CZ302912B6

CZ302912B6 - Použití inhibitoru vápníkových kanálu typu L pro prípravu kultivacního média na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro

Info

Publication number: CZ302912B6
Application number: CZ20090536A
Authority: CZ
Inventors: Rajmon@Radko; Petr@Jaroslav; Tumová@Lenka; Ctrnáctá@Andrea; Krejcová@Tereza; Chmelíková@Eva; Jílek@František
Original assignee: Ceská zemedelská univerzita v Praze; Výzkumný ústav živocišné výroby, v.v.i.
Priority date: 2009-08-10
Filing date: 2009-08-10
Publication date: 2012-01-18
Also published as: CZ2009536A3

Abstract

Rešení se týká použití inhibitoru vápníkových kanálu typu L pro prípravu kultivacního média na prodloužení životnosti savcích oocytu in vitro, kdy se odebrané savcí oocyty kultivují v podmínkách in vitro v kultivacním médiu s prídavkem specifického inhibitoru vápníkových kanálu typu L.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká použití inhibitorů vápníkových kanálů typu L pro přípravu kultivačního média na prodloužení životnosti odebraných savčích oocytů uchovávaných pro reprodukcí po delší dobu v podmínkách in vitro.

Dosavadní stav techniky

Je známo, že oocyty savců (samičí pohlavní buňky) mají po vyjmutí z těla samice omezenou životnost a pri následné kultivaci v podmínkách in vitro po dokončení zrání podléhají spontánně řadě procesů, ježje znehodnocují pro další využití v reprodukčních biotechnologiích hospodářských zvířat (klonování, in vitro oplození, transgeneze) i v humánní medicíně (asistovaná reprodukce). Nej významnější z procesů je fragmentace oocytů, jež je projevem apoptózy, a lýza oocytů jež je důsledkem nekrózy. Proto jsou hledána ošetření, která by těmto procesům zabránila. Možnosti potlačit apoptózu a nekrózu oocytů jsou zatím ale velmi omezené a tím stále dochází k velkým ztrátám pri používání současných reprodukčních technik.

Podstata vynálezu

Výše uvedené nedostatky odstraňuje použití inhibitorů vápníkových kanálů typu L pro přípravu kultivačního média na prodloužení životnosti odebraných savčích oocytů ín vitro podle vynálezu, jehož podstata spočívá vtom, že se odebrané savčí oocyty kultivují v podmínkách in vitro v kultivačním médiu s přídavkem specifického inhibitoru vápníkových kanálů typu L.

Použití inhibitorů vápníkových kanálů typu L pro přípravu kultivačního média na prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro je dále charakterizováno tím, že se odebrané dozrálé savčí oocyty in vitro kultivují před oplodněním v kultivačním médiu s obsahem specifického inhibitoru vápníkových kanálů typu L po dobu 3 až 5 dnů. Poté jsou oocyty opláchnuty kultivačním médiem a použity pro reprodukční biotechnologie (např. partenogenetickou aktivaci, oplození in vitro, pro přípravu cytoplastů k přenosu jader somatických buněk, tj. klonování).

Podstata použití inhibitorů vápníkových kanálů typu L pro přípravu kultivačního média na prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro podle vynálezu dále spočívá v tom, že se dozrálé savčí oocyty kultivují až po dobu 5 dnů se specifickým inhibitorem vápníkových kanálů typu L. Poté jsou oocyty opláchnuty v kultivačním médiu bez inhibitoru a použity pro reprodukční biotechnologie (např. partenogenetickou aktivaci, oplození in vitro, pro přípravu cytoplastů k přenosu jader somatických buněk, tj. klonování).

Použití inhibitorů vápníkových kanálů typu L pro přípravu kultivačního média na prodloužení životnosti odebraných savčích oocytů uchovávaných pro reprodukci po delší dobu v podmínkách in vitro podle vynálezu se výhodně provádí tak, že se savčí oocyty dozrálé do stádia metafáze II zbaví kumulámích buněk opakovaným pipetováním úzkou skleněnou pipetou, propláchnou se kultivačním médiem (např. médium Ml99 obohacené o 10 % hmotn. bovinního telecího séra) a pak jsou přeneseny do kultivačního média s přídavkem molekul inhibuj ících vápníkové kanály typu L (např. verapamil, lercanidipin). V tomto médiu se oocyty kultivují po dobu 3 dnů. Pro další kultivaci je výhodné, aby po 3 dnech kultivace byly oocyty opláchnuty v čerstvě připraveném médiu obohaceném o inhibitor vápníkových kanálů typu L a následně byly kultivovány v čerstvě připraveném médiu obohaceném o inhibitor vápníkových kanálů typu L. Po ukončení

- 1 CZ 302912 B6 kultivace s cílem prodloužit životaschopnost oocytů jsou oocyty před dalším použitím propláchnuty v médiu bez inhibitoru a kultivovány běžným laboratorním postupem.

