ES2298301T3 - Medio de cultivo para celulas cho y celulas cho adaptadas. - Google Patents

Abstract

Un medio de cultivo definido bioquímicamente para el cultivo de células de CHO DHFR- manipuladas genéticamente para producir un producto seleccionado entre el grupo constituido por: anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos injertados con CDR, activador de plasminógeno de tipo tisular, cuyo medio está libre de proteína, lípido y carbohidrato aislado a partir de una fuente animal, en el que dicho medio comprende: (a) agua; (b) un regulador de la osmolalidad para mantener la osmolalidad del medio dentro del intervalo de 200-350 mOsm; (c) un tampón para mantener el pH del medio dentro del intervalo de 6, 5 a 7, 5; (d) una fuente de energía de monosacárido en el intervalo de 1000-10.000 mg/litro; (e) aminoácidos, incluyendo L-glutamina en el intervalo de 400-600 mg/ml; (f) una fuente de hierro recombinante o una fuente de hierro inorgánico dentro del intervalo de 0, 25 a 5 mg/litro; (g) insulina recombinante o sintética; (h) un potenciador del desarrollo de células queestá implicado en la vía folato seleccionado entre el grupo constituido por ácido fólico, vitamina B6, vitamina B12; (i) un factor lípido en el intervalo de 0, 05-10 mg/litro; en el que dicho medio está esencialmente libre de hipoxantina y/o timidina.

Description

Medio de cultivo para células CHO y células CHO adaptadas.

La presente invención se refiere a un medio de cultivo definido bioquímicamente para el cultivo de líneas de células de ovario de hamster chino (CHO) y células adaptadas para desarrollarse en el medio de cultivo.

Las células de ovario de hamster chino (CHO) fueron cultivadas por primera vez por Puck (J. Exp. Med., vol. 108, pág. 945, (1958)) a partir de una biopsia de un ovario procedente de un hamster chino hembra. A partir de estas células originales diversos investigadores han clonado un cierto número de de sub-líneas con diversas deficiencias, una de las cuales, la CHO-K1, requiere prolina y es diploide para el gen dihidrofolato reductasa (dhfr). A partir de esta línea de células se desarrolló una línea de células de CHO dhfr^{-} (CHO DUK B11) (PNAS, vol. 77, págs. 4216-4220, (1980)), la cual se caracteriza por la pérdida de la función dhfr como una consecuencia de una mutación en un gen dhfr y la subsiguiente pérdida del otro gen. Estas células son funcionalmente dfhr^{-}. Se han obtenido otras sub-líneas de CHO DUK, las cuales son igualmente fenotípicamente dhfr^{-}. Las células de CHO que son dhfr^{-} no pueden desarrollarse sin precursores de nucleótidos tales como timidina, hipoxantina, o los nucleósidos equivalentes.

Se han expresado diversas proteínas en dichas células de CHO incluyendo el gen XGPRT de E. coli (J. Mol. App. Gen., vol. 1, págs. 165-175, (1981)), el activador de plasminógeno de tipo tisular humano (Mol & Cell Biol., vol. 5, págs. 1750-1759, (1985)), el (\gamma) interferón inmune humano (PNAS, vol. 80, págs. 4654-4658), y el beta interferón humano (Molecular and Cellular Biology, vol. 4, págs. 166-172, (1984)). Una línea de células de CHO dhfr^{-} se transfectó con un gen producto y un gen dhfr, lo cual hizo posible la selección de transformantes de células de CHO del fenotipo dhfr^{+}. La selección se llevó a cabo mediante el cultivo de las colonias en medios exentos de timidina e hipoxantina, cuya ausencia previene el desarrollo de las células no transformadas. Usualmente, los transformantes expresan bajos niveles del gen producto debido a la co-integración de ambos genes transfectados. Los niveles de expresión para el gen producto pueden incrementarse mediante amplificaciones usando metotrexato. Este fármaco es un inhibidor directo de la enzima dhfr y permite aislamientos de colonias resistentes que han amplificado su número de copias del gen de manera suficiente como para sobrevivir bajo estas condiciones. Puesto que los genes dhfr y producto están usualmente íntimamente ligados en los transformantes originales, existe normalmente una amplificación simultánea que da como resultado un incremento en la expresión del gen producto deseado.

Un sistema diferente de selección y amplificación es el proporcionado por el marcador seleccionable de la glutamina sintetasa (o sistema GS), el cual se describe en la patente WO 87/04462. Las células de CHO que han sido transfectadas satisfactoriamente con el gen que codifica la enzima GS y el gen del anticuerpo deseado pueden seleccionarse mediante el cultivo de colonias en medios exentos de glutamina y amplificación mediante la adición de metionina sulfoxina (Msx), tal como se describe en la solicitud PCT publicada número WO 87/04462.

