WO2022215640A1

WO2022215640A1 - 動物細胞培養用の培地添加剤、動物細胞培養用の培地添加剤の製造方法、および細胞の培養方法

Info

Publication number: WO2022215640A1
Application number: PCT/JP2022/016402
Authority: WO
Inventors: 龍介藤田; 宜宏日下部; 真人日野; 啓充荒木
Original assignee: 国立大学法人九州大学
Priority date: 2021-04-08
Filing date: 2022-03-31
Publication date: 2022-10-13
Also published as: JPWO2022215640A1

Abstract

カイコ細胞を除く動物細胞培養用の培地添加剤は、カイコの血清に由来する成分を含む。カイコ細胞を除く動物細胞培養用の培地添加剤の製造方法は、カイコから抽出した血液に還元剤を添加する添加工程と、血液から分離した血清成分を加熱する第１の加熱工程と、を含む。

Description

動物細胞培養用の培地添加剤、動物細胞培養用の培地添加剤の製造方法、および細胞の培養方法

　本発明は、動物細胞培養用の培地添加剤、動物細胞培養用の培地添加剤の製造方法、および細胞の培養方法に関する。

　培養細胞は、本来生体内で起こる生命現象を生体外で再現することができるため、生命現象に関するメカニズムの解明、機能分子の産生、および薬剤の評価等に有用であり、研究、産業、製薬、および臨床を含む様々な分野において、多様な生物種で利用されている。

　細胞を培養するためには、培養対象の細胞に適した培地を使用する必要がある。細胞の種類および実験系に応じて様々な培地が使用されており、培地には、アミノ酸、ビタミン、無機塩、糖、成長因子およびホルモン等の様々な成分が含まれる。

　特に、ヒト等の哺乳類の細胞、ならびにショウジョウバエおよびカイコ等の昆虫の細胞を含む動物細胞を培養する場合には、アミノ酸、ビタミン、無機塩および糖等の基本培地に血清を添加することが必須である。血清は、多数の細胞増殖因子およびホルモン等の供給源であることが知られているが、血清中のすべての有効成分が同定されているわけではない。

　動物細胞の培養用培地に添加する血清としては、ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）、ウシ血清、ウマ血清、新生仔ウシ血清、ヤギ血清、ウサギ血清、ブタ血清、およびニワトリ血清等が使用されている。培養する細胞と同種の動物由来の血清を使用する場合もあるが、必ずしも入手が容易ではなく、また汎用性の観点からも、ＦＢＳが最も一般的に使用されている。多くの種類の細胞、例えば、ヒト等の哺乳類の細胞だけでなく、ショウジョウバエおよびカイコ等の昆虫細胞の培養においても、ＦＢＳは広く使用されている。乳牛および肉牛の生産において多くのオス牛が堕胎されており、ＦＢＳはその副産物として製造されているため、比較的安価に入手できるという利点がある。

　しかし、ＦＢＳを利用する際に最も大きな問題となるのが、人獣共通感染症のウイルス等の病原体の混入である。ＦＢＳの原料となるのは、ＦＢＳの生産用に管理された牛ではなく、前述のように一般の畜産農家で堕胎されたオス胎児である。ＦＢＳに混入するリスクのある病原体は１０種類ほど存在しているが、必ずしもそのすべての病原体の混入が検査されているわけではなく、病原体が混入した製品が流通するおそれがある。もし培地に病原体が混入すれば、その培地で培養した試料のすべてが病原体で汚染されてしまう。

　ＦＢＳの原料となる牛の飼育地域で病原体に起因する牛の感染症が流行した場合、ＦＢＳの供給が絶たれるという問題がある。細胞培養用血清は海外輸入に大きく依存しており、感染症の流行等によりサプライチェーンが崩壊し、安定的に供給できない事態が起こりうる。また、牛は遺伝的に均質な系統が確立されているわけではないため、個体差が大きく、ＦＢＳの成分等の品質もロットによる差が大きいという問題もある。

