JP2011067203A - 無血清培養できるカイコ培養細胞株の作出およびその利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討し、カイコの胚子組織由来のNIAS-Bm-Ke1細胞株から連続継代性の培養細胞株(NIAS-Bm-Ke17)をクローニングにより作出した。当該細胞株は、カイコ熱処理体液添加及び低温処理を行うことにより、ウイルス感染を強く誘導することが可能であることが明らかとなった。
【選択図】なし
Description
本発明者らは、カイコの胚子組織由来のNIAS-Bm-Ke1細胞株から連続継代性の培養細胞株(NIAS-Bm-Ke17)をクローニングにより作出した。本細胞株は無血清・無タンパク質培地(SH-Ke-117培地)による培養においても優れた増殖性を示し、またカイコ熱処理体液をFBSの代替物として添加することにより、BmNPVの感染を増強できるのでFBS使用の弊害を回避できることが明らかとなった。さらにKe17細胞株は2.5℃、48時間の低温処理により、BmNPVの感染が高度に誘発される特長を有していることも明らかとなった。さらに、これらのカイコ熱処理体液添加効果と低温処理効果を組み合わせたところ、BmNPVの感染を著しく増強できるが明らかとなった。
〔1〕無血清培地における培養により安定に増殖する連続継代性のカイコ培養細胞系であって、低温処理によりウイルス感染が誘発される特徴を有するカイコ培養細胞系。
〔2〕カイコの胚組織由来である、〔1〕に記載のカイコ培養細胞系。
〔3〕クローン化された細胞系である、〔1〕または〔2〕に記載のカイコ培養細胞系。
〔4〕前記ウイルスが、カイコバキュロウイルスであることを特徴とする、〔1〕に記載のカイコ培養細胞系。
〔5〕前記カイコバキュロウイルスが、発現させたい目的遺伝子を含む組換えカイコバキュロウイルスであることを特徴とする、〔4〕に記載のカイコ培養細胞系。
〔6〕前記低温処理が2〜5℃で行われることを特徴とする、〔1〕に記載のカイコ培養細胞系。
〔7〕細胞系に培養細胞株(NIAS-Bm-Ke17(FERM P-21829))を含有することを特徴とする、〔1〕に記載のカイコ培養細胞系。
〔8〕以下の(1)〜(3)の工程を含む、目的遺伝子の発現方法。
(1)無血清培地において、〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載のカイコ培養細胞系を培養する工程、
(2)低温条件化において、発現させたい目的遺伝子を含む組換えカイコバキュロウイルスを(1)の培養物に感染させる工程、
(3)感染後の培養物をさらに培養し、目的遺伝子の発現物を回収する工程
〔9〕〔8〕(2)の工程における低温条件が、2〜5℃であることを特徴とする、〔8〕に記載の発現方法。
〔10〕〔8〕(2)の工程において、カイコ熱処理体液を培地に添加することを特徴とする、〔8〕に記載の発現方法。
〔11〕前記目的遺伝子が、膜タンパク質であることを特徴とする、〔8〕〜〔10〕のいずれかに記載の発現方法。
〔12〕培養細胞株(NIAS-Bm-Ke17(FERM P-21829))。
NIAS-Bm-Ke17細胞
(1)寄託機関名:独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
(2)連絡先: 〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 つくばセンター 中央第6
(3)受託番号:FERM P-21829
(4)識別のための表示:NIAS-Bm-Ke17
(5)受領日:2009年7月22日
(1)無血清培地において、請求項1〜7のいずれかに記載のカイコ培養細胞系を培養する工程、
(2)低温条件化において、発現させたい目的遺伝子を含む組換えカイコバキュロウイルスを(1)の培養物に感染させる工程、
(3)感染後の培養物をさらに培養し、目的遺伝子の発現物を回収する工程
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
〔実施例1〕NIAS-Bm-Ke17培養細胞株の培養
