CZ32520U1

CZ32520U1 - Kultivační medium pro eliminaci defektů zrání savčích oocytů vyvolaných glyfosátem - ocimen

Info

Publication number: CZ32520U1
Application number: CZ2018-35591U
Authority: CZ
Inventors: Kristýna Hošková; Tereza Žalmanová; Tomáš Kott; Jaroslav Petr
Original assignee: Výzkumný Ústav Živočišné Výroby V.V.I.
Priority date: 2018-06-20
Filing date: 2018-06-20
Publication date: 2019-01-30

Description

Oblast techniky

Řešení se týká zvýšení vývojové schopnosti savčích oocytů získaných od zvířat, která byla vystavena nepříznivým účinkům herbicidu glyfosátu. Toto kultivační medium má velký význam zejména při asistované reprodukci hospodářských zvířat.

Dosavadní stav techniky

Narůstající znečištění životního prostředí má za následek poruchy plodnosti. K polutantům, které se na tom významně podílejí, patří i endokrinní disruptory, čili látky schopné narušit hormonální rovnováhu organismu. Mezi nimi zaujímají významné místo i herbicidy používané v zemědělství včetně glyfosátu. Tyto látky jsou v životním prostředí velmi rozšířené a jejich negativní efekt se projevuje už ve velmi nízkých koncentracích. Je proto krajně obtížné, ne-li nemožné, zajistit, aby lidé či zvířata nebyli účinku těchto látek vystaveni. V současné době se pro asistovanou reprodukci savců, např. pro klonování, in vitro oplození, transgenozi, včetně hospodářsky významných druhů, využívají oocyty dozrálé v podmínkách in vitro. Ty mohou pocházet od zvířat, jež byla vystavena účinkům látek znečišťujících životní prostředí. Kvalita takových oocytů je snížená a jejich schopnost dozrát v podmínkách in vitro bývá narušena. Platí to i při expozici zvířat glyfosátem, který se vyskytuje v krmivech a je schopný následně narušit zrání oocytů in vitro. Proto se vyvíjejí systémy kultivace, které by riziko narušení in vitro zrání u oocytů ze zvířat exponovaných glyfosátem eliminovaly. Pro tyto kultivační systémy se hledají látky, které by u oocytů kultivovaných in vitro zabránily významným vývojovým defektům.

Pokud by se podařilo zajistit plnohodnotné zrání i u oocytů ze zvířat, která byla předtím v důsledku znečištění životního prostředí vystavena působení glyfosátu, zvýšilo by se využití šlechtitelského potenciálu samic a zefektivnily by se i postupy asistované reprodukce.

Podstata technického řešení

Uvedené problémy odstraňuje kultivační medium pro eliminaci defektů zrání savčích oocytů vyvolaných glyfosátem, podle technického řešení, jehož podstata spočívá v tom, že 1 1 tohoto media obsahuje

Chlorid vápenatý	0,139600 g/1
Dusičnan železitý · 9 H₂O	0,000720 g/1
Síran hořečnatý (bezvodý)	0,097670 g/1
Chlorid draselný	4,000000 g/1
Fosforečnan draselný	0,060000 g/1
Octan sodný (bezvodý)	0,050000 g/1
Uhličitan sodný	2,200000 g/1
Chlorid sodný	8,000000 g/1

- 1 CZ 32520 U1

Fosforečnan sodný (bezvodý)	0,047880 g/1
L-alanin	0,025000 g/1
L-arginin · HC1	0,070000 g/1
L-kyselina asparagová	0,030000 g/1
L-cystein · HC1 · H₂O	0,000110 g/1
L-cystin · 2 HC1	0,026000 g/1
L-kyselina glutamová	0,066800 g/1
L-glutamin	0,100000 g/1
Glycin	0,050000 g/1
L-histidin · HC1 · H₂O	0,021880 g/1
Hydroxy-L-prolin	0,010000 g/1
L-isoleucin	0,020000 g/1
L-leucin	0,060000 g/1
L-lysin · HC1	0,070000 g/1
L-methionin	0,015000 g/1
L-fenylalanin	0,025000 g/1
L-prolin	0,040000 g/1
L-serin	0,025000 g/1
L-threonin	0,030000 g/1
L-tryptofan	0,010000 g/1
L-tyrozin· 2 Na · 2 H₂O	0,057660 g/1
L-valin	0,025000 g/1
Kyselina askorbová «Na	0,0000566 g/1
D-Biotin	0,000010 g/1
Kalciferol	0,000100 g/1
Cholin chlorid	0,000500 g/1
Kyselina listová	0,000010 g/1
Menadion	0,000016 g/1
Myo-inozitol	0,000050 g/1

