CZ35512U1 - Kultivační médium pro eliminaci defektů zrání savčích oocytů vyvolaných bisfenolem A nebo bisfenolem S - 2 - Google Patents

Description

Kultivační médium pro eliminaci defektů zrání savčích oocytů vyvolaných bisfenolem A nebo bisfenolem S - 2

Oblast techniky

Řešení se týká zvýšení vývojové schopnosti savčích oocytů získaných od zvířat, která byla vystavena nepříznivým účinkům endokrinních disruptorů bisfenolu A nebo bisfenolu S. Tento způsob kultivace má velký význam zejména při asistované reprodukci hospodářských zvířat.

Dosavadní stav techniky

Narůstající znečištění životního prostředí má za následek poruchy plodnosti. K polutantům, které se na tom významně podílejí, patří i endokrinní disruptory čili látky schopné narušit hormonální rovnováhu organismu. Mezi nimi zaujímají významné místo bisfenoly, především pak bisfenol A abisfenol S, používané hojně do nejrůznějších plastů, ale i dalších produktů, např. nejrůznějších druhů papíru včetně recyklovaných papírů. Endokrinní disruptory včetně bisfenolu A a bisfenolu S jsou v životním prostředí velmi rozšířené a jejich negativní efekt se projevuje už ve velmi nízkých koncentracích. Je proto krajně obtížné, ne-li nemožné, zajistit, aby lidé či zvířata nebyli účinku těchto látek vystaveni.

V současné době se pro asistovanou reprodukci savců, např. pro klonování, in vitro oplození, transgenozi, včetně hospodářsky významných druhů využívají oocyty dozrálé v podmínkách in vitro. Ty mohou pocházet od zvířat, jež byla vystavena účinkům endokrinních disruptorů. Kvalita takových oocytů je snížená a jejich schopnost dozrát v podmínkách in vitro bývá narušena. Platí to i při expozici zvířat bisfenolu A nebo bisfenolu S. Oba tyto endokrinní disruptory jsou s to narušit následné zrání oocytů in vitro. Proto se vyvíjejí systémy kultivace, které by riziko narušení in vitro zrání u oocytů ze zvířat exponovaných bisfenolu A nebo bisfenolu S snížily či eliminovaly. Pro tyto kultivační systémy se hledají látky, které by u oocytů kultivovaných in vitro zabránily významným vývojovým defektům.

Pokud by se podařilo zajistit plnohodnotné zrání i u oocytů ze zvířat, která byla předtím v důsledku znečištění životního prostředí vystavena působení bisfenolu A nebo bisfenolu S, zvýšilo by se využití šlechtitelského potenciálu samic a zefektivnily by se i postupy asistované reprodukce.

Podstata technického řešení

Uvedené problémy odstraňuje kultivační médium pro eliminaci defektů zrání savčích oocytů vyvolaných bisfenolem A nebo bisfenolem S, podle technického řešení, jehož podstata spočívá v tom, že 1 litr tohoto média obsahuje:

Chlorid vápenatý	0,139600 g/1
Dusičnan železitý · 9 H2O	0,000720 g/1
Síran hořečnatý (bezvodý)	0,097670 g/1
Chlorid draselný	4,000000 g/1
Fosforečnan draselný	0,060000 g/1
Octan sodný (bezvodý)	0,050000 g/1
Uhličitan sodný	2,200000 g/1
Chlorid sodný	8,000000 g/1
Fosforečnan sodný (bezvodý)	0,047880 g/1
L-alanin	0,025000 g/1
L-arginin · HC1	0,070000 g/1
L-kyselina asparagová	0,030000 g/1

