CZ305178B6

CZ305178B6 - Kultivační médium pro prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro

Info

Publication number: CZ305178B6
Application number: CZ2014-230A
Authority: CZ
Inventors: Tereza Krejčová; Lenka Tůmová; Jaroslav Petr; Tomáš Kott; Jan Nevoral; Markéta Dvořáková; Alena Vyskočilová; Tereza Žalmanová; Markéta Sedmíková; František Jílek
Original assignee: Česká zemědělská univerzita v Praze; Výzkumný ústav živočišné výroby, v.v.i.
Priority date: 2014-04-04
Filing date: 2014-04-04
Publication date: 2015-05-27
Also published as: CZ2014230A3

Abstract

Řešení se týká kultivačního média na prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro, s obsahem základních surovin, které je charakterizováno tím, že dále obsahuje přídavek allyl sloučenin, vybraných ze skupiny alliin, allicin, diallylsulfid, diallyldisulfid nebo diallyltrisulfid v koncentracích do 500 mikromol/l.

Description

Oblast techniky

Řešení se týká modifikace kultivačních médií pro prodloužení životnosti odebraných savčích oocytů uchovávaných pro reprodukci po delší dobu v podmínkách in vitro s použitím allyl sloučenin pro jeho přípravu.

Dosavadní stav techniky

Je známo, že oocyty savců (samičí pohlavní buňky) mají po vyjmutí z těla samice omezenou životnost a při následné kultivaci v podmínkách in vitro po dokončení zrání podléhají spontánně řadě procesů, jež je znehodnocují pro další využití v reprodukčních biotechnologiích hospodářských zvířat (klonování, in vitro oplození, transgeneze) i v humánní medicíně (asistovaná reprodukce). Nej významnější z procesů je fragmentace oocytů, jež je projevem apoptózy, a lýza oocytů, jež je důsledkem nekrózy. Proto jsou hledána ošetření, která by těmto procesům zabránila. Možnosti potlačit apoptózu a nekrózu oocytů jsou zatím ale velmi omezené a tím stále dochází k velkým ztrátám při používání současných reprodukčních technik.

Podstata vynálezu

Výše uvedené nedostatky odstraňuje kultivační médium pro prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro, s obsahem základních surovin, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že dále obsahuje přídavek allyl sloučenin, vybraných ze skupin alliin, allicin, diallylsulfid, diallyldisulfid nebo diallyltrisulfid tak, aby se finální koncentrace allyl sloučeniny v kultivačním médiu pohybovala do 500 mikromol/1.

Kultivační médium podle vynálezu je charakterizováno tím, že obsahuje allyl sloučeniny v koncentracích 20 až 300 mikromol/1.

Použití allyl sloučenin pro přípravu kultivačního média na prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro je dále charakterizováno tím, že se odebrané dozrálé savčí ovocyty in vitro kultivují před oplodněním v kultivačním médiu s obsahem allyl sloučenin po dobu 3 až 5 dnů. Poté jsou oocyty opláchnuty kultivačním médiem a použity pro reprodukční biotechnologie (např. partenogenetickou aktivaci, oplození in vitro, pro přípravu cytoplastů k přenosu jader somatických buněk, tj. klonování). Optimálně se dozrálé savčí oocyty kultivují v kultivačním médiu podle vynálezu až po dobu 5 dnů s allyl sloučeninou. Poté jsou oocyty opláchnuty v kultivačním médiu bez allyl sloučeniny a použity pro reprodukční biotechnologie (např. partenogenetickou aktivaci, oplození in vitro, pro přípravu cytoplastů k přenosu jader somatických buněk, tj. klonování).