Las células de CHO manipuladas genéticamente (aquellas en las cuales una línea de células de CHO ha sido transfectada con un gen producto y un gen marcador seleccionable) se desarrollan de manera rutinaria en medios de cultivo que contienen suero. (Referencias: J. Mol. Appl. Gen., vol. 1, págs. 165-175, (1981); Mol & Cell Biol., vol. 5, págs. 1750-1759, (1985); PNAS, vol. 80, págs. 4654-4658); Molecular and Cellular Biology, vol. 4, págs. 166-172, (1984). El suero bovino fetal (FBS) es probablemente el suero más extensamente usado para el cultivo de células de mamíferos, aunque se usan otros sueros de mamíferos. Sin embargo, el uso de suero plantea un cierto número de problemas. El suero es un artículo costoso que no está fácilmente disponible en las cantidades requeridas para producciones comerciales. Además, es un material bioquímicamente indefinido. El suero se sabe que contiene muchos componentes principales que incluyen albúmina y transferrina e igualmente componentes menores muchos de los cuales no han sido completamente identificados ni determinada su acción, por ello, el suero diferirá de un lote a otro lote lo que posiblemente requiere su ensayo para determinar los niveles de los diversos componentes y su efecto sobre las células. Frecuentemente, el suero está contaminado con microorganismos tales como virus y micoplasma muchos de los cuales pueden ser inocuos pero representarán un factor adicional desconocido. Este problema ha llegado a ser más agudo en los últimos años con la aparición de la encelopatía espongiforme bovina (BSE). A pesar de las mejoras en el rastreo, las autoridades reguladoras están dispuestas a exigir el origen de productos bovinos procedentes de aquellas áreas que están libres de infecciones (BSE).

Además, la presencia de proteínas animales en los medios de cultivo puede requerir procedimientos de purificación bastante largos, en particular la presencia de anticuerpos de bovinos en la albúmina de suero bovino (BSA) hace extremadamente difícil la purificación de los anticuerpos deseados expresados por la línea de células de CHO recombinantes. La separación del anticuerpo bovino del medio antes de su uso es posible, pero este y el ensayo adicional requerido del producto, aumenta grandemente el coste total de producción del producto. En consecuencia, se ha investigado mucho en el hallazgo de un medio de cultivo exento de componentes animales que soporten el desarrollo celular, especialmente de células de CHO. Desgraciadamente, los problemas asociados con la disposición de un medio de este tipo son, por sí mismos, numerosos. Las células de CHO no se desarrollan fácilmente en condiciones libres de suero. Además, la separación del suero puede igualmente separar aquellos componentes que proporcionan protección y actividad destoxificante a las células.

Un medio de cultivo que está libre de suero pero no libre de componentes animales es el descrito por Mendiaz y otros ( In Vitro Cellular & Development Biology, vol. 22, No. 2, (1986)) para uso en el cultivo de células de CHO K1. El medio es una modificación del medio desarrollado por Ham (Microbiology, vol. 53, págs. 288-293, (1965)), el cual es conocido como "F12 de Ham". Otros ejemplos de medios están basados en el medio F12 de Ham, por ejemplo, tal como se describe en el documento EP-A-390327 y la patente EP 325190. Estos medios contienen transferrina como el substituto del suero, pero la transferrina se obtiene a partir de una fuente animal, de manera que los medios resultantes no evitan los problemas de contaminación asociados con el uso de suero.

Un problema adicional que surge con el uso de medios libres de suero es el del soporte de células de CHO recombinantes para hacer posible el desarrollo y la expresión de producto. Los medios basados en F12 de Ham que no están suplementados con suero no son generalmente lo suficientemente ricos como para soportar un completo desarrollo o expresión.

Las células de CHO manipuladas genéticamente son también difíciles de desarrollar en suspensión. Es altamente deseable lograr el desarrollo en suspensión cuando se usan las células para expresar un producto tal como un anticuerpo. Para la producción de una proteína biológica a una escala comercial, es preferible ser capaces de soportar el desarrollo en fermentadores comprendidos dentro del intervalo de desde recipientes de vidrio de 1 litro hasta tanques de acero inoxidable de varios miles de litros. Un medio adecuado debe ser capaz de soportar las células frente a las fuerzas de cizalla procedentes de los impulsores o turbinas de cuchillas y de los efectos del rociado (es decir: suministro de aire, oxígeno y CO_{2} en forma de burbujas directamente al medio).

De acuerdo con ello, la presente invención proporciona un medio de cultivo definido bioquímicamente para el cultivo de células de CHO manipuladas genéticamente, el cual está esencialmente libre de proteína, lípido y carbohidrato aislado a partir de una fuente animal, tal como se define en la reivindicación 1 más adelante.

