JP2019504634A - 統合細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)水不溶性マクロ構造物へと集合することができる絹タンパク質の水溶液を設けること、ここで、前記絹タンパク質は場合により細胞結合モチーフを含む;
(b)真核細胞のサンプルと前記絹タンパク質との水性混合物を調製すること、ここで、該絹タンパク質は水性混合物中に溶解したままである;
(c)前記絹タンパク質を前記真核細胞の存在下で水不溶性マクロ構造物へと集合させ、それにより真核細胞を培養するための足場材料を形成させる;及び
(d)細胞培養に適した条件下にて、前記足場材料内で真核細胞を維持すること、
を含む、方法を提供する。
(a)水不溶性マクロ構造物へと集合することができる絹タンパク質の水溶液を設けること、ここで、前記絹タンパク質は場合により細胞結合モチーフを含む;
(b)真核細胞のサンプルと前記絹タンパク質との水性混合物を製造すること、ここで、前記絹タンパク質は水性混合物中に溶解したままである;及び
(c)前記絹タンパク質を真核細胞の存在下で水不溶性マクロ構造物へと集合させ、それにより真核細胞を培養するための足場材料を形成させること、
を含む方法を提供する。
REPは、L(AG)nL、L(AG)nAL、L(GA)nL、及びL(GA)nGL(式中、nは2〜10の整数である)からなる群から選択される70〜300アミノ酸残基の反復フラグメントであり;個々のAセグメントは、8〜18アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、該アミノ酸残基のうち0〜3個はAlaではなく、かつ、残りのアミノ酸残基はAlaであり;個々のGセグメントは、12〜30アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、該アミノ酸残基の少なくとも40%がGlyであり;及び個々のLセグメントは、0〜30アミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列であり;CTは、配列番号3又は配列番号68と少なくとも70%同一性を有する70〜120アミノ酸残基のフラグメントであり;ならびに場合により含まれる細胞結合モチーフは、クモ糸タンパク質の末端に、又は前記部分間、もしくは前記部分のいずれかの内に、好ましくは該クモ糸タンパク質の末端に配置される。
配列番号
1 RepCT(4RepCT,WT)(DNA)
2 RepCT(4RepCT,WT)
3 CT
4 コンセンサスCT配列
5 ユープロステノプス・オーストラリス(Euprosthenops australis)由来反復配列MaSp1
6 コンセンサスGセグメント配列1
7 コンセンサスGセグメント配列2
8 コンセンサスGセグメント配列3
9 FNcc
10 IKVAV
11 YIGSR
12 EPDIM
13 NKDIL
14 GRKRK
15 KYGAASIKVAVSADR
16 NGEPRGDTYRAY
17 PQVTRGDVFTM
18 AVTGRGDSPASS
19 TGRGDSPA
20 CTGRGDSPAC
21 GPNSRGDAGAAS
22 VTGRGDSPAS
23 STGRGDSPAS
24 RGD−4RepCT、Widhe et al. (2013)(DNA)*
25 RGD−4RepCT、Widhe et al. (2013)*
26 FNCC−4RepCT(DNA)
27 FNCC−4RepCT
28 2RepRGD2RepCT(2R)
29 3RepRGD1RepCT(3R)
30 GRKRK−4RepCT
31 IKVAV−4RepCT
32 リンカーペプチド1
33 リンカーペプチド2
34 リンカーペプチド3
35 リンカーペプチド4
36 CTユープロステノプス属(Euprosthenops sp)MaSp1
37 CTユープロステノプス・オーストラリス(Euprosthenops australis)MaSp1
