JPS6125480A - 細胞用の無血清合成培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産渠上の利用分野） 本発明は細胞用の無血清合成培地に係り、殊に安定で高
頻度に生理活性物質を産生ずる細胞を増殖させるだめの
無血清合成培地に係る。

（従来の技術） 動物細胞が産生ずる生理活性物質を得るためには、この
生理活性物質を合成分泌する細胞を培養系に移さなけれ
ばならない。一般に培養系において、初代細胞は固有の
寿命を有しているので、生理活性物質の取得を目的とす
る場合には薬剤、ウィルス等で処理し突然変異を誘発さ
せて当該細胞を永代増殖細胞として株化させるのが有利
である。

しかしながら、目的とする細胞がすべてこのような条件
付けを満足させるものではなく、又高単位の生理活性物
質を安定に分泌させるためには培養系での栄！ｌ！！求
性、増殖因子等を充分に考慮し、又培養液に関する吟味
、工夫が必要であり、殊に試験管やシャーレを用いた少
量培養から大量培養に移行するには条件設定その他に種
々の国難がある。。

翻えりで、Ｒいに興なる機能形質を保有する動物細胞同
志を融合させ、これにより永続的に特定の生理活性物質
を産生じようとする試みが従来からなされて来ており、
これは細胞融合法による単一抗体産生融合細胞、即ち、
ハイブリドーマの作製に代表されている。この方法は予
め抗原で免疫させた動物の牌細胞と、核酸合成系に部分
的な関与をする酵素であるＨＰＰＴ　（ヒポキサンチン
グアニジンホス本リボシル転移酵素）又はＴＫ（チミジ
ン活性化酵素）等を人為的に欠損させておいた同種動物
超厚の骨髄−株化細胞とを混ぜ、これをポリエチレング
リコールで処理して細胞融合を行わせるものである。形
成されたハイブリドーマはこの特定のハイブリドーマの
みが増殖し得る選択培地で培養される。この選択培地と
しては通例所ＷＨＡＴ培地（Ｈ：ヒポキサンチンと、Ａ
ニアミノプテリンと、Ｔ：チミジンとを適当濃度で含有
する培地）が用いられる。即ち、上記酵素の内の１つで
も合成能を欠いている細胞はＨＡＴ培地中のアミノプテ
リンの作用により生育できないが、ハイブリドーマは上
記酵素産生を受持つ遺伝子や抗体合成及び分泌能が牌細
胞側から与えられており且つ永続増殖性が骨髄−株化細
胞側から与えられているので、ＨＡＴ培地中のとホキサ
ン及びチミジンを利用して生育し増殖し得るのである。

上記ＨＡＴ培地を基本として培養液をｍ製するためには
、これに栄養物等としての各種添加物や浸透圧調整剤が
添加されるが、経験上から適当濃度の血清、一般的には
成牛、牛新生児又は牛胎児血清の添加が必須とされて来
た。

一方、無血清培地も従来から知られている。これらの従
来技術による無血清培地は例えばダルベコ変法イーグル
ＭＥＭ、ダルベコ変法イーグルＭＥＭとハムＦ１２との
混合物、ＲＰＭＩ１６４０とダルベコ変法イーグルＭＥ
ＭとハムＦ”１２との混合物を基本とするものである。

（発明が解決しようとする問題点） 従来の血清添加培地を用いて培養液を調製して生理活性
物質産生細胞（単独細胞又はハイブリドーマ）を生育増
殖させようとする場合に血清に依存して、殊にその種類
や濃度に依存して細胞増殖支持能力は著しく異なる。極
論すれば、増殖させようとする細胞に対する毒性が高く
死滅させるに至る血清すら存在する。血清が如何なる作
用機序で細胞増殖に彰智を及ぼすのか並びにその程度如
何は現在の処未解決のａｍであり、従って成る特定細胞
を安定に増殖させて生理活性物質の分泌をもたらすため
にどの血清を使用するかを決定するには幾多の予備試験
が必要とされる。更に、用いられる血清の種類等によっ
ては、マウス、ラット等の胸腺細胞、四細胞又は腹腔細
胞、若しくは増殖はしないが主台はするように予めＸ線
照射等により処理されたｒ雑芽精胞等を支持細胞（所謂
フィーダ細胞）としてＨＡＴ培地での培養中に所期の特
定細胞と共存させておく必要性が生じる場合もある。