Los componentes del medio son en su mayor parte inorgánicos, sintéticos o recombinantes y, como tales, no se obtienen directamente a partir de ninguna fuente animal. Algunos componentes pueden obtenerse a partir de una planta de fuente bacteriana. Los componentes recombinantes se preparan bajo condiciones altamente puras para minimizar el riesgo de contaminación a partir del tejido progenitor que pasa a las células usadas para producir los componentes. Pueden usarse etapas de purificación adicionales para separar las proteínas de las células. De acuerdo con ello, puede lograrse un medio que está esencialmente libre de toda proteína, lípido y carbohidrato aislado a partir de una fuente animal. El medio de cultivo preferido de la invención no contiene proteína, lípido y carbohidrato aislado a partir de una fuente animal.

Es ventajoso mantener la osmolalidad dentro del intervalo de 200-350 mOsm, preferiblemente dentro del intervalo de 290-350 mOsm. Los reguladores de la osmolalidad son, generalmente, sales. Las sales que pueden usarse en el medio incluyen NaCl, KCl, KNO_{3}.

Los tampones se usan en el medio con el fin de mantener el pH dentro del intervalo de 6,5-7,5, lo más preferiblemente alrededor de 7,0. Los tampones de uso en el medio incluyen carbonatos tales como NaHCO_{3}; igualmente, se usan cloruros, sulfatos y fosfatos tales como CaCl_{2}2H_{2}O, MgSO_{4}7H_{2}O, NaH_{2}PO_{4}2H_{2}O, o piruvato sódico; dichos tampones están presentes generalmente en una cantidad de 50-500 mg/litro. Otros tampones, tal como N-[2-hidroxietil]piperacina-N'-[ácido 2-etanosulfónico] también conocido como HEPES y ácido 3-[N-morfolino]-propanosulfónico también conocido como MOPS, están presentes generalmente en una cantidad de 1000-10.000 mg/litro.

La fuente de energía de uso en el medio está presente, generalmente, en una cantidad de 1000-10.000 mg/litro y, preferiblemente, es un monosacárido tal como mannosa, fructosa, galactosa o maltosa, lo más preferiblemente glucosa, preferiblemente D-glucosa.

Los iones de metal no ferroso, opcionalmente de uso en el medio, incluyen magnesio, cobre y cinc; igualmente, sodio, potasio y selenio. Generalmente, los iones se agregan al medio en la forma de sales tales como cloruros y sulfatos. Las cantidades son, típicamente, similares a las suministradas en el medio ISCOVES establecido en la Tabla 1, pero evidentemente pueden variarse.

Las vitaminas y las vitaminas de co-factor enzima (co-factores), de uso opcionalmente en el medio, incluyen Vitamina B6 (piridoxina), Vitamina B12 (cianocobalamina) y Vitamina K (biotina) presentes en una cantidad de 0,01-0,5 mg/litro; Vitamina C (ácido ascórbico) presente en una cantidad de 10-30 mg/litro; Vitamina B2 (riboflavina) presente una cantidad de 0,1-1,0 mg/litro y Vitamina B1 (tiamina), nicotinamida, Vitamina B5 (D-pantotenato cálcico), ácido fólico, i-inositol presentes, generalmente, en una cantidad de 0,2 - 8,0 mg/litro.

Es preferible incluir en el medio basal un factor lípido tal como cloruro de cloina, ácido lipoico, ácido oleico, fosfatidilcolina o linooleato de metilo, generalmente en una cantidad de 0,05-10 mg/litro. Igualmente, pueden agregarse compuestos implicados en la producción de lípidos, por ejemplo alcoholaminas tal como etanolamina.

Es preferible incluir aminoácidos adicionales en el medio seleccionados entre:

1

Las formas entre paréntesis son las preferidas.

Los aminoácidos son, preferiblemente, de origen sintético. Las cantidades en las que usualmente se incluyen varían para cada aminoácido, pero, preferiblemente, están dentro del intervalo de 10-150 mg/litro. Sin embargo, la L-glutamina está presente, generalmente, en una concentración muy superior, preferiblemente dentro del intervalo de 400-600 mg/ml.

Puede ser ventajoso incluir en el medio un indicador de pH, por ejemplo sal sódica de rojo fenol, por ejemplo a una concentración de 5-50 mg/litro.

El Medio A, tal como se establece en la Tabla 1, es un ejemplo de medio que proporciona las cantidades preferidas de agua, osmolalidad, regulador, tampón, fuente de energía, aminoácidos, iones de metal no ferroso, vitaminas y co-factores, como una base para un medio de cultivo de acuerdo con la invención. Este medio no contiene nada de hipoxantina o timidina y se encuentra comercialmente disponible de GIBCO Ltd., Unit 4, Cowley Mill Td. Est., Uxbridge UB8 2YG. Es similar a un medio de cultivo publicado (Iscoves y Melcher, J. Exp. Med., vol. 1, no. 47, pág. 923, (1978)), pero no contiene nada de albúmina de suero bovino, transferrina humana pura o lecitina de soja.