　したがって、均質性が高く安定的に供給できる血清が求められている。現在、ＦＢＳの代替品として、合成血清が販売されている。合成血清は、数十種類の細胞増殖因子を遺伝子組み換え大腸菌で合成し、精製して混合したものである。しかし、前述のように血清の有効成分がすべて同定されているわけではないため、合成血清を使用した場合の再現度は不十分である。また、合成血清は非常に高価である。

　ＦＢＳの代替として、様々な生物由来の成分を含有する添加剤が提案されている。例えば、特許文献１および特許文献２では、魚類由来の成分を含有する動物細胞用の培地添加剤が提案されている。特許文献１には、添加剤を添加した培地を用いた臍帯由来ヒト血管内皮細胞の培養では、ＦＢＳと同等の増殖活性がみられたことが記載されている。また、非特許文献１には、カイコ由来の血清成分を添加した培地を用いてカイコの細胞を培養することが記載されている。

特開２０１２－１２０５１５号公報特開２００３－３３４０６８号公報

Ｍａｓａｔｏ　Ｈｉｎｏ、外７名、「Ｍｉｌｄ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ　ｉｎ　ｓｉｌｋｗｏｒｍ　ｓｅｒｕｍ　ｆｏｒ　ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｉｎｓｅｃｔ　ｃｅｌｌｓ」、２０２０年、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｓｅｒｉｃｏｌｏｇｙ、８９、９－１６

　本発明は上述の事情に鑑みてなされたものであり、種々の細胞の培養に使用可能で、病原体混入のリスクがなく安定的に供給できる動物細胞培養用の培地添加剤、および動物細胞培養用の培地添加剤の製造方法を提供することを目的とする。また、種々の細胞の培養に使用可能で、病原体混入のリスクがない細胞の培養方法を提供することを目的とする。

　本発明の第１の観点に係るカイコ細胞を除く動物細胞培養用の培地添加剤は、
　カイコの血清に由来する成分を含む。

　本発明の第２の観点に係るカイコ細胞を除く動物細胞培養用の培地添加剤の製造方法は、
　カイコから抽出した血液に還元剤を添加する添加工程と、
　前記血液から分離した血清成分を加熱する第１の加熱工程と、
　を含む。

　この場合、上記本発明の第２の観点に係るカイコ細胞を除く動物細胞培養用の培地添加剤の製造方法は、
　前記第１の加熱工程において変性したタンパク質を除去する除去工程をさらに含む、
　こととしてもよい。

　また、上記本発明の第２の観点に係るカイコ細胞を除く動物細胞培養用の培地添加剤の製造方法は、
　前記除去工程の後に、前記血清成分を６５～８０℃に加熱する第２の加熱工程をさらに含む、
　こととしてもよい。

　また、前記還元剤は、
　Ｌ－システインである、
　こととしてもよい。

　また、前記第１の加熱工程では、
　前記血清成分を５３～５９℃に加熱する、
　こととしてもよい。

　また、前記第１の加熱工程における前記血清成分の加熱時間は、
　３０分間である、
　こととしてもよい。

　本発明の第３の観点に係る細胞の培養方法は、
　上記本発明の第１の観点に係る培地添加剤を含む培地において、カイコ細胞を除く動物細胞を培養する培養工程を含む。

　この場合、前記動物細胞は、
　初代培養細胞である、
　こととしてもよい。

　本発明によれば、種々の細胞の培養に使用可能で、病原体混入のリスクがない動物細胞培養用の培地添加剤を安定的に供給することができる。また、種々の細胞の培養に使用可能で、病原体混入のリスクがない細胞の培養方法が提供される。

試験例１に係る培養細胞を撮像した写真を示す図である。試験例２に係る培養細胞を撮像した写真を示す図である。試験例３に係る培養細胞を撮像した写真を示す図である。試験例４に係る吸光度を示す図である。試験例５に係る吸光度を示す図である。