従って、本発明が解決しようとする基本的問題点は細胞
用の培地であって、血清添加を要件としない培地を提供
し、これによって血清に基因する上記課題の発生を無か
らしめることにある。

更に、従来の細胞用無血清培地はハイブリドーマ用であ
って、特定の骨髄腫（ミエローマ）株化細胞を親株とし
左場合にのみ適用し得るに過ぎず、且つ低密度細胞培養
に用いるには不適当とされて来た。

従って、本発明が解決しようとする本質的問題点は細胞
用無血清培地であって、従来の無血清培地における上記
適用規制を有しない培地を提供することにある。

（問題点を解決するための手段） 本発明によれば、上記問題点は、イーグルＭＥＭとＲＰ
ＭＩ１６４０との混合物を基本培地とし、これに培養添
加物を加え、ジヒドロキシエチルグリシン溶液及びβ−
グリセロリン酸二ナトリウム溶液の少なくとも１方の溶
液により浸透圧が２６５〜３００ｉ０ｓ／ｋｏに調整さ
れている細胞用無血清培地培地により解決される。

本発明による無血清合成培地における地殻添加物として
は亜セレン酸ナトリウム、ブトレスミン・２１１１１！
、チミジン、ヒポキサンチン、ピルビン酸ナトリウム、
トランスフェリン、インシュリン、モノエタノールアミ
ン等を挙げることができる。

本発明による無Ｉｉｈ清合成培地には安定化剤としてコ
ハク酸及びその塩例えばコハク酸ナトリウム塩を添加す
ることができる。

本発明による無血清合成培地のＤＨは約７．２〜７．４
であることが好ましく、これは炭酸水素ナトリウムの添
加により設定することができる。

本発明による無ｄｎｒＩＩ合成培地はその浸透圧が２８
５±５ｍＯｓ／ｋａに調整されているのが殊に好ましい
。浸透圧の調整は既述のようにジヒドロキシエチルグリ
シン又はβ−グリセロリン酸二ナトリウムの添加により
行われるが何れの浸透圧調整剤を用いても効果に有意の
差は認められない。

（作用） 一般に無血清培養又は低血清濃度培養においては培養液
の緩衝能及び浸透圧を保持するために、培地に１０〜２
５１Ｍ程度のＮ−２−とドロキシエチルピペラジン−Ｎ
′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を添加して培
養液のｐＨを７．２〜７．４に且つ浸透圧を２８０〜２
９０ｍＯｓ／ｋＱに調整している。

しかしながら、イーグルＭＥＭとＲＰＭＩ１６４０とを
基本培地とする場合に上記のようにＨＥＰＥＳを用いる
と細胞増殖に悪影響を及ぼす虞れがあるが、ＨＥＰＥＳ
をジヒドロキシエチルグリシン又はβ−グリセロリン酸
二ナトリウムに代替することによりその可能性を解消す
ることができる（ジヒドロキシエチルグリシンは培地に
従来用いられていなかった成分であることに留意され度
い）。

本発明による培地中において、モノエタノールアミン、
リノール酸、インシュリン及びトランスフェリンは細胞
の増殖性を向上させるのに寄与する。

（発明の効果） 本発明による培地は無血清培地であるので、細胞、殊に
融合細胞の培養に用いる場合に細胞の増殖性を阻害しな
い。本発明による培地を使用すれば、従来無血清培地の
使用が不適当とされて来た単個乃至低密度細胞培地が可
能となる。

本発明による培地は細胞融合用に用いる場合に種々の利
点をもたらす。即ち、先ず第１に融合に用いる増殖用の
細胞としての原則的条件は面清添加培地中で増殖可能で
ありて本無血清培地中で死滅する細胞であり、従ってこ
の増殖用細胞は、ＨＰＲＴ、ＴＫ等の核酸合成系に関与
する酵素の有無を問わず、又細胞内代謝に係る一切の阻
害剤耐性を保持していなくとも良いのであり、このこと
は融合の親株として殆んど全ての株化細胞を選択し得る
ことを意味し、本発明による培地が汎用性を有すること
を意味している。第２には本発明による培地を用いて形
成された融合細胞は当然のことながら無血清培地中で増
殖できるので、抗体等の免疫制御物質のみならず、抗原
の成長因子等に代表される各種の生理活性物質を産生分
泌する融合細胞として増殖させることができるのである
。