-2CZ 32520 Ul

Niacinamid	0,000025 g/1
Kyselina nikotinová	0,000025 g/1
Kyselina pantotenová	0,000050 g/1
Kyselina p-aminobenzoová	0,000010 g/1
Pyridoxal · HC1	0,000025 g/1
Pyridoxin · HC1	0,000025 g/1
Retinol acetát	0,000140 g/1
Riboflavin	0,000010 g/1
DL-a-tokoferol fosfát · Na	0,000010 g/1
Thiamin · HC1	0,000010 g/1
Adenin sulfát	0,010000 g/1
Adenosin trifosfát · 2 Na	0,001000 g/1
Adenosin mono fosfát «Na	0,0002385 g/1
Cholesterol	0,0002000 g/1
Deoxyribóza	0,0005000 g/1
Glukóza	1,0000000 g/1
Glutathion (redukovaný)	0,0000500 g/1
Guanin · HC1	0,0003000 g/1
Hypoxanthin	0,0003000 g/1
Fenolová červeň · Na	0,0213000 g/1
Polyoxyethylensorbitanmonooleát	0,0200000 g/1
Ribóza	0,0005000 g/1
Thymin	0,0003000 g/1
Uráčil	0,0003000 g/1
Xantin · Na	0,0003440 g/1
Resveratrol	5 μΜ
Cystathionin	5 μΜ
Kyselina merkaptopyrohroznová	10 μΜ
Beta-ocimen	25 nM.

Kultivační medium podle technického řešení je charakterizováno tím, že se oocyty s ukončenou růstovou fází kultivují in vitro s beta-ocimenem po dobu, která je u daného druhu zvířat běžně nutná pro postup zrání oocytů do metafáze II. Kultivační medium podle technického řešení je dále charakterizováno tím, že se na oocyty s ukončeným růstem a úplně vyvinutou vývojovou schopností během jejich zrání in vitro působí v in vitro kultuře beta-ocimen v koncentracích od 10 do 100 nM, přičemž tato kultivace trvá po dobu, která odpovídá době nutné v podmínkách kultivace in vitro pro postup zrání oocytů do stádia metafáze II.

Kultivační medium podle technického řešení pro zvýšení ochrany oocytů proti efektům glyfosátu se konkrétně výhodně používá tak, že se nezralé savčí oocyty s ukončeným růstem a úplně vyvinutou vývojovou schopností in vitro kultivují v médiu s beta-ocimenem v koncentraci 50 nM. Kultivace trvá dobu, která je u daného druhu potřebná pro dozrání oocytů s ukončenou růstovou fází a plnou vývojovou schopností v podmínkách in vitro, tj. u prasete asi 44 až 48 hodin, u skotu 22 až 24 hodin a poté se získá nejméně 80 % kvalitních oocytů pro jejich další použití.

Kultivačním mediem podle technického řešení jsou oocyty vystaveny působení beta-ocimenu, což má pozitivní vliv na kvalitu zrání oocytů, především pak na integritu dělícího vřeténka a euploidní stav chromozomů dozrálého oocytů. To se ukazuje jako velmi výhodné, protože experimenty původců prokázaly, že kultivace s beta-ocimenem má příznivý efekt na zrání oocytů od zvířat, jež byla předtím vystavena účinku glyfosátu. Pokud není použito kultivační medium podle technického řešení, pak většina kultivovaných oocytů ze zvířat, jež byla předtím vystavena účinkům glyfosátu, má narušené dělící vřeténko a při vydělení prvního pólového tělíska dochází k aneuploidiím. Takové oocyty jsou pro většinu biotechnologií nepoužitelné. Kultivačním mediem podle technického řešení je dosaženo úplného zrání oocytů do metafáze II u více než 80 % oocytů. Tyto oocyty lze použít pro další reprodukční biotechnologie, protože jsou s to se vyvíjet v kvalitní embrya.

Působením kultivačního media podle technického řešení dojde k podstatnému zvýšení podílu oocytů, jež dokončí zrání a jsou využitelné pro další reprodukční biotechnologie. Ve srovnání s tradičními postupy kultivace je nárůst podílu dozrálých oocytů zhruba dvoj- až trojnásobný, což má velký hospodářský význam. Způsob kultivace in vitro oocytů od zvířat, jež byla předtím vystavena účinku glyfosátu, kultivačním mediem podle technického řešení lze využít zejména při reprodukčních biotechnologiích hospodářských zvířat, např. pro klonování či ICSI.

Kultivační medium podle technického řešení pro zvýšení vývojové schopnosti oocytů od zvířat vystavených před kultivací působení glyfosátu in vitro s beta-ocimenem bylo původci úspěšně ověřeno v laboratořích a stájích u přihlašovatele, kterým je Výzkumný ústav živočišné výroby, v.v.i., v Praze, CZ.