38 CTアルギオペ・トリファスシアタ(Argiope trifasciata)MaSp1
39 CTシルトホラ・モルセンシス(Cyrtophora moluccensis)Sp1
40 CTラトロデクツス・ゲオメトリクス(Latrodectus geometricus)MaSp1
41 CTラトロデクツス・ヘスペルス(Latrodectus hesperus)MaSp1
42 CTホルストジョウゴグモ(Macrothele holsti)Sp1
43 CTネフィラ・クラビペス(Nephila clavipes)MaSp1
44 CTネフィラ・ピリペス(Nephila pilipes)MaSp1
45 CTネフィラ・マダガスカリエンシス(Nephila madagascariensis)MaSp1
46 CTネフィラ・セネガレンシス(Nephila senegalensis)MaSp1
47 CTウズグモ(Octonoba varians)Sp1
48 CTボロアミグモ属シネンシス(Psechrus sinensis)Sp1
49 CTテトラグナタ・カウアイエンシス(Tetragnatha kauaiensis)MaSp1
50 CTテトラグナタ・ベルシカラー(Tetragnatha versicolor)MaSp1
51 CTアラネウス・ビセンテナリウス(Araneus bicentenarius)Sp2
52 CTアルギオペ・アモエナ(Argiope amoena)MaSp2
53 CTアルギオペ・アウランティア(Argiope aurantia)MaSp2
54 CTアルギオペ・トリファスシアタ(Argiope trifasciata)MaSp2
55 CTガステラカンタ・マモサ(Gasteracantha mammosa)MaSp2
56 CTラトロデクタス・ジオメトリカス(Latrodectus geometricus)MaSp2
57 CTラトロデクタス・ヘスペルス(Latrodectus hesperus)MaSp2
58 CTネフィラ・クラビペス(Nephila clavipes)MaSp2
59 CTネフィラ・マダガスカリエンシス(Nephila madagascariensis)MaSp2
60 CTネフィラ・セネガレンシス(Nephila senegalensis)MaSp2
61 CTドロメデス・テネブロサス(Dolomedes tenebrosus)Fb1
62 CTドロメデス・テネブロサス(Dolomedes tenebrosus)Fb2
63 CTアラネウス・ジアデマタス(Araneus diadematus)ADF−1
64 CTアラネウス・ジアデマタス(Araneus diadematus)ADF−2
65 CTアラネウス・ジアデマタス(Araneus diadematus)ADF−3
66 CTアラネウス・ジアデマタス(Araneus diadematus)ADF−4
67 STGRGDSPAV(FN10II)
68 CTアラネウス・ベントリコサス(Aranaeus ventricosus)MiSp
69 FNcc−RepCTMiSp
* Widhe M et al., Biomaterials 34(33): 8223-8234 (2013)
(a)水不溶性マクロ構造物へと集合することができる絹タンパク質の水溶液を設けること、ここで、前記絹タンパク質は場合により細胞結合モチーフを含む;
(b)真核細胞のサンプルと前記絹タンパク質との水性混合物を製造すること、ここで、該絹タンパク質は水性混合物中に溶解したままである;
(c)前記絹タンパク質を真核細胞の存在下で水不溶性マクロ構造物へと集合させ、それにより真核細胞を培養するための足場材料を形成させること;及び
(d)細胞培養に適した条件下にて、前記足場材料内で真核細胞を維持すること、
を含む。
(式中、
nは2〜10の整数であり;
個々のAセグメントが8〜18アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、該アミノ酸残基のうち0〜3個はAlaではなく、かつ、残りのアミノ酸残基はAlaであり;
