RU2504581C2 - Способ витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных - Google Patents

Способ витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных

Info

Publication number
RU2504581C2
RU2504581C2 RU2012103454A RU2012103454A RU2504581C2 RU 2504581 C2 RU2504581 C2 RU 2504581C2 RU 2012103454 A RU2012103454 A RU 2012103454A RU 2012103454 A RU2012103454 A RU 2012103454A RU 2504581 C2 RU2504581 C2 RU 2504581C2
Authority
RU
Grant status
Grant
Patent type
Prior art keywords
sperm
mmol
medium
characterized
human
Prior art date
Application number
RU2012103454A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2012103454A (ru )
Inventor
Константин Владимирович Кириенко
Сергей Александрович Яковенко
Original Assignee
Константин Владимирович Кириенко
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Grant date

Links

Abstract

Изобретение относится к медицине, андрологии, репродуктологии, ветеринарии. Предложены среда и способ витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных, где сперматозоиды из нативной или размороженной спермы, полученные путем центрифугирования эякулята в градиенте плотности или отобранные в результате флотации, переносятся в среду для иммобилизации с пониженным осмотическим давлением 100-170 мОсм/кг на время от 1 мин до 2 часов при составе газовой среды от 0,1 до 8% углекислого газа и температуре среды от 0 до 39°C. Изобретение может быть использовано для диагностических и лечебных целей для размножения или оплодотворения животных. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 1 табл.

Description

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к андрологии и репродуктологии и к ветеринарии, а именно к способам для размножения или оплодотворения животных. Изобретение также применимо в научных исследованиях.

Из существующего уровня техники известен способ иммобилизации (обездвиживания) сперматозоидов путем механического переламывания или перетирания хвоста сперматозоида микроинъекционной иглой о дно чашки Петри непосредственно перед процедурой ICSI (intracytoplasmic sperm injection - внутрицитоплазматическая инъекция сперматозоида). Данный методический прием является неотъемлемой частью вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в терапии женского и мужского бесплодия (в рамках процедуры ICSI), широко используется и стал классическим (In vitro fertilization: a practial approach / edited by David K, Gardner. Informa Healthcare USA. Inc: ISBN-13: 978-0-8493-3335-4; p.167-169). Аналогично, данный подход к иммобилизации сперматозоидов используется при ICSI яйцеклеток домашних и лабораторных животных (Kimura Y, Yanagimachi R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biol Reprod 1995; 52:709-720).

Недостатком данного технического решения является тот факт, что иммобилизованные таким образом сперматозоиды нежизнеспособны в связи с нарушением целостности цитоплазматической мембраны клетки и аппарата передвижения - хвоста и должны быть немедленно использованы в процедуре ICSI. То есть данный методический прием иммобилизации является мортальным (смертельным) для сперматозоида, и по истечении короткого промежутка времени такой сперматозоид становится непригодным для искусственного оплодотворения яйцеклетки методом ICSI.

Наиболее близким по принципу действия (но не по целям и задачам) к заявленному техническому решению является Hypo Osmotic Swelling Test (HOS-Test), основанный на способности хвостов живых сперматозоидов набухать в гипоосмолярной среде, который используется для оценки целостности цитоплазматической мембраны сперматозоида и определения, таким образом, его жизнеспособности. Принцип действия HOS-Test основан на гидратировании цитоплазмы сперматозоидов с неповрежденной цитоплазматической мембраной в гипоосмотической среде, что приводит к видимым морфологическим изменениям в его хвосте. Таким образом, принцип действия HOS-Test (эффект воздействия гипоосмотической среды на сперматозоиды) аналогичен принципу действия, заложенному в патентуемом способе, однако служит для решения совершенно иных целей и задач. Непосредственно HOS-Test не предназначен и не пригоден для витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является осуществление витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных для использования их в дальнейшем в диагностических либо лечебных целях.

Данная задача решается за счет того, что заявленный способ витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных характеризуется тем, что сперматозоиды получают из нативной или размороженной спермы или центрифугируют эякулят в градиенте плотности, или сперматозоиды отбирают в результате флотации и переносят в среду для иммобилизации на время от 1 мин до 4 часов и характеризующейся пониженной осмоляльностью (100-170 mOsmol/kg), значением рН, находящимся в диапазоне от 7,0 до 8,0, газовой средой, содержащей от 0,1 до 8% углекислого газа, температурой среды от 0 до 39°C для поддержания жизнеспособности иммобилизованных сперматозоидов.

Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для создания необходимой осмоляльности 100-170 mOsmol/kg содержит химические соединения, преимущественно соли: натрия хлорид (NaCl) - 41-70 mmol/l, калия хлорид (KCl) - 1,25-4,8 mmol/l, калий фосфорнокислый однозамещенный (КН2РО4) - 0-0,8 mmol/l, натрий фосфорнокислый двузамещенный (Na2HPO4) - 0-0,3 mmol/l, сульфат магния семиводный (MgSO4×7H2O) - 0-0,8 mmol/l, хлорид кальция двуводный (CaCl2×2Н2О) - 0,3-1,2 mmol/l, бикарбонат натрия (NaHCO3) - 0-27,0 mmol/l, натрия пируват - 0-0,25 mmol/l, L-натрия лактат - 0-7,0 mmol/l.

Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для обеспечения необходимого уровня рН=7,0-8,0 содержит буферные системы на основе HEPES (0-15,0 mM/l), бикарбоната натрия (0-27,0 mM/l), фосфатного буфера (калий фосфорнокислый однозамещенный - 0-0,8 mM/l, натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0-0,3 mM/l), цитратного буфера (цитрат натрия - 0-70,0 mM/l).

Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для обеспечения потребности сперматозоидов в энергии содержит: натрия пируват (0-0,25 mmol/l), L-натрия лактат (0-7,0 mmol/l), глюкозу (0-5,0 mmol/l), фруктозу (0-5,0 mmol/l).

Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для обеспечения потребности сперматозоидов в аминокислотах содержит аланин (0-0,05 mmol/l), аспарагиновую кислоту (0-0,05 mmol/l), аспарагин (0-0,05 mmol/l), аргинин (0-0,5 mmol/l), цистин (0-0,07 mmol/l), глутамин (0-0,5 mmol/l), аланил-глутамин (0-1,0 mmol/l), глицин (0-0,05 mmol/l), гистидин (0-0,06 mmol/l), изолейцин (0-0,01 mmol/l), лейцин (0-0,05 mmol/l), лизин (0-0,08 mmol/l), метионин (0-0,02 mmol/l), фенилаланин (0-0,02 mmol/l), пролин (0-0,05 mmol/l), серин (0-0,05 mmol/l), таурин (0-0,05 mmol/l), треонин (0-0,02 mmol/l), триптофан (0-0,002 mmol/l), тирозин (0-0,005 mmol/l), валин (0-0,02 mmol/l).

Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для обеспечения потребности сперматозоидов в витаминах и биогенных аминах содержит холина хлорид (0-0,003 mmol/l), фолиевую кислоту (0-0,002 mmol/l), инозитол (0-0,003 mmol/l), никотинамид (0-0,003 mmol/l), пантотенат (0-0,001 mmol/l), пиридоксаль (0-0,0005 mmol/l), рибофлавин (0-0,0005 mmol/l), тиамин (0-0,002 mmol/l).

Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для обеспечения потребности сперматозоидов в белках или макромолекулах содержит человеческий сывороточный альбумин (0-20,0 mg/ml), бычий сывороточный альбумин (0-20,0 mg/ml), заменитель белков сыворотки (0-20,0 mg/ml), поливинилпирролидон (0-10,0 mg/ml), поливинилалкоголь (0-10,0 mg/ml).

Результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является гипоосмотический шок сперматозоидов, находящихся в среде иммобилизации, обусловленный притоком воды из внеклеточного пространства через цитоплазматическую мембрану в цитоплазму сперматозоида и характеризующийся выключением аппарата передвижения - то есть иммобилизацией сперматозоида без потери последним жизнеспособности в течение от 1 мин до 2 часов.

Изобретение поясняется рецептами сред для иммобилизации сперматозоидов человека и животных (Табл.1), которые не охватывают и тем более не ограничивают весь объем притязаний данного методического решения, а являются лишь поясняющими материалами частного случая исполнения.

Способ иммобилизации сперматозоидов реализуется следующим образом.

Сперматозоиды концентрируют центрифугированием при 400-600 g в среде для культивирования сперматозоидов (например, М2, ТН, TL-HEPES, SOF или DPBS), супернатант удаляют, а 100-200 µl осадка, содержащего сперматозоиды, ресуспендируют в 1-2 ml среды для иммобилизации. Полученную взвесь сперматозоидов вновь осаждают центрифугированием, супернатант удаляют, а осадок, содержащий иммобилизованные сперматозоиды, разбавляют средой для иммобилизации до необходимой концентрации.

Иммобилизованные таким образом сперматозоиды могут быть использованы для процедуры ICSI. оценки и отбору по ультаморфологическим признакам с последующим использованием в процедурах ВРТ.