新規培養細胞株NIAS-Bm-Ke17(以下Ke17細胞と記載する)を以下の方法により作出した。Ke17細胞は今西ら(今西重雄ら(2006) 蚕糸・昆虫バイオテック, 75, 45-51)の方法により、先ずカイコ胚子を初代培養してNIAS-Bm-Ke1培養細胞株(FERM P-20572)を作出し、次にこの細胞株からクローニングを行って本培養細胞株を作出した。初代培養は1985年6月に開始し、1986年12月には継代培養に移行し、以後7日ごとに植え継ぎを行った。初代培養にはMGM448培地(Mitsuhashi, J: (1984) Zool.Sci., 1, 415-419)にFBSを10%容量加えた培地を用い、培養経過に応じてFBS添加量を順次減少し、同時にlactoalbumin hydrolysateとTC-Yeastolateを添加物とするMMSF培地(Mitsuhashi,J. (1982) Appl.Entomological.Zool., 17,575-581)に順次移行した。FBS添加量が1%量のMM培地で細胞が安定して増殖した後、MMSF培地または、コージンバイオ社製のカイコ細胞培養用無血清培地のKBM700培地(今西重雄ら(2005) 特開2007-75102)による無血清培養に移行した。
次に目的遺伝子を組み込んだカイコ核多角体病ウイルス(BmNPV)を、カイコ培養細胞株Ke17細胞へ感染させ、その遺伝子産物の測定を行った。
植え継ぎ後4日目の対数的増殖期のKe17細胞を2.5℃、5℃、10℃の低温室と20℃、25℃の恒温室にそれぞれ24時間保存した。温度処理直後の細胞を96ウエルマルチプレートにとり、2.5%量の熱処理体液とともにBmPTLNPVを接種した。27℃で4日間経過後、細胞内で産生されたルシフェラーゼ産物量を測定した。その結果、2.5℃保存の細胞では25℃保存の細胞内産生物量よりも32倍量ものルシフェラーゼ産生量を測定した(図5)。さらに保護時間を検討した結果、48時間において最大量のルシフェラーゼが産生されていた。一方、熱処理体液を加えない場合、ルシフェラーゼはほとんど産生されなかった(図6)。低温処理後室温に培養フラスコを取り出してBmPTLNPVを接種する際、時間の経過に従って培地の温度が上昇し、室温に達する。同時に細胞内の温度も室温に上昇する。室温に取り出して直ちに接種した場合は3時間経過後に接種した場合と比較して2.5倍高いルシフェラーゼ産生量であった(図7)。
次に、本発明のKe17細胞を用いて、4回膜貫通タンパク質claudin(claudin19:Miyamoto, T., et al (2005) J.Cell Biol., 169, 527-537)の発現検討を行った。
Claims (12)
- 無血清培地における培養により安定に増殖する連続継代性のカイコ培養細胞系であって、低温処理によりウイルス感染が誘発される特徴を有するカイコ培養細胞系。
- カイコの胚組織由来である、請求項1に記載のカイコ培養細胞系。
- クローン化された細胞系である、請求項1または2に記載のカイコ培養細胞系。
- 前記ウイルスが、カイコバキュロウイルスであることを特徴とする、請求項1に記載のカイコ培養細胞系。
- 前記カイコバキュロウイルスが、発現させたい目的遺伝子を含む組換えカイコバキュロウイルスであることを特徴とする、請求項4に記載のカイコ培養細胞系。
- 前記低温処理が2〜5℃で行われることを特徴とする、請求項1に記載のカイコ培養細胞系。
- 細胞系に培養細胞株(NIAS-Bm-Ke17(FERM P-21829))を含有することを特徴とする、請求項1に記載のカイコ培養細胞系。
- 以下の(1)〜(3)の工程を含む、目的遺伝子の発現方法。
(1)無血清培地において、請求項1〜7のいずれかに記載のカイコ培養細胞系を培養する工程、
(2)低温条件化において、発現させたい目的遺伝子を含む組換えカイコバキュロウイルスを(1)の培養物に感染させる工程、
(3)感染後の培養物をさらに培養し、目的遺伝子の発現物を回収する工程 - 請求項8(2)の工程における低温条件が、2〜5℃であることを特徴とする、請求項8に記載の発現方法。
- 請求項8(2)の工程において、カイコ熱処理体液を培地に添加することを特徴とする、請求項8に記載の発現方法。
- 前記目的遺伝子が、膜タンパク質であることを特徴とする、請求項8〜10のいずれかに記載の発現方法。
- 培養細胞株(NIAS-Bm-Ke17(FERM P-21829))。
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