（＠造例、使用例及び試股例） 次に、本発明による無血清合成培地の製造例、この培地
を用いての各種細胞の培養例及び各種試験例について具
体的に説明する。

製造例１ 下記諸成分、即ち 成　　分　　　　　　　　　　　　　　震ＬイーグルＭ
ＥＭ　　　　　　　４，５６９ＲＰＭ　Ｉ　　１６４０
　　　　　　　　５，０４ａ亜セレン酸ナトリウム　　
　　０．００１７騰りブトレスシン・２塩酸　　　０．
０３１２５１１１１１チミジン　　　　　　　　　６．
９ｍｇヒポキサンチン　　　　　　　３．２５ａ＋ｇビ
オチン　　　　　　　　　　０．００２５−〇ビタミン
Ｂ　　　　　　　　　　００００２５＋＋ｇピルビン酸
ナトリウム　　　１１０１０−グルタミン　　　　　　
４５０ｍｇ トランスフェリン（ヒト・ホロ型）　１０ｍｇインシュ
リン（牛）　　　　　　２＋ｅ（７モノエタノールアミ
ン　　　０．０２ｗ＋ｇジヒドロキシエチルグリシン　
１．６５ｇ１）及び２〉： 容量で等量。出願人会社から市販のイーグルＭＥＭ培地
■（商品コード０５９００　）及びＲＰＭＩ１６４０培
地■（商品コード０５９１１　）をそれぞれ使用。一般
に市販の濾過滅菌品を使用する場合にはそれぞれ上記使
用量の０．４８倍量を用い且つ安定化剤としてコハク［
７５１Ｒｇ及びコハク酸ナトリウム（６水塩）　１００
１ｇを更に添加することもできる ３）： アポ型のトランスフェリンに代替することもできるが、
この場合には硫酸第一鉄を０，８■添加することが必要
である ４）： 予め１／２０規定程度の塩酸に溶解させたもの ビオチン、ビタミンＢ　及び　−グルタミンは基本培地
であるイーグルＭＥＭやＲＰＭＩ１６４０に添加されて
いるが、これらは増量分として添加された に再蒸留水を添加し−Ｃ全量を１０００ｓＱとなし、炭
酸ガスを導通する。次いで炭酸水素ナトリウム１．６ｇ
を添加してｌ）Ｈを７．２〜７．４に調整すれば浸透圧
２８５±５ｓＯｓを有する所望の無血清合成培地が調製
される。

製造例２ 製造例１と同様にして、但し ブドウ等（増量剤）　　　　　ｏ、ｓｇリノール酸　　
　　　　　ｉＢ　　及び塩化コリン（増量剤）　　　２
５ｎ＋ｇ５）： 予めエタノール１０　ｍＱに溶解させた上で分散させる を更に添加し全量を再蒸留水で１０００ＩｌＩＱとなし
た上で同様の処理を行なって２８５±５１１ＩＯ８を有
する所望の無血清合成培地が調製された。

ｆｉ 製造例１と同様にして、但しジヒドロキシエチルグリシ
ンの代りにβ−グリセロリン酸二ナトリウムを添加して
浸透圧を２８５±５ｍＯｓに調整することにより所望の
無血清合成培地が調製された。

使用例１ マウス−マウス　ハイブリドーマの作製マウスを予め抗
原で免疫しておき、最終抗原の注射後３〜４日目に紳臓
を副出し、その牌細胞１０６〜１０７個を準備する。予
め血清添加培地で対数期に増殖させておいたマウス骨髄
腫株化細胞１０６〜１０７個を準備する。予めｔｈ清添
加培地で対数期に増殖させておいたマウス骨髄腫株化細
胞１０６〜５×１０θ個を上記牌細胞と混合し、ＩＩ胞
塊の沈渣を取得する。無血清培地を用いて３０〜５０（
ｗ／ｗ）％濃度に調整されたポリエチレングリコール（
分子量１０００〜６０００）液を上記沈渣に適量添加し
、２０〜３７℃で１〜８分間程度反応させる。次いで、
無血清培地で細胞凝集塊を稀釈し、直ちに遠心処理して
上清を除去して沈渣を得る。