個々のGセグメントが12〜30アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、該アミノ酸残基の少なくとも40%がGlyであり;及び
個々のLセグメントが0〜30アミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列である)
からなる群から選択される70〜300アミノ酸残基の反復フラグメントであり;及び
CTが、配列番号3又は配列番号68と少なくとも70%同一性を有する70〜120アミノ酸残基のフラグメントである。
LA1G1A2G2A3G3A4G4A5G5LなどのL(AG)nL;
LA1G1A2G2A3G3A4G4A5G5A6LなどのL(AG)nAL;
LG1A1G2A2G3A3G4A4G5A5LなどのL(GA)nL;又は
LG1A1G2A2G3A3G4A4G5A5G6LなどのL(GA)nGL。
(a)水不溶性マクロ構造物へと集合することができる絹タンパク質の水溶液を設けること、ここで、前記絹タンパク質は場合により細胞結合モチーフを含む;
(b)真核細胞のサンプルと前記絹タンパク質との水性混合物を調製すること、ここで、前記絹タンパク質は水性混合物中に溶解したままである;及び
(c)前記絹タンパク質を真核細胞の存在下で水不溶性マクロ構造物へと集合させ、それにより前記真核細胞を培養するための足場材料を形成させること;
を含む。
材料及び方法
組換えクモ糸タンパク質の調製
大腸菌(E.coli)中の組換え絹タンパク質の産生及び次の精製を、基本的に、Hedhammar M et al., Biochemistry 47(11):3407-3417 (2008) 及び Hedhammar M et al., Biomacromolecules 11: 953-959 (2010)に記載されているように行った。
間葉系幹細胞(MSC)
8〜14代の継代のマウス間葉系幹細胞(mMSC、Gibco)を、10%ウシ胎仔血清(Mesenchymal Stem Cell Qualified, USDA Approved Regions, Gibco)を添加したDMEM F12 HAM中で培養した。
マウス内皮細胞(Cell Biologics)を、完全内皮細胞培地MV(PromoCell GmbH、ドイツ)中、7〜9代の継代で培養した。
ヒト皮膚線維芽細胞、HDF(ECACC、英国、ソールズベリー)を、8〜11代の継代で使用した。5%FBS(Sigma)を添加した培養培地、DMEM F12ハムを、2〜3日目毎に交換した。
HaCaT(ヒトケラチノサイト細胞系統、自然形質転換)を、5%FBS(Sigma)を添加したMEM F12ハム中で培養した。培地を2〜3日目毎に交換した。
ヒト骨格筋サテライト細胞、HskMSC(ScienCell Research Laboratorie、米国カリフォルニア州カールスバッド)及びヒト骨格筋筋芽細胞(HSMM、Lonza、ベルギー)を、2〜6代の継代から使用した。骨格筋細胞増殖用添加物、SkMCGS(ScienCell Research Laboratories)又はSkGM−2 BulletKit(HSMM用、Lonza)及び5%FBS(それぞれ、ScienCell Research Laboratories 又はLonza)を含む骨格筋培養培地、SkMCM(ScienCell Research Laboratories)を、2日目毎に交換した。
27〜35代の継代の膵臓β細胞系統MIN6m9を、βメルカプトエタノール(50μM)、ペニシリン(100U/mL)、ストレプトマイシン(100μg/mL)、10%熱失活FBS及びグルコース(11mM)を添加したDMEM(Gibco)中で培養した。
げっ歯類肝細胞(肝臓細胞)を、肝臓の酵素(25mM ヘペス、0.25%w/v BSAを添加したpH7.4 HBSS緩衝液中の1.2mg/mlコラゲナーゼP)コラゲナーゼ処理により単離し、37℃、20分間の連続機械振盪により消化し、分離して、10%FBS(Invitrogen)を添加したRPMI−1640培地中で培養する。