　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。なお、下記の実施の形態において、“有する”、“含む”または“含有する”といった表現は、“からなる”または“から構成される”という意味も包含する。

　本実施の形態に係るカイコ細胞を除く動物細胞培養用の培地添加剤は、カイコの血清に由来する成分を含む。カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）は、カイコガ科に属する昆虫である。「血清に由来する成分」とは、単離した血清に含まれる１種以上の成分を意味し、「血清に由来する成分」には、単離した血清から一部の成分を除去したものが包含される。

　カイコ等の昆虫は牛等の哺乳類に比べ非常に小型であり、また哺乳類とは進化的に非常に離れているため、昆虫血清をヒト等の哺乳類の細胞の培養に利用しようという試みはなされてこなかった。しかし、カイコは、ヒト等の哺乳類と共通の病原体を持たないため、ヒト等の哺乳類の細胞を培養する際に、添加剤に由来する病原体の混入リスクを回避することができる。さらに、遺伝的に均質な系統のカイコを用いることで高い均質性を確保できる。

　本実施の形態に係る培地添加剤の製造方法の一例について説明する。培地添加剤の製造方法は、抽出工程と、添加工程と、分離工程と、第１の加熱工程と、除去工程と、を含む。

　抽出工程では、カイコ幼虫から血液を抽出する。血液はカイコ幼虫を遠心分離することで抽出できる。カイコ幼虫は、特に限定されないが、例えば、５齢幼虫である。

　カイコの血液が体外に抽出された後、酸化酵素の一種であるフェノールオキシダーゼの作用によりメラニンが生成される。メラニンの生成過程においてキノン類が生成されることが知られており、これらは反応性が高く、細胞毒性を示す。そのため、カイコの血清をそのまま細胞培養用の培地添加剤として用いることは好ましくない。このため、添加工程では、カイコから抽出した血液に還元剤を添加する。

　添加工程において使用する還元剤としては、フェニルチオウレア（ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏｕｒｅａ、ＰＴＵ）、チオ硫酸ナトリウム、Ｌ－グルタチオン、Ｌ－システイン、Ｌ－アスコルビン酸、およびクエン酸等が例示される。ＰＴＵおよびチオ硫酸ナトリウムは、フェノールオキシダーゼと銅イオンとの結合を阻害することによりフェノールオキシダーゼの活性を阻害する。そのため、フェノールオキシダーゼだけでなく、細胞における金属イオン依存性の酵素反応にも影響するおそれがある。したがって、好ましくは、還元剤は、フェノールオキシダーゼの活性を直接阻害する物質ではなく、メラニン生合成にのみ関係する代謝物であるドーパキノンを阻害する物質である。例えば、還元剤はＬ－グルタチオンまたはＬ－システインである。最も好ましくは、還元剤はＬ－システインである。

　還元剤は、メラニンの生成を抑制し、かつ細胞の増殖を阻害しない濃度であることが好ましい。還元剤がＬ－グルタチオンである場合、培地添加後のＬ－グルタチオンの終濃度は、好ましくは２．０～５．０ｍＭである。Ｌ－グルタチオンの終濃度は、より好ましくは２．５ｍＭ～３．０ｍＭである。還元剤がＬ－システインである場合、培地添加後のＬ－システインの終濃度は、好ましくは０．１ｍＭ～１２．５ｍＭ、より好ましくは０．５ｍＭ～２．０ｍＭ、さらに好ましくは１．２ｍＭ～１．６ｍＭである。

　分離工程では、血液から血清を遠心分離等により分離する。遠心分離の条件は適宜調整されるが、例えば、１２１０×ｇ、４℃で１５分間である。

　第１の加熱工程では、血液から分離した血清成分を加熱する。血清成分を加熱することで、フェノールオキシダーゼ等のメラニン化関連酵素を失活させることができる。第１の加熱工程における加熱温度は５０～９０℃程度である。好ましくは、加熱温度は５３～８０℃であり、より好ましくは５５～５７℃である。第１の加熱工程における加熱時間は１０分間以上である。好ましくは、加熱時間は２５～６０分間であり、より好ましくは３０分間である。第１の加熱工程では、例えば、血清成分は５６℃で３０分間加熱される。

