CZ27174U1

CZ27174U1 - Kultivační medium pro zvýšení kvality savčích oocytů dozrálých v podmínkách in vitro

Info

Publication number: CZ27174U1
Application number: CZ2014-29519U
Authority: CZ
Inventors: Jan Nevoral; Jaroslav Petr; Tereza Žalmanová; Tomáš Kott; Ivona Weingartová; Kateřina Zámostná; Markéta Dvořáková; Lenka Křivohlávková
Original assignee: Česká zemědělská univerzita v Praze; Výzkumný ústav živočišné výroby, v.v.i.
Priority date: 2014-04-29
Filing date: 2014-04-29
Publication date: 2014-07-14

Description

Oblast techniky

Řešení se týká modifikovaných kultivačních médií pro zrání odebraných savčích oocytů v podmínkách in vitro s použitím subtoxických koncentrací sulfanu pro jeho přípravu.

Dosavadní stav techniky

Je známo, že oocyty savců (samičí pohlavní buňky) se po vyjmutí z těla samice nacházejí ve stádiu zárodečného váčku a pro jejich další využití, např. pro partenogenetickou aktivaci, in vitro oplození, klonování přenosem jader somatických buněk nebo pro tvorbu transgenních jedinců, je nezbytné, aby tyto oocyty prodělaly komplex procesů souhrnně označovaný jako meiotické zrání, během kterého oocyt vystoupí ze stádia zárodečného váčku a postoupí až do stádia metafáze II.

Za přirozených podmínek probíhá proces zrání oocytů uvnitř folikulu v ovariu samice. Při zrání v podmínkách in vitro jsou oocyty kultivovány v laboratorních podmínkách, které ale nezajišťují oocytům plnohodnotné podmínky adekvátní podmínkám ve folikulu. Všechny faktory, které zajišťují plnohodnotné zrání ve folikulu, nejsou v současné době ani známy. Oocyty dozrálé v podmínkách in vitro proto mají horší kvalitu než oocyty dozrálé in vivo. To má negativní dopad na výsledky biotechnologických postupů, při kterých jsou používány oocyty dozrálé in vitro. Proto jsou hledána řešení, která by optimalizovala kultivační podmínky pro zrání savčích oocytů in vitro. Možnosti zvýšení kvality oocytů dozrálých in vitro jsou ale stále poměrně omezené a tím stále dochází k velkým ztrátám při používání současných reprodukčních technik.

Podstata technického řešení

Výše uvedené nedostatky odstraňuje kultivační medium pro zvýšení kvality savčích oocytů dozrálých v podmínkách in vitro s obsahem základních surovin, podle technického řešení, jehož podstata spočívá v tom, že médium dále obsahuje přídavek subtoxických koncentrací sulfanu v koncentracích do 1 milimolu/1.

Kultivační medium podle technického řešení je charakterizováno tím, že přídavek subtoxických koncentrací sulfanu je tvořen molekulami sloužícími jako donor sulfanu v koncentracích od 0,1 do 1,0 milimol/1.

Kultivační medium podle technického řešení bylo původci používáno tak, že se nezralé savčí oocyty odebrané z ovarií samic kultivovaly po druhově specifickou dobu potřebnou k jejich meiotickému dozrání v kultivačním médiu obsahujícím subtoxickou koncentraci sulfanu. Poté byly oocyty opláchnuty kultivačním médiem bez přídavku sulfanu a použity pro reprodukční biotechnologie (např. partenogenetickou aktivaci, oplození in vitro, přípravu cytoplastů k přenosu jader somatických buněk, tj. klonování).

Kultivační medium podle technického řešení bylo původci dále používáno tak, že se nezralé savčí oocyty kultivovaly potřebnou, druhově specifickou dobu (ovce, koza 22 hod,, skot 24 hodin, prase 46 hodin) v kultivačním médiu s přídavkem molekul, jež byly donorem sulfanu. Poté byly oocyty opláchnuty v kultivačním médiu bez přídavku donorových molekul a použity pro reprodukční biotechnologie (např. partenogenetickou aktivaci, oplození in vitro, pro přípravu cytoplastů k přenosu jader somatických buněk, tj. klonování).

