CZ2007763A3 - Použití inhibitoru proteasomu pro prípravu kultivacního média na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro - Google Patents
Použití inhibitoru proteasomu pro prípravu kultivacního média na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2007763A3 CZ2007763A3 CZ20070763A CZ2007763A CZ2007763A3 CZ 2007763 A3 CZ2007763 A3 CZ 2007763A3 CZ 20070763 A CZ20070763 A CZ 20070763A CZ 2007763 A CZ2007763 A CZ 2007763A CZ 2007763 A3 CZ2007763 A3 CZ 2007763A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- oocytes
- culture medium
- vitro
- proteasome inhibitor
- mammalian
- Prior art date
Links
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 77
- 229940079156 Proteasome inhibitor Drugs 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 239000003207 proteasome inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims description 16
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 6
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000035899 viability Effects 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 3
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 abstract description 3
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 6
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 5
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 4
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 4
- TZYWCYJVHRLUCT-VABKMULXSA-N N-benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-leucyl-L-leucinal Chemical compound CC(C)C[C@@H](C=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 TZYWCYJVHRLUCT-VABKMULXSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 description 3
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 230000001776 parthenogenetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 1
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 1
- 241000283903 Ovis aries Species 0.000 description 1
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 125000004213 tert-butoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C(O*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Rešení se týká použití inhibitoru proteasomu pro prípravu kultivacního media na prodloužení životnosti savcích ovocytu in vitro, kdy se odebrané savcí oocyty kultivují v podmínkách in vitro v kultivacním médiu s prídavkem specifického inhibitoru proteasomu. Uchovávání odebraných savcích oocytu v podmínkách in vitro za soucasné inhibice proteasomu zajištuje zvýšenou životaschopnost oocytu a má velký význam pri reprodukcních biotechnologiích u hospodárských zvírat i v asistované reprodukci v humánní medicíne.
Description
Použití inhibitoru proteasomu pro přípravu kultivačního média na prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro
Oblast techniky
Vynález se týká použití inhibitorů proteasomu pro přípravu kultivačního média na prodloužení životnosti odebraných savčích oocytů uchovávaných pro reprodukci po delší dobu v podmínkách in vitro.
Dosavadní stav techniky
Je známo, že oocyty savců (samičí pohlavní buňky) mají po vyjmutí z těla samice omezenou životnost a při následné kultivaci v podmínkách in vitro po dokončení zrání podléhají spontánně řadě procesů, jež je znehodnocují pro další využití v reprodukčních biotechnologiích hospodářských zvířat (klonování, in vitro oplození, transgenoze) i v humánní medicíně (asistovaná reprodukce). Nejvýznamnější z procesů je fragmentace oocytů, jež je projevem apoptózy, a lýza oocytů, jež je důsledkem nekrózy. Proto jsou hledána ošetření, která by těmto procesům zabránila. Možnosti potlačit apoptózu a nekrózu oocytů jsou zatím ale velmi omezené a tím stále dochází k velkým ztrátám při používání současných reprodukčních technik.
Podstata vynálezu
Výše uvedené nedostatky odstraňuje použití inhibitorů proteasomu pro přípravu kultivačního média na prodloužení životnosti odebraných savčích oocytů in vitro podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se odebrané savčí oocyty kultivují v podmínkách in vitro v kultivačním médiu s přídavkem specifického inhibitoru proteasomu.
• « « · · · · «« ··· ♦♦♦ *♦· ·· ·
Použití inhibitorů proteasomu pro přípravu kultivačního média na prodloužení životnosti savčích oocytú in vitro se dále vyznačuje tím, že se odebrané dozrálé savčí ovocyty in vitro kultivují před oplodněním v kultivačním médiu s obsahem specifického inhibitoru proteasomu po dobu 3 až 5 dnů. Poté jsou oocyty opláchnuty kultivačním médiem a použity pro reprodukční biotechnologie (např. partenogenetickou aktivaci, oplození in vitro, pro přípravu cytoplastů k přenosu jader somatických buněk, tj. klonování).
Podstata použití inhibitorů proteasomu pro přípravu kultivačního média na prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro podle vynálezu dále spočívá vtom, že se dozrálé savčí oocyty kultivují až po dobu 5 dnů se specifickým inhibitorem proteasomu. Poté jsou oocyty opláchnuty v kultivačním médiu bez inhibitoru a použity pro reprodukční biotechnologie (např. partenogenetickou aktivaci, oplození in vitro, pro přípravu cytoplastů k přenosu jader somatických buněk, tj. klonování).