　本実施の形態に係る培地添加剤の製造方法には、第１の加熱工程において変性したタンパク質を除去する除去工程をさらに含むことができる。タンパク質を除去する方法は、当分野で知られる任意のタンパク質除去方法を使用することができ、濾過、透析、塩析、遠心分離、吸着、抽出、およびクロマトグラフィー等が例示される。好ましくは、タンパク質を除去する方法は濾過であり、例えば孔径０．２２μｍのステリトップ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いることができる。

　なお、除去工程で得られた上清を透析して、Ｌ－システインの濃度を低くしてもよい。また、得られた血清成分に対して滅菌処理を行ってもよい。

　本実施の形態に係る培地添加剤の製造方法は、除去工程の後に、血清成分をさらに加熱する、第２の加熱工程をさらに含むことができる。第２の加熱工程における加熱温度は、５６～９０℃、好ましくは６５～８０℃である。第２の加熱工程における加熱時間は１０分間以上である。好ましくは、加熱時間は２５～６０分間であり、より好ましくは３０分間である。第２の加熱工程では、例えば、血清成分は６５℃で３０分間加熱される。第２の加熱工程の後に、上記除去工程と同様に、変性したタンパク質を除去してもよい。

　本実施の形態に係る培地添加剤は、上述の抽出、添加、分離、加熱、および除去工程を経て得られるカイコの血清に由来する成分そのままでもよいし、当分野で知られる手法によりカイコの血清に由来する成分を濃縮または希釈したものであってもよい。培地添加剤の形態は、液体または固体であってもよく、当分野で知られる手法を用いて、乾燥粉末、散剤、または錠剤等、任意の形態としてもよい。

　本実施の形態に係る培地添加剤は、カイコの血清に由来する成分および還元剤以外に、任意の他の成分をさらに含んでいてもよい。培地添加剤に含み得る他の成分としては、限定されないが、塩類、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、動物または植物由来の抽出物、緩衝剤、ビタミン、ホルモン、脂質、糖、浸透圧調節剤、増殖補助因子、および核酸等が例示される。

　カイコの血清に由来する成分および還元剤以外の他の成分としては、具体的には、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－オルニチン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン等、好ましくはＬ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、およびＬ－バリン等のアミノ酸；ｉ－イノシトール、ビオチン、葉酸、リポ酸、ニコチンアミド、ニコチン酸、ｐ－アミノ安息香酸、パントテン酸カルシウム、塩酸ピリドキサール、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミンＢ１２、およびアスコルビン酸等のビタミン；塩化コリン、酒石酸コリン、リノール酸、オレイン酸、リノレン酸、およびコレステロール等の脂質；グルコース、ガラクトース、マンノース、およびフルクトース等の炭素源；塩化ナトリウム、塩化カリウム、および硝酸カリウム等、好ましくは塩化ナトリウム等の浸透圧調節剤；ＥＤＴＡ鉄、クエン酸鉄、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、および硝酸第二鉄等の鉄源；炭酸水素ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、およびＭＯＰＳ等の緩衝剤などが例示される。

