CZ2010579A3 - Kultivacní medium na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro a zpusob tohoto prodloužení - Google Patents
Kultivacní medium na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro a zpusob tohoto prodloužení Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2010579A3 CZ2010579A3 CZ20100579A CZ2010579A CZ2010579A3 CZ 2010579 A3 CZ2010579 A3 CZ 2010579A3 CZ 20100579 A CZ20100579 A CZ 20100579A CZ 2010579 A CZ2010579 A CZ 2010579A CZ 2010579 A3 CZ2010579 A3 CZ 2010579A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- oocytes
- culture medium
- vitro
- sulfane
- prolongation
- Prior art date
Links
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 74
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 claims abstract description 22
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims description 15
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000035899 viability Effects 0.000 abstract description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 6
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 5
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 description 3
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 3
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 230000001776 parthenogenetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- HYHCSLBZRBJJCH-UHFFFAOYSA-M sodium hydrosulfide Chemical compound [Na+].[SH-] HYHCSLBZRBJJCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000283903 Ovis aries Species 0.000 description 1
- 102000004257 Potassium Channel Human genes 0.000 description 1
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- VDQVEACBQKUUSU-UHFFFAOYSA-M disodium;sulfanide Chemical compound [Na+].[Na+].[SH-] VDQVEACBQKUUSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108020001213 potassium channel Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Rešení se týká kultivacního media a zpusobu na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro, které jsou charakterizovány tím, že kultivacní medium pro kultivaci odebraných savcích oocytu v podmínkách in vitro obsahuje prídavek sulfanu. To má velký význam pri reprodukcních biotechnologiích u hospodárských zvírat i v asistované reprodukci v humánní medicíne.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká kultivačního media na prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro, zejména při použití subtoxických koncentrací sulfanu (sirovodík, H2S) pro přípravu kultivačního média na prodloužení životnosti odebraných savčích oocytů uchovávaných pro reprodukci po delší dobu v podmínkách in vitro. Dále se vynález týká způsobu tohoto prodloužení životnosti oocytů in vitro.
Dosavadní stav techniky
Je známo, že oocyty savců (samičí pohlavní buňky) mají po vyjmutí z téla samice omezenou životnost a při následné kultivaci v podmínkách in vitro po dokončení zrání podléhají spontánně řadě procesů, jež je znehodnocují pro další využití v reprodukčních biotechnologiích hospodářských zvířat (klonování, in vitro oplození, transgenoze) i v humánní medicíně (asistovaná reprodukce). Nejvýznamnější z procesů je fragmentace oocytů, jež je projevem apoptózy, a lýza oocytů, jež je důsledkem nekrózy. Proto jsou hledána ošetření, která by těmto procesům zabránila. Možnosti potlačit apoptózu a nekrózu oocytů jsou zatím ale velmi omezené a tím stále dochází k velkým ztrátám při používání současných reprodukčních technik.
Podstata vynálezu
Výše uvedené nedostatky odstraňuje kultivační medium na prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že kultivační medium pro kultivaci odebraných savčích oocytů v podmínkách in vitro obsahuje přídavek sulfanu.
? * *
Způsob prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro kultivačním mediem podle vynálezu je také podstatou vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se odebrané dozrálé savčí oocyty in vitro kultivují před oplodněním v kultivačním mediu se subtoxickými koncentracemi sulfanu po dobu 3 až 5 dnů, poté jsou oocyty opláchnuty kultivačním mediem, případně jsou přeneseny do čerstvě připraveného kultivačního media se subtoxickými koncentracemi sulfanu pro kultivaci dalších 1 až 3 dnů.
Způsob podle vynálezu je dále charakterizován tím, že se odebrané dozrálé savčí oocyty kultivují in vitro po dobu až 5 dnů s látkou uvolňující subtoxické koncentrace sulfanu, poté jsou po případném opláchnutí kultivačním mediem oocyty přeneseny do čerstvě připraveného kultivačního média, kde jsou dále kultivovány a pak jsou použity pro reprodukční biotechnologie (např. partenogenetickou aktivaci, oplození in vitro, pro přípravu cytoplastů k přenosu jader somatických buněk, tj. klonování).
Podstata použití sulfanu pro přípravu kultivačního média na prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro podle vynálezu dále spočívá vtom, že se dozrálé savčí oocyty kultivují až po dobu 5 dnů se subtoxickými koncentracemi sulfanu. Poté jsou oocyty opláchnuty v kultivačním médiu bez sulfanu a použity pro reprodukční biotechnologie (např. partenogenetickou aktivaci, oplození in vitro, pro přípravu cytoplastů k přenosu jader somatických buněk, tj. klonování).