Kultivační médium podle vynálezu se používá na prodloužení životnosti odebraných savčích oocytů uchovávaných pro reprodukci po delší dobu v podmínkách in vitro tak, že se savčí oocyty dozrálé do stádia metafáze II zbaví kumulámích buněk opakovaným pipetováním úzkou skleněnou pipetou, propláchnou se kultivačním médiem (např. médium Ml99 obohacené o 10 % bovinního telecího séra, nebo DMEM) a pak jsou přeneseny do kultivačního média s přídavkem allyl sloučenin (např. alliin, allicin, diallylsulfid, diallyldisulfid nebo diallyltrisulfid). V tomto médiu se oocyty kultivují po dobu 3 dnů. Pro další kultivaci je výhodné, aby po 3 dnech kultivace byly oocyty opláchnuty v čerstvě připraveném médiu obohaceném o allyl sloučeninu a následně byly kultivovány v čerstvě připraveném médiu obohaceném o allyl sloučeninu. Po ukončení kultivace s cílem prodloužit životaschopnost oocytů jsou oocyty před dalším použitím propláchnuty v médiu bez allyl sloučeniny a kultivovány běžným laboratorním postupem.

- 1 CZ 305178 B6

Původci vynálezu ověřili, že použitím allyl sloučenin pro přípravu kultivačního média podle vynálezu jsou u oocytů kultivovaných po dlouhou dobu v podmínkách in vitro potlačeny procesy fragmentace a lýzy. Například při kultivaci v médiu s alliinem v koncentraci 200 mikromol/1 po dobu tří dnů nedochází u oocytů prasete vůbec k fragmentaci ani lýze, zatímco při kultivaci standardním způsobem dosahuje za stejnou dobu podíl fragmentovaných oocytů zhruba 25 % a podíl lyžovaných oocytů zhruba 10 %. Výsledkem kultivace oocytů v přítomnosti allyl sloučenin je tedy eliminace nežádoucích procesů fragmentace a lýzy oocytů. Podíl oocytů, které si uchovávají životaschopnost, je podstatně vyšší.

Při oplození oocytů in vitro hospodářských zvířat (ať již metodou kultivace oocytů se spermiemi nebo metodou mikroinjekce spermie do cytoplasmy oocytů) jsou získávány zralé oocyty buď odběrem z těla samice, nebo po kultivaci v podmínkách in vitro. Pokud se ale z jakéhokoli důvodu nezdaří tyto oocyty okamžitě oplodnit (např. při zpoždění dodávky spermatu vybraného plameníka, např. plamenného kance, býka, hřebce), odebrané oocyty rychle ztrácejí na své kvalitě, procházejí procesem stárnutí, což snižuje pravděpodobnost úspěšného oplození i úspěšného a zdravého vývoje zárodku. Následující nežádoucí škody v reprodukci savců jsou velké.

Rovněž při oplození oocytů člověka při léčbě neplodnosti metodami asistované reprodukce (ať již metodou kultivace oocytů se spermiemi nebo metodou mikroinjekce spermie do cytoplasmy oocytů) jsou získávány zralé oocyty buď odběrem z těla budoucí matky, nebo jsou tyto oocyty získány po dozrání v podmínkách in vitro. Pokud se ale z jakéhokoli důvodu nezdaří tyto oocyty okamžitě oplodnit (např. při potížích s odběrem spermatu potenciálního otce), oocyty rychle ztrácejí na kvalitě, procházejí procesem stárnutí, což snižuje pravděpodobnost úspěšného oplození a tím i úspěšného a zdravého vývoje zárodku. Negativní následky jsou pak velmi citelné.

Z uvedeného jasně vyplývá, že použití allyl sloučenin k modifikaci běžných kultivačních médií podle vynálezu pro prodloužení kultivace oocytů lze využít zejména při reprodukčních biotechnologiích u hospodářských zvířat (např. klonování, in vitro oplození, IVF, ICSI, transgenezi).