　本実施の形態に係る培地添加剤は、サイトカイン、アルブミン、および宿主細胞由来タンパク質等のタンパク質；硫酸銅、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム、塩化ニッケル、塩化スズ、塩化マグネシウム、および亜ケイ酸ナトリウム等の微量金属元素；Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ポリソルベート、およびプルロニック（登録商標）Ｆ６８等の界面活性剤；Ｃｌ^－、Ｂｒ^－、ＮＯ^２－、およびＳＯ４^２－等の無機アニオン、Ｌｉ^＋、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、およびＭｇ^２＋等の無機カチオン；コハク酸、およびピルビン酸等の有機酸、低級アミン類を含む無機物；インスリン、トランスフェリン、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ、ＩＧＦ）、表皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ、ＴＧＦ）－α、塩酸エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、レチノイン酸、および塩酸プトレッシン等の増殖等の増殖因子；デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、アデノシン、シチジン、グアノシン、およびウリジン等のヌクレオシド；ストレプトマイシン、ペニシリンＧカリウム、およびゲンタマイシン等の抗生物質；フェノールレッド等のｐＨ指示薬；２－メルカプトエタノール、およびシメチコン等の添加物等をさらに含んでもよい。

　本実施の形態に係る培地添加剤は、当分野で知られる任意の動物細胞培養用の培地に添加して使用することができる。好ましくは、当該培地添加剤は、無血清培地に添加される。動物細胞培養用の培地は、培養する細胞に応じて適した培地を選択することができる。培地の成分は、塩類、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、動物または植物由来の抽出物、緩衝剤、ビタミン、ホルモン、脂質、糖、浸透圧調節剤、増殖補助因子、および核酸等の、培地の成分として知られる任意の物質を含有していてもよい。当分野で知られる動物細胞培養用の培地としては、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅａｇｌｅ）培地、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）培地、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）培地、１９９培地、ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）１６４０培地、ハムＦ－１２培地、シュナイダー昆虫培地、およびグレース昆虫培地等が例示される。通常、これらの動物細胞用の培地には、ＦＢＳ等の血清を添加して使用されるが、ＦＢＳ等の血清に替えて、本実施の形態に係る培地添加剤を使用することができる。

　本実施の形態に係る培地添加剤は、カイコの血清に由来する成分の終濃度が２０％（ｖ／ｖ）以下となるように培地に添加される。好ましくは、培地におけるカイコの血清に由来する成分の終濃度は１～１５％（ｖ／ｖ）または２～１２％（ｖ／ｖ）であって、好ましくは１０％（ｖ／ｖ）である。

　動物細胞培養用の培地は、通常、哺乳類の細胞ではｐＨ７．２～７．４、昆虫の細胞ではｐＨ６．０であることが好ましい。本実施の形態に係る培地添加剤の添加後に、ＨＣｌまたはＮａＯＨ等を加えて、培養する細胞の至適ｐＨとなるように調整してもよい。

　本実施の形態に係る培地添加剤を添加した動物細胞培養用の培地を用いて培養される細胞は、カイコ細胞以外の動物細胞であれば特に限定されない。細胞は、例えば、ヒト、サル、牛、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、イヌ、およびネコ等の哺乳類、鶏、およびアヒル等の鳥類、爬虫類、両生類、魚類、およびショウジョウバエ等のカイコを除く昆虫の細胞である。細胞の種類は、あらゆる発生段階のあらゆる組織由来の細胞であってもよく、具体的には、ハムスター腎臓由来ＢＨＫ細胞、イヌマクロファージ由来ＤＨ８２細胞、アフリカミドリザル腎臓由来Ｖｅｒｏ細胞、ヒト乳腺由来ＭＣＦ７細胞等の動物組織由来の細胞、ならびにヒト由来初代培養細胞、ラット由来初代培養細胞、およびマウス由来初代培養細胞等の初代培養細胞等が例示される。

　また、細胞は胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ、ＥＳ細胞）または人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ、ｉＰＳ細胞）等の人工的に作製した幹細胞であってもよい。また、細胞は、当分野で知られる方法により外来のＤＮＡを導入したトランスジェニック動物由来の細胞であってもよいし、当分野で知られる方法により外来のＤＮＡまたはＲＮＡを一過的または安定的に導入した細胞であってもよい。

　本実施の形態に係る培地添加剤を添加した動物細胞培養用の培地を用いて細胞を培養する方法は、接着細胞または浮遊細胞等の細胞の性質、および実験に応じて、静置培養であってもよいし、振とう培養であってもよい。培養温度、培養時間、および気体組成等の培養条件は、培養する細胞および実験に応じて適宜選択してもよい。