TABLA 1 Medio A (modificación del DMEM de Iscoves que carece de albúmina, transferrina y lecitina)

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TABLA 1 (continuación)

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TABLA 1 (continuación)

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Modificación del DMEM de Iscoves, N y Melcher (J. Exp. Med., vol. 1, no. 47, pág. 923, (1978)).

Es preferible agregar al medio selenio (opcionalmente en las formas de selenito sódico) generalmente en una cantidad de 0,01-0,2 mg/litro o ácido L-ascórbico, generalmente en una cantidad de 20-50 mg/litro, para ayudar a minimizar los efectos tóxicos potenciales de iones ferrosos o férricos, y oxígeno. El uso adicional de agentes quelantes tales como citrato o ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) o un depurador de radical libre tal como \alpha-tocoferol (Vitamina E), son ventajosos en la reducción del daño por radicales libres.

Pueden agregarse al medio antibióticos tales como polimixina, neomicina, penicilina o estreptomicina con el fin de prevenir la contaminación bacteriana. Usualmente, estos se incluyen en una cantidad de 10.000-1.000.000 Iu/litro.

Los factores de desarrollo que pueden agregarse al medio basal son sintéticos o recombinantes e incluyen insulina. Pueden incluirse otros factores tales como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDFG), tiroxina T_{3}, trombina, interleuquinas tales como IL2 e IL6, progesterona, hidrocortisona y Vitamina E. El ácido fólico, la vitamina B6 y la Vitamina B12 que están implicadas en la vía folato pueden agregarse para potenciar el desarrollo de las célu-
las.

La hormona péptida insulina (la cual está presente en el presente contexto e incluye análogos de la misma tal como Nucellin (marca comercial de Eli Lilly), se obtiene de manera ventajosa mediante técnicas de ADN recombinantes pero no está aislada a partir de una fuente animal. Preferiblemente, se agrega al medio en una cantidad de 5 \mug-5 mg/litro. La Nucellin es la forma preferida de insulina para uso en la invención.

La fuente de hierro obtenida de fuente no animal para suplementar el medio es, preferiblemente, inorgánica, y está presente en una cantidad de 0,25-5 mg/litro. Los ejemplos incluyen sales ferrosas y férricas tales como citrato férrico o sulfato ferroso. Las preferidas son sales quelatadas tales como citrato férrico y citrato amónico férrico. No obstante, puede usarse cualquier fuente de hierro que no esté aislada a partir de una fuente animal, por ejemplo, queladores de hierro químicos o portadores de hierro de proteína recombinante.

La concentración de iones ferrosos o férricos debería controlarse cuidadosamente ya que estos pueden ayudar a generar superóxidos y radicales libres en el medio, los cuales pueden dañar no solamente las propias células, sino además los componentes del medio y el producto final deseado.

Igualmente, es preferible agregar al medio un compuesto tal como putrescina, de manera ventajosa en forma de una sal tal como HCl, la cual es sabido que juega un papel en el mantenimiento de la estructura del retículo endoplásmico y es requerida por ciertas líneas de células de CHO para soportar el crecimiento. La putrescina o una sal de la misma se agrega, preferiblemente, en una cantidad de 0,01-1,0 mg/litro.

Los medios libres de suero descritos hasta la fecha contienen hipoxantina o timidina. Esto podría desviar la presión de selección enfocada al sistema de selección y amplificación de dhfr tal como anteriormente se ha descrito. El resultado puede ser la pérdida del material genérico que especifica los genes del producto y de dhfr. De acuerdo con ello, la invención proporciona un medio de cultivo para el desarrollo de células de CHO dhfr^{-} manipuladas genéticamente de acuerdo con la invención, esencialmente libres de hipoxantina y/o timidina.

El medio de cultivo de la presente invención soporta el desarrollo de células de CHO y cuando se suplementa con un agente apropiado tal como metotrexato para el sistema dhfr usualmente en una cantidad de 0,1-5,0 \muM (o MSX para el sistema GS), permite ejercer la presión de selección completa sobre las células. Se sobreentiende que pueden estar presentes en el medio la hipoxantina y timidina a concentraciones que son insuficientes para desviar la selección del sistema dhfr, pero la presencia de estos dos precursores de nucleótidos no se prefiere para uso con la presente invención.

En fermentadores a gran escala, las células de mamífero son particularmente susceptibles a la fuerzas de cizalla que surgen del rociado del recipiente con gases y el mezclado con el impulsor. Para minimizar la aparición de daño celular es ventajoso para el medio el contener un protector de las células tal como polietileno glicol, alcoholes polivinílicos o polioles plurónicos. De entre estos, se prefiere el poliol Pluronic F68 (marca comercial de BASF Wyandotte Corp.) puesto que a diferencia de los alcoholes polivinílicos es una substancia no tóxica y a diferencia de los polietileno glicoles no interfiere con la purificación aguas abajo.