Při klonování savců obecně dochází ke vnášení jaderné dědičné informace somatické buňky do cytoplasmy oocytů, jež bylo vlastní jaderné dědičné informace zbaveno (bylo enukleováno). Kvalita použitého oocytů významně ovlivňuje úspěšnost celého postupu klonování. Při náročném postupu přenosu jsou oocyty připravené pro klonování uchovávány v podmínkách in vitro. Přitom v nich ale samovolně probíhají procesy stárnutí, které poškozují odebraný oocyt. Pro následný vývoj embrya klonu je nezbytná aktivace takto vzniklé buňky. Pro takové dočasné uchovávání oocytů před enukleací nebo i pro uchovávání enukleovaných oocytů před vlastním přenosem jádra somatické buňky lze s výhodou použít média obohaceného o allyl sloučeniny. Původci vynálezu bylo zjištěno, že takto použité oocyty nebo cytoplasty (oocyty zbavené enukleací jaderné dědičné informace) jsou opět kvalitnější a embrya klonů, která jsou z nich vytvořena přenosem jader somatických buněk, jsou životaschopnější, než při dosud používaných postupech. To má pro budoucí vývoj v této oblasti dalekosáhlé možnosti využití.

Následující příklady provedení použití allyl sloučenin k modifikaci kultivačních médií podle vynálezu pouze dokládají, aniž by ho jakkoliv omezovaly. Uvedené modifikace kultivačních médií byly úspěšně ověřeny v laboratořích České zemědělské univerzity v Praze a ve Výzkumném ústavu živočišné výroby, v.v.i., Praha, CZ.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Dozrálé prasečí oocyty (300 oocytů) ve stádiu metafáze II byly po dozrání v podmínkách in vitro kultivovány před oplozením v médiu obohaceném o alliin ve výsledné koncentraci 200 mikro-2CZ 305178 B6 mol/1. V tomto kultivačním médiu byly kultivovány až do chvíle, kdy je vše připraveno kjejich oplození. Pak byly oocyty opláchnuty médiem bez allyl sloučeniny a následně podrobeny obvyklým procedurám potřebným k oplození in vitro. Takto ošetřené oocyty měly vyšší kvalitu než oocyty, které by byly před oplozením kultivovány podle dosavadních postupů bez allyl sloučenin, a i vzniklá embrya byla životaschopnější. Úspěšnost reprodukce s oocyty kultivovanými podle vynález byla při opakovaných pokusech v průměru 70 % (u reprodukce podle dosavadního způsobu zacházení s oocyty bývá cca 45 %).

Při ověřování použití allyl sloučenin pro přípravu kultivačního média podle vynálezu na prodloužení životnosti odebraných oocytů in vitro u telat, hříbat, jehňat a kůzlat bylo původci vynálezu potvrzeno zvýšení životaschopnosti oocytů v průměru o 20 % oproti současně používaným způsobům reprodukce hospodářských zvířat.

Příklad 2

Dozrálé prasečí oocyty (40 oocytů) ve stádiu metafáze II byly po dozrání v podmínkách in vitro kultivovány v médiu obohaceném o allicin ve výsledné koncentraci 100 mikromol/1. V tomto médiu byly drženy až do chvíle, kdy z nich byly enukleací připraveny cytoplasty pro následný přenos jader somatických buněk. Po přenosu jader do cytoplastů z takto ošetřených oocytů byl pozorován vývoj do stádia blastocyty v 18 % případů. Pokud byly oocyty nechány před přípravou cytoplastů stejně dlouhou dobu bez allicinu, jejich kvalita se zhoršila natolik, že je nebylo možné pro klonování použít v důsledku vysoké náchylnosti k fragmentaci (zániku programovanou smrtí - apoptózou).