グリオーマ産生細胞系統GL261を、DMEM(Invitrogen)を含む10%FBS中で、2〜3日目毎に培地を交換しながら培養する。
ECとの共培養中のHsk細胞を、SkMCM培養培地中で培養した。MSC及びECとの共培養中の内分泌細胞を、50:25:25の比のRPMI 1640培地(Gibco)、2mM Glutamaxを含むStemPro MSC無血清培地CTS(Gibco)及び内分泌細胞培地MV(PromoCell GmbH、ドイツ)中で培養した。
繊維調合物
絹タンパク質(0.5〜3mg)を、全体積2〜4mlでそれぞれの培養培地中0.5〜2百万細胞と混合した。優しい縦揺れ下、室温で、1〜3時間、細胞と一緒に繊維形成を行った。それから、形成された繊維を、1×PBSで洗浄し、その後、非組織処理した12又は24ウェルプレートに移動し、新鮮な培地(24ウェルプレートに0.5mL又は12ウェルプレートに1mL)の添加により培養液中にさらに保持した。
絹発泡体足場を、疎水性培養ウェルの中央部に入れた絹タンパク質(3mg/mL)20〜40μlで製造した。20μlのタンパク質の液滴中に、30回、空気をピペットで入れた。細胞懸濁液(0.5〜2百万細胞/ml)を、25mMヘペスを含むが血清を含まないそれぞれの培養培地中に調製し、気泡の導入前後のいずれかで滴下(10〜20μl)した。細胞含有発泡体プレートを、細胞インキュベーター内で30〜60分間インキュベートして、適切な細胞培養培地を添加した。
絹タンパク質(3mg/mL)を、解凍してアグリゲートを除去後に遠心分離した。タンパク質溶液5μL又は10μLを疎水性培養ウェル(Sarstedt懸濁細胞)に添加して、ウェル底面に液滴を作製した。その後、同体積の細胞懸濁液(HDFn又はHaCaT、0.5milj/mL、1milj/mL又は2milj/mL)をタンパク質の液滴に添加した。細胞含有薄膜を、細胞インキュベーター内で30〜60分間インキュベートし、次いで、蓋のないLAFベンチ内で30分(5+5μL薄膜)又は60分(10+10μL薄膜)インキュベートした後、培養培地1mLを添加した。2又は3日間培養を行った後、Live/Deadアッセイ(Life Technologies)を行った。
組換えクモ糸タンパク質を使用してタンパク質20μlの発泡体(3mg/mL)を調製し、24ウェルプレートのウェルの中央部に入れる。20μlのタンパク質の液滴中に、空気をピペットで入れた。細胞懸濁液(1百万細胞/ml)を、25mMヘペスを含むが血清を含まないDMEM(Invitrogen)中に調製する。調製した細胞懸濁液から20,000細胞(20μl)の最終量を、小さな液滴で、発泡体の上部に慎重に置く。細胞含有発泡体を、細胞インキュベーター内で1時間インキュベートした後、10%FBSを添加したRPMI−1640培地をさらに添加する(500μl、Invitrogen)。
増殖
アラマーブルー(Alamar Blue)(Invitrogen、スウェーデン、ストックホルム)を使用して、21日までの期間にわたって、繊維及び発泡体内に統合された細胞の生存率及び増殖を調査した。アラマーブルーを適切な細胞培養培地中、1/10に希釈し、繊維又は発泡体を含む各ウェルに添加し、細胞インキュベーター内で2時間インキュベートした。インキュベート後、上澄みを、新しい96ウェルプレート(Corning)に移動し、マルチモードプレートリーダー(ClarioStar、LabVision)を用いて595nmにおいてODを測定した。ODを、ウェル毎に蛍光強度としてプロットした。それから、アラマーブルーインキュベーションをして除去後、培養を新鮮な完全培地を用いて継続した。