Pueden obtenerse mejoras adicionales en el desarrollo de células de CHO suplementando el medio con un digesto, hidrolizados o extractos péptidos, tales como Triptona, hidrolizado de caseína, extracto de levadura, o preferiblemente peptona de soja digerida con papaína. Las cantidades preferidas son 1%-0,025% p/v, lo más preferiblemente 0,25% p/v.

Los medios de la invención para el cultivo de células de CHO recombinantes son capaces de soportar el desarrollo y secreción de producto procedente de dichas células en suspensión en fermentadores de pequeña y gran escala, cultivos estáticos y/o dispositivos rotatorios. El medio de cultivo de acuerdo con la invención es igualmente capaz de soportar células en desarrollo a una alta densidad celular, fundamentalmente superior a 1x10^{5} células/ml hasta o superior a 1,5x10^{6} células/ml y secreción de producto de 30 mg/ml hasta más de 150 mg/ml. El medio de acuerdo con la invención es capaz igualmente de soportar este desarrollo y secreción de producto a lo largo de múltiples pasadas durante hasta 6 meses o más.

El medio se prefiere para la producción de todos los tipos de anticuerpos naturales y alterados. De acuerdo con ello, la invención incluye la producción de anticuerpos humanos en los que las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras y pesadas son homólogas con las secuencias de anticuerpos producidos mediante linfocitos humanos in vivo o in vitro mediante hibridomas. Igualmente, se proporcionan anticuerpos híbridos en los cuales las cadenas ligeras y pesadas son homólogas a un anticuerpo natural pero están combinadas de una manera tal que no se producirían de manera natural. Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico tiene sitios de unión de antígeno específicos con más de un antígeno. La región constante del anticuerpo puede relacionarse con una u otra de las regiones de unión del antígeno o puede proceder de un anticuerpo adicional. Los anticuerpos alterados, por ejemplo anticuerpos quiméricos, tienen regiones variables procedentes de un anticuerpo y regiones constantes procedentes de otro. En consecuencia, los anticuerpos quiméricos pueden ser especies/especies quimeras o clase/clase quimeras. Dichos anticuerpos quiméricos pueden tener una o más modificaciones adicionales para mejorar la capacidad de unión del antígeno o para alterar el funcionamiento efector. Los anticuerpos injertados con CDR o humanizados (patente EP 239400) están abarcados dentro de la invención, en particular también anticuerpos compuestos Campath 1H (patente EP 328404) (Campath es una marca comercial de The Wellcome Foundation), en los que partes de las regiones hipervariables además de las CDRs son transferidas al marco conservado humano. Los aminoácidos adicionales en el marco conservado o las regiones constantes de dichos anticuerpos pueden ser alterados. La invención incluye además la producción de fragmentos Fab que son algo equivalentes a las porciones de la rama Y de las cadenas ligeras y pesadas; esto incluye fragmentos incompletos o fragmentos que incluyen parte de la región Fc.

En un aspecto adicional de la invención se proporciona una célula de CHO manipulada genéticamente adaptada para desarrollo en un medio de acuerdo con la invención. En particular una célula de CHO manipulada genéticamente para expresar proteínas tal como el activador de plasminógeno de tipo tisular o anticuerpos tal como se han definido anteriormente. En particular, la invención proporciona una línea de células de CHO dhfr^{-} transfectada con un gen que codifica una proteína activa biológicamente y un gen marcador seleccionable dhfr, adaptado para desarrollo en un medio de cultivo de acuerdo con la invención. Preferiblemente, la proteína es un anticuerpo tal como se ha definido anteriormente.

Los ingredientes del medio de cultivo pueden agregarse en cualquier orden, pero es preferible agregar la fuente de hierro y, cuando se use tirosina, al final para evitar la precipitación.

Las Figuras adjuntas son únicamente para ilustración.

La Figura 1 muestra el desarrollo de C1H 3D11^{*} 44 en WCM5 (medio libre de proteína) en un fermentador de 1 litro medido como recuento de células/ml durante 90 días.

La Figura 2 muestra la producción de anticuerpo a partir de células C1H 3D11^{*} 44 en WCM5 en un fermentador de 1 litro medido como microgramos de anticuerpo/ml durante 80 días.

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(Tabla pasa a página siguiente)

Ejemplo 1 Formulación para medio WCM4 Medio A: (modificación de Iscoves de DMEM sin BSA, transferrina y lecitina tal como se establece en la Tabla 1)

+	5 ml/litro	L-glutamina 200 mM
+	50 mg/litro	L-prolina
+	50 mg/litro	L-treonina
+	50 mg/litro	L-metionina
+	50 mg/litro	L-cisteína
+	50 mg/litro	L-tirosina
+	25 mg/litro	Ácido ascórbico
+	0,062 mg/litro	Vitamina B6
+	1,36 mg/litro	Vitamina B12
+	0,2 mg/litro	Ácido lipoico
+	0,088 mg/litro	Linoleato de metilo
+	1 \muM	Metotrexato
+	1 mg/litro	FeSO_{4}
+	1 mg/litro	ZnSO_{4}
+	0,0025 mg/litro	CuSO_{4}
+	5 mg/litro	Insulina recombinante (Nucellin)
+	50.000 Iu/litro	Polimoxina
+	20.000 Iu/litro	Neomicina
+	0,16 mg/litro	Putrescina-2 HCl

Este medio no contiene hipoxantina, timidina o ácido fólico que puedan desviar la selección de metotexato. El medio no contiene glicina que no puede por sí misma desviar la selección. De acuerdo con ello, este medio mantiene la selección total para resistencia al metotrexato.