弊造例１による無血清合成培地を適量上記沈渣に添加し
撹拌して均一な細胞懸濁液を調製する。

この懸濁液を９６穴の培養用マルチウェルプレートに分
注し、３７℃、５％炭酸ガス幹卵器により培養する。３
日毎に各穴における培地の半量を新鮮な無血清培地（製
造Ｗ４１）と交換する。融合細胞（ハイブリドーマ）は
２〜４週間で充分に発育し抗体を分泌する。この抗体は
例えば酵素免疫測定法により検′出することができる。

抗体活性陽性である増殖ハイブリドーマを採取し、マウ
スの腹腔細胞が予め支持細胞として播いである別の９６
穴培養マルチウエルプレートに培養穴当り１個以下とな
るように、上記バイブリド−７を播いた。２週間後、増
殖してくるハイブリドーマのコロニーが認められた。

結果は後記表１に示される通りであり、本発明を培地を
用いることにより単個細胞からでも増殖可能であること
が判明した。尚、対照として公知の無血清培地であるＲ
ｒＴＣ５５−９を用いた処コロニーの発生は全く認めら
れなかった。更にＫＳＬＭ変法培地を用いた対照区では
増殖コロニーが出現したが、その頻度が極めて低かった
。

比重遠心法により予めＩ製されたヒト末梢血リンパ球１
０６〜１０７個と、自消添加培地で増殖するヒト由来の
リンパ株化細胞１０６〜１０７個とを使用例１に準じて
、ポリエチレングリコールを用いて融合させる。得られ
たハイブリドーマに製造例１による無血清合成培地を添
加して細胞懸濁液をｗ４製する。この懸濁液を使用例１
におけると同様に培養用マルチウェルプレートに分注し
、次いで培養した。細胞が充分に発育した段階で採取し
て染色体分析及び螢光抗体法によるｓｒｌｌｍの表面抗
原解析を行なった処、これがバイブリドーマであること
が確認された。

東几ｌ支 抗ヒトインシュリン抗　産生ハイブリドーマの作製 ヒトインシュリン０．２単位を７０インドの完全アジュ
バントで乳化させ、これを６〜７週令のＢＡＬＢ／Ｃ系
マウスの腹腔内に注射する。２週問後に、同様にして再
度注射する。更に２週間後に、０．２単位のヒトインシ
ュリンを上記マウスの尾静脈に注射し、その３日後に牌
臓を割出し、牌細胞２Ｘ１０？個を整え、この牌細胞と
マウス骨髄腫株化細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ　１４
ｘ１０６個とを５０％ポリエチレングリコール（分子１
４０００）にて処理して細胞融合させる。得られた細胞
凝集塊を三等分し、その−方を従来法に従って血清含有
培地（ＨＡＴが添加され１０％濃度で牛胎児血清を含有
するＲＰＭＩ１６４０培地）に懸濁させ且つ他方を本発
明による無血清合成培地（製造例１）に懸濁させる。こ
れら懸濁液をそれぞれ９６穴培養用マルチウエルプレー
トに播いた。各穴における培地の半量の３日毎に交換し
て２週間培液を行ない、細胞の発育が認められた穴の上
清における抗体活性を、ヒトインシュリンが予め吸着さ
れている９６穴マルチウエルプレートとペルオキシダー
ゼ標識抗マウス免疫グロブリン（カッペル社製）を用い
た酵素免疫測定法により調べる。結果は後記表２に示さ
れる通りであった。

尚、対照培地を用いたマルチウェルプレートの各穴には
フィーダ層としてマウス腹腔細胞を播いておいた、蓋し
、フィーダ層が存在しないとハイブリドーマの出現頻度
が零又は極めて少ないからである。この表から明らかな
ように、本発明による無血清培地は従来の有血清培地と
比較する場合にハイブリドーマの成育や増殖を著しく促
進し、その結果として抗体分泌を高めるのである。

使用例４ 抗ヒツジ赤血球抗　　生ハイブリ゛−マの生理食塩液で
５　（ｖ　／ｖ　）％濃度に調整されたヒツジ赤血球浮
遊液０．２〜０．３ｍＱを６〜７遍令のＢＡＬＢ／Ｃ系
マウスの腹腔内に注射する。