　本実施の形態に係る培地添加剤によれば、細胞培養用の培地に添加して、ヒト等の哺乳類の細胞、およびショウジョウバエ等の昆虫の細胞等のカイコを除く動物の細胞を培養することができる。当該培地添加剤は、ヒト等の哺乳類または他の脊椎動物と共通する病原体を有しないカイコの血清に由来する成分を含むため、哺乳類または他の脊椎動物等の細胞を培養する場合には、培地添加剤に含まれ得る病原体による汚染を回避することができる。カイコは、牛等と異なり、既に遺伝的に均質な系統が確立されており、また、新たに遺伝的に均質な系統を確立することも比較的容易であるため、ロットの違いによる成分の相違等が少なく、均質な培地添加剤を安価かつ安定的に供給することができる。

　本実施の形態に係る培地添加剤の製造方法によれば、カイコの血清に由来する成分から生成されるメラニンの生成を抑制し、高品質な培地添加剤を製造することができる。当該製造方法は、さらに血清成分を超音波処理する工程を含んでもよい。

　なお、別の実施の形態では、細胞の培養方法が提供される。細胞の培養法方法は、上述の培地添加剤を含む培地において、カイコ細胞を除く動物細胞を培養する方法である。細胞は初代培養細胞であってもよい。

　以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

　（実施例１：動物細胞培養用の培地添加剤の調製）
　カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）は、Ｎ１７系統の遺伝的に均質なものを使用した。カイコの幼虫は、２５℃で桑の葉の上で飼育した。５齢幼虫の５日目のカイコから簡易遠心分離器を用いて血液を採取した。採取した血液に、培地添加後の終濃度が１．４ｍＭとなるようにＬ－システイン（富士フイルム和光純薬社製）を添加し、１，２１０×ｇ、４℃で１５分間遠心分離して血球成分を除去した。上清を回収し、５６℃で３０分間加熱してメラニン化関連酵素等を失活させた。さらに４℃で１５分間、９，０００×ｇで遠心分離して変性タンパク質を除去することで血清上清を得た。この血清上清をリン酸緩衝液（１×濃度等）に対して透析し、透析後の溶液を孔径０．２２μｍのステリトップ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で滅菌濾過することで、培地添加剤としてのカイコ血清を得た。

　（試験例１：ＦＢＳとカイコ血清由来培地添加剤の比較）
　１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＭＥＭ培地、および実施例１で調製したカイコ血清を１０％（ｖ／ｖ）の濃度で含むＭＥＭ培地を使用して、ハムスター腎臓由来ＢＨＫ細胞の増殖を比較した。１２穴プレートのウェルに、１×１０^５細胞／ｍＬのＢＨＫ細胞を加えた。ＰＢＳで細胞を２回洗浄した後、各ウェルにＭＥＭ培地を１ｍＬずつ加えた。ＦＢＳまたは実施例１で調製したカイコ血清を１０％（ｖ／ｖ）となるように各ウェルに加えた。陰性対照として、同量のＰＢＳを加えた。３７℃、５％ＣＯ_２で３日間培養し、細胞の状態を顕微鏡で観察した。

　（結果）
　図１は、ＦＢＳ、カイコ血清またはＰＢＳを添加したＭＥＭ培地で培養したＢＨＫ細胞の顕微鏡写真を示す。陰性対照であるＰＢＳ添加区では細胞の増殖はほとんど認められなかった。ＦＢＳ添加区およびカイコ血清添加区では、細胞の増殖が認められた。ＦＢＳ添加区では、細胞はコンフルエントまで増殖していた。カイコ血清添加区では、細胞はセミコンフルエントまで増殖していたが，ＦＢＳ添加区に比べると細胞数は少なかった。このことから、カイコ血清は、ＢＨＫ細胞に対し一定の増殖活性を有することが示された。