Live/Dead細胞生存率アッセイ(分子プローブ/Invitrogen、スウェーデン、ストックホルム)を、培養7〜21日後、選択されたエンドポイントについて細胞含有絹足場で行った。絹足場を、PBS中で洗浄した後、PBS中のCalcein(1/2000)及びEthD−1(1/500)の混合物をウェルに添加し、室温で30分間インキュベートした。それから、染色を、倒立蛍光顕微鏡(ニコン製エクリプス、スウェーデン)で、生細胞(緑)及び死細胞(赤)について分析した。足場の選択された平面において10倍の拡大で画像を撮った。ソフトウェアNIS−elements3を用いて、画像毎の3箇所の同面積を、生存率%について算出した(緑色細胞の量/細胞の総数×100)。
穏やかに洗浄後、細胞含有絹足場を、4%パラホルムアルデヒドを用いて固定し、PBS中の0.1%トリトンX−100を用いて透過処理し、PBS中の1%ウシ血清アルブミン(BSA、AppliChem)を用いてブロックした。一次抗体マウス抗ヒトビンキュリン(Sigma、V9131)を、1%BSA中、9.5μg/mlの濃度で使用した。二次抗体は、AlexaFlour488ヤギ抗マウスIgG(H+L)であり、交差吸着処理(Invitrogen)し、1:500で使用した。ファロイジン−AlexaFluor594(Life Technologies)を1:40で使用し、線維状アクチンを検出した。DAPIを核染色のために使用した。スライドを蛍光封入剤(Dako、コペンハーゲン)で封入した。染色細胞を、4倍及び10倍の拡大で倒立顕微鏡(ニコン製エクリプスTi)を用いて分析した。
エンドポイントにおいて、細胞含有絹足場を4%パラホルムアルデヒドで15〜30分間固定し、洗浄し、Tissue−Tek(サクラ、日本)中に包埋されるまで20%ショ糖中でインキュベートし、凍結保存し、クリオスタットで12〜25μm厚の連続した切片を作製した。選択された切片を、凍結組織用の次の標準ヘマトキシリン及びエオジン(HE)染色後、形態評価した。
細胞含有絹足場の選択された切片を、5分間、0.5%トリトンX100中で透過処理し、室温で30分間PBS中の5%正常ヤギ血清でブロックし、デスミン(Anti-Des、Prestige Antibodies、Atlas Antibodies、Sigma Aldrich、1:200)に対して染色した。次に、繊維切片を、Alexa488と結合したウサギに対するヤギ中で産生した二次抗体を用いてプローブした(分子プローブ、1:1000)。
選択された切片を、PBS中の1%BSAでブロックした後、1%BSA中、3.5mg/mLでマウス抗I型コラーゲン(クローンCOL−1、SigmaAldrich)を用いて染色し、次いで、AlexaFluor488ヤギ抗マウスIgG抗体(Invitrogen)でプローブした。DAPIを核染色のために使用した。スライドを蛍光封入剤(Fluorescence mounting medium)(Dako)で封入した。写真を、ニコン倒立蛍光顕微鏡で10倍で撮影した。
内分泌細胞のクラスターを含む絹発泡体足場をPBS中で洗浄し、1%パラホルムアルデヒド中で固定し、その後、0.3%トリトンX100を含むPBS中で15分間透過処理した。室温(RT)で1時間、0.1%ツイーンを含むPBS中6%ウシ胎仔血清(FCS)を用いてブロッキングした。それから、インスリン(モルモット抗インスリン、1:1000、Dako)、ウサギ抗ヒトCD44(1:100)及び/又はマウス抗ヒトCD31(1:100、BD Pharmingen)に対する抗体と一緒に、4℃で一夜、サンプルをインキュベートした。翌日、Alexa488と結合したモルモットならびにAlexa594と結合したウサギ及びマウスに対するヤギ中で産生した二次抗体を用いて、サンプルをプローブした(分子プローブ、1:1000)。
細胞含有繊維の応力対歪み(長さ伸び%)を、0.2N/分のランプ力を使用し、特注のZwick/Roell材料試験機を用いて、生理様条件(37℃、1×PBS)下で測定した。繊維端部を検体グリッパで取り付けた。巨視的欠陥を含む繊維又は機械的試験中に明らかに扱いが悪かった繊維は除外した。繊維の円形の最初の断面を応力算出のために使用した。
