CZ2017366A3

CZ2017366A3 - Způsob elimace defektů zrání savčích oocytů vyvolaných bisfenolem A nebo bisfenolem S

Info

Publication number: CZ2017366A3
Application number: CZ2017-366A
Authority: CZ
Inventors: Tomáš Kott; Jaroslav Petr
Original assignee: Výzkumný ústav živočišné výroby, v. v. i.
Priority date: 2017-06-23
Filing date: 2017-06-23
Publication date: 2019-01-02
Also published as: CZ308182B6

Abstract

Způsob zdokonalené kultivace oocytů s ukončenou růstovou fází získaných od zvířat, která byla vystavena účinku bisfenolu A nebo bisfenolu S, v podmínkách in vitro využívající kultivace s inhibitory SERCA. Tato kultivace má velké využití při reprodukčních biotechnologiích hospodářských zvířat.

Description

Řešení se týká zvýšení vývojové schopnosti savčích oocytů získaných od zvířat, která byla vystavena nepříznivým účinkům endokrinních disruptorů bisfenolu A nebo bisfenolu S. Tento způsob kultivace má velký význam zejména při asistované reprodukci hospodářských zvířat.

Dosavadní stav techniky

Narůstající znečištění životního prostředí má za následek poruchy plodnosti. K polutantům, které se na tom významně podílejí, patří i endokrinní disruptory čili látky schopné narušit hormonální rovnováhu organismu. Mezi nimi zaujímají významné místo i bisfenoly, především pak bisfenol A a bisfenol S, používané hojně do nejrůznějších plastů, ale i dalších produktů (nejrůznější druhy papíru včetně recyklovaných papírů). Endokrinní disruptory včetně bisfenolu A a bisfenolu S jsou v životním prostředí velmi rozšířené a jejich negativní efekt se projevuje už ve velmi nízkých koncentracích. Je proto krajně obtížné, ne-li nemožné, zajistit, aby lidé či zvířata nebyli účinku těchto látek vystaveni.

V současné době se pro asistovanou reprodukci savců (klonování, in vitro oplození, transgenoze) včetně hospodářsky významných druhů využívají oocyty dozrálé v podmínkách in vitro. Ty mohou pocházet od zvířat, jež byla vystavena účinkům endokrinních disruptorů. Kvalita takových oocytů je snížená a jejich schopnost dozrát v podmínkách in vitro bývá narušena. Platí to i při expozici zvířat bisfenolu A nebo bisfenolu S. Oba tyto endokrinní disruptory jsou s to narušit následné zrání oocytů in vitro. Proto se vyvíjejí systémy kultivace, které by riziko narušení in vitro zrání u oocytů ze zvířat exponovaných bisfenolem A nebo bisfenolem S snížily či eliminovaly. Pro tyto kultivační systémy se hledají látky, které by u oocytů kultivovaných in vitro zabránily významným vývojovým defektům.

Pokud by se podařilo zajistit plnohodnotné zrání i u oocytů ze zvířat, která byla předtím v důsledku znečištění životního prostředí vystavena působení bisfenolu A nebo bisfenolu S, zvýšilo by se využití šlechtitelského potenciálu samic a zefektivnily by se i postupy asistované reprodukce.

Podstata vynálezu

Uvedené problémy odstraňuje způsob elimace defektů zrání savčích oocytů vyvolaných bisfenolem A nebo bisfenolem S podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že v oocytech s ukončeným růstem jsou během jejich zrání v podmínkách in vitro inhibovány sarco/endoplasmic reticulum Ca²⁺ ATPázy (SERCA).

Způsob podle vynálezu je charakterizován tím, že se oocyty s ukončenou růstovou fází kultivují in vitro s inhibitory SERCA, obsahující kyselinu cyklopiazonovou nebo thapsigargin, po dobu, která je u daného druhu běžně nutná pro postup zrání oocytů do metafáze II.

- 1 CZ 2017 - 366 A3

Způsob podle vynálezu je dále charakterizován tím, že se na oocyty s ukončeným růstem a úplně vyvinutou vývojovou schopností během jejich zrání in vitro působí kyselinou cyklopiazonovou nebo thapsigargine v koncentracích od 1 do 1000 nM, přičemž tato kultivace trvá po dobu, která odpovídá době nutné v podmínkách kultivace in vitro pro postup zrání oocytů do stádia metafáze II.

Způsob podle vynálezu je také charakterizován tím, že se na oocyty působí kyselinou cyklopiazonovou v koncentracích od 10 do 40 nM nebo thapsigarginem v koncentracích od 100 do 200 μΜ.

Způsob zvýšení ochrany oocytů proti efektům bisfenolu A a bisfenolu S podle vynálezu se konkrétně výhodně provádí tak, že se nezralé savčí oocyty s ukončeným růstem a úplně vyvinutou vývojovou schopností in vitro kultivují v médiu s inhibitorem SERCA. Např. kyselina cyklopiazonová se používá v koncentracích od 10 do 40 nM, thapsigargin se používá v koncentracích od 100 do 200 μΜ. Kultivace trvá dobu, která je u daného druhu potřebná pro dozrání oocytů s ukončenou růstovou fází a plnou vývojovou schopností v podmínkách in vitro (tj. u prasete asi 44 hodin, u skotu 22 až 24 hodin).