Použití sulfanu pro přípravu kultivačního média podle vynálezu na prodloužení životnosti odebraných savčích oocytů uchovávaných pro reprodukci po delší dobu v podmínkách in vitro se výhodně provádí tak, že se savčí oocyty dozrálé do stádia metafáze II zbaví kumulárních buněk opakovaným pipetováním úzkou skleněnou pipetou, propláchnou se kultivačním médiem (např. médium M199, které je na bázi earleových solí, a je obohacené o 10 % hmotn. bovinního telecího séra) a pak jsou přeneseny do kultivačního média s přídavkem molekul uvolňujících do média subtoxické koncentrace sulfanu (např. Na2S nebo NaHS). V tomto médiu se oocyty kultivují po dobu 3 dnů. Pro další kultivaci je výhodné, aby po 3 dnech
J > * * > » I* ι * » · >ιί t >f k > » I I 1 > 1 , » > » » » 1 I I » »· '4 (i >>
·»»»»*! >1 » >>>-!>
kultivace byly oocyty opláchnuty v čerstvě připraveném médiu obohaceném o látky uvolňující subtoxické koncentrace sulfanu a následně byly kultivovány v čerstvě připraveném médiu obohaceném o látky uvolňující subtoxické koncentrace sulfanu. Po ukončení kultivace s cílem prodloužit životaschopnost oocytů jsou oocyty před dalším použitím propláchnuty v médiu bez sulfanu a kultivovány běžným laboratorním postupem.
Původci vynálezu ověřili, že použitím látek uvolňujících subtoxické koncentrace sulfanu pro přípravu kultivačního média podle vynálezu jsou u oocytů kultivovaných po dlouhou dobu v podmínkách in vitro potlačeny procesy fragmentace a lýzy. Například při kultivaci v médiu s 1 milimol sirníku sodného (Na2S) po dobu tří dnů nedochází u oocytů prasete vůbec k fragmentaci ani lýze, zatímco při kultivaci standardním způsobem dosahuje za stejnou dobu podíl fragmentovaných oocytů zhruba 25 % a podíl lyžovaných oocytů zhruba 10 %. Výsledkem kultivace oocytů v přítomností inhibitorů draslíkových kanálů závislých na ATP je tedy eliminace nežádoucích procesů fragmentace a lýzy oocytů. Podíl oocytů, které si uchovávají životaschopnost, je podstatně vyšší.
Při oplození oocytů in vitro hospodářských zvířat (ať již metodou kultivace oocytů se spermiemi nebo metodou mikroinjekce spermie do cytoplasmy oocytů) jsou získávány zralé oocyty buď odběrem z těla samice nebo po kultivaci v podmínkách in vitro. Pokud se ale z jakéhokoli důvodu nezdaří tyto oocyty okamžitě oplodnit (např. při zpoždění dodávky spermatu vybraného plemeníka, např. plemenného kance, býka, hřebce), odebrané oocyty rychle ztrácejí na své kvalitě, procházejí procesem stárnutí, což snižuje pravděpodobnost úspěšného oplození i úspěšného a zdravého vývoje zárodku. Následující nežádoucí škody v reprodukci savců jsou velké.
Rovněž při oplození oocytů člověka při léčbě neplodnosti metodami asistované reprodukce (ať již metodou kultivace oocytů se spermiemi nebo metodou mikroinjekce spermie do cytoplasmy oocytů) jsou získávány zralé oocyty buď odběrem z těla budoucí matky, nebo jsou tyty oocyty získány po dozrání v podmínkách in vitro. Pokud se ale z jakéhokoli důvodu nezdaří tyto oocyty okamžitě oplodnit (např. při potížích s odběrem spermatu potenciálního otce), oocyty rychle ztrácejí na kvalitě, procházejí procesem stárnutí, což snižuje pravděpodobnost úspěšného oplození a tím i úspěšného a zdravého vývoje zárodku. Negativní následky jsou pak velmi citelné.
Z uvedeného jasně vyplývá, že použití látek uvolňujících subtoxické koncentrace sulfanu pro přípravu kultivačního media na prodloužení kultivace oocytů za současného použití subtoxických koncentrací sulfanu podle vynálezu lze využít zejména při reprodukčních biotechnologiích u hospodářských zvířat (např. klonování, in vitro oplození; IVF, ICSI, transgenozi).