Původci vynálezu ověřili, že použitím inhibitorů vápníkových kanálů typu L pro přípravu kultivačního média podle vynálezu jsou u oocytů kultivovaných po dlouhou dobu v podmínkách in vitro potlačeny procesy fragmentace a lýzy. Například při kultivaci v médiu s 40 mikromolů verapamilu po dobu tří dnů nedochází u oocytů prasete vůbec k fragmentací ani lýze, zatímco při kultivaci standardním způsobem dosahuje za stejnou dobu podíl fragmentováných oocytů zhruba 25 % a podíl lyžovaných oocytů zhruba 10 %. Výsledkem kultivace oocytů v přítomnosti inhibitorů vápníkových kanálů typu L je tedy eliminace nežádoucích procesů fragmentace a lýzy oocytů. Podíl oocytů, které si uchovávají životaschopnost, je podstatně vyšší.

Při oplození oocytů in vitro hospodářských zvířat (ať již metodou kultivace oocytů se spermiemi nebo metodou mi kro injekce spermie do cytoplasmy oocytů) jsou získávány zralé oocyty buď odběrem z těla samice, nebo po kultivaci v podmínkách in vitro. Pokud se ale z jakéhokoli důvodu nezdaří tyto oocyty okamžitě oplodnit (např. při zpoždění dodávky spermatu vybraného plemeníka, např. plemen né ho kance, býka, hřebce), odebrané oocyty rychle ztrácejí na své kvalitě, procházejí procesem stárnutí, což snižuje pravděpodobnost úspěšného oplození i úspěšného a zdravého vývoje zárodku. Následující nežádoucí Škody v reprodukci savců jsou velké.

Rovněž při oplození oocytů člověka při léčbě neplodnosti metodami asistované reprodukce (ať již metodou kultivace oocytů se spermiemi nebo metodou mikroinjekce spermie do cytoplasmy oocytů) jsou získávány zralé oocyty buď odběrem z těla budoucí matky, nebo jsou tyto oocyty získány po dozrání v podmínkách in vitro. Pokud se ale z jakéhokoli důvodu nezdaří tyto oocyty okamžitě oplodnit (např, při potížích s odběrem spermatu potenciálního otce), oocyty rychle ztrácejí na kvalitě, procházejí procesem stárnutí, což snižuje pravděpodobnost úspěšného oplození a tím i úspěšného a zdravého vývoje zárodku. Negativní následky jsou pak velmi citelné.

Z uvedeného jasně vyplývá, že použití inhibitoru vápníkových kanálů typu L pro přípravu kultivačního média na prodloužení kultivace oocytů za současné inhibice vápníkových kanálů typu L podle vynálezu lze využít zejména při reprodukčních biotechnologiích u hospodářských zvířat (např. klonování, in vitro oplození, IVF, ICSI, transgenezi).

Při klonování savců obecně dochází ke vnášení jaderné dědičné informace somatické buňky do cytoplasmy oocytů, jež bylo vlastní jaderné dědičné informace zbaveno (bylo enukleováno). Kvalita použitého oocytů významně ovlivňuje úspěšnost celého postupu klonování. Při náročném postupu přenosu jsou oocyty připravené pro klonování uchovávány v podmínkách in vitro. Přitom v nich ale samovolně probíhají procesy stárnutí, které poškozují odebraný oocyt. Pro následný vývoj embrya klonuje nezbytná aktivace takto vzniklé buňky. Pro takové dočasné uchovávání oocytů před enukleaci nebo i pro uchovávání enukleovaných oocytů před vlastním přenosem jádra somatické buňky lze s výhodou použit média obohaceného o inhibitory vápníkových kanálů typu L. Původci vynálezu bylo zjištěno, že takto použité oocyty nebo cytoplasty (oocyty zbavené enukleaci jaderné dědičné informace) jsou opět kvalitnější a embrya klonů, která jsou z nich vytvořena přenosem jader somatických buněk, jsou životaschopnější, než pri dosud používaných postupech. To má pro budoucí vývoj v této oblasti dalekosáhlé možnosti využití.