Následující příklady provedení kultivační medium podle technického řešení pouze dokládají, aniž by ho jakkoliv omezovaly.

Příklady uskutečnění technického řešení

Příklad 1

Kultivační medium podle technického řešení pro eliminaci defektů zrání savčích oocytů vyvolaných glyfosátem mělo vil následující složení:

Chlorid vápenatý 0,139600 g/1

Dusičnan železitý · 9 H₂O 0,000720 g/1

-4CZ 32520 U1

Síran hořečnatý (bezvodý)	0,097670 g/1
Chlorid draselný	4,000000 g/1
Fosforečnan draselný	0,060000 g/1
Octan sodný (bezvodý)	0,050000 g/1
Uhličitan sodný	2,200000 g/1
Chlorid sodný	8,000000 g/1
Fosforečnan sodný (bezvodý)	0,047880 g/1
L-alanin	0,025000 g/1
L-arginin · HC1	0,070000 g/1
L-kyselina asparagová	0,030000 g/1
L-cystein · HC1 · H₂O	0,000110 g/1
L-cystin · 2 HC1	0,026000 g/1
L-kyselina glutamová	0,066800 g/1
L-glutamin	0,100000 g/1
Glycin	0,050000 g/1
L-histidin · HC1 · H₂O	0,021880 g/1
Hydroxy-L-prolin	0,010000 g/1
L-isoleucin	0,020000 g/1
L-leucin	0,060000 g/1
L-lysin · HC1	0,070000 g/1
L-methionin	0,015000 g/1
L-fenylalanin	0,025000 g/1
L-prolin	0,040000 g/1
L-serin	0,025000 g/1
L-threonin	0,030000 g/1
L-tryptofan	0,010000 g/1
L-tyrozin· 2 Na · 2 H₂O	0,057660 g/1
L-valin	0,025000 g/1
Kyselina askorbová «Na	0,0000566 g/1
D-Biotin	0,000010 g/1

-5 CZ 32520 U1

Kalciferol	0,000100 g/1
Cholin chlorid	0,000500 g/1
Kyselina listová	0,000010 g/1
Menadion	0,000016 g/1
Myo-inozitol	0,000050 g/1
Niacinamid	0,000025 g/1
Kyselina nikotinová	0,000025 g/1
Kyselina pantotenová	0,000050 g/1
Kyselina p-aminobenzoová	0,000010 g/1
Pyridoxal · HC1	0,000025 g/1
Pyridoxin · HC1	0,000025 g/1
Retinol acetát	0,000140 g/1
Riboflavin	0,000010 g/1
DL-a-tokoferol fosfát · Na	0,000010 g/1
Thiamin · HC1	0,000010 g/1
Adenin sulfát	0,010000 g/1
Adenosin trifosfát · 2 Na	0,001000 g/1
Adenosin mono fosfát «Na	0,0002385 g/1
Cholesterol	0,0002000 g/1
Deoxyribóza	0,0005000 g/1
Glukóza	1,0000000 g/1
Glutathion (redukovaný)	0,0000500 g/1
Guanin · HC1	0,0003000 g/1
Hypoxanthin	0,0003000 g/1
Fenolová červeň «Na	0,0213000 g/1
Polyoxyethylensorbitanmonooleát	0,0200000 g/1
Ribóza	0,0005000 g/1
Thymin	0,0003000 g/1
Uráčil	0,0003000 g/1
Xantin · Na	0,0003440 g/1

-6CZ 32520 U1

Resveratrol

Cystathionin

Kyselina merkaptopyrohroznová

Beta-ocimen μΜ μΜ μΜ nM.

Při klasické kultivaci prasečích oocytů od prasnic, jež byly předtím vystaveny účinkům glyfosátu v krmivu, dochází v podmínkách in vitro za 44 hodin ke kompletaci zrání do stádia metafáze II u 38 % oocytů. Prasečí oocyty s ukončenou růstovou fází odebrané ze zvířat, jež byla vystavena účinku glyfosátu, např. v krmivu z plodin ošetřených tímto herbicidem, jsou kultivovány po celou dobu kultivace in vitro, tj. po dobu 44 hodin v kultivačním médiu s přídavkem 50 nM betaocimenu. Při tomto postupu stoupá významně podíl dozrálých oocytů, které dosáhnou stádia metafáze II s četností přes 80 %. Takto získané oocyty lze podrobit standardní partenogenetické aktivaci, např. kalcium ionoforem, a navodit u nich embryonální vývoj do stádia blastocysty. Takto získané savčí partenogenetické zárodky ve vývojovém stádiu blastocyty lze využít například pro tvorbu embryonálních kmenových buněk.