Při klonování savců obecně dochází ke vnášení jaderné dědičné informace somatické buňky do cytoplasmy oocytu, jež bylo vlastní jaderné dědičné informace zbaveno (bylo enukleováno). Kvalita použitého oocytu významně ovlivňuje úspěšnost celého postupu klonování. Při náročném postupu přenosu jsou oocyty připravené pro klonování uchovávány v podmínkách in vitro. Přitom v nich ale samovolně probíhají procesy stárnutí, které poškozují odebraný oocyt. Pro následný vývoj embrya klonu je nezbytná aktivace takto vzniklé buňky. Pro takové dočasné uchovávání oocytů před enukleací nebo i pro uchovávání enukleovaných oocytů před vlastním přenosem jádra somatické buňky lze s výhodou použít média obohaceného o sultán. Původci vynálezu bylo zjištěno, že takto použité oocyty nebo cytoplasty (oocyty zbavené enukleací jaderné dědičné informace) jsou opět kvalitnější a embrya klonů, která jsou z nich vytvořena přenosem jader somatických buněk, jsou životaschopnější, než při dosud používaných postupech. To má pro budoucí vývoj v této oblasti dalekosáhlé možnosti využití.
Následující příklady provedeni použití látek uvolňujících sultán pro přípravu kultivačního media podle vynálezu pouze dokládají, aniž by ho jakkoliv omezovaly. Kultivační medium a způsob podle vynálezu byly úspěšně ověřeny původci v prostorách Výzkumného ústavu živočišné výroby, v.v.i. a v České zemědělské univerzitě v Praze, CZ.
' , f » i II » s > t * > ♦ >1 »
I I 1 J J J »i , 1 I » * f » I » » 1 • 5
Příklady provedení
Příklad 1
Dozrálé prasečí oocyty (600 oocytů) ve stádiu metafáze II byly po dozrání v podmínkách in vitro kultivovány před oplozením v médiu obohaceném o 1 mM Na2S. V tomto kultivačním médiu podle vynálezu byly kultivovány až do chvíle, kdy bylo vše připraveno k jejich oplození. Pak byly oocyty opláchnuty médiem bez sulfanu a následné podrobeny obvyklým procedurám potřebným k oplození in vitro. Takto ošetřené oocyty měly vyšší kvalitu než oocyty, které by byly před oplozením kultivovány podle dosavadních postupů bez látek uvolňujících subtoxické koncentrace sulfanu, a i vzniklá embrya byla životaschopnější. Úspěšnost reprodukce s oocyty kultivovanými v mediu podle vynálezu byla při opakovaných pokusech v průměru 80 % (u reprodukce podle dosavadního způsobu zacházení s oocyty bývá cca 45 %).
Při ověřování použití látek uvolňujících subtoxické koncentrace sulfanu pro přípravu kultivačního media podle vynálezu na prodloužení životnosti odebraných oocytů in vitro u telat, hříbat, jehňat a kůzlat bylo původci vynálezu potvrzeno zvýšení životaschopnosti oocytů v průměru o 30 % oproti současně používaným způsobům reprodukce hospodářských zvířat.
Příklad 2
Dozrálé prasečí oocyty (40 oocytů) ve stádiu metafáze II byly po dozrání v podmínkách in vitro kultivovány v médiu obohaceném o 2 mM NaHS. V tomto médiu byly drženy až do chvíle, kdy z nich byly enukleací připraveny cytoplasty pro následný přenos jader somatických buněk. Po přenosu jader do cytoplastú z takto ošetřených oocytů byl pozorován vývoj do stádia blastocyty v 18 % případů. Pokud byly oocyty nechány před přípravou cytoplastú stejně dlouhou dobu bez látky uvolňující subtoxické koncentrace sulfanu, jejich kvalita se zhoršila natolik, že je nebylo možné pro klonování použít v důsledku vysoké náchylnosti k fragmentaci (zániku programovanou smrtí - apoptózou).
> » » · » J f I »> '*»>» » *
Průmyslová využitelnost
Řešení se týká prodlouženého uchovávání savčích oocytů v podmínkách in vitro v médiu obsahujícím subtoxické koncentrace sulfanu, což má velký význam při reprodukčních biotechnologiích u hospodářských zvířat i v asistované reprodukci v humánní medicíně.
Vysvětlení zkratek použitých v textu
IVF
ICSI in vitro oplodnění (in vitro fertilization) intracytoplazmatická injekce spermie (intra cytoplasmic sperm injection)
Claims (3)
- PATENTOVÉ NÁROKY pndl1. Kultivační medium na prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro, vyznačující se tím, že kultivační medium pro kultivaci odebraných savčích oocytů v podmínkách in vitro obsahuje přídavek sulfanu.
