CZ2014296A3 - Kultivační medium pro zvýšení kvality savčích oocytů dozrálých v podmínkách in vitro - Google Patents
Kultivační medium pro zvýšení kvality savčích oocytů dozrálých v podmínkách in vitro Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2014296A3 CZ2014296A3 CZ2014-296A CZ2014296A CZ2014296A3 CZ 2014296 A3 CZ2014296 A3 CZ 2014296A3 CZ 2014296 A CZ2014296 A CZ 2014296A CZ 2014296 A3 CZ2014296 A3 CZ 2014296A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- oocytes
- culture medium
- vitro
- mammalian
- medium
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Řešení se týká kultivačních médií na zvýšení kvality oocytů dozrávajících v podmínkách in vitro, které je charakterizováno tím, že obsahuje kromě základních surovin přídavek molekul sloužících jako donor sulfanu v koncentracích do 1 milimolu na litr média.
Description
Oblast techniky
Řešení se týká modifikovaných kultivačních médií pro zrání odebraných savčích oocytů v podmínkách in vitro s použitím subtoxických koncentrací sulfanu pro jeho přípravu.
Dosavadní stav techniky
Je známo, že oocyty savců (samičí pohlavní buňky) se po vyjmutí z těla samice nacházejí ve stádiu zárodečného váčku a pro jejich další využití, např. pro partenogenetickou aktivaci, in vitro oplození, klonování přenosem jader somatických buněk nebo pro tvorbu transgenních jedinců, je nezbytné, aby tyto oocyty prodělaly komplex procesů souhrnně označovaný jako meiotické zrání, během kterého oocyt vystoupí ze stádia zárodečného váčku a postoupí až do stádia metafáze II.
Za přirozených podmínek probíhá proces zrání oocytů uvnitř folikulu v ovariu samice. Při zrání v podmínkách in vitro jsou oocyty kultivovány v laboratorních podmínkách, které ale nezajišťují oocytům plnohodnotné podmínky adekvátní podmínkám ve folikulu. Všechny faktory, které zajišťují plnohodnotné zrání ve folikulu, nejsou v současné době ani známy. Oocyty dozrálé v podmínkách in vitro proto mají horší kvalitu než oocyty dozrálé in vivo. To má negativní dopad na výsledky biotechnologických postupů, při kterých jsou používány oocyty dozrálé in vitro. Proto jsou hledána řešení, která by optimalizovala kultivační podmínky pro zrání savčích oocytů in vitro. Možnosti zvýšení kvality oocytů dozrálých in vitro jsou ale stále poměrně omezené a tím stále dochází k velkým ztrátám při používání současných reprodukčních technik.
Podstata vynálezu
Výše uvedené nedostatky odstraňuje kultivační medium pro zvýšení kvality savčích oocytů dozrálých v podmínkách in vitro s obsahem základních surovin, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že médium dále obsahuje přídavek subtoxických koncentrací sultánu v koncentracích do 1
Kultivační medium podle vynálezu je charakterizováno tím, že přídavek subtoxických koncentrací sultánu je tvořen molekulami sloužícími jako donor sultánu v koncentracích od 0,1 do 1,0 milimol^/l.
Kultivační medium podle vynálezu bylo původci používáno tak, že se nezralé savčí oocyty odebrané z ovarií samic kultivovaly po druhově specifickou dobu potřebnou k jejich meiotickému dozrání v kultivačním médiu obsahujícího subtoxickou koncentraci sulfanu. Poté byly oocyty opláchnuty kultivačním médiem bez přídavku sulfanu a použity pro reprodukční biotechnologie (např. partenogenetickou aktivaci, oplození in vitro, přípravu cytoplastů k přenosu jader somatických buněk, tj. klonování).
Kultivační medium podle vynálezu bylo původci dále používáno tak, že se nezralé savčí oocyty kultivovaly potřebnou, druhově specifickou dobu (ovce, koza 22 hod., skot 24 hodin, prase 46 hodin) v kultivačním médiu s přídavkem molekul, jež byly donorem sulfanu. Poté byly oocyty opláchnuty v kultivačním médiu bez přídavku donorových molekul a použity pro reprodukční biotechnologie (např. partenogenetickou aktivaci, oplození in vitro, pro přípravu cytoplastů k přenosu jader somatických buněk, tj. klonování).