Таблица 1
Примеры рецептов сред для иммобилизации сперматозоидов человека и животных
Состав: Рецепт №:
1 2 3 4 5
NaCl, mmol/l 56,8 68,4 64,6 63,3 68,4
KCl, mmol/l 2,86 1,89 4,30 1,90 1,34
KH2PO4, mmol/l 0,71 - 0,71 0,30 0,74
MgSO4×7H2O, mmol/l 0,71 - - 0,32 -
L-натрия лактат, mmol/l 2,0 6 2,0 - -
Глюкоза, mmol/l 3,0 3,0 - 3,0 -
NaHCO3, mmol/l 2,4 1,2 15,4 7,1 -
Натрия пируват, mmol/l 0,2 - 0,2 0,5 -
CaCl2×2H2O, mmol/l 1,02 1,2 1,02 0,30 0,50
HEPES, mmol/l 12,6 6 - - -
Na2HPO4×H2O, mmol/l - 0,21 - - -
NaH2PO4, mmol/l - - - 0,54 4,05
MgCl2×6H2O, mmol/l - - 0,3 - 0,25
Бычий сывороточный альбумин, mg/ml - 3 19 5 -
Поливинилпирролидон, mg/ml - - - - 1,0
Аланин, mmol/l - - - 0,05 -
Аспарагиновая кислота, mmol/l - - - 0,05 -
Аспарагин, mmol/l - - - 0,05 -
Аргинин, mmol/l - - - 0,5 -
Цистин, mmol/l - - - 0,07 -
Глутамин, mmol/l - - - 0,5 -
Аланил-глутамин, mmol/l - - - 1,0 -
Глицин, mmol/l - - - 0,05 -
Гистидин, mmol/l - - - 0,06 -
Изолейцин, mmol/l - - - 0,01 -
Лейцин, mmol/l - - - 0,05 -
Лизин, mmol/l - - - 0,08 -
Метионин, mmol/l - - - 0,02 -
Фенилаланин, mmol/l - - - 0,02 -
Пролин, mmol/l - - - 0,05 -
Серин, mmol/l - - - 0,05 -
Таурин, mmol/l - - - 0,05 -
Треонин, mmol/l - - - 0,02 -
Триптофан, mmol/l - - - 0,002 -
Тирозин, mmol/l - - - 0,005 -
Валин, mmol/l - - - 0,02 -
Холина хлорид, mmol/l - - - 0,003 -
Фолиевая кислота, mmol/l - - - 0,002 -
Инозитол, mmol/l - - - 0,003 -
Никотинамид, mmol/l - - - 0,003 -
Пантотенат, mmol/l - - - 0,001 -
Пиридоксаль, mmol/l - - - 0,0005 -
Рибофлавин, mmol/l - - - 0,0005 -
Тиамин, mmol/l - - - 0,002 -

Claims (7)

1. Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных, отличающаяся тем, что для создания необходимой осмоляльности 100-170 мОсм/кг содержит следующие химические соединения: натрия хлорид NaCl 56,8-68,4 ммоль/л, калия хлорид KCl 1,89-4,30 ммоль/л, калий фосфорнокислый однозамещенный KH2PO4 0-0,71 ммоль/л, натрий фосфорнокислый двузамещенный одноводный Na2HPO4×H2O 0-0,21 ммоль/л, сульфат магния семиводный MgSO4×7H2O - 0-0,71 ммоль/л, хлорид кальция двуводный CaCl2×2H2O 1,02-1,2 ммоль/л, бикарбонат натрия NaHCO3 1,2-15,4 ммоль/л, натрия пируват 0-0,2 ммоль/л, L-натрия лактат 2-6,0 ммоль/л, магния хлорид шестиводный MgCl2×6H2O 0-0,3 ммоль/л, бычий сывороточный альбумин BSA 0-19 мг/мл, буфер HEPES 0-15,0 мМ/л, глюкоза 0-3 мМ/л.
2. Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных по п.1, отличающаяся тем, что для обеспечения необходимого уровня рН=7,0-8,0 содержит буферные системы на основе бикарбоната натрия 1,2-15,4 мМ/л, фосфатного буфера - калий фосфорнокислый однозамещенный 0-0,71 мМ/л, натрий фосфорнокислый двузамещенный 0-0,21 мМ/л.
3. Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных по п.1, отличающаяся тем, что для обеспечения потребности сперматозоидов в энергии содержит: натрия пируват 0-0,25 мМ/л, L-натрия лактат 2,0-6,0 мМ/л, глюкозу 0-3,0 мМ/л.
4. Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных по п.1, отличающаяся тем, что для обеспечения потребности сперматозоидов в аминокислотах содержит аланин, аспарагиновую кислоту, аспарагин, аргинин, цистин, глутамин, аланил-глутамин, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, таурин, треонин, триптофан, тирозин, валин.
5. Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных по п.1, отличающаяся тем, что для обеспечения потребности сперматозоидов в витаминах и биогенных аминах содержит холина хлорид, фолиевую кислоту, инозитол, никотинамид, пантотенат, пиридоксаль, рибофлавин, тиамин.
6. Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных по п.1, отличающаяся тем, что для обеспечения потребности сперматозоидов в белках и макромолекулах содержит человеческий сывороточный альбумин, бычий сывороточный альбумин, заменитель белков сыворотки, поливинилпирролидон, поливинилалкоголь.
7. Способ витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных, отличающийся тем, что сперматозоиды получают из нативной или размороженной спермы, центрифугируют эякулят в градиенте плотности или сперматозоиды отбирают в результате флотации, переносят в среду для иммобилизации по п.1 на время от 1 мин до 2 часов, причем состав газовой среды при культивировании на среде для иммобилизации представляет собой 0,1-8% углекислого газа, а температура - 0-39°C.
RU2012103454A 2012-02-02 2012-02-02 Способ витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных RU2504581C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2012103454A RU2504581C2 (ru) 2012-02-02 2012-02-02 Способ витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2012103454A RU2504581C2 (ru) 2012-02-02 2012-02-02 Способ витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2012103454A true RU2012103454A (ru) 2013-08-10
RU2504581C2 true RU2504581C2 (ru) 2014-01-20