１ケ月後に同量のヒツジ赤血球浮遊液を上記マウスの尾
静脈に注射した。３日後に使用例３と同様にして細胞融
合及び培養を行なう。２週間後に細胞発育の認められる
穴の上宿における抗体活性を、ヒツジ赤血球、抗体く即
ち培養上清）及びモルモット補体を用いた溶血反応系に
より調べる。結果は後記表３に示される通りであった。

この表から、本発明による培地を使用することにより、
ハイブリドーマの生育や増殖性が向上し、抗体の分泌が
促進されることが判る。

ヒト腹水より抽出され精製されたＣ反応性蛋白５０μ９
を７０インドの完全アジュバントで乳化し、６〜７週令
のＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に注射した。２週間後
に上記蛋白２５μ９を生理食塩液に溶解して上記マウス
の尾静脈に注射し、その３日後に牌臓を副出し、これよ
り得られた牌細胞と骨髄腫株化細胞であるＰ３−Ｘ６３
−Ａｇ８−Ｕｌ及びＰ３−ＮＣＩ／１−Ａｏ　４−１を
用いてそれぞれ細胞融合を行ない、又抗体活性検出を使
用例３に準じて行なった処、後記表４に示される通りの
結果が得られた。この表から、Ｃ反応性蛋白を抗原とす
る場合のハイブリドーマの生育や増殖性は、本発明によ
る無血清培地を用いても従来の含血清培地を用いても同
様であることが判る。

１）　胎児線維芽細胞×末梢血すンパ球＊ｔ’＊培地に
おいて対数増殖期にあるヒト胎児の初代線維芽細胞（フ
ァイブロブラスト）を常法によりｌＸ１０１１個集めた
。一方、比重１．０７７のファイコール・コンレイ混合
液との比重差遠心分峻操作処理により末梢血よりリンパ
球層を得て、ｌＸ１０７１１１のリンパ球を整えた。こ
れら両細胞を５０％ポリエチレングリコール（分子Ｉ４
０００）にて細胞融合させ、９６穴培養用マルチウエル
プレートを用い製造例１の無血清培地に分散させ、５％
ＣＯ２，３７℃幹卵器により培養を継続して行なった。

この培養中において、３日毎に各培養穴の培地の半量を
新鮮培地（製造例１）に変換した。この培地にはファイ
ブロブラストの成長因子であるエビダーマル・グロース
・ファクタ（ＥＧＦ）を必要に応じて添加した。

培１１開始後３３１１間目からファイブロブラストやリ
ンパ球とは寸法や形態の全く異なる細胞が出現したく９
６穴中の１６穴）。

ファイブロブラスト及びリンパ球の単独培養並びにこれ
ら両細胞の混合培養も同時に行なわれたが、これらの対
照培液では、上記の如き特殊１１１胞の形成は認められ
なかった。

２）　培養株ＲＰＭＩ８２２６Ｘ末梢血リンパ球ヒト骨
髄腫培養株であるＲＰＭＩ８２２６の１×１０６個と末
梢向リンパ球１Ｘ１０？個との組合せで上記第１項の操
作処理を行りた処、ポリエチレングリコール処理系にの
み増殖細胞が認められたく９６穴中２０穴）。

３）　培養株ＣＥＭＸ末梢リンパ球 ヒトＴリンフオーマ培養株であるＯＥＭの１×１０６個
と末梢血リンパ球１Ｘ１０７個との組み合わせでも上記
第２項の事例が認められたく９６穴中の９６穴全部）。

吏ユに− Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−ＬＪＩの１ｘｉｏｅ個とヒト末
梢血リンパ球ｌＸｌ０？個との組合せで使用例６第１項
に記載に準じて操作処理を行なった処、ポリエチレング
リコール処理系において増殖してくる細胞が認められた
（９６穴中の５９穴）。

ＬＬＬ マウス骨　腫　　　びハイブリドーマの製造例１の培地
成分中よりインシュリン及びトランスフェリンを除いた
培地を用い、各種細胞を５％ＣＯ２，３７℃の培養器中
で４８時間培養してＳ＋胞同周期停止させておく。次に
、各細胞の細胞数を５Ｘ１０４個／培養皿宛整えて製造
例１の培地に播き、その後の増殖を調べる。結果は後記
表５に示される通りであり、これから本発明による培地
を使用すればこれらハイブリドーマの種類が増殖性に影
響を殆どもたらさないことが判る。