Kultivační medium podle vynálezu bylo původci výhodně používáno tak, že se nezralé savčí oocyty ve stádiu zárodečného váčku v komplexu s jejich kumulárními buňkami izolované z folikulů na ovariích samic propláchly kultivačním médiem (např. médium M199 obohacené o 10 % bovinního telecího séra) a pak byly přeneseny do kultivačního média s přídavkem donorů sulfanu (např. Na2S nebo NaHS). V tomto médiu se oocyty kultivovaly po dobu, jež byla potřebná pro jejich dozrání do stádia metafáze II meiotického zrání. Před dalším použitím byly takto kultivované oocyty propláchnuty • ·
• 9
9 9 9 v médiu bez přídavku molekul sloužících jako donor sulfanu a následně byly využity pro reprodukční biotechnologie (např. partenogenetickou aktivaci, in vitro oplození, klonování přenosem jader somatických buněk nebo pro tvorbu transgenních jedinců).
Původci vynálezu ověřili, že při použití kultivačního média podle vynálezu dochází u oocytů kultivovaných pro dozrání v podmínkách in vitro ke zkvalitnění procesu zrání. Například při kultivaci v médiu s přídavkem NaHS v koncentraci 0,3 milimol^/l po dobu 44 hodin dozraje 100 % prasečích oocytů do stádia metafáze II, zatímco při kultivaci standardním způsobem dosahuje za stejnou dobu podíl oocytů dozrálých do metafáze II asi 80 %. Výsledkem kultivace oocytů v přítomnosti donorů sulfanu v subtoxických koncentracích je tedy zvýšení podílu oocytů, které zdárně dokončí zrání in vitro a jsou následně využitelné pro reprodukční biotechnologie.
Původci vynálezu dále ověřili, že při použití kultivačního média podle vynálezu dochází u oocytů kultivovaných pro dozrání v podmínkách in vitro ke zvýšení kvality, jež se následně projeví zvýšenou vývojovou schopností embryí vzniklých z těchto oocytů. Například prasečí oocyty dozrálé v médiu s přídavkem NaHS v koncentraci 0,3 milimol^/l do stádia metafáze II jsou po partenogenetické aktivaci schopny vytvořit prvojádra u 90 % oocytů, zatímco po kultivaci standardním způsobem jsou partenogeneticky aktivované oocyty schopny vytvořit prvojádra asi u 70 % oocytů.
Výše podílu oocytů, jež jsou s to dozrát v podmínkách in vitro, a následně podíl oocytů, jež jsou s to dalšího vývoje po partenogenetické aktivaci, in vitro oplození (ať již metodou kultivace oocytů se spermiemi nebo metodou mikroinjekce spermie do cytoplasmy oocytů), přenosu jader somatických buněk do enukleovaných oocytů nebo při tvorbě transgenních jedinců jsou klíčové parametry biologické účinnosti reprodukčních biotechnologií a významně limitují jejich ekonomickou efektivnost. Nízká účinnost reprodukčních biotechnologií brání jejich praktickému využívání. Tím se snižuje genetický zisk při šlechtění, zpomaluje se pokrok v užitkovosti, není • ·
• · · · · * naplněn biologický potenciál produkce a následně dochází ke ztrátám na tržbách.
Z uvedeného jasně vyplývá, že použití donorů sulfanu v subtoxických koncentracích pro zrání savčích oocytů v podmínkách in vitro v kultivačním médiu podle vynálezu lze využít zejména při reprodukčních biotechnologiích u hospodářských zvířat.
Následující příklady provedení použití donorů sulfanu v subtoxických koncentracích k modifikaci médií podle vynálezu pouze dokládají, aniž by ho jakkoli omezovaly. Uvedené modifikované kultivační média byla úspěšně ověřena v laboratořích České zemědělské univerzity v Praze a ve Výzkumném ústavu živočišné výroby, v.v.i., Praha, CZ.