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Ejemplo 2 Formulación para medio WCM5 Medio A: (modificación de Iscoves de DMEM sin BSA, transferrina o lecitina)

+	5 ml/litro	L-glutamina 200 mM
+	50 mg/litro	L-prolina
+	50 mg/litro	L-treonina
+	50 mg/litro	L-metionina
+	50 mg/litro	L-cisteína
+	50 mg/litro	L-tirosina
+	25 mg/litro	Ácido L-ascórbico
+	0,062 mg/litro	Vitamina B6
+	1,36 mg/litro	Vitamina B12
+	2 mg/litro	Citrato férrico
+	1 mg/litro	Sulfato de cinc
+	0,0025 mg/litro	Sulfato de cobre
+	50.000 Iu/litro	Polimoxina
+	20.000 Iu/litro	Neomicina
+	3 \mul/litro	Etanolamina
+	0,16 mg/litro	Putrescina
+	5 mg/litro	Insulina recombinante (Nucellin)

Ejemplo 3 Desarrollo y producción a partir de C1H 3D11^{*} 44 en WCM4

Las células C1H 3D11^{*} son células CHO DUK B11 manipuladas genéticamente (Urlaub y Chasin, PNAS, vol. 77, págs. 4216-4220, (1980)). Las células CHO DUK B11 no pueden producir dihidrofolato reductasa (dhfr). Estas células se manipularon para producir un anticuerpo IgG humanizado, Campath 1H (Winter y otros, Nature, vol. 322, págs. 323-327, (1998)) usando constructos plásmidos para expresar cadenas de anticuerpo ligeras y pesadas y el dhfr de ratón. La expresión se amplificó y mantuvo usando el folato antagonista metotrato. Las células C1H 3D11^{*} que se desarrollan como una monocapa en Iscoves + FBS Flow al 10%, sin aminoácidos esenciales, metotrexato 10^{-6} M y antibióticos, fueron confluentes aproximadamente al 90%. Estas células se separaron del plástico con tripsina/verseno, se lavaron en medio Iscoves sin suplementos, se centrifugaron y volvieron a suspender a una concentración de 5x10^{4}/ml en medio WCM4 + peptona al 0,25% + polietileno glicol (PEG) 10.000 al 0,1% + suero bovino fetal (FBS) al 0,5% sin metotrexato (MTX). Se prepararon tres matraces de 25 cm^{3} con 10 ml de suspensión de células + hipoxantina (H), timidina (T) o HT. Estos matraces se incubaron a 36,5ºC en un incubador con CO_{2} al 5%.

Después de seis días, los matraces se agruparon y se agregaron a un volumen igual de WCM4 + MTX sin peptona o PEG, y se transfirieron a un matraz de 75 cm^{3}.

Estas células se usaron para sembrar un dispositivo rotatorio Techner de 500 ml, se incubaron a 36,5ºC con una velocidad de rotación de 40 rpm. Las células continuaron desarrollándose libres de suero durante un período de cinco meses y aunque se encontró que las células necesitaban un período de adaptación, la velocidad de desarrollo y la viabilidad mejoró de manera constante. El tiempo de duplicado de la población se calculó que fue de 73,1 horas a lo largo de aproximadamente 7 semanas; este disminuyó a 47,4 horas a lo largo de los 20 días posteriores y, a continuación, se estabilizó. La secreción de anticuerpos se mantuvo alta a niveles superiores a 60 \mug/ml. Se determinó que el número de copias de genes en estas células no disminuyó de acuerdo con la intensidad de banda usando el análisis de transferencia Northern.

En los fermentadores, está células produjeron anticuerpos en un niveles superiores a 70 \mug/ml y normalmente se alcanzaron niveles de 100 \mug/ml o superiores. Las células se denominaron C1H 3D11^{*} 44.

Ejemplo 4 Desarrollo y producción de C1H 3D11^{*} 44 en WCM5 en un fermentador de 1 litro

Las células C1H 3D11^{*} procedentes del Ejemplo 3 las cuales se habían desarrollado libres de suero a lo largo de 2 meses, se transfirieron a un fermentador de 1 litro SGi con una paleta en ángulo de acero inoxidable una velocidad de rotación de 70 rpm. La temperatura se fijó a 37ºC, CO_{2} al 10% y control de pH a 7-7,2. El fermentador se sembró el día 0 con 0,22x10^{6} células/ml en medio WCM4 (Ejemplo 1) con polietileno glicol (PEG) 10.000 al 0,1% y peptona de soja al 0,25%, y se gasificó por la parte superior con O_{2}. Las células se pasaron de manera rutinaria usando medio reciente y una velocidad de división típicamente entre 1 a 2 y 1 a 4.