CZ 35512 UI

	L-cystein · HC1 · H2O	0,000110 g/1
	L-cystin · 2 HC1	0,026000 g/1
	L-kyselina glutamová	0,066800 g/1
	L-glutamin	0,100000 g/1
5	Glycin	0,050000 g/1
	L-histidin · HC1 · H2O	0,021880 g/1
	Hydroxy-L-prolin	0,010000 g/1
	L-isoleucin	0,020000 g/1
	L-leucin	0,060000 g/1
10	L-lysin · HC1	0,070000 g/1
	L-methionin	0,015000 g/1
	L-fenylalanin	0,025000 g/1
	L-prolin	0,040000 g/1
	L-serin	0,025000 g/1
15	L-threonin	0,030000 g/1
	L-tryptofan	0,010000 g/1
	L-tyrozin · 2 Na · 2 H2O	0,057660 g/1
	L-valin	0,025000 g/1
	Kyselina askorbová · Na	0,0000566 g/1
20	D-Biotin	0,000010 g/1
	Kalciferol	0,000100 g/1
	Cholin chlorid	0,000500 g/1
	Kyselina listová	0,000010 g/1
	Menadion	0,000016 g/1
25	Myo-inozitol	0,000050 g/1
	Niacinamid	0,000025 g/1
	Kyselina nikotinová	0,000025 g/1
	Kyselina pantotenová	0,000050 g/1
	Kyselina p-aminobenzoová	0,000010 g/1
30	Pyridoxal · HC1	0,000025 g/1
	Pyridoxin · HC1	0,000025 g/1
	Retinol acetát	0,000140 g/1
	Riboflavin	0,000010 g/1
	DL-a-tokoferol fosfát · Na	0,000010 g/1
35	Thiamin · HC1	0,000010 g/1
	Adenin sulfát	0,010000 g/1
	Adenosin trifosfát · 2 Na	0,001000 g/1
	Adenosin monofosfát · Na	0,0002385 g/1
	Cholesterol	0,0002000 g/1
40	Deoxyribóza	0,0005000 g/1
	Glukóza	1,0000000 g/1
	Glutathion (redukovaný)	0,0000500 g/1
	Guanin ·	HC1 0,0003000 g/1
	Hypoxanthin	0,0003000 g/1
45	Fenolová červeň · Na	0,0213000 g/1
	TWEEN 80 - polyethylenglykolsorbitan oleát	0,0200000 g/1
	Ribóza	0,0005000 g/1
	Thymin	0,0003000 g/1
	Uracil	0,0003000 g/1
50	Xantin · Na	0,0003440 g/1
	Resveratrol	5 pM
	Cystathionin	5 pM
	Kyselina merkaptopyrohroznová	10 pM
55	Pinocembrin	25 nM.

-2 CZ 35512 UI

Kultivační medium podle technického řešení, ve kterém je nově obsažen pinocembrin podstatně zlepšuje kultivaci oocytů od zvířat, na které bylo nechtěně působeno všude přítomným bisfenolem A nebo bisfenolem S. Tím se snižují nežádoucí ztráty při řízené reprodukci hospodářských zvířat, což přináší velkou úsporu finančních prostředků.

Kultivační medium podle technického řešení bylo původci úspěšně vyzkoušeno v praxi v laboratořích přihlašovatele, kterým je Výzkumný ústav živočišné výroby, v.v.i., Praha Uhříněves, CZ.

Následující příklady provedení kultivační medium podle technického řešení pouze dokládají, ale neomezují.

Příklady uskutečnění technického řešení

Příklad 1

Při klasické kultivaci prasečích oocytů od prasnic, jež byly předtím vystaveny účinkům bisfenolu A nebo bisfenolu S, dochází v podmínkách in vitro k dokončení zrání do stádia metafáze II jen u 40 % oocytů.

Při použití kultivačního média podle technického řešení jsou prasečí oocyty s ukončenou růstovou fází kultivovány 44 hodin v kultivačním médiu s přídavkem 25nM pinocembrinu. Při tomto postupu stoupá významně podíl dozrálých oocytů, které dosáhnou stádia metafáze II s četností přes 85 %. Takto získané oocyty lze podrobit standardní partenogenetické aktivaci a navodit u nich vývoj do stádia blastocysty. Takto získané savčí partenogenetické zárodky ve vývojovém stádiu blastocysty lze využít například pro tvorbu embryonálních kmenových buněk.

