この培地は、メトトレキセート選択を迂回
する、ヒポキサンチン、チミジン、またはフォリン酸を
含有しない。この培地は単独で選択を迂回するグリシン
を含まない。したがってこの培地はメトトレキセート低
抗性のための完全な選択を保持する。
【0041】実施例2培地WCM5用の調合物 培地A:(BSA、トランスフェリンまたはレシチンを
除いたDMEMのIscoves改変) + 5ml/リットル 200mM Lグルタミン + 50mg/リットル Lプロリン + 50mg/リットル Lスレオニン + 50mg/リットル Lメチオニン + 50mg/リットル Lシステイン + 50mg/リットル Lチロシン + 25mg/リットル Lアスコルビン酸 + 0.062mg.リットル ビタミンB6 + 1.36mg.リットル ビタミンB12 + 2 mg/リットル クエン酸第二鉄 + 1 mg/リットル 硫酸亜鉛 + 0.0025mg.リットル 硫酸銅 + 50,000IU/リットル ポリミキシン + 20,000IU/リットル ネオマイシン + 3μl/リットル エタノールアミン + 0.16mg/リットル プトレシン + 5 mg/リットル 組換えインスリン(ヌセリン)
【0042】実施例3WCM4中でのCIH 3DII*の増殖とそれからの
生産 CIH 3DII*は遺伝子的に作り出したCHO D
UK BII細胞(VrlaubおよびChasin
(1980)PNAS77,7 pp 4216〜42
20)である。CHO DUK BII細胞はジヒドロ
フォレート レダクターゼ(dhfr)を生産すること
ができない。この細胞を、HおよびL鎖およびマウスの
dhfrを発現するプラスミド コンストラクトを用い
て、人体適応化IgG抗体、カンパス1H(Winte
r等、Nature,1988、322、323〜32
7)を生産するよう作り出した。発現は葉酸拮抗剤メト
トレートを用いて増幅し維持した。Iscoves+1
0%FBSフロー、非必須アミノ酸、10−6Mメトト
レキセートおよび抗生物質中で単層として増殖したCI
H 3DII*細胞は90%集密的であった。これらの
細胞をトリプシン/ベルセンによりプラスチックから除
去し、補充しないIscoves媒地で洗浄し、遠心分
離し、メトトレキセート(MTX)を含まない、WCM
4媒地+0.25%ペプトン+0.1%ポリエチレング
リコール(PEG)10,000+0.5%牛胎児血清
(FBS)中に5×10/mlで再懸濁させた。細胞
懸濁液+ヒポキサンチン(H)、チミジン(T)、また
はHTの10mlを入れた、3個の25cmフラスコ
を準備した。これらのフラスコを36.5℃で5%CO
インキュベーター中で培養した。
【0043】6日後フラスコをプールし、ペプトンまた
はPEGを含まない等体積のWCM4+MTXに加え、
75cmフラスコに移した。
【0044】これらの細胞を、36.5℃で培養し、4
0rpmでスピンする500mlテヒナースピンナーに
接種するのに用いた。細胞は5か月以上の期間、血清な
しで増殖を続け、細胞は適応期間を必要とすることがわ
かったが、増殖速度と生存率は着実に改良された。集団
倍加時間は、約7週間にわたって73.1時間であると
計算された。これは次の20日にわたって47.4時間
に減少し、次に安定化した。抗体の分泌は60μg/m
l以上のレベルで高く維持された。これらの細胞中の遺
伝子コピー数は、ノーサンブロット分析を用いたバンド
強度によると減少しなかった。
【0045】ファーメンターではこれらの細胞は70μ
g/ml以上の抗体を生産し、100μg/ml以上の
レベルに達した。その細胞をCIH 3DII44と
表示する。
【0046】実施例41リットルファーメンターでのWCM5中でのCIH
3DII*の増殖と生産 2か月にわたって血清なしで増殖していた実施例3のC
IH 3DII*44細胞を、70rpmで回転するス
テンレススチールの曲がったバドルを有するSGiの1
リットルのファーメンターに移した。温度を37℃に、
dOを10%に、pHコントロールを7〜7.2にセ
ットした。ファーメンターに0日目に、0.1%のポリ
エチレングリコール(PEG)10,000および0.