Použití inhibitorů proteasomu pro přípravu kultivačního média na prodloužení životnosti odebraných savčích oocytú uchovávaných pro reprodukci po delší dobu v podmínkách in vitro podle vynálezu se výhodně provádí tak, že se savčí oocyty dozrálé do stádia metafáze II zbaví kumulárních buněk opakovaným pipetováním úzkou skleněnou pipetou, propláchnou se kultivačním médiem (např. médium M199 obohacené o 10 % bovinního telecího séra) a pak jsou přeneseny do kultivačního média s přídavkem molekul inhibujících histon deacetylázu (např. karbobenzoxy-Lleucyl-L-leucyI-L-leucina1, 5-b/s-(4-boronic acid-benzylidene)-1 -methylpiperidin -4-one), Z-lle-Glu(OtBu)-Ala-Leu-CHO, benzyloxykarbonyl-Leu-Leuphenylalaninal). V tomto médiu se oocyty kultivují po dobu 3 dnů. Pro další kultivaci je výhodné, aby po 3 dnech kultivace byly oocyty opláchnuty v čerstvě připraveném médiu obohaceném o vybraný inhibitor proteasomu a následně byly kultivovány v čerstvě připraveném médiu obohaceném o inhibitor proteasomu. Po ukončení kultivace s cílem prodloužit životaschopnost oocytů ·* ·»··
4 4 4 4 4*· «4 »4* 444 444 44 jsou oocyty před dalším použitím propláchnuty v médiu bez aktivátoru a kultivovány běžným laboratorním postupem.
Původci vynálezu ověřili, že použitím inhibitorů protesomu pro přípravu kultivačního média podle vynálezu jsou u oocytů kultivovaných po dlouhou dobu v podmínkách in vitro potlačeny procesy fragmentace a lýzy. Například při kultivaci v médiu se 200 mikromolú karbobenzoxy-L-leucyl-L-leucyl-Lleucinalu po dobu tri dnů nedochází u oocytů prasete vůbec k fragmentaci ani lýze, zatímco při kultivaci standardním způsobem dosahuje za stejnou dobu podíl fragmentovaných oocytů zhruba 25 % a podíl lyžovaných oocytů zhruba 10 %. Výsledkem kultivace oocytů v přítomnosti inhibitorů proteasomu je tedy eliminace nežádoucích procesů fragmentace a lýzy oocytů. Podíl oocytů, které si uchovávají životaschopnost, je podstatně vyšší.
Při oplození oocytů in vitro hospodářských zvířat (ať již metodou kultivace oocytů se spermiemi nebo metodou mikroinjekce spermie do cytoplasmy oocytů) jsou získávány zralé oocyty buď odběrem z těla samice nebo po kultivaci v podmínkách in vitro. Pokud se ale z jakéhokoli důvodu nezdaří tyto oocyty okamžitě oplodnit (např. při zpoždění dodávky spermatu vybraného plemeníka, např. plemenného kance, býka, hřebce), odebrané oocyty rychle ztrácejí na své kvalitě, procházejí procesem stárnutí, což snižuje pravděpodobnost úspěšného oplození i úspěšného a zdravého vývoje zárodku. Následující nežádoucí škody v reprodukci savců jsou velké.
Rovněž při oplození oocytů člověka při léčbě neplodnosti metodami asistované reprodukce (ať již metodou kultivace oocytů se spermiemi nebo metodou mikroinjekce spermie do cytoplasmy oocytů) jsou získávány zralé oocyty buď odběrem z těla budoucí matky nebo jsou tyty oocyty získány po dozrání v podmínkách in vitro. Pokud se ale z jakéhokoli důvodu nezdaří tyto oocyty okamžitě oplodnit (např. při potížích s odběrem spermatu potenciálního otce), oocyty rychle ztrácejí na kvalitě, procházejí procesem stárnutí, což »· · · · ♦ ♦ ···· β · «β « · *· «8 · ·«· * · · ·
JJ·’· · · · ♦ ·· »·· ·· · ··· ·· · snižuje pravděpodobnost úspěšného oplození a tím i úspěšného a zdravého vývoje zárodku. Negativní následky jsou pak velmi citelné.
Z uvedeného jasně vyplývá, že použití inhibitoru proteasomu pro přípravu kultivačního media na prodloužení kultivace oocytů za současné inhibice proteasomu podle vynálezu lze využít zejména při reprodukčních biotechnologiích u hospodářských zvířat (např. klonování, in vitro oplození, IVF, ICSI, transgenozi) i v asistované reprodukci v humánní medicíně, kdy při současném snižování porodnosti tato metoda zvláště nabývá na významu.