- 2. Způsob prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro kultivačním mediem podle nároku 1, vyznačující se tím, že se odebrané dozrálé savčí oocyty in vitro kultivují před oplodněním v kultivačním mediu se subtoxickými koncentracemi sulfanu po dobu 3 až 5 dnů, poté jsou oocyty opláchnuty kultivačním mediem, případně jsou přeneseny do čerstvě připraveného kultivačního media se subtoxickými koncentracemi sulfanu pro kultivaci dalších 1 až 3 dnů.
- 3. Způsob podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že jsou odebrané dozrálé savčí oocyty kultivovány in vitro po dobu až 5 dnů s látkou uvolňující subtoxické koncentrace sulfanu, poté jsou po případném opláchnutí kultivačním mediem oocyty přeneseny do čerstvě připraveného kultivačního média, kde jsou dále kultivovány.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20100579A CZ302580B6 (cs) | 2010-07-27 | 2010-07-27 | Kultivacní medium na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro a zpusob tohoto prodloužení |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20100579A CZ302580B6 (cs) | 2010-07-27 | 2010-07-27 | Kultivacní medium na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro a zpusob tohoto prodloužení |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2010579A3 true CZ2010579A3 (cs) | 2011-07-20 |
| CZ302580B6 CZ302580B6 (cs) | 2011-07-20 |
Family
ID=44278549
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20100579A CZ302580B6 (cs) | 2010-07-27 | 2010-07-27 | Kultivacní medium na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro a zpusob tohoto prodloužení |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ302580B6 (cs) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ2014230A3 (cs) * | 2014-04-04 | 2015-05-27 | Česká zemědělská univerzita v Praze | Kultivační médium pro prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro |
-
2010
- 2010-07-27 CZ CZ20100579A patent/CZ302580B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ302580B6 (cs) | 2011-07-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Toyoda et al. | The early history of the TYH medium for in vitro fertilization of mouse ova | |
| JP5439677B2 (ja) | 透明帯が菲薄化又は除去された哺乳動物卵又は胚を調製するための方法及び培地、該方法により調製された哺乳動物卵を用いた受精方法 | |
| CN112501114A (zh) | 提高牛体外受精效率的方法 | |
| US20080268419A1 (en) | Supplementation for Embryo and/or Cell Manipulation Media | |
| CZ2010579A3 (cs) | Kultivacní medium na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro a zpusob tohoto prodloužení | |
| Parmar et al. | Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) and its applications in veterinary sciences: An overview | |
| CZ2007197A3 (cs) | Použití inhibitoru histon deacetylázy pro prípravu kultivacního média na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro | |
| Morishita et al. | History and prospects of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) and the development of golden hamster ICSI embryos | |
| Suthar et al. | Bovine In vitro embryo production: an overview | |
| Lee et al. | Optimization of the in vitro fertilization system in pigs | |
| CZ297528B6 (cs) | Použití inhibitoru MAP kinázy JNK pro přípravu kultivačního média na prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro | |
| CZ21336U1 (cs) | Kultivační médium na prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro | |
| CZ302925B6 (cs) | Použití aktivátoru draslíkových kanálu závislých na ATP pro prípravu kultivacního média na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro | |
| CZ302912B6 (cs) | Použití inhibitoru vápníkových kanálu typu L pro prípravu kultivacního média na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro | |
| CZ2007763A3 (cs) | Použití inhibitoru proteasomu pro prípravu kultivacního média na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro | |
| CZ2014230A3 (cs) | Kultivační médium pro prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro | |
| Beebe et al. | Development of an improved porcine embryo culture medium for cloning, transgenesis and embryonic stem cell isolation | |
| CZ26979U1 (cs) | Kultivační médium pro prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro | |
| CZ2006787A3 (cs) | Zpusob prodloužení životnosti savcích oocytu v podmínkách in vitro | |
| Mohshina et al. | Effects of Different Co-Culture on Bovine In Vitro Embryo Production: An Overview | |
| CZ27174U1 (cs) | Kultivační medium pro zvýšení kvality savčích oocytů dozrálých v podmínkách in vitro | |
| CZ307949B6 (cs) | Způsob eliminace defektů zrání savčích oocytů vyvolaných glyfosátem C | |
| Krivokharchenko et al. | Fertilization and subsequent development of cattle oocytes after reduced incubation with spermatozoa | |
| CZ2014296A3 (cs) | Kultivační medium pro zvýšení kvality savčích oocytů dozrálých v podmínkách in vitro | |
| CZ2014809A3 (cs) | Způsob kultivace in vitro rostoucích oocytů zvířat |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20160727 |