El día 33, la gasificación por la parte superior se reemplazó con un rociado intenso, el cual era de esperar que causara más daño físico a las células.

Del día 50 en adelante, se usó WCM5 (Ejemplo 2) conjuntamente con peptona y PEG en lugar de WCM4.

El día 53, el PEG se reemplazó por Pluronic F68 al 0,1%. El desarrollo y niveles de anticuerpo resultante logrados se muestran en los gráficos adjuntos (Figuras 1 y 2), y demuestran la capacidad de la invención para permitir la producción libre de proteína de anticuerpo en cantidades superiores a 100 \mug/ml en fermentadores.

Ejemplo 5 Desarrollo de CHO AJ19 MCB1 en WCM4 comparado con el desarrollo de CHO AJ19 MCB1 en medio que contiene suero

Las células de ovario de hamster chino, CHO AJ19 MCB, obtenidas de células CHO DUK (Urlaub y Chasin, PNAS, vol. 77, No. 7, págs. 4216-4220, (1980)) se manipularon genéticamente para producir tPA bajo selección de metotrexato. Este línea de células se desarrollo de manera rutinaria en un fermentador en forma de un cultivo de suspensión usando medio de desarrollo normal consistente en medio RPMI 1640 (GIBCO), suero bovino adulto hidrolizado en ácido al 2, 5% (Imperial), triptona al 0,5%, 50 IU/ml de polimicina, 20 IU/ml de neomicina, metotrexato (MTX) 500 nM.

Se formuló medio WCM4, al cual se agregó:

Peptona de soja N-Z (Sigma P1265) al 0,25% p/v, polietileno glicol (PEG) 20.000 (Serva, Carbowax 20M) al 0,1% p/v, MTX 1 uM.

Extracto de levadura (Sigma Y0500) al 0,25% p/v, PEG 20.000 al 0,1% p/v, MTX 1 uM. En este medio, el Iscoves en CM4 se reemplazó por medio RPMI 1640 (ICN FLOW).

Extracto de levadura al 0,25% p/v, PEG 20.000 al 0,1% p/v, MTX 1 uM.

Extracto de levadura al 0,25% p/v, PEG 20.000 al 0,1% p/v, suero bovino fetal (Imperial ) al 0,25%, MTX 1 uM.

El extracto de levadura, la peptona y el PEG se prepararon como soluciones al 10% p/v con agua (unidad de producción de medios Wellcome) y se filtraron a través de un filtro desechable de 0,2 um (Gelman, Supor Vac) y, a continuación, se diluyeron para su uso. Las células se incubaron a 37ºC en un incubador humidificado que contenía CO_{2} al 5%.

Las células que se desarrollaron en medio de desarrollo normal se granularon mediante centrifugación a 1200g a +44ºC durante 5 minutos, se lavaron en RPMI 1640 sin suplementos y se granularon nuevamente. A continuación, las células se volvieron a suspender a una concentración de 10^{5} células/ml en medio de desarrollo normal (46A) y otros medios (46B, 45C, 46D ó 46E). Se sembraron placas de 24 pocillos (pocillos de 16 mm de Costar) con 1 ml/pocillo y se incubaron a 37ºC en un incubador que contenía CO_{2} al 5%.

Las células que se desarrollaron en medio de desarrollo normal se granularon mediante centrifugación a 1200g a +4ºC durante 5 minutos, se lavaron en RPMI 1640 sin suplementos y se granularon nuevamente. A continuación, las células se volvieron a suspender a una concentración de 10^{5} células/ml en medio de desarrollo normal (46A) y otros medios (46B, 46C, 46D ó 46E). Se sembraron placas de 24 pocillos (pocillos de 16 mm de Costar) con 1 ml/pocillo y se incubaron a 37ºC en un incubador que contenía CO_{2} al 5%. Los días 3, 4, 5 y 6 un pocillo de cada una se contó usando un hemocitómetro y exclusión con azul triptano. Se recolectaron dos pocillos más de cada una, se agruparon y granularon a 1200g, a +4ºC durante 5 minutos. El sobrenadante se separó y almacenó a -20ºC. Estas muestras se ensayaron posteriormente para determinar la tPA. El día 6, se recolectaron muestras procedentes únicamente de 46A y 46D.

Resultados Actividades específicas de tPA en diversas cosechas brutas

El material bruto producido en los cinco medios diferentes se ensayó usando un ensayo ELISA validado por QA para medir las concentraciones de antígeno de tPA en \mug/ml usando la unión a un anticuerpo policlonal frente a tPA, y ensayo de lisis del coágulo para medir la actividad de tPA en IU/ml. A partir de estos resultados (Tabla 2), se calcularon las actividades específicas.