Následující příklady provedení použití inhibitoru vápníkových kanálů typu L pro přípravu kultivačního média podle vynálezu pouze dokládají, aniž by ho jakkoliv omezovaly.

-2CZ 302912 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Dozrálé prasečí oocyty (250 oocytů) ve stádiu metafáze II byly po dozrání v podmínkách in vitro kultivovány před oplozením v médiu obohaceném o 40 μΜ inhibitoru vápníkových kanálů typu L verapamilu. V tomto kultivačním médiu byly kultivovány až do chvíle, kdy je vše připraveno k jejich oplození. Pak byly oocyty opláchnuty médiem bez inhibitoru a následně podrobeny obvyklým procedurám potřebným k oplození in vitro. Takto ošetřené oocyty měly vyšší kvalitu než oocyty, které by byly před oplozením kultivovány podle dosavadních postupů bez inhibitorů vápníkových kanálů typu L, a i vzniklá embrya byla životaschopnější. Úspěšnost reprodukce s oocyty kultivovanými podle vynálezu byla při opakovaných pokusech v průměru 70 % (u reprodukce podle dosavadního způsobu zacházení s oocyty bývá cca 45 %).

Při ověřování použití inhibitoru vápníkových kanálů typu L pro přípravu kultivačního média podle vynálezu na prodloužení životnosti odebraných oocytů in vitro u telat, hříbat, jehňat a kůzlat bylo původci vynálezu potvrzeno zvýšení životaschopnosti oocytů v průměru o 20 % oproti současně používaným způsobům reprodukce hospodářských zvířat.

Příklad 2

Dozrálé prasečí oocyty (40 oocytů) ve stádiu metafáze II byly po dozrání v podmínkách in vitro kultivovány v médiu obohaceném o 50 μΜ inhibitoru vápníkových kanálů typu L lercanidipinu. V tomto médiu byly drženy až do chvíle, kdy z nich byly enukleací připraveny cytoplasty pro následný přenos jader somatických buněk. Po přenosu jader do cytoplastů z takto ošetřených oocytů byl pozorován vývoj do stádia blastocyty v 18 % případů. Pokud byly oocyty nechány před přípravou cytoplastů stejně dlouhou dobu bez inhibitoru vápníkových kanálů typu L lercanidipinu, jejich kvalita se zhoršila natolik, že je nebylo možné pro klonování použít v důsledku vysoké náchylnosti k fragmentaci (zániku programovanou smrtí - apoptózou).

Průmyslová využitelnost

Řešení se týká prodlouženého uchovávání savčích oocytů v podmínkách in vitro za současné inhibice vápníkových kanálů typu L, což má velký význam při reprodukčních biotechnologiích i hospodářských zvířat i v asistované reprodukci v humánní medicíně.

Vysvětlení zkratek použitých v textu:

IVF in vitro oplodnění (in vitro fertilization)

ICSI intracytoplazmatická injekce spermie (intra cytoplasmic sperm injection)

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití inhibitorů vápníkových kanálů typu L pro přípravu kultivačního média na prodloužení životnosti savčích oocytů in vitro, kdy se odebrané savčí oocyty kultivují v podmínkách in vitro v kultivačním médiu s přídavkem specifického inhibitoru vápníkových kanálů typu L.
2. Použití inhibitorů vápníkových kanálů typu L pro přípravu kultivačního média, podle nároku 1, kdy se odebrané dozrálé savčí oocyty in vitro kultivují před oplodněním v kultivačním médiu s obsahem inhibitoru vápníkových kanálů typu L po dobu 3 až 5 dnů, poté jsou oocyty opláchnuty kultivačním médiem, případně jsou přeneseny do čerstvě připraveného kultivačního médía

5 s inhibitorem pro kultivaci po další l až 3 dny.
3. Použití inhibitorů vápníkových kanálů typu L pro přípravu kultivačního média, podle nároku 1, kdy se odebrané dozrálé savčí oocyty kultivují in vitro po dobu až 5 dnů s inhibitory vápníkových kanálů typu L, poté se po případném opláchnutí kultivačním médiem oocyty přenesou do io čerstvě připraveného kultivačního média a je s nimi nakládáno běžným laboratorním postupem.

15 --------------------------------Konec dokumentu