Při klonování savců obecně dochází ke vnášení jaderné dědičné informace somatické buňky do cytoplasmy oocytu, jež bylo vlastní jaderné dědičné informace zbaveno (bylo enukleováno). Kvalita použitého oocytu významně ovlivňuje úspěšnost celého postupu klonování. Při náročném postupu přenosu jsou oocyty připravené pro klonování uchovávány v podmínkách in vitro. Přitom v nich ale samovolné probíhají procesy stárnutí, které poškozují odebraný oocyt. Pro následný vývoj embrya klonu je nezbytná aktivace takto vzniklé buňky. Pro takové dočasné uchovávání oocytů před enukleací nebo i pro uchovávání enukleovaných oocytů před vlastním přenosem jádra somatické buňky lze s výhodou použít média obohaceného o inhibitory proteasomu. Původci vynálezu bylo zjištěno, že takto použité oocyty nebo cytoplasty (oocyty zbavené enukleací jaderné dědičné informace) jsou opět kvalitnější a embrya klonů, která jsou z nich vytvořena přenosem jader somatických buněk, jsou životaschopnější, než při dosud používaných postupech. To má pro budoucí vývoj v této oblasti dalekosáhlé možnosti využití.
Následující příklady provedení použití inhibitoru proteasomu pro přípravu kultivačního media podle vynálezu pouze dokládají, aniž by ho jakkoliv omezovaly.
• ta · · ·· ··*· • · ·· ·· ·4 · · * • Φ · · · · ·
Příklady provedení
Příklad 1
Dozrálé prasečí oocyty (400 oocytů) ve stádiu metafáze II byly po dozrání v podmínkách in vitro kultivovány před oplozením v médiu obohaceném o 200 μΜ inhibitoru proteasomu karbobenzoxy-L-leucyl-L-leucylL-leucinalu. V tomto kultivačním médiu byly kultivovány až do chvíle, kdy je vše připraveno k jejich oplození. Pak byly oocyty opláchnuty médiem bez inhibitoru a následně podrobeny obvyklým procedurám potřebným k oplození in vitro. Takto ošetřené oocyty měly vyšší kvalitu než oocyty, které by byly před oplozením kultivovány podle dosavadních postupů bez inhibitoru proteasomu, a i vzniklá embrya byla životaschopnější. Úspěšnost reprodukce s oocyty kultivovanými podle vynálezu byla při opakovaných pokusech v průměru 70 % (u reprodukce podle dosavadního způsobu zacházení s oocyty bývá cca 45 %).
Při ověřování použití inhibitoru proteasomu pro přípravu kultivačního media podle vynálezu na prodloužení životnosti odebraných oocytů in vitro u telat, hříbat, jehňat a kůzlat bylo původci vynálezu potvrzeno zvýšení životaschopnosti oocytů v průměru o 20 % oproti současně používaným způsobům reprodukce hospodářských zvířat.
Příklad 2
Dozrálé lidské oocyty (16 oocytů) ve stádiu metafáze II byly kultivovány před oplozením v médiu obohaceném o 10 nM inhibitoru proteasomu karbobenzoxy-L-leucyl-L-leucyl-L-leucinalu. V tomto kultivačním médiu byly kultivovány až do chvíle, kdy je vše připraveno k jejich oplození. Pak byly oocyty opláchnuty médiem bez inhibitoru a následně podrobeny obvyklým postupům potřebným k oplození in vitro. Takto ošetřené oocyty mají vyšší kvalitu a i vzniklá embrya jsou životaschopnější o cca 10 % než oocyty, které by byly před oplozením kultivovány bez inhibitoru proteasomu karbobenzoxyL-leucyl-L-leucyl-L-leucinalu.
Příklad 3
Dozrálé prasečí oocyty (40 oocytů) ve stádiu metafáze II byly po dozrání v podmínkách in vitro kultivovány v médiu obohaceném o 200 μΜ inhibitoru proteasomu karbobenzoxy-L-leucyl-L-leucyl-L-leucinalu. V tomto médiu byly drženy až do chvíle, kdy z nich byly enukleací připraveny cytoplasty pro následný přenos jader somatických buněk. Po přenosu jader do cytoplastú z takto ošetřených oocytů byl pozorován vývoj do stádia blastocyty v 18 % případů. Pokud byly oocyty nechány před přípravou cytoplastú stejně dlouhou dobu bez inhibitoru inhibitoru proteasomu karbobenzoxy-L-leucyl-L-leucyl-Lleucinalu, jejich kvalita se zhoršila natolik, že je nebylo možné pro klonování použít v důsledku vysoké náchylnosti k fragmentaci (zániku programovanou smrtí - apoptózou).
Průmyslová využitelnost
Řešení se týká prodlouženého uchovávání savčích oocytů v podmínkách in vitro za současné inhibice proteasomu, což má velký význam při reprodukčních biotechnologiích u hospodářských zvířat i v asistované reprodukci v humánní medicíně.
Vysvětlení zkratek použitých v textu:
IVF
ICSI in vitro oplodnění (in vitro fertization) intracytoplazmatická injekce spermie (intra cytoplasmic sperm injection)
Claims (3)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Použití inhibitoru proteasomu pro přípravu kultivačního media na prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro, kdy se odebrané savčí oocyty kultivují v podmínkách in vitro v kultivačním médiu s přídavkem specifického inhibitoru proteasomu.