Příklady provedení
Příklad 1
Nezralé prasečí oocyty ve stádiu zárodečného váčku v komplexech s kumulárními buňkami (300 komplexů) čerstvě izolovaných z ovarií byly kultivovány v podmínkách in vitro v médiu obohaceném o 0,3 milimolu Na2S na litr média. V tomto kultivačním médiu byly komplexy kultivovány 44 hodin. Pak byly komplexy opláchnuty médiem bez Na2S a následně podrobeny partenogenetické aktivaci - 5 minut kultivace v kalcium ionoforu v koncentraci 25 mikromoll^/l a následně dvě hodiny v médiu s 6-dimethylaminopurinem (6-DMAP) v koncentraci 2 milimol^f/l. Takto ošetřené oocyty měly vyšší kvalitu než oocyty, které zrály v podmínkách in vitro podle dosavadních postupů bez přídavku sloučeniny sloužící jako donor sulfanu. Vzniklá partenogenetická embrya měla vyšší vývojový potenciál a byla životaschopnější. Podíl embryí, u kterých došlo k tvorbě prvojader, byl u oocytů dozrálých v kultivačním médiu podle vynálezu při opakovaných pokusech v průměru přes 90 % (při postupu podle dosavadního způsobu zacházení s oocyty bývá cca 75 %).
• · ·· · · ♦ • · · · · · · • · · · · · · · • · · ······ · ···· • · · · · · •· · * · ··· ·
Při ověřování použití donoru sultánu pro přípravu kultivačního meclia podle vynálezu pro zrání odebraných oocytů skotu in vitro bylo původci vynálezu potvrzeno zvýšení podílu partenogenetických embryí s tvorbou prvojader oocytů v průměru o 20 % oproti současně používaným způsobům reprodukce hospodářských zvířat.
Příklad 2
Nezralé prasečí oocyty ve stádiu zárodečného váčku v komplexech s kumulárními buňkami (40 oocytů) zrály v médiu obohaceném o 0,3 milimollf NaHS na litr média do stádia metafáze II. Pak byly oocyty opláchnuty médiem bez molekul sloužících jako donor sultánu a následně z nich byly enukleací připraveny cytoplasty pro následný přenos jader somatických buněk. Po přenosu jader do cytoplastů z takto ošetřených oocytů byl pozorován vývoj do stádia blastocyty u 28 % případů. Pokud oocyty dozrály v médiu bez přídavku subtoxických koncentrací sultánu, pak byl podíl embryí vyvíjejících se do blastocysty v průměru pouze kolem 15 %.
Příklad 3
Nezralé prasečí oocyty ve stádiu zárodečného váčku v komplexech s kumulárními buňkami (100 oocytů) dozrály v podmínkách in vitro do stádia metafáze II kultivací v médiu obohaceném o 0,3 milimol|=| Na2S na litr média. Pak byly oocyty opláchnuty médiem bez molekul sloužících jako donor sultánu a následně podrobeny obvyklým procedurám potřebným k oplození in vitro. Takto ošetřené oocyty měly vyšší kvalitu než oocyty, které by byly před oplozením kultivovány podle dosavadních postupů bez molekul sloužících jako donor sultánu, a i vzniklá embrya byla životaschopnější. Úspěšnost reprodukce s oocyty kultivovanými podle vynálezu byla při opakovaných pokusech v průměru 63 % (u reprodukce podle dosavadního způsobu zacházení s oocyty bývá cca 45 %).
• · e
· 9 · 9 9 • · • · • ·
Při ověřování použití subtoxických koncentrací sultánu pro přípravu kultivačního média podle vynálezu na zkvalitnění zrání odebraných oocytů in vitro u skotu bylo původci vynálezu potvrzeno zvýšení životaschopnosti oocytů v průměru o 20 % oproti současně používaným způsobům reprodukce hospodářských zvířat.
Vysvětllení zkratek v textu
Na2S sultán sodný
NaHS hydrogensulfan sodný
M199, NCSU37 běžný základ kultivačních médií
Průmyslová využitelnost
Řešení se týká kultivačního média pro zvýšení kvality savčích oocytů při zrání v podmínkách in vitro za přítomnosti molekul sloužících jako donor sultánu, což má velký význam při reprodukčních biotechnologiích u hospodářských zvířat.
