CZ307943B6

CZ307943B6 - Způsob eliminace defektů zrání savčích oocytů vyvolaných glyfosátem A

Info

Publication number: CZ307943B6
Application number: CZ2018-300A
Authority: CZ
Inventors: Kristýna Hošková; Tereza Žalmanová; Tomáš Kott; Jaroslav Petr
Original assignee: Výzkumný Ústav Živočišné Výroby V.V.I.
Priority date: 2018-06-20
Filing date: 2018-06-20
Publication date: 2019-09-04
Also published as: CZ2018300A3

Abstract

Řešení se týká způsobu zdokonalené kultivace oocytů s ukončenou růstovou fází získaných od zvířat, která byla vystavena účinku glyfosátu, v podmínkách in vitro využívající kultivace s beta-ocimenem. Tato kultivace umožňuje získat podstatně větší množství kvalitních dozrálých oocytů, což má velké využití při reprodukčních biotechnologiích hospodářských zvířat.

Description

Řešení se týká zvýšení vývojové schopnosti savčích oocytů získaných od zvířat, která byla vystavena nepříznivým účinkům herbicidu glyfosátu. Tento způsob kultivace má velký význam zejména při asistované reprodukci hospodářských zvířat.

Dosavadní stav techniky

Narůstající znečištění životního prostředí má za následek poruchy plodnosti. K polutantům, které se na tom významně podílejí, patří i endokrinní disruptory čili látky schopné narušit hormonální rovnováhu organismu. Mezi nimi zaujímají významné místo i herbicidy používané v zemědělství včetně glyfosátu. Tyto látky jsou v životním prostředí velmi rozšířené a jejich negativní efekt se projevuje už ve velmi nízkých koncentracích. Je proto krajně obtížné, ne-li nemožné, zajistit, aby lidé či zvířata nebyli účinku těchto látek vystaveni. V současné době se pro asistovanou reprodukci savců, např. pro klonování, in vitro oplození, transgenozi, včetně hospodářsky významných druhů využívají oocyty dozrálé v podmínkách in vitro. Ty mohou pocházet od zvířat, jež byla vystavena účinkům látek znečišťujících životní prostředí. Kvalita takových oocytů je snížená a jejich schopnost dozrát v podmínkách in vitro bývá narušena. Platí to i při expozici zvířat glyfosátem, který se vyskytuje v krmivech a je schopný následně narušit zrání oocytů in vitro. Proto se vyvíjejí systémy kultivace, které by riziko narušení in vitro zrání u oocytů ze zvířat exponovaných glyfosátem eliminovaly. Pro tyto kultivační systémy se hledají látky, které by u oocytů kultivovaných in vitro zabránily významným vývojovým defektům.

Pokud by se podařilo zajistit plnohodnotné zrání i u oocytů ze zvířat, která byla předtím v důsledku znečištění životního prostředí vystavena působení glyfosátu, zvýšilo by se využití šlechtitelského potenciálu samic a zefektivnily by se i postupy asistované reprodukce.

Podstata vynálezu

Uvedené problémy odstraňuje způsob eliminace defektů zrání savčích oocytů vyvolaných glyfosátem, podle vynálezu, jehož podstata spočívá vtom, že během zrání těchto oocytů v podmínkách in vitro jsou oocyty vystaveny působení beta-ocimenu.

Způsob podle vynálezu je charakterizován tím, že se oocyty s ukončenou růstovou fází kultivují in vitro s beta-ocimenem po dobu, která je u daného druhu zvířat běžně nutná pro postup zrání oocytů do metafáze II. Způsob podle vynálezu je dále charakterizován tím, že se na oocyty s ukončeným růstem a úplně vyvinutou vývojovou schopností během jejich zrání in vitro působí v in vitro kultuře beta-ocimenem v koncentracích od 10 do 100 nM, přičemž tato kultivace trvá po dobu, která odpovídá době nutné v podmínkách kultivace in vitro pro postup zrání oocytů do stádia metafáze II.

Způsob zvýšení ochrany oocytů proti efektům glyfosátu podle vynálezu se konkrétně výhodně provádí tak, že se nezralé savčí oocyty s ukončeným růstem a úplně vyvinutou vývojovou schopností in vitro kultivují v médiu s beta-ocimenem v koncentraci 50 nM. Kultivace trvá dobu, která je u daného druhu potřebná pro dozrání oocytů s ukončenou růstovou fází a plnou vývojovou schopností v podmínkách in vitro, tj. u prasete asi 44 až 48 hodin, u skotu 22 až 24 hodin, a poté se získá nejméně 80 % kvalitních oocytů pro jejich další použití.