Způsobem podle vynálezu jsou oocyty vystaveny působení inhibitoru SERCA, což má pozitivní vliv na kvalitu zrání oocytů, především pak na integritu dělícího vřeténka a euploidní stav chromozomů dozrálého oocytů. To se ukazuje jako velmi výhodné, protože experimenty původců prokázaly, že kultivace s inhibitory SERCA má příznivý efekt na zrání oocytů od zvířat, jež byla předtím vystavena účinku bisfenolu A nebo bisfenolu S. Pokud není použit způsob podle vynálezu, pak většina kultivovaných oocytů ze zvířat, jež byla předtím vystavena neblahým účinkům bisfenolu A nebo bisfenolu S, má narušené dělící vřeténko a při vydělení prvního pólového tělíska dochází k aneuploidiím. Takové oocyty jsou pro většinu biotechnologií nepoužitelné. Způsobem podle vynálezu je dosaženo úplného zrání oocytů do metafáze II u více než 90 % oocytů. Tyto oocyty lze použít pro další reprodukční biotechnologie, protože jsou s to se vyvíjet v kvalitní embrya.

Výsledkem způsobu kultivace podle vynálezu je podstatné zvýšení podílu oocytů, jež dokončí zrání a jsou využitelné pro další reprodukční biotechnologie. Ve srovnání s tradičními postupy kultivace je nárůst podílu dozrálých oocytů zhruba dvoj- až trojnásobný, což má velký hospodářský význam. Způsob kultivace in vitro oocytů od zvířat, jež byla předtím vystavena účinku bisfenolu A nebo bisfenolu S, podle vynálezu lze využít zejména při reprodukčních biotechnologiích hospodářských zvířat (např. klonování, ICSI).

Způsob zvýšení vývojové schopnosti oocytů od zvířat vystavených před kultivací bisfenolu A nebo bisfenolu S jejich kultivací in vitro s inhibitory SERCA podle vynálezu byl původci úspěšně ověřen v laboratořích a stájích u přihlašovatele, kterým je Výzkumný ústav živočišné výroby, v.v.i., v Praze, CZ.

Následující příklady způsob podle vynálezu pouze dokládají, aniž by ho jakkoliv omezovaly.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Při klasické kultivaci prasečích oocytů od prasnic, jež byly předtím vystaveny účinkům bisfenolu A nebo bisfenolu S, dochází v podmínkách in vitro k dokončení zrání do stádia metafáze II u 40 % oocytů. Způsobem podle vynálezu jsou prasečí oocyty s ukončenou růstovou fází kultivovány 44 hodin v kultivačním médiu s přídavkem 25 nM kyseliny cyklopiazonové. Při tomto postupu stoupá významně podíl dozrálých oocytů, které dosáhnou stádia metafáze II (přes 90 %). Takto získané oocyty lze podrobit standardní partenogenetické aktivaci a navodit u nich

-2CZ 2017 - 366 A3 vývoj do stádia blastocysty. Takto získané savčí partenogenetické zárodky ve vývojovém stádiu blastocyty lze využít například pro tvorbu embryonálních kmenových buněk.

Příklad 2

Při tradiční kultivaci oocytů skotu s ukončeným růstem od krav, jež byly předtím vystaveny účinkům bisfenolu A nebo bisfenolu S, dochází v podmínkách in vitro k dokončení zrání do stádia metafáze II u 25 % oocytů. Způsobem podle vynálezu jsou oocyty skotu s ukončenou růstovou fází od krav, jež byly předtím vystaveny účinku bisfenolu A nebo bisfenolu S, kultivovány 24 hodin v kultivačním médiu se 150 nM thapsigarginu. Při tomto postupu stoupá významně podíl dozrálých oocytů, které dosáhnou stádia metafáze II (přes 90 %). Takto získané oocyty lze podrobit standardnímu oplození in vitro. Úspěšně oplozené oocyty se dále vyvíjejí v embrya vhodná pro přenos náhradní matce.

Průmyslová využitelnost

Nový způsob elimace defektů zrání savčích oocytů vyvolaných bisfenolem A nebo bisfenolem S umožňuje zdokonalení kultivačního postupu oocytů in vitro, jenž využívá účinků inhibitorů SERCA, což má velký význam při reprodukčních biotechnologiích hospodářských zvířat.

Claims

1. Způsob elimace defektů zrání savčích oocytů vyvolaných bisfenolem A nebo bisfenolem S, vyznačující se tím, že v oocytech s ukončeným růstem jsou během jejich zrání v podmínkách in vitro inhibovány sarco/endoplasmic reticulum Ca²⁺ ATPázy (SERCA).

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se oocyty s ukončenou růstovou fází kultivují in vitro s inhibitory SERCA, obsahující kyselinu cyklopiazonovou nebo thapsigargin, po dobu, která je u daného druhu běžně nutná pro postup zrání oocytů do metafáze II.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se na oocyty s ukončeným růstem a úplně vyvinutou vývojovou schopností během jejich zrání in vitro působí kyselinou cyklopiazonovou nebo thapsigargine v koncentracích od 1 do 1000 nM, přičemž tato kultivace trvá po dobu, která odpovídá době nutné v podmínkách kultivace in vitro pro postup zrání oocytů do stádia metafáze II.

4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se na oocyty působí kyselinou cyklopiazonovou v koncentracích od 10 do 40 nM nebo thapsigarginem v koncentracích od 100 do 200 μΜ.