Kultivační medium podle technického řešení bylo původci výhodně používáno tak, že se nezralé savčí oocyty ve stádiu zárodečného váčku v komplexu s jejich kumulámími buňkami izolované z folikulů na ovariích samic propláchly kultivačním médiem (např. médium Ml99 obohacené o 10 % bovinního telecího séra) a pak byly přeneseny do kultivačního média s přídavkem donorů sulfanu (např. Na₂S nebo NaHS). V tomto médiu se oocyty kultivovaly po dobu, jež byla potřebná pro jejich dozrání do stádia metafáze Π meiotického zrání. Před dalším použitím byly takto kultivované oocyty propláchnuty v médiu bez přídavku molekul sloužících jako donor sul-1 CZ 27174 Ul fanu a následně byly využity pro reprodukční biotechnologie (např. partenogenetickou aktivaci, in vitro oplození, klonování přenosem jader somatických buněk nebo pro tvorbu transgenních jedinců).

Původci technického řešení ověřili, že při použití kultivačního média podle technického řešení dochází u oocytů kultivovaných pro dozrání v podmínkách in vitro ke zkvalitnění procesu zrání. Například při kultivaci v médiu s přídavkem NaHS v koncentraci 0,3 milimolu/1 po dobu 44 hodin dozraje 100 % prasečích oocytů do stádia metafáze 11, zatímco při kultivaci standardním způsobem dosahuje za stejnou dobu podíl oocytů dozrálých do metafáze Π asi 80 %. Výsledkem kultivace oocytů v přítomnosti donorů sulfanu v subtoxických koncentracích je tedy zvýšení podílu oocytů, které zdárně dokončí zrání in vitro a jsou následně využitelné pro reprodukční biotechnologie.

Původci technického řešení dále ověřili, že při použití kultivačního média podle technického řešení dochází u oocytů kultivovaných pro dozrání v podmínkách in vitro ke zvýšení kvality, jež se následně projeví zvýšenou vývojovou schopností embryí vzniklých z těchto oocytů. Například prasečí oocyty dozrálé v médiu s přídavkem NaHS v koncentraci 0,3 milimol/1 do stádia metafáze II jsou po partenogenetické aktivaci schopny vytvořit prvojádra u 90 % oocytů, zatímco po kultivaci standardním způsobem jsou partenogeneticky aktivované oocyty schopny vytvořit prvojádra asi u 70 % oocytů.

Výše podílu oocytů, jež jsou s to dozrát v podmínkách in vitro, a následně podíl oocytů, jež jsou s to dalšího vývoje po partenogenetické aktivaci, in vitro oplození (ať již metodou kultivace oocytů se spermiemi nebo metodou mikroinjekce spermie do cytoplasmy oocytů), přenosu jader somatických buněk do enukleováných oocytů nebo při tvorbě transgenních jedinců jsou klíčové parametry biologické účinnosti reprodukčních biotechnologií a významně limitují jejich ekonomickou efektivnost. Nízká účinnost reprodukčních biotechnologií brání jejich praktickému využívání. Tím se snižuje genetický zisk při šlechtění, zpomaluje se pokrok v užitkovosti, není naplněn biologický potenciál produkce a následně dochází ke ztrátám na tržbách.

Z uvedeného jasně vyplývá, že použití donorů sulfanu v subtoxických koncentracích pro zrání savčích oocytů v podmínkách in vitro v kultivačním mediu podle technického řešení lze využít zejména při reprodukčních biotechnologiích u hospodářských zvířat.

Následující příklady provedení použití donorů sulfanu v subtoxických koncentracích k modifikaci médií podle technického řešení pouze dokládají, aniž by ho jakkoli omezovaly. Uvedená modifikovaná kultivační média byla úspěšně ověřena v laboratořích České zemědělské univerzity v Praze a ve Výzkumném ústavu živočišné výroby, v.v.i., Praha, CZ.