　（試験例２：カイコ血清を添加した培地での様々な細胞の培養）
　実施例１で調製したカイコ血清を１０％（ｖ／ｖ）の濃度で含むＭＥＭ培地を使用して、ハムスター腎臓由来ＢＨＫ細胞、イヌマクロファージ由来ＤＨ８２細胞、アフリカミドリザル腎臓由来Ｖｅｒｏ細胞、およびヒト乳腺由来ＭＣＦ７細胞を培養した。２４穴プレートのウェルに、それぞれ２×１０^４細胞／ｍＬのＢＨＫ細胞、ＤＨ８２細胞、Ｖｅｒｏ細胞、またはＭＣＦ７細胞を加えた。ＰＢＳで細胞を２回洗浄した後、各ウェルに１０％（ｖ／ｖ）のカイコ血清を含有するＭＥＭ培地を１ｍＬずつ加えた。３７℃、５％ＣＯ_２で４日間培養し、細胞の状態を顕微鏡で観察した。

　（結果）
　図２は、カイコ血清を添加したＭＥＭ培地で培養したＢＨＫ細胞、ＤＨ８２細胞、Ｖｅｒｏ細胞、およびＭＣＦ７細胞の顕微鏡写真である。上段は細胞培養開始時、下段は４日目の細胞の状態を示す写真である。ＢＨＫ細胞、ＤＨ８２細胞、Ｖｅｒｏ細胞、およびＭＣＦ７細胞のいずれの細胞においても細胞の増殖を示した。これにより、実施例１で調製したカイコ血清は、様々な種類の細胞の培養に使用できることが示された。

　（試験例３：カイコ血清を添加した培地でのヒト由来初代培養細胞の培養）
　１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地、および実施例１で調製したカイコ血清を１０％（ｖ／ｖ）の濃度で含むＤＭＥＭ培地を使用して、ヒト由来初代膵星細胞の増殖を比較した。１２穴プレートのウェルに、１×１０^５細胞／ｍＬの膵星細胞を加えた。ＰＢＳで細胞を２回洗浄した後、各ウェルに培地を１ｍＬずつ加えた。ＦＢＳまたは実施例１で調製したカイコ血清を１０％（ｖ／ｖ）となるように加えた。３７℃、５％ＣＯ_２で培養し、細胞の状態を顕微鏡で観察した。同じ培養試験を独立して２回行った。

　（結果）
　図３は、ＦＢＳを含むＭＥＭ培地またはカイコ血清を含むＭＥＭ培地で培養した膵星細胞の４日目の顕微鏡写真を示す。ＦＢＳ添加区およびカイコ血清添加区では、細胞の増殖が認められた。カイコ血清添加区では、ＦＢＳ添加区に比べると細胞数は少なかった。このことから、実施例１で調製したカイコ血清の添加によって、膵星細胞は一定の増殖活性を有することが示された。よって、カイコ血清は初代培養細胞の培養においても有用であることが示された。

　（試験例４：Ｖｅｒｏ細胞に対するカイコ血清の効果）
　アフリカミドリザル腎臓上皮細胞由来Ｖｅｒｏ細胞の増殖に対するカイコ血清の効果を、無血清またはＦＢＳと比較した。９６穴プレートに、１×１０^４細胞／ウェルでＶｅｒｏ細胞を播種し、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で一晩培養した（前培養）。血清を含まないＥＭＥＭ培地（２％（ｖ／ｖ）ＰＢＳを添加）、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地、および実施例１で調製したカイコ血清を２％（ｖ／ｖ）の濃度で含むＤＭＥＭ培地のいずれかを各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で３～６日間培養した。３日目および６日目に、以下の方法でＭＴＴアッセイを行った。１．５ｍｇ／ｍＬ　ＭＴＴ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｉｎ　ＰＢＳを各ウェルに１０μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で３．５時間培養した。培養上清を除去し、ＭＴＴ　ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（イソプロパノール中の４ｍＭ　ＨＣｌ、０．１％ＮＰ４０）を１５０μＬ添加し、３０分間、室温で振とうした。６５０ｎｍをリファレンスとして、プレートリーダーで５７０ｎｍの吸光度を測定した。