Příklad 2

Při tradiční kultivaci oocytů skotu s ukončeným růstem od krav, jež byly předtím vystaveny účinkům bisfenolu A nebo bisfenolu S, dochází v podmínkách in vitro k dokončení zrání do stádia metafáze II jen u 25 % oocytů.

Při použití kultivačního média podle technického řešení jsou oocyty skotu s ukončenou růstovou fází od krav, jež byly předtím vystaveny účinku bisfenolu A nebo bisfenolu S, kultivovány 24 hodin v kultivačním médiu s přídavkem 50nM pinocembrinu. Při tomto postupu stoupá významně podíl dozrálých oocytů, které dosáhnou stádia metafáze II s četností přes 85 %. Takto získané oocyty lze podrobit standardnímu oplození in vitro. Úspěšně oplozené oocyty se dále vyvíjejí v embrya vhodná pro přenos náhradní matce.

Poznámka

TWEEN 80 je polyethylenglycolsorbitan monooleát

Průmyslová využitelnost

Nové kultivační médium pro eliminaci defektů zrání savčích oocytů vyvolaných bisfenolem A nebo bisfenolem S, které je obohaceno přídavkem pinocembrinu, podstatně zdokonaluje kultivaci oocytů in vitro, což má velký význam při reprodukčních biotechnologiích hospodářských zvířat.

Claims (1)

1. NÁROKY NA OCHRANU

   1. Kultivační médium pro eliminaci defektů zrání savčích oocytů vyvolaných bisfenolem A nebo

   5 bisfenolem S, vyznačující se tím, že 1 litr tohoto média obsahuje:

   Chlorid vápenatý 0,139600 g/1

   Dusičnan železitý · 9 H2O 0,000720 g/1

   Síran hořečnatý bezvodý 0,097670 g/1

   10 Chlorid draselný 4,000000 g/1

   Fosforečnan draselný 0,060000 g/1

   Octan sodný bezvodý 0,050000 g/1

   Uhličitan sodný 2,200000 g/1

   Chlorid sodný 8,000000 g/1

   15 Fosforečnan sodný bezvodý 0,047880 g/1

   U-alanin 0,025000 g/1

   U-arginin · HC1 0,070000 g/1

   U-kyselina asparagová 0,030000 g/1

   U-cystein · HC1 · H2O 0,000110 g/1

   20 U-cystin · 2 HC1 0,026000 g/1

   U-kyselina glutamová 0,066800 g/1

   U-glutamin 0,100000 g/1

   Glycin 0,050000 g/1

   U-histidin · HC1 · H2O 0,021880 g/1

   25 Hydroxy-U-prolin 0,010000 g/1

   U-isoleucin 0,020000 g/1

   U-leucin 0,060000 g/1

   U-lysin · HC1 0,070000 g/1

   U-methionin 0,015000 g/1

   30 U-fenylalanin 0,025000 g/1

   U-prolin 0,040000 g/1

   U-serin 0,025000 g/1

   U-threonin 0,030000 g/1

   U-tryptofan 0,010000 g/1

   35 U-tyrozin· 2 Na · 2 H2O 0,057660 g/1

   U-valin 0,025000 g/1

   Kyselina askorbová · Na 0,0000566 g/1

   D-Biotin 0,000010 g/1

   Kalciferol 0,000100 g/1

   40 Cholin chlorid 0,000500 g/1

   Kyselina listová 0,000010 g/1

   Menadion 0,000016 g/1

   Myo-inozitol 0,000050 g/1

   Niacinamid 0,000025 g/1

   45 Kyselina nikotinová 0,000025 g/1

   Kyselina pantotenová 0,000050 g/1

   Kyselina p-aminobenzoová 0,000010 g/1

   Pyridoxal · HC1 0,000025 g/1

   Pyridoxin · HC1 0,000025 g/1

   50 Retinol acetát 0,000140 g/1

   Riboflavin 0,000010 g/1

   DU-a-tokoferol fosfát · Na 0,000010 g/1

   Thiamin · HC1 0,000010 g/1

   Adenin sulfát 0,010000 g/1

   55 Adenosin trifosfát · 2 Na 0,001000 g/1