試験例１ 細胞増殖と抗体産生　験 製造例１による無血清合成培地及び対照培地としてＲＰ
ＭＩ１６４０−１０％牛脂児向清添加培地とをそれぞれ
調製する。これらの各培地に抗体Ｃ反応性蛋白抗体産生
ハイプリドーマである２Ｄ７−Ｃ２ａを播種して予め継
代培養する。新たな培養皿に更めで各培地をセットし、
継代培養された上記ハイブリドーマを細胞数が５×１０
４個／培羨皿となるように上記新鮮培地に播種して再喰
培養し、以降の増殖及び抗体産生を調べる。結果は添附
図面のグラフに示される通りであった。このグラフにお
いて、抗体産生は培養上清の稀釈系列を組み、これを酵
素免疫測定法で判定し、その時に陽性となる最終稀釈倍
数で示されている。このグラフから、本発明による培地
はハイブリドーマの増殖性及び抗体産生において、従来
の血清添加培地と等しいか、はぼ等しく、従って血清添
加培地を代替し得るものであることが判る。

各培地を用いて種々のハイブリドーマを予め継代培養す
る。新たな培養皿に更めて各培地をセットし、継代培養
された各ハイブリドーマを細胞数がそれぞれ５×１０４
個／培曽皿となるように上記各培地に播種し、３７℃、
５％ＣＯ２培養器内で３日間培養する。各培地における
細胞数を、ＲＰＭＩ１６４０−１０％牛脂児血清添加培
地に各バイプリドーマを５×１０４個／培養皿播種して
同様に培養した場合の細胞数で除算することにより各培
地による増殖効率を測定する。結果は後記機６に示され
る通りであった。この結果から、従来の培地を使用する
場合と比較して、本発明の培地によればハイブリドーマ
の増殖性がその種類の如何を問わず良好であることが判
る。

製造例１による無血清合成培地からインシュリン及びト
ランスフェリンを除いた培地を準備し、この培地を用い
５％００２．３７℃の培養器中でマウスハイブリドーマ
である２Ｄ７−Ｃ２ａを４８時間培養してこのハイブリ
ドーマの細胞同期を停止させておく。次に、製造例１に
準じて調製され、但しインシュリン及びトランスフェリ
ン濃度を種々変化させた各培地を調製し、又対照培地と
して１０％牛脂児血清の添加されたＲＰＭＩ１６４０培
地を調製し、上記ハイブリドーマの細胞数をｌＸ１０５
／培養佃に整えてこれらの各培地に播き、“３日の増殖
１Ｉｖｉ数を調べた。結果は後記機７に示される通りで
あり、この表からインシュリン及びトランスフェリンの
添加量はそれぞれ１〜１０μ９／■悲及び１０μｇ／■
Ｑが適当なことが判る。

試験例４ エタノールアミンの 製造例１による無血清合成培地からエタノールアミン除
いた培地及び対照培地としての血清添加培地（１０％牛
脂児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地）を調製し、これら
培地を用い５％ＣＯ２，３７℃の培養器中で各種のハイ
ブリドーマを継代培養しておく。次いで製造例１による
培地、製造例１に準じた但しエタノールアミン成分を欠
損させた培地及び上記血清添加培地をそれぞれ調製し、
上記の継代培養させたバイプリドーマを１×１０５個／
培ｌＩ皿に整えてこれらの各培地に播き３日問培養して
増殖細胞数を調べた。結果は後記機８に示される通りで
あり、エタノールアミンが細胞増造に有意の影響を及ぼ
すことが判る。

」１１ｉ 脂　　　（リノール　　の マウスハイブリドーマである２Ｄ７−Ｃ２ａを製造例２
の但し、リノール酸を含有しない培地を用いて５％ＣＯ
２，３７℃の培養器中で継代培養しておく。次いで対照
培地（ＲＰＭ　Ｉ　１６４０＋１０％牛脂児血清）及び
製造２による培地並びに製造例２に準じた但しノリール
酸量が異なったり、リノール酸が他の脂質に代替された
培地をそれぞれ調製し、上記の継代培養されたハイブリ
ドーマをｌＸ１０５１１／培ＩＩＩに整えてこれらの各
培地に播き、５％ＣＯ２，３７℃の培養器で３日間培養
して増殖細胞数を調べた。結果は後記機９に示される通
りであり、脂質成分としてはリノール酸が有効であり、
その添加量は１μＱ／ｍＱが適当であることが判る。