25%のソイペプトンを含むWCM4(実施例1)中に
0.22×10細胞/ml接種し酸素ガスを頂部に供
給した。細胞は新鮮な培地を用いてルーティンに培養
し、スプリット比は典型的には1対2および1対4の間
であった。
【0047】33日目に、頂部ガス供給を、細胞により
大きい物理的損傷を起こすと予期される深部スパージン
グに切り換えた。
【0048】50日目以降、WCM4の代りに、WCM
5(実施例2)をペプトンおよびPEGと共に用いた。
【0049】53日目にPEGを0.1%のプルロニッ
クF68に置換した。生じた増殖および抗体のレベルを
添付図面(図1および2)に示すが、ファーメンター中
で100μg/ml以上の抗体をタンパク質なしで生産
できる本発明の能力を示している。
【0050】実施例5WCM4中でのCHO AJ19 MCBIの増殖と血
清を含有する培地中で生育したCHO AJ19 MC
BIとの比較 CHO DUK細胞から誘導するチャイニーズハムスタ
ー卵巣細胞、CHOAJ19 MCBI(Vrlaub
およびChasin PNAS,77,7,pp 42
16〜4220,1980)を、メトトレキセート選択
下にtPAを生産するよう遺伝子的に作り出した。この
細胞系は、RPMI 1640培地(GIBCO)、
2.5%酸加水分解成牛血清(Imperial)、
0.5%トリプトン、50IV/mlポリマイシン、2
0IV/mlネオマイシン、500nMメトトレキセー
ト(MTX)よりなる正常増殖培地を用いて、懸濁培養
としてファーメンター中でルーティンに増殖させてあっ
た。
【0051】次のものを加えた培地WCM4を調合し
た。 46B 0.25%(重量/体積)ソイペプトン(Sigma P 1265 )、0.1%(重量/体積)ポリエチレングリコール(PEG)20 ,000(Serva Carbowax 20M)、1μm MT X 46C 0.25%(重量/体積)イーストエクストラクト(Sigma Y O500)、0.1%(重量/体積)PEG20,000、1μM MTX この培地ではCM4中のIscoves′をRPMl 1640培地 (ICN FIOW)で置き換えた。 46D 0.25%(重量/体積)イーストエクストラクト、0.1%(重量 /体積)PEG20,000、1μM MTX 46E 0.25%(重量/体積)イーストエクストラクト、0.1%(重量 /体積)PEG20,000、0.25%牛胎児血清(Imperi al)、1μM MTX
【0052】イーストエクストラクト、ペプトンおよび
PEGは水(Wellcome媒地製造ユニット)で1
0%(重量/体積)として調製し、0.2μmの使い捨
てフィルター(Gelman、Supor Vac)で
濾過し、次に使用のために希釈した。細胞を5%のCO
を含有する調湿したインキュベーター中で37℃で培
養した。
【0053】正常増殖培地で増殖した細胞は、1200
g、+4℃での5分間の遠心分離によりペレット化し、
補充物のないRPMI l640中で洗浄し、再びペレ
ット化した。その細胞を、正常増殖培地(46A)およ
び他の培地(46B、46C、46Dまたは46E)中
で、10細胞/mlに再懸濁した。24ウェルプレー
ト(Costar 16mmウェル)に1ml/ウェ
ル、接種し、5%COを有するインキュベート中で3
7℃で培養した。3、4、5および6日目に、それぞれ
の一つのウェルを血球計数器およびトリパンブルー排除
を用いて細胞数を算えた。それぞれのさらに二つのウェ
ルを収穫し、プールし、1200g、+4℃、5分でペ
レットにした。上清液を分離し、−20℃で貯蔵した。
これらの試料を次にtPAに関し分析した。6日目には
46Aおよび46Dからの試料のみを収穫した。
【0054】結果 様々な粗収穫物中のtPA比活性 5つの異る培地中で生産された粗物質を、tPAに対す
るポリクローナル抗体への結合を用いるtPA抗原濃度
を測定するQA確証ELISA分析、およびtPA活性
をIU/mlで測定する血餅溶解(clot lysi
s)を用いて、試験した。これらの結果(表2)から、
比活性を計算した。
【0055】
【表3】
【0056】上表より、5つの異った粗生産物中での比
活性の変化はない。タンパク質を含まない媒地B、C、
およびDからのtPAの収量は、グループAおよびEの
標準増殖培地からのtPAの収量にほぼ等しい。
【0057】実施例6WCM4中でのCHO AJ19 MCBIの連続増殖 正常増殖培地中で増殖するWCM4系CHO AJ19
MCBIを、実施例5のようにしてペレットにし洗浄
し、500mlの媒地46B中に7×10/mlで再
懸濁させた。様々な時間間隔で細胞の数を算え、同じ媒