本質的に、Speier S, et al. Nat Protoc. 3:1278-1286 (2008)に以前に記載されているのと同手順を用いて移植を行った。細胞含有絹マトリックスを小片(約50μm)に解体し、無菌培養培地に入れた後、0.4mmポリエチレンチュービング(Portex)により1mLハミルトン製シリンジ(Hamilton)と連結した27ゲージアイカニューレ(平滑末端パッチクランプガラスキャピラリーの適応により調製)に吸引した。Jackson Laboratory (米国メーン州バーハーバー)から購入したB6アルビノA++(C57BL/6NTac-Atm1.1Arte Tyrtm1Arte, Taconic、ドイツ、ケルン)を、2%イソフルラン(vol/vol)を用いた麻酔後に、レシピエントとして使用した。カニューレを前眼房中に安定に挿入した場合、これらが虹彩上に定着する前眼房中に滅菌生理食塩水の可能限り少量の体積中に、移植片をゆっくりと注入した。外科的処置後にブプレノルフィン(0.05〜0.1mg/kg、皮下投与)を用いて鎮痛を得た。
統合細胞を含む絹足場の調合物
図3は、統合細胞を含む絹足場の調合物の模式的説明を示す。
図3Aは、細胞含有絹繊維の調合物の模式的説明を示す。絹タンパク質を培地(I)中に懸濁された細胞と混合する。1〜3時間のインキュベーションの優しい縦揺れの間に、絹タンパク質は、空気−液体界面において、統合された細胞(II)を含む繊維マット中へと集合する。それから、細胞含有絹繊維を容易に回収し、培養ウェル(III)中に入れた。
図3Bは、細胞含有絹発泡体の調合物の模式的説明を示す。培地中の細胞を含む絹タンパク質溶液を、穏やかに空気を導入することにより湿った発泡体(I)に転換する。プレインキュベーション30〜60分後、追加の培養培地を添加し、発泡体(II)を覆う。それから、細胞絹発泡体を、ウェル(III)中で培養することができる。スケールバー=1mm。
図3Cは、細胞含有絹薄膜の調合物の模式的説明である。絹タンパク質溶液を、培地中に懸濁された細胞を直接滴下した後に、培養ウェル中に液滴として入れる(I)。プレインキュベーションの30〜60分後、追加の培養培地を添加し、薄膜(II)を覆う。それから、細胞含有絹薄膜をウェル中で培養し、L/D染色に付すことができる(III)。左:2日後のHDFn(20,000細胞/薄膜)の4倍拡大、右:3日後のHaCaT(10,000細胞/薄膜)の4倍拡大。
細胞増殖の測定(アラマーブルー細胞生存率アッセイを用いて)は、発泡体、繊維及び薄膜両方内の細胞増殖の増殖プロファイルを確認させた。図4は、絹足場内の細胞の代謝活性を示す。図4Aは、アラマーブルー細胞生存率アッセイを用いて測定した異なる細胞型(mMSC、mEC、HDFn、Hsk)を含む個別の絹繊維束の代表的増殖プロファイルを示す。図4Bは、アラマーブルー細胞生存率アッセイを用いて測定した異なる細胞型(mMSC、mEC、HaCaT、MIN6m9)を含む個別の絹発泡体の代表的増殖プロファイルを示す。
絹足場内での細胞の生存率を生細胞(緑)及び死細胞(赤)を同時に染色する二色蛍光生存率アッセイを用いて、顕微鏡で分析した。
A)細胞絹繊維内の様々な細胞型の生染色(10倍)。
B)細胞絹発泡体内の様々な細胞型の生染色(10倍)。
C)繊維内の細胞生存率。
D)発泡体内の細胞生存率。
細胞が広がり、絹足場内から散らばる能力を、張力繊維の染色(アクチンフィラメントによる)により評価した。図6は、絹足場内の細胞の拡張を示す。図6Aは、繊維(左)及びDapi(丸い点は核を表す)内のHDFn細胞のf−アクチン染色ならびに発泡体におけるmMSCのf−アクチン染色(右)を示す(10倍)。図6Bは、繊維におけるHDFn(左)及びHDMEC(右)のf−アクチン及びビンキュリン(輝点)染色を示す。
細胞が絹足場内によく分布することを確認するために、本発明者らは、細胞の場所を決めるために凍結切片及びH/E染色を行った。繊維を、繊維軸の縦断面及び横断面の両方で薄片化した(図7A)。いくつかの領域は他のものより集中しているが、細胞を繊維全体にわたって見ることができた。生存率アッセイからの結果に従えば、発泡体足場は、材料全体にわたって、細胞がより高密度で集中していた(図7B)。
