JPH01187083A - 血管内皮細胞用培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、動物、ヒト等の血管内皮細胞を培養するため
の培地組成物に関するものである。

［従来の技術］ 最近の免疫学、細胞生理学などの分野において、血管内
皮細胞由来の細胞を培養し、動脈硬化症や癌の研究或い
は有用な生理活性作用をもった物質を見出す研究が活発
に行われている。

かかる研究、或いはかかる研究の成果として得られた有
用物質の生産等において、大量の血管内皮細胞用の培地
が必要とされる。

この血管内皮細胞用の培地としては、従来から牛胎児血
清や仔牛血清を１０％程度添加した培地が広く用いられ
ており、また、最近は、ヘパリン又はデキストラン硫酸
と内皮細胞増殖因子を添加した培地等が提案されている
（ヨーロッパ特許第１４２３４４号公報）。

［発明が解決しようとする問題点］ 上記の培地は、血清や内皮細胞増殖因子等の価格が高く
、また血清類の製造方法や製造ロットなどの相違により
増殖性が変動する等の問題があった。

本発明者は、血管内皮細胞の増殖因子に関する研究を進
める過程で、ヒポキサンチン、アデニン若しくはグアニ
ン、又はイノシン、アデノシン若しくはグアノシン又は
これらのデオキシ体等と、非常に少ない量の血清、ヘパ
リン又は繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）とを共存させる
ことにより、血管内皮細胞を特異的に増殖させ得ること
を見い出した。

本発明は、かかる知見に基づき、上記問題点を解決した
もので、本発明の目的は、比較的安価で、血管内皮細胞
を特異的、安定的に、かつ効率よく培養増殖できる培地
を提供することにある。

［問題点を解決するための手段］ 本発明は、血管内皮細胞用培地として、ヒポキサンチン
、アデニン若しくはグアニン、又はイノシン、アデノシ
ン若しくはグアノシン又はこれらのデオキシ体から選択
された一種以上の化合物と、血清、ヘパリン又は繊維芽
細胞増殖因子から選択される一種以上の物質とを含有さ
せることから成るものである。

すなわち、本発明においては、核酸の分解物であるヒポ
キサンチン、アデニン或いはグアニン及びこれらのりボ
ヌクレオシドであるイノシン、グアノシン或いはアデノ
シンさらにはイノシン、アデノシン、グアノシンのデオ
キシ体であるデオキシイノシン、デオキシアデノシン、
デオキシグアノシンのいずれか、或いはこれらの化合物
の二双上の組合せで用いられる。これらの化合物は、培
地中に０．１〜１０μｇ／ｍｌになるように添加するこ
とが好ましい。

また、本発明では、上記化合物とともに、血清、ヘパリ
ン又は繊維芽細胞増殖因子のいずれか或いはこれらの２
種以上の混合物を添加するが、この添加量としては、血
清の場合は、１％以下、ヘパリンの場合は、１０μｇ以
下、繊維芽細胞増殖因子の場合は、１０ｎｇ以下とする
ことが好ましい、なお、上記血清は、牛脂児血清や仔牛
血清を用いることが、入手が容易で好ましい。

上記化合物及び物質は、基本培地に加えられるが、この
基本培地としては、ダルベツコ改変イーグル培地（ＤＭ
Ｅ）、イーグルベーサルメディウム培地（ＢＭＥ）、ミ
ニマムエッセンシャ、ルメディウム培地（ＭＥＭ）、ハ
ム氏培地等の単独或いはこれらを適宜混合したものを用
いることができる。これらの基本培地の組成は、組織培
養の技術（日本組織培養学会間、１８６〜１８７頁、朝
食書店、昭和５７年２月２５日発行）に記載されている
。

［実施例］ （実験例１） 第１表記載の組成から成るダルベツコ改変イーグル培地
に１０％の牛脂児血清を加えた培地に、ブタ由来の大動
脈血管内皮細胞を４　Ｘ　１０”個／ｎ＋１になるよう
浮遊させ、９６穴のマルチデイツシュに０．２５＋ｓｌ
づつ分注した後、これを５％炭酸ガス濃度雰囲気、３７
℃の温度のインキュベーター内で、３２時間培養した０
次いで、培地を、ダルベツコ改変イーグル培地に、第２
表の成分にヒポキサンチンをそれぞれ０．０７．０．２
．０．６８．２．０４．６．８μｇ／醜１添加した培地
に替え、培養を続け、１６時間経過後。