試験例６ 製造例１に準じて但しジヒドロキシエチルグリシンの添
加量を変化させて浸透圧が種々異なる無血清合成培地を
調製し１．又対照培地として血清添加培地（１０％牛脂
児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地）を調製し、これら培
地１マウスハイブリドーマである２Ｄ７−Ｃ２ａを継代
培液する。その後に、各々の培地のハイブリドーマをＩ
　Ｘ　１０５個／培養皿に整え、５％ＣＯ２，３７℃の
培養器中で３日間、培養して増殖細胞数を培養皿４枚の
平均上標準偏差を調べた。結果は後記衣１０に示される
通りであり、浸１圧としては２８５＋１１０８／向付近
が好適であることが判る。

尚、上記血清添加培地及び上記無血清合成培地Ｃを選択
し、且つ対照培地として製造例１に準じ但しジヒドロキ
シエチルグリシンの代りに汎用のＨＥＰＥＳ及び生理食
塩液を浸透圧調整剤とする培地を調製して上記と同様に
ハイブリドーマ２Ｄ７−Ｃ２ａを培養して細胞増殖を調
べた。結果は後記衣１１に示される通りであり、これか
らジヒドロキシエチルグリシンが細胞増殖に好影響を与
えること並びに汎用のＨＥＰＥＳが好ましいものではな
いことが判る。

表５ １）数値は培養皿２枚の平均値 ２）　　Ｐ３−Ｘ６３−人＃８−Ｕｌ由来（Ｃ反応性蛋
白を認識）５）　　、Ｐ３−Ｎ８Ｉ／１−Ａ１４−１由
来（マウスＭＭ抗原ｔ−認識）表６ 表９ １）脂質成分はエタノ−′ルで溶解し、予め１００倍濃
度に調製しておき、培地に は１／１０’０量宛添加。エタノール１７１００量では
１６３Ｘ１０’個／培養皿の増殖を示した。

２）培養皿３秋の平均値

【図面の簡単な説明】

添附図面は本発明による無血清合成培地及び対照培地と
しての牛胎児１１ｈｒｆｉ添加培地を用いて抗Ｃ反応性
蛋白抗体ハイプリドーマである２Ｄ７−Ｃ２ａを培養し
た場合の細胞増殖及び抗体産生を示づ一グラフである。 特　許　出　願　人　　日水製薬株式会社培養日数 手　　続　　補　　正　　書　（自　発）昭和５９年８
月２４日

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）イーグルＭＥＭとＲＰＭＩ１６４０との混合物を
   基本培地とし、これに培養添加物を加え、ジヒドロキシ
   エチルグリシン溶液及びβ−グリセロリン酸二ナトリウ
   ム溶液の少なくとも１方の溶液により浸透圧が２６５〜
   ３００ｍＯｓ／ｋｇに調整されていることを特徴とする
   、細胞用の無血清合成培地。
2. （２）基本培地が等容量のイーグルＭＥＭとＲＰＭＩ１
   ６４０との混合物であることを特徴とする、特許請求の
   範囲第１項に記載の無血清合成培地。
3. （３）培養添加物が亜セレン酸ナトリウムと、プレトス
   シン・２塩酸と、トランスフェリンと、モノエタノール
   アミンとを少なくとも含有していることを特徴とする、
   特許請求の範囲第１又は２項に記載の無血清合成培地。
4. （４）培養添加物がチミジン、ヒポキサンチン、ピルビ
   ン酸ナトリウム及びインシュリンを更に含有しているこ
   とを特徴とする、特許請求の範囲第３項に記載の無血清
   合成培地。
5. （５）培養添加物がチミジン、ヒポキサンチン、ピルビ
   ン酸ナトリウム、インシュリン及びリノール酸を更に含
   有していることを特徴とする、特許請求の範囲第３項に
   記載の無血清合成培地。
6. （６）培養添加物が安定化剤としてのコハク酸及びコハ
   ク酸塩を含有していることを特徴とする、特許請求の範
   囲第４項に記載の無血清合成培地。
7. （７）炭酸水素ナトリウムを含有しており、これにより
   ｐＨが約７．２−７．４に調整されていることを特徴と
   する、特許請求の範囲第１〜６項の何れか１つに記載の
   無血清合成培地。