Claims (2)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Kultivační medium pro zvýšení kvality savčích oocytů dozrálých v podmínkách in vitro s obsahem základních surovin, vyznačují se tím, že médium dále obsahuje přídavek subtoxických koncentrací sultánu v koncentracích do 1 milimol]^/l.
- 2. Kultivační medium podle nároku 1, vyznačující se tím, že přídavek subtoxických koncentrací sultánu je tvořen molekulami sloužícími jako donor sultánu v koncentracích od 0,1 do 1,0 milimoli^/1.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ2014-296A CZ2014296A3 (cs) | 2014-04-29 | 2014-04-29 | Kultivační medium pro zvýšení kvality savčích oocytů dozrálých v podmínkách in vitro |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ2014-296A CZ2014296A3 (cs) | 2014-04-29 | 2014-04-29 | Kultivační medium pro zvýšení kvality savčích oocytů dozrálých v podmínkách in vitro |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ2014296A3 true CZ2014296A3 (cs) | 2015-11-11 |
Family
ID=54771279
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ2014-296A CZ2014296A3 (cs) | 2014-04-29 | 2014-04-29 | Kultivační medium pro zvýšení kvality savčích oocytů dozrálých v podmínkách in vitro |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CZ (1) | CZ2014296A3 (cs) |
-
2014
- 2014-04-29 CZ CZ2014-296A patent/CZ2014296A3/cs unknown
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111254109B (zh) | 牛卵母细胞的体外受精和胚胎培养的方法和运输培养液 | |
CN112501114B (zh) | 提高牛体外受精效率的方法 | |
García-Roselló et al. | Analysis of different factors influencing the intracytoplasmic sperm injection (ICSI) yield in pigs | |
CN117925511A (zh) | 提高经体细胞复制的卵子的胚胎发育或胚胎形成的效率的方法 | |
CZ2014296A3 (cs) | Kultivační medium pro zvýšení kvality savčích oocytů dozrálých v podmínkách in vitro | |
Mizutani et al. | Treatment of donor cell/embryo with different approaches to improve development after nuclear transfer | |
Morishita et al. | History and prospects of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) and the development of golden hamster ICSI embryos | |
CZ27174U1 (cs) | Kultivační medium pro zvýšení kvality savčích oocytů dozrálých v podmínkách in vitro | |
CZ302580B6 (cs) | Kultivacní medium na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro a zpusob tohoto prodloužení | |
CZ297528B6 (cs) | Použití inhibitoru MAP kinázy JNK pro přípravu kultivačního média na prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro | |
Lee et al. | Production of cloned sei whale (Balaenoptera borealis) embryos by interspecies somatic cell nuclear transfer using enucleated pig oocytes | |
CZ299271B6 (cs) | Použití inhibitoru histon deacetylázy pro prípravu kultivacního média na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro | |
CZ2014809A3 (cs) | Způsob kultivace in vitro rostoucích oocytů zvířat | |
CZ2017401A3 (cs) | Kultivační médium pro prodloužení životnosti savčích oocytů v podmínkách in vitro | |
CZ307949B6 (cs) | Způsob eliminace defektů zrání savčích oocytů vyvolaných glyfosátem C | |
JP4119513B2 (ja) | クローン動物の作出方法 | |
CZ307948B6 (cs) | Způsob eliminace defektů zrání savčích oocytů vyvolaných glyfosátem C | |
CZ26979U1 (cs) | Kultivační médium pro prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro | |
CZ307946B6 (cs) | Způsob eliminace defektů zrání savčích oocytů vyvolaných glyfosátem B | |
CZ2014230A3 (cs) | Kultivační médium pro prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro | |
Joan | Development of In vitro maturation Protocol in Rat Oocytes | |
CZ2010394A3 (cs) | Zpusob zvýšení vývojové schopnosti rostoucích oocytu aktivací protein kináz C | |
CZ302925B6 (cs) | Použití aktivátoru draslíkových kanálu závislých na ATP pro prípravu kultivacního média na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro | |
CZ2017366A3 (cs) | Způsob elimace defektů zrání savčích oocytů vyvolaných bisfenolem A nebo bisfenolem S | |
CZ31850U1 (cs) | Kultivační médium pro prodloužení životnosti savčích oocytů v podmínkách in vitro |