０．１μＣｉのトリチウムチミジンを添加し、さらに８
時間培養した。培養終了後、培養液を除き、リン酸緩衝
生理食塩水で洗浄し、トリプシン溶液を用いて、細胞を
デイツシュから取り出し、洗浄後、液体シンチュレーシ
ョンカウンターで測定することにより、細胞中に取り込
まれたトリチウムチミジンの量、すなわち、ａ胞の増殖
率を見た。この増殖率の結果をヒポキサンチンを添加し
なかった場合を１００とし、これに対する比率として第
３表に示した。

（以下余白） 第１表　　　　　　（ｍｇ／ｌ） 第２表 （−は、添加無し。） 第３表 尚、上記において、培地を変換する際に、ダルベツコ改
変イーグル培地に１０％の牛脂児血清を加え、ヒポキサ
ンチンを添加しない培地で、同様の操作を行った結果は
、上記実験Ｎｏｌの血清０．３％、ヒポキサンチン無添
加の場合を１００として、約４００であった。

この結果から、ヒポキサンチンを添加することにより、
血清等の量を大幅に減少しても、細胞の増殖が充分に行
えることが分かる。

（実験例２） 実験例１に用いたのと同じダルベツコ改変イーグル培地
に１０％の牛脂児血清を加えた培地に、ブタ由来の大動
脈血管内皮細胞を細胞数２×１０４個／＋ａｌとなるよ
うに浮遊させ、２４穴のマルチデイツシュに０　、４　
ｍｌづつ分注した後、これを５％炭酸ガス濃度雰囲気、
３７℃の温度のインキュベーター内で、２０時間培養し
た０次いで、培地を、ダルベツコ改変イーグル培地に０
．３％の牛脂児血清及び第４表に示した化合物をそれぞ
れ５又は５０μＭ添加した培地に替え、培養を続け、４
日経過後に、０　、５　Ｂ／＋ｍｌの３−（４，５−ジ
メチルチアゾール−２−イル）−２゜５−ジフェニルテ
トラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）を含むダルベツコ改
変イーグル培地を２００μｍ添加し、４時間後、０．０
４規定の塩酸を含むイソプロピルアルコールを２００μ
ｌ加えて混合し、５７００■での吸光度を測定すること
により、細胞の増殖率を見た。この増殖率の結果は、第
４表の化合物を添加しない場合を１００とし、これに対
する比率として第４表に示した。　　　　　　　　　　
　　　　　（以下余白）第４表 この結果から明らかなように、アデニン、グアニン、イ
ノシン、グアノシン、アデノシン又はこれらのデオキシ
体もヒポキサンチンと同様に血清等の量を大幅に減少し
ても、細胞の増殖が充分に行えることが分かる。

（実験例３） 実験例１と同様のダルベツコ改変イーグル培地に１０％
の牛脂児血清を加えた培地に、ラット皮膚由来の繊維芽
細胞及びブタ血管由来の平滑筋細胞をそれぞれ細胞数４
　Ｘ　１０’個／ｍｌとなるように浮遊させ、これを９
６穴のマルチデイツシュに０．２５ｍ１づつ分注した後
、５％炭酸ガス濃度雰囲気、３７℃の温度のインキュベ
ーター内で、３２時間培養した。次いで、培地を、ダル
ベツコ改変イーグル培地に０．３％の牛脂児血清及び第
５表に示した化合物をそれぞれ５又は５０μＭ添加した
培地に替えて培養を続け、１６時間経過後、０．１μＣ
ｉのトリチウムチミジンを添加し、さらに８時間培養し
た。培養終了後、実験例１と同様な方法で細胞の増殖率
を見た。この増殖率の結果を、それぞれの化合物を添加
しなかった場合を１００とし、これに対する比率として
第５表に示した。

この結果から、ヒポキサンチン等が、血管内皮細胞に対
して特異的に増殖効果を示すことが分かる。

［発明の効果］ 本発明は、血管内皮細胞の培養用培地にヒポキサンチン
、アデニン若しくはグアニン、又はイノシン、アデノシ
ン若しくはグアノシン又はこれらのデオキシ体から選択
された一種以上の化合物と、血清、ヘパリン又は繊維芽
細胞増殖因子から選択される一種以上の物質を含有させ
るようにしたため、比較的安価で、血管内皮細胞を特異
的、安定的に、かつ効率よく培養増殖できるという格別
の効果を有する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ヒポキサンチン、アデニン若しくはグアニン、又はイノ
   シン、アデノシン若しくはグアノシン又はこれらのデオ
   キシ体から選択された一種以上の化合物と、血清、ヘパ
   リン又は繊維芽細胞増殖因子から選択される一種以上の
   物質とを含有させることを特徴とする血管内皮細胞用培
   地。