- 2. Použití inhibitoru proteasomu pro přípravu kultivačního media, podle nároku 1, kdy se odebrané dozrálé savčí oocyty in vitro kultivují před oplodněním v kultivačním mediu s obsahem inhibitoru proteasomu po dobu 3 až 5 dnů, poté jsou oocyty opláchnuty kultivačním mediem, případně jsou přeneseny do čerstvě připraveného kultivačního media s inhibitorem pro kultivaci dalších 1 až 3 dnů.
- 3. Použití inhibitoru proteasomu pro přípravu kultivačního media, podle nároku 1, kdy se odebrané dozrálé savčí oocyty kultivují in vitro po dobu až 5 dnů s inhibitory proteasomu, poté se po případném opláchnutí kultivačním mediem oocyty přenesou do čerstvě připraveného kultivačního média a je snimi nakládáno běžným laboratorním postupem.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20070763A CZ2007763A3 (cs) | 2007-11-01 | 2007-11-01 | Použití inhibitoru proteasomu pro prípravu kultivacního média na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20070763A CZ2007763A3 (cs) | 2007-11-01 | 2007-11-01 | Použití inhibitoru proteasomu pro prípravu kultivacního média na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2007763A3 true CZ2007763A3 (cs) | 2009-05-13 |
Family
ID=40625241
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20070763A CZ2007763A3 (cs) | 2007-11-01 | 2007-11-01 | Použití inhibitoru proteasomu pro prípravu kultivacního média na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2007763A3 (cs) |
-
2007
- 2007-11-01 CZ CZ20070763A patent/CZ2007763A3/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Li et al. | Glutathione and cysteine enhance porcine preimplantation embryo development in vitro after intracytoplasmic sperm injection | |
| Zhang et al. | Advances on in vitro production and cryopreservation of porcine embryos | |
| Kim et al. | Improved preimplantation development of porcine somatic cell nuclear transfer embryos by caffeine treatment | |
| Shirazi et al. | The in vitro fertilization of ovine oocytes in the presence of oviductal cells and its effect on the expression of zygote arrest 1 (zar1) and subsequent embryonic development | |
| CZ2007197A3 (cs) | Použití inhibitoru histon deacetylázy pro prípravu kultivacního média na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro | |
| Parmar et al. | Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) and its applications in veterinary sciences: An overview | |
| CZ2007763A3 (cs) | Použití inhibitoru proteasomu pro prípravu kultivacního média na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro | |
| CZ2010579A3 (cs) | Kultivacní medium na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro a zpusob tohoto prodloužení | |
| CZ2005369A3 (cs) | Použití inhibitoru MAP kinázy JNK pro přípravu kultivačního média na prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro | |
| Beebe et al. | Adding essential amino acids at a low concentration improves the development of in vitro fertilized porcine embryos | |
| CZ2009536A3 (cs) | Použití inhibitoru vápníkových kanálu typu L pro prípravu kultivacního média na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro | |
| CZ2009535A3 (cs) | Použití aktivátoru draslíkových kanalu závislých na ATP pro prípravu kultivacního média na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro | |
| de Rezende Carvalheira et al. | Heat shock on bovine embryos from day 2.5–3 selects the most competent for progression to the blastocyst stage | |
| CZ2006787A3 (cs) | Zpusob prodloužení životnosti savcích oocytu v podmínkách in vitro | |
| CZ21336U1 (cs) | Kultivační médium na prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro | |
| Beebe et al. | Development of an improved porcine embryo culture medium for cloning, transgenesis and embryonic stem cell isolation | |
| Meirelles et al. | Strategies to increase in vitro embryo yield: lessons from cell and molecular research | |
| CZ2014230A3 (cs) | Kultivační médium pro prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro | |
| Shahzad et al. | Buffalo Embryo Production | |
| Mohshina et al. | Effects of Different Co-Culture on Bovine In Vitro Embryo Production: An Overview | |
| CZ26979U1 (cs) | Kultivační médium pro prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro | |
| Al-Hadıthy | In Vitro Koşullarında Üretilen Koyun Embriyolarının Kalitelerinin Iyileştirilmesi Olanakları | |
| グエンティ ニエン | Studies on preservation of porcine zygotes for embryo production by interspecies somatic cell nuclear transfer | |
| Mohyuddin | RECENT ADVANCES IN OOCYTES IN-VITRO MATURATION PROCESS IN BOVINES | |
| KR101446888B1 (ko) | 체세포복제용 난자 동결보존 방법 및 이를 이용한 체세포 복제수정란 생산 방법 |