細胞含有絹足場は、高湿度条件下、柔軟性に関して通常の絹足場と類似して、培養期間全体にわたる取り扱い及び分析手順に充分に安定であった。天然組織と比較して機械特性を関連づけるために、細胞含有繊維を、前以て温めた生理緩衝液中で引張試験に付した(図8)。初期弾性相後、変形域に達し、繊維はその最初の長さの約2倍まで伸びた。
絹足場内で培養中、細胞がこれらの主要機能を維持することを確認するための第一ステップとして、異なる足場タイプ内で増殖する場合に線維芽細胞がI型コラーゲンを産生するか調査した。細胞内I型コラーゲンの染色により、繊維又は発泡体内であるが、大部分の細胞がコラーゲンを産生するのは明らかだった。
絹足場内の細胞が分化することができることを確認するために、ヒト骨格筋サテライト細胞を含む繊維をDMEM培養培地に移動して分化を促進させた。デスミン染色を適用して、筋管形成を可視化した(図10)。
大部分の天然組織型は、細胞周囲及びこれと離れないようにしている細胞外マトリックスと複雑な三次元配置で一緒に組織化されたいくつかの細胞型からなる。したがって、改変組織コンストラクト中でこれを複製するために、足場内で共培養を成し遂げることは重要なことである。本明細書に記載された、細胞含有絹足場の調合物方法を用いて、いくつかの細胞型を組合せることは、これらが同様な培地中で培養することができる限り、実際非常に容易である。
しばしばランゲルハンス島と呼ばれる、膵臓内で見られる内分泌細胞島は、機能を維持するための物理的三次元支持体だけでなく適切な細胞近隣物質を必要とする細胞の典型例である。
次に、細胞含有絹足場がインビボで如何に持続するかを調査した。細胞を、それぞれ、繊維及び発泡体内で先ず培養し、1週間後にマウスの眼の前眼房中に移植した。眼により提供された開窓を、カメラを用いた絹足場(図13、左)及び共焦点顕微鏡を用いたその中の細胞(インビボ追跡)の評価に利用した(図13)。絹足場の顕微鏡外観は全4週間インビボで同様であったが、細胞の分布及び量は、おそらく分解だけでなく細胞遊走のせいでゆっくりと変化した。
代替の調合物プロトコールを調査し、調合物処理中に添加されるどの段階において、絹足場内に分布する細胞が如何に依存しているかを決定した。
絹タンパク質FNcc−RepCTMiSp(配列番号69)の製造及び精製を実施例1に記載のように行った。CTMiSp(配列番号68)は、アラネウス・ベントリコサス(Araneus ventricosus)由来の小瓶状腺クモ糸タンパク質である。
カイコ(B. mori)由来の繭の部分を、沸騰0.02M炭酸ナトリウム中に精錬し、蒸留水で適切に洗浄し、室温で一夜乾燥した。それから、精錬及び乾燥した絹を9.3M LiBrに溶解し、継続的に水を交換しながら、3日間、透析膜(MWCO 12kDa)を用いてミリQ水に対して透析した。
発泡体形成
FNcc−RepCT(配列番号27;3mg/ml)及びラミニン521(BioLamina、10μg/mlの最終濃度)の20μl液滴を、疎水性培養ウェルの中央部に入れた。40μlのピペット設定で上下に素早くピペッティングすることにより液滴に空気をピペットで入れて、緻密な湿った発泡体を作製した。通常、Essential 8(商標)培地(Life Technologies)中の10,000細胞/μ濃度における50,000hPSCを、さらに10往復動作により発泡体に直ちに導入して、3D構造物全体にわたって細胞を拡散した。それから、細胞含有発泡体を、37℃で20分間細胞インキュベーター内で安定化した後、24ウェルプレートに適切な、ROCK阻害剤Y27632、10μMを含むEssential 8(商標)1mlを添加した。翌日、ROCK阻害剤なしで新鮮な培養培地を添加し、培地を毎日交換した。