Příklady provedení

Příklad 1

Nezralé prasečí oocyty ve stádiu zárodečného váčku v komplexech s kumulámími buňkami (300 komplexů) čerstvě izolovaných z ovarií byly kultivovány v podmínkách in vitro v médiu obohaceném o 0,3 milimol Na₂S na litr média. V tomto kultivačním médiu byly komplexy kultivovány 44 hodin. Pak byly komplexy opláchnuty médiem bez Na₂S a následně podrobeny partenogenetické aktivaci - 5 minut kultivace v kalcium ionoforu v koncentraci 25 mikromol/1 a následně dvě hodiny v médiu s 6-dimethylaminopurinem (6-DMAP) v koncentraci 2 milimol/1. Takto ošetřené oocyty měly vyšší kvalitu než oocyty, které zrály v podmínkách in vitro podle dosavadních postupů bez přídavku sloučeniny sloužící jako donor sulfanu. Vzniklá partenogenetická embrya měla vyšší vývojový potenciál a byla životaschopnější. Podíl embryí, u kterých došlo k tvorbě prvojader, byl u oocytů dozrálých v kultivačním médiu podle technického řešení při opakovaných pokusech v průměru přes 90 % (při postupu podle dosavadního způsobu zacházení s oocyty bývá cca 75 %).

-2CZ 27174 Ul

Při ověřování použití donoru sulfanu pro přípravu kultivačního media podle technického řešení pro zrání odebraných oocytů skotu in vitro bylo původci technického řešení potvrzeno zvýšení podílu partenogenetických embryí s tvorbou prvojader oocytů v průměru o 20 % oproti současně používaným způsobům reprodukce hospodářských zvířat.

Příklad 2

Nezralé prasečí oocyty ve stádiu zárodečného váčku v komplexech s kumulámími buňkami (40 oocytů) zrály v médiu obohaceném o 0,3 milimol NaHS na litr media do stádia metafáze II. Pak byly oocyty opláchnuty médiem bez molekul sloužících jako donor sulfanu a následně z nich byly enukleací připraveny cytoplasty pro následný přenos jader somatických buněk. Po přenosu jader do cytoplastů z takto ošetřených oocytů byl pozorován vývoj do stádia blastocyty u 28 % případů. Pokud oocyty dozrály v médiu bez přídavku subtoxických koncentrací sulfanu, pak byl podíl embryí vyvíjejících se do blastocysty v průměru pouze kolem 15 %.

Příklad 3

Nezralé prasečí oocyty ve stádiu zárodečného váčku v komplexech s kumulámími buňkami (100 oocytů) dozrály v podmínkách in vitro do stádia metafáze Π kultivací v médiu obohaceném o 0,3 milimol Na₂S na litr média. Pak byly oocyty opláchnuty médiem bez molekul sloužících jako donor sulfanu a následně podrobeny obvyklým procedurám potřebným k oplození in vitro. Takto ošetřené oocyty měly vyšší kvalitu než oocyty, které by byly před oplozením kultivovány podle dosavadních postupů bez molekul sloužících jako donor sulfanu, a i vzniklá embrya byla životaschopnější. Úspěšnost reprodukce s oocyty kultivovanými podle technického řešení byla při opakovaných pokusech v průměru 63 % (u reprodukce podle dosavadního způsobu zacházení s oocyty bývá cca 45 %).

Při ověřování použití subtoxických koncentrací sulfanu pro přípravu kultivačního media podle technického řešení na zkvalitnění zrání odebraných oocytů in vitro u skotu bylo původci technického řešení potvrzeno zvýšení životaschopnosti oocytů v průměru o 20 % oproti současně používaným způsobům reprodukce hospodářských zvířat.

Vysvětlení zkratek v textu

Na₂S sulfid sodný

NaHS hydrogensulfid sodný

Μ199, NCSU37 běžný základ kultivačních médií

Průmyslová využitelnost

Řešení se týká kultivačního média pro zvýšení kvality savčích oocytů při zrání v podmínkách in vitro za přítomnosti molekul sloužících jako donor sulfanu, což má velký význam při reprodukčních biotechnologiích u hospodářských zvířat.

Claims

NÁROKY NA OCHRANU

1. Kultivační medium pro zvýšení kvality savčích oocytů dozrálých v podmínkách in vitro s obsahem základních surovin, vyznačující se tím, že médium dále obsahuje přídavek subtoxických koncentrací sulfanu v koncentracích do 1 milimol/1.

-3 CZ 27174 Ul
2. Kultivační medium podle nároku 1, vyznačující se tím, že přídavek subtoxických koncentrací sulfanu je tvořen molekulami sloužícími jako donor sulfanu v koncentracích od 0,1 do 1,0 milimol/1.