Family

ID=49159189

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2012103454A RU2504581C2 (ru) 2012-02-02 2012-02-02 Способ витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2504581C2 (ru)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7144921B2 (en) * 2001-09-04 2006-12-05 Council Of Scientific And Industrial Research Composition having antibacterial and antifungal properties
EA008674B1 *
RU2437100C1 (ru) * 2010-05-18 2011-12-20 Государственное учреждение Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Способ диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии
RU2438309C2 (ru) * 2006-07-04 2012-01-10 Спермвиталь Ас Консервирование и контролируемая доставка/высвобождение сперматозоидов

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA008674B1 *
US7144921B2 (en) * 2001-09-04 2006-12-05 Council Of Scientific And Industrial Research Composition having antibacterial and antifungal properties
RU2438309C2 (ru) * 2006-07-04 2012-01-10 Спермвиталь Ас Консервирование и контролируемая доставка/высвобождение сперматозоидов
RU2437100C1 (ru) * 2010-05-18 2011-12-20 Государственное учреждение Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Способ диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии

Also Published As

Publication number Publication date Type
RU2012103454A (ru) 2013-08-10 application

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Morisawa et al. Effects of potassium and osmolality on spermatozoan motility of salmonid fishes
Davis et al. Cleavage and Blastocyst Formation by Pig Eggs In Vitro 1, 2
Pavlok et al. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles
Abe et al. Accumulation of cytoplasmic lipid droplets in bovine embryos and cryotolerance of embryos developed in different culture systems using serum‐free or serum‐containing media
Luberda The role of glutathione in mammalian gametes
Abeydeera et al. In vitro penetration of pig oocytes in a modified Tris-buffered medium: effect of BSA, caffeine and calcium
Camaioni et al. Uptake of exogenous DNA by mammalian spermatozoa: specific localization of DNA on sperm heads
Naito et al. Effects of porcine follicular fluid on male pronucleus formation in porcine oocytes matured in vitro
Rivera et al. Development of cultured bovine embryos after exposure to high temperatures in the physiological range
Yanagimachi Fertilization of guinea pig eggs in vitro
Grupen et al. Cysteamine enhances in vitro development of porcine oocytes matured and fertilized in vitro
Fukui Effect of follicle cells on the acrosome reaction, fertilization, and developmental competence of bovine oocytes matured in vitro
Lenz et al. Chondroitin sulfate facilitates an acrosome reaction in bovine spermatozoa as evidenced by light microscopy, electron microscopy and in vitro fertilization
Yanagimachi et al. Calcium dependence of the acrosome reaction and activation of guinea pig spermatozoa
US20050003472A1 (en) Process for the staining of sperm
Zeng et al. Dietary arginine supplementation during early pregnancy enhances embryonic survival in rats
Rogers Mammalian sperm capacitation and fertilization in vitro: a critique of methodology
Salamon et al. Storage of ram semen
Aurich Factors affecting the plasma membrane function of cooled-stored stallion spermatozoa
Seshagiri et al. Phosphate is required for inhibition by glucose of development of hamster 8-cell embryos in vitro
Harrison et al. Bicarbonate-induced membrane processing in sperm capacitation
Fraser Dibutyryl cyclic AMP decreases capacitation time in vitro in mouse spermatozoa
Keefer Fertilization by sperm injection in the rabbit
Cross et al. In vitro development of mouse oocytes
Matsuoka et al. Effects of bovine serum albumin and trehalose in semen diluents for improvement of frozen-thawed ram spermatozoa

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Correction of name of patent owner
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20150203