地を用いて二次培養した。試料をtPA分析のために取
り、実施例5のように処理した。
【0058】様々な細胞二次培養中のtPA比活性 ペプトンおよび0.1%PEG 20Kを有するWCM
4中で増殖した様々な継代レベルからの上清の比活性
を、ELISAおよび血餅溶解を組み合わせて測定し
た。異った細胞継代の比活性を表3に要約する。
【0059】
【表4】
【0060】48日の期間にわたって、上記スプリット
比に基づくと、一つの細胞は分裂して3.77×10
の細胞になった。これは倍加時間36時間の31.8集
団倍価に相当する
【0061】実施例5およびせ6で行った実験結果は、
本発明の血清を含有しない培地が、血清含有培地で達成
されるのと比較できる細胞増殖とtPA収量を支援する
ことができることを示す。
【図面の簡単な説明】
【図1】90日にわたって細胞数/mlとして測定し
た、1リットルファーメンター中でのWCM5(タンパ
ク質を含まない培地)中でのCIH 3DII*44の
増殖を示す。
【図2】80日にわたって抗体のmg/mlとして測定
した、1リットルファーメンター中でのWCM5中での
CIH 3DII*44細胞からの抗体生産を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−196268(JP,A) 特開 平2−5859(JP,A) 特表 平2−500946(JP,A) 欧州公開 390327(EP,A1) 欧州公開 389786(EP,A2)

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 生物学的に活性な蛋白質をコードする遺
    伝子及びdhfr選択マーカー遺伝子で形質転換された
    dhfrCHOセルラインを培養するための生化学的
    に定義された培地であって、 本質的にヒポキサンチンおよびチミジンを含まず、 動物源から分離したタンパク質、脂肪および炭水化物を
    本質的に含まず、水、浸透圧調節剤、緩衝剤、エネルギ
    ー源、L−グルタミンを含むアミノ酸類、無機または組
    換え鉄源、組換えまたは合成の成長因子、並びに必要に
    より非鉄金属イオン、ビタミン類、および補因子類を含
    む、上記培地。
  2. 【請求項2】 浸透圧調節剤が培地を200〜350m
    Osmに維持する、請求項1に記載の培地。
  3. 【請求項3】 緩衝剤が培地をpH域6.5〜7.5に
    維持する、請求項1に記載の培地。
  4. 【請求項4】 エネルギー源が1,000〜10,00
    0mg/リットル存在する、請求項1に記載の培地。
  5. 【請求項5】 エネルギー源が単糖類である、請求項4
    に記載の培地。
  6. 【請求項6】 アミノ酸類が、L−アラニン、L−アル
    ギニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−
    シスチン、L−グルタミン酸、グリシン、L−ヒスチジ
    ン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシン、L
    −メチオニン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、
    L−セリン、L−スレオニン、L−トリプトファン、L
    −チロシン、L−バリンから選択される1以上のもので
    ある、請求項1に記載の培地。
  7. 【請求項7】 L−グルタミンが400〜600mg/
    リットル存在する、請求項1に記載の培地。
  8. 【請求項8】 培地がさらに脂質因子を0.05〜10
    mg/リットル含む、請求項1に記載の培地。
  9. 【請求項9】 鉄源が0.25〜5mg/リットルの無
    機第二または第一鉄塩である、請求項1から8のいずれ
    かに記載の培地。
  10. 【請求項10】 生長因子を、インシュリン、PDG
    F、チロキシンT、スロンビン、インターロイキン、
    ブロゲステロン、ハイドロコーチゾン、およびビタミン
    Eから選択する、請求項1から9のいずれかに記載の培
    地。
  11. 【請求項11】 生長因子がヌセリンである、請求項1
    0に記載の培地。
  12. 【請求項12】 ペプチド消化物、加水分解物または抽
    出物を含む、請求項1から11のいずれかに記載の培
    地。
  13. 【請求項13】 メトトレキセートを含む、請求項1か
    ら12のいずれかに記載の培地。
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