TABLA 2

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TABLA 2 (continuación)

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A partir de la tabla anterior, no existe cambio de la actividad específica en los cinco materiales brutos diferentes. El rendimiento de tPA a partir de medio B, C y D libre de proteína, fue casi igual al rendimiento de tPA a partir de medio de desarrollo convencional en el grupo A y E.

Ejemplo 6 Desarrollo continuo de CHO AJ19 MCB1 en WCM4

Las células CHO AJ19 MCB1 que se desarrollan en medio de desarrollo normal se granularon y lavaron como en el Ejemplo 5 y se volvieron a suspender a una concentración de 7x10^{4}/ml en 500 ml de medio 46B. Estas células se transfirieron a un matraz rotatorio Techne y se incubaron, tal como anteriormente, con rotación a 40 rpm. A diferentes intervalos de tiempo, se contaron las células y se subcultivaron usando el mismo medio. Se tomó una muestra para el ensayo de tPA y se trató como en el Ejemplo 5.

La actividad específica de tPA en diversos subcultivos de células

La actividad específica de sobrenadantes procedentes de diferentes niveles de pasos de células desarrolladas en WCM4 con peptona y PEG 20K al 0,1%, se midió mediante una combinación de ELISA y ensayo de lisis del coágulo. En la Tabla 3 se resumen las actividades específicas de diferentes pasadas de células.

TABLA 3

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A lo largo de un período de 48 días, en base a la velocidad de división anterior, una célula podría haberse dividido para dar 3,77x10^{6} células. Esto es equivalente a 31,8 duplicados de la población con un tiempo de duplicado de 38 horas.

Los resultados de los experimentos llevados a cabo en los Ejemplos 5 y 6 demuestran que el medio libre de suero de la presente invención es capaz de soportar el desarrollo de células y un rendimiento de tPA comparable al logrado en medios que contienen suero.

Claims (13)

1. Un medio de cultivo definido bioquímicamente para el cultivo de células de CHO DHFR^{-} manipuladas genéticamente para producir un producto seleccionado entre el grupo constituido por: anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos injertados con CDR, activador de plasminógeno de tipo tisular, cuyo medio está libre de proteína, lípido y carbohidrato aislado a partir de una fuente animal, en el que dicho medio comprende:

(a) agua;

(b) un regulador de la osmolalidad para mantener la osmolalidad del medio dentro del intervalo de 200-350 mOsm;

(c) un tampón para mantener el pH del medio dentro del intervalo de 6,5 a 7,5;

(d) una fuente de energía de monosacárido en el intervalo de 1000-10.000 mg/litro;

(e) aminoácidos, incluyendo L-glutamina en el intervalo de 400-600 mg/ml;

(f) una fuente de hierro recombinante o una fuente de hierro inorgánico dentro del intervalo de 0,25 a 5 mg/litro;

(g) insulina recombinante o sintética;

(h) un potenciador del desarrollo de células que está implicado en la vía folato seleccionado entre el grupo constituido por ácido fólico, vitamina B6, vitamina B12;

(i) un factor lípido en el intervalo de 0,05-10 mg/litro;

en el que dicho medio está esencialmente libre de hipoxantina y/o timidina.

2. El medio de la reivindicación 1, en el que el regulador de la osmolalidad está seleccionado entre el grupo constituido por NaCl, KCl, KNO_{3}.

3. El medio de la reivindicación 1 ó 2, en el que el regulador de la osmolalidad se mantiene entre 290-350 mOsm.

4. El medio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el tampón está seleccionado entre el grupo constituido por NaHCO_{3}, CaCl_{2}2H_{2}O, MgSO_{4}7H_{2}O, NaH_{2}PO_{4}2H_{2}O, piruvato sódico.

5. El medio de la reivindicación 4, en el que el tampón está presente en una cantidad de 50 a 500 mg/litro.

6. El medio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el tampón es HEPES o MOPS.

7. El medio de la reivindicación 6, en el que el tampón está presente en una cantidad de 1000-10.000 mg/litro.

8. El medio de cualquier reivindicación precedente, en el que la fuente de energía de monosacárido está seleccionada entre el grupo constituido por: manosa, fructosa, galactosa, maltosa, glucosa.

9. El medio de cualquier reivindicación precedente, en el que la fuente de hierro es sal férrica o ferrosa tal como citrato férrico o sulfato ferroso.

10. El medio de cualquier reivindicación precedente, en el que la insulina es recombinante.

11. El medio de cualquier reivindicación precedente, en el que el medio está esencialmente libre de timidina.

12. El medio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el medio está esencialmente libre de hipoxantina.

13. El medio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el medio está esencialmente libre de timidina e hipoxantina.