Způsobem podle vynálezu jsou oocyty vystaveny působení beta-ocimenu, což má pozitivní vliv na kvalitu zrání oocytů, především pak na integritu dělicího vřeténka a euploidní stav

- 1 CZ 307943 B6 chromozomů dozrálého oocytu. To se ukazuje jako velmi výhodné, protože experimenty původců prokázaly, že kultivace s beta-ocimenem má příznivý efekt na zrání oocytů od zvířat, jež byla předtím vystavena účinku glyfosátu. Pokud není použit způsob podle vynálezu, pak většina kultivovaných oocytů ze zvířat, jež byla předtím vystavena účinkům glyfosátu, má narušené dělicí vřeténko a při vydělení prvního pólového tělíska dochází k aneuploidiím. Takové oocyty jsou pro většinu biotechnologií nepoužitelné. Způsobem podle vynálezu je dosaženo úplného zrání oocytů do metafáze II u více než 80 % oocytů. Tyto oocyty lze použít pro další reprodukční biotechnologie, protože jsou s to se vyvíjet v kvalitní embrya.

Výsledkem způsobu kultivace podle vynálezu je podstatné zvýšení podílu oocytů, jež dokončí zrání a jsou využitelné pro další reprodukční biotechnologie. Ve srovnání s tradičními postupy kultivace je nárůst podílu dozrálých oocytů zhruba dvoj- až trojnásobný, což má velký hospodářský význam. Způsob kultivace in vitro oocytů od zvířat, jež byla předtím -vystavena účinku glyfosátu, podle vynálezu lze využít zejména při reprodukčních biotechnologiích hospodářských zvířat, např. pro klonování či ICSI.

Způsob zvýšení vývojové schopnosti oocytů od zvířat vystavených před kultivací glyfosátu jejich kultivací in vitro s beta-ocimenem podle vynálezu byl původci úspěšně ověřen v laboratořích a stájích u přihlašovatele, kterým je Výzkumný ústav živočišné výroby, v.v.i., v Praze, CZ.

Následující příklady provedení způsob podle vynálezu pouze dokládají, aniž by ho jakkoliv omezovaly.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Při klasické kultivaci prasečích oocytů od prasnic, jež byly předtím vystaveny účinkům glyfosátu v krmivu, dochází v podmínkách in vitro za 44 hodin ke kompletaci zrání do stádia metafáze II u 38 % oocytů. Způsobem podle vynálezu jsou prasečí oocyty s ukončenou růstovou fází odebrané ze zvířat, jež byla vystavena účinku glyfosátu, např. v krmivu zplodin ošetřených tímto herbicidem, kultivovány po celou dobu kultivace in vitro, tj. po dobu 44 hodin v kultivačním médiu s přídavkem 50 nM beta-ocimenu. Při tomto postupu stoupá významně podíl dozrálých oocytů, které dosáhnou stádia metafáze II s četností přes 80 %. Takto získané oocyty lze podrobit standardní partenogenetické aktivaci, např. kalcium ionoforem, a navodit u nich embryonální vývoj do stádia blastocysty. Takto získané savčí partenogenetické zárodky ve vývojovém stádiu blastocyty lze využít například pro tvorbu embryonálních kmenových buněk.

Příklad 2

Při tradiční kultivaci oocytů skotu s ukončeným růstem od krav, jež byly předtím vystaveny účinkům glyfosátu v krmivu, dochází v podmínkách in vitro za 24 hodin ke kompletaci zrání do stádia metafáze II u 41 % oocytů. Způsobem podle vynálezu jsou oocyty skotu s ukončenou růstovou fází od krav, jež byly předtím vystaveny účinku glyfosátu, např. v krmi věch z plodin ošetřených tímto herbicidem, kultivovány po celou dobu kultivace, tj. po dobu 24 hodin, v kultivačním médiu s 50 nM beta-ocimenu. Při tomto postupu stoupá významně podíl dozrálých oocytů, které dosáhnou stádia metafáze II s četností přes 85 %. Takto získané oocyty lze podrobit standardnímu oplození in vitro. Úspěšně oplozené oocyty se dále vyvíjejí v embrya vhodná pro přenos náhradní matce.

-2CZ 307943 B6

Průmyslová využitelnost

Nový způsob eliminace defektů zrání savčích oocytů in vitro vyvolaných glyfosátem využívá 5 účinků beta-ocimenu, kdy dojde k podstatnému zvýšení množství získaných kvalitních dozrálých oocytů, což má velký význam při reprodukčních biotechnologiích hospodářských zvířat.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Způsob eliminace defektů zrání savčích oocytů vyvolaných glyfosátem, vyznačující se tím, že během zrání těchto oocytů v podmínkách in vitro jsou oocyty vystaveny působení beta15 ocimenu.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se na oocyty s ukončeným růstem a úplně vyvinutou vývojovou schopností od zvířat, jež byla předtím vystavena účinkům glyfosátu, během zrání oocytů in vitro působí beta-ocimenem v koncentracích od 10 do 100 nM, přičemž tato

20 kultivace trvá po dobu, která odpovídá době nutné v podmínkách kultivace in vitro pro postup zrání oocytů do stádia metafáze II, tj. u prasete 44 až 48 hodin a u skotu 22 až 24 hodin, načež se získá nejméně 80 % kvalitních oocytů.