Příklad 3

Dozrálé prasečí oocyty (100 oocytů) ve stádiu metafáze II byly po dozrání v podmínkách in vitro kultivovány v médiu před oplozením v médiu obohaceném o diallyltrisulfid ve výsledné koncentraci 40 mikromol/1. V tomto kultivačním médiu byly kultivovány až do chvíle, kdy je vše připraveno kjejich oplození. Pak byly oocyty opláchnuty médiem bez allyl sloučeniny a následně podrobeny obvyklým procedurám potřebným k oplození in vitro. Takto ošetřené oocyty měly vyšší kvalitu než oocyty, které by byly před oplozením kultivovány podle dosavadních postupů bez allyl sloučenin, a i vzniklá embrya byla životaschopnější. Úspěšnost reprodukce s oocyty kultivovanými podle vynálezu byla při opakovaných pokusech v průměru 65 % (u reprodukce podle dosavadního způsobu zacházení s oocyty bývá cca 45 %).

Při ověřování použití allyl sloučenin pro přípravu kultivačního média podle vynálezu na prodloužení životnosti odebraných oocytů in vitro u telat, hříbat, jehňat a kůzlat bylo průvodci vynálezu potvrzeno zvýšení životaschopnosti oocytů v průměru o 20 % oproti současně používaným způsobům reprodukce hospodářských zvířat.

Příklad 4

Dozrálé prasečí oocyty (100 oocytů) ve stádiu metafáze II byly po dozrání v podmínkách in vitro kultivovány před oplozením v médiu obohaceném o diallyldisulfid ve výsledné koncentraci 80 mikromol/1. V tomto kultivačním médiu byly kultivovány až do chvíle, kdy je vše připraveno kjejich oplození. Pak byly oocyty opláchnuty médiem bez allyl sloučeniny a následně podrobeny obvyklým procedurám potřebným k oplození in vitro. Takto ošetřené oocyty měly vyšší kvalitu než oocyty, které by byly před oplozením kultivovány podle dosavadních postupů bez allyl sloučenin, a i vzniklá embrya byla životaschopnější. Úspěšnost reprodukce s oocyty kultivovanými podle vynálezu byla při opakovaných pokusech v průměru 69 % (u reprodukce podle dosavadního způsobu zacházení s oocyty bývá cca 45 %).

-3 CZ 305178 B6

Příklad 5

Dozrálé prasečí oocyty (150 oocytů) ve stádiu metafáze II byly po dozrání v podmínkách in vitro kultivovány před oplozením v médiu obohaceném o diallyldisulfid ve výsledné koncentraci 120 mikromol/1. V tomto kultivačním médiu byly kultivovány až do chvíle, kdy je všech připraveno k jejich oplození. Pak byly oocyty opláchnuty médiem bez allyl sloučeniny a následně podrobeny obvyklým procedurám potřebným k oplození in vitro. Takto ošetřené oocyty měly vyšší kvalitu než oocyty, které by byly před oplozením kultivovány podle dosavadních postupů bez allyl sloučenin, a i vzniklá embrya byla životaschopnější. Úspěšnost reprodukce s oocyty kultivovanými podle vynálezu byla při opakovaných pokusech v průměru 72 % (u reprodukce podle dosavadního způsobu zacházení s oocyty bývá cca 45 %).

Průmyslová využitelnost

Řešení se týká prodlouženého uchovávání savčích oocytů v podmínkách in vitro za přítomnosti allyl sloučenin, což má velký význam při reprodukčních biotechnologiích u hospodářských zvířat i v asistované reprodukci v humánní medicíně.

Vysvětlení zkratek použitých v textu

IVF in vitro oplodnění (in vitro fertization)

ICSI intracytoplazmatická injekce spermie (intra cytoplasmic sperm injection)

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

ICSI intracytoplazmatická injekce spermie (intra cytoplasmic sperm injection)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Kultivační médium na prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro, s obsahem základních surovin, vyznačující se tím, že dále obsahuje přídavek allyl sloučenin, vybraných ze skupiny albín, allicin, diallylsulfid, diallyldisulfid nebo diallyltrisulfid v koncentracích do 500 mikromol/1.
2. Kultivační médium podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje allyl sloučeninu v koncentracích 20 až 300 mikromol/1.

Konec dokumentu