　(結果）
　図４に５７０ｎｍの吸光度を示す。陰性対照である血清を含まないＤＭＥＭでは細胞の増殖が見られないのに対し、カイコ血清を含むＤＭＥＭでは穏やかな細胞の増殖を示した。細胞の増殖速度は、ＦＢＳを含むＤＭＥＭに比べると遅かった。しかし、長期間の培養では、ＦＢＳを含むＤＭＥＭでは細胞の過密による負の影響により細胞数が著しく減少したのに対し、カイコ血清を含むＤＭＥＭでは細胞数の著しい減少が見られなかった。結果として、６日目において、２％（ｖ／ｖ）カイコ血清を含むＤＭＥＭでは、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地と同等の細胞数となった。

　（試験例５：カイコ血清の熱処理による効果）
　実施例１で調製したカイコ血清を、６５℃、７０．７℃、７４．４℃、８１．９℃、８５．６℃、８９．３℃、または９５℃で３０分間処理した。その後、５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を回収して熱処理カイコ血清とした。９６穴プレートに、１×１０^４細胞／ウェルでＶｅｒｏ細胞を播種し、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で一晩培養し（前培養）、５６℃で熱処理したサンプルとして実施例１で調製したカイコ血清、および各温度で熱処理した熱処理カイコ血清を、２％（ｖ／ｖ）または１０％（ｖ／ｖ）となるように添加した。添加後２日目に、試験例４と同様の方法でＭＴＴアッセイを行い、５７０ｎｍの吸光度を測定した。

　（結果）
　図５に５７０ｎｍの吸光度を示す。５６℃の熱処理カイコ血清を高濃度（１０％（ｖ／ｖ））で添加した場合は毒性が生じ、血清を含まない対照と比較して細胞数が少なかった。一方、６５～８０℃の熱処理カイコ血清では、高濃度で添加した場合であっても毒性はなく、対照および熱処理カイコ血清を低濃度（２％（ｖ／ｖ））で添加した場合と比較して、顕著な細胞増殖が見られた。

　上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

　本出願は、２０２１年４月８日に出願された、日本国特許出願２０２１－０６６００２号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０２１－０６６００２号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。

　本発明は、研究、産業、製薬、および臨床分野における生命現象に関するメカニズムの解明、機能分子の産生、または薬剤の評価等のための細胞培養に利用することができる。

Claims

　カイコの血清に由来する成分を含む、
　カイコ細胞を除く動物細胞培養用の培地添加剤。
　カイコから抽出した血液に還元剤を添加する添加工程と、
　前記血液から分離した血清成分を加熱する第１の加熱工程と、
　を含む、
　カイコ細胞を除く動物細胞培養用の培地添加剤の製造方法。
　前記第１の加熱工程において変性したタンパク質を除去する除去工程をさらに含む、
　請求項２に記載の製造方法。
　前記除去工程の後に、前記血清成分を６５～８０℃に加熱する第２の加熱工程をさらに含む、
　請求項３に記載の製造方法。
　前記還元剤は、
　Ｌ－システインである、
　請求項２から４のいずれか一項に記載の製造方法。
　前記第１の加熱工程では、
　前記血清成分を５３～５９℃に加熱する、
　請求項２から５のいずれか一項に記載の製造方法。
　前記第１の加熱工程における前記血清成分の加熱時間は、
　３０分間である、
　請求項６に記載の製造方法。
　請求項１に記載の培地添加剤を含む培地において、カイコ細胞を除く動物細胞を培養する培養工程を含む、
　細胞の培養方法。
　前記動物細胞は、
　初代培養細胞である、
　請求項８に記載の培養方法。