Příklad 2

Při tradiční kultivaci oocytů skotu s ukončeným růstem od krav, jež byly předtím vystaveny účinkům glyfosátu v krmivu, dochází v podmínkách in vitro za 24 hodin ke kompletaci zrání do stádia metafáze II u 41 % oocytů. Oocyty skotu s ukončenou růstovou fází od krav, jež byly předtím vystaveny účinku glyfosátu, např. v krmivech z plodin ošetřených tímto herbicidem, byly kultivovány po celou dobu kultivace, tj. po dobu 24 hodin, v kultivačním médiu podle technického řešení s 50 nM beta-ocimenu. Při tomto postupu stoupá významně podíl dozrálých oocytů, které dosáhnou stádia metafáze II s četností přes 85 %. Takto získané oocyty lze podrobit standardnímu oplození in vitro. Úspěšně oplozené oocyty se dále vyvíjejí v embrya vhodná pro přenos náhradní matce.

Průmyslová využitelnost

Nové kultivační medium pro eliminaci defektů zrání savčích oocytů in vitro vyvolaných glyfosátem využívá účinků beta-ocimenu, kdy dojde k podstatnému zvýšení množství získaných kvalitních dozrálých oocytů, což má velký význam při reprodukčních biotechnologiích hospodářských zvířat.

NÁROKY NA OCHRANU

Claims

1. Kultivační medium pro eliminaci defektů zrání savčích oocytů vyvolaných glyfosátem, vyznačující se tím, že 1 1 media obsahuje

Chlorid vápenatý

Dusičnan železitý · 9 H₂O

Síran hořečnatý (bezvodý)

Chlorid draselný

0,139600 g/1

0,000720 g/1

0,097670 g/1

4,000000 g/1

-7 CZ 32520 U1

Fosforečnan draselný 0,060000 g/1 Octan sodný (bezvodý) 0,050000 g/1 Uhličitan sodný 2,200000 g/1 Chlorid sodný 8,000000 g/1 Fosforečnan sodný (bezvodý) 0,047880 g/1 L-alanin 0,025000 g/1 L-arginin · HC1 0,070000 g/1 L-kyselina asparagová 0,030000 g/1 L-cystein · HC1 · H₂O 0,000110 g/1 L-cystin · 2 HC1 0,026000 g/1 L-kyselina glutamová 0,066800 g/1 L-glutamin 0,100000 g/1 Glycin 0,050000 g/1 L-histidin · HC1 · H₂O 0,021880 g/1 Hydroxy-L-prolin 0,010000 g/1 L-isoleucin 0,020000 g/1 L-leucin 0,060000 g/1 L-lysin · HC1 0,070000 g/1 L-methionin 0,015000 g/1 L-fenylalanin 0,025000 g/1 L-prolin 0,040000 g/1 L-serin 0,025000 g/1 L-threonin 0,030000 g/1 L-tryptofan 0,010000 g/1 L-tyrozin· 2 Na · 2 H₂O 0,057660 g/1 L-valin 0,025000 g/1 Kyselina askorbová «Na 0,0000566 g/1 D-Biotin 0,000010 g/1 Kalciferol 0,000100 g/1 Cholin chlorid 0,000500 g/1

-8CZ 32520 Ul

Kyselina listová 0,000010 g/1 Menadion 0,000016 g/1 Myo-inozitol 0,000050 g/1 Niacinamid 0,000025 g/1 Kyselina nikotinová 0,000025 g/1 Kyselina pantotenová 0,000050 g/1 Kyselina p-aminobenzoová 0,000010 g/1 Pyridoxal · HC1 0,000025 g/1 Pyridoxin · HC1 0,000025 g/1 Retinol acetát 0,000140 g/1 Riboflavin 0,000010 g/1 DL-a-tokoferol fosfát · Na 0,000010 g/1 Thiamin · HC1 0,000010 g/1 Adenin sulfát 0,010000 g/1 Adenosin trifosfát · 2 Na 0,001000 g/1 Adenosin monofosfát · Na 0,0002385 g/1 Cholesterol 0,0002000 g/1 Deoxyribóza 0,0005000 g/1 Glukóza 1,0000000 g/1 Glutathion (redukovaný) 0,0000500 g/1 Guanin · HC1 0,0003000 g/1 Hypoxanthin 0,0003000 g/1 Fenolová červeň · Na 0,0213000 g/1 Polyoxyethylensorbitanmonooleát 0,0200000 g/1 Ribóza 0,0005000 g/1 Thymin 0,0003000 g/1 Uráčil 0,0003000 g/1 Xantin · Na 0,0003440 g/1 Resveratrol 5 μΜ Cystathionin 5 μΜ