疎水性ウェルの中央部に、FNcc−RepCT(配列番号27;3mg/ml)及びラミニンの10〜20μlを添加することにより薄膜を作製した。絹溶液を、ピペットチップを用いて所望の形状に形成し、通常30,000〜50,000hPSC(少なくとも10,000細胞/μl濃度)を、溶液を絹タンパク質の中央部に穏やかに滴下することにより添加し、細胞を浮き出させてタンパク質混合物中に浸漬させた。それから、薄膜を、薄膜の大きさに応じて20〜40分間、37℃で細胞インキュベーター内で安定化した後、ROCK阻害剤、10μMを含むEssential 8(商標)0.5ml(24ウェルプレートに適切)を添加した。翌日、ROCK阻害剤なしで新鮮な培養培地を添加し、培地を毎日交換した。絹ディスク内に統合されたPSCを、明視野顕微鏡により容易にモニターすることができ、細胞が選択のプロトコールのコンフルエンス達する場合、分化の開始時点を決定する。
絹中への細胞の統合後、選択される時点において免疫細胞化学を行った。絹足場をPBS中1回洗浄した後、15分間で4%パラホルムアルデヒドを添加した。0.1%トリトンX−100を含むPBS中で15分間透過処理を行った後、10%ロバ血清(Jackson ImmunoResearch)でブロッキングした。0.1%ツイーン20(PBS−T)及び5%血清を含むPBS中に4℃で一夜、一次抗体をインキュベートした。PBS−T及び5%血清中、室温で1時間、二次抗体をインキュベートした。DAPI(Sigma)を用いて核を対比染色し、30分間インキュベートした。各インキュベーション間、PBS−Tで3回サンプルを洗浄した。
(A) 50,000ヒトiPS C5の含有の後24時間においてラミニン521(LN521)と一緒のFNcc−RepCT(配列番号27)の発泡体及び薄膜の実施例の顕微鏡写真。核DAPI染色(青)により、細胞分布を可視化した。スケールバーは1000μmを表す。
(B)ヒト胚細胞、HS980はよく増殖し、ICCにより明らかになったFNcc−RepCT(配列番号27)の発泡体(上パネル)及び薄膜(下パネル)に統合された後72時間、Naongポジティブのままであった。BFは明視野である。ラミニン被覆絹を、緑の抗ラミニン抗体(Abcam)により可視化し、多能性を赤の抗nanog(R&D)により可視化した。核をDAPI(青)で対比染色した。スケールバーは200μmを表す。
(C)含有物を明視野顕微鏡で可視化した後72時間、FNcc−RepCT(配列番号27)発泡体及び薄膜中の増殖するiPS C5細胞の代表的画像。
2つの異なる細胞型を試験した:平滑筋細胞(ヒト冠動脈、Gibco)及びヒト臍帯静脈内皮細胞(Promocell)。それぞれの培養培地に懸濁した細胞を、FNcc−RepCT(配列番号27;3mg/ml)と1:1で混合し、それから、培養ウェルに液滴として播種した(未被覆、又はRepCT(「WT」、配列番号2)又はFNcc−RepCT(「FN]、配列番号27)。
繊維及び発泡体を、実施例1で記載したように統合されたヒト間葉系幹細胞(hMSC)を含むFNcc−RepCT(配列番号27)から調製した。
統合されたhMSC細胞を含むマクロ構造物を、培養の7日後に、脂肪生成又は骨原性分化培地(PromoCell)のいずれかに付した。培地を、14日目まで3日毎に交換した。それから、サンプルを、全て標準プロトコールに従って、固定及び脂肪に対する脂質マーカー、レッドオイルO(Sigma Aldrich)、及び骨に対する骨原性マーカー、アリザリンレッドS(Sigma Aldrich)で染色に付した。
統合されたhMSC細胞を含むマクロ構造物を3日間培養し、それから、7日間デュアルSMAD阻害(Noggin及びSB431542)に付した。このプロトコールは神経前駆細胞を得る。その後、培地を神経前駆体分化培地に置き換え、14日間培養を継続し、次いで、神経細胞分化マーカーβIII tub、MAP2及びGAD1のRT−qPCR分析を行った。
原繊維絹ネットワークが細胞拡張する効果を調査するために、細胞を統合するマクロ構造物を、実施例1に記載したようにFNcc−RepCT(配列番号27)から調製した。
Claims (13)
- 真核細胞の培養方法であって、以下のステップ:
(a)水不溶性マクロ構造物へと集合することができる絹タンパク質の水溶液を設けること、ここで、前記絹タンパク質は場合により細胞結合モチーフを含む;
(b)真核細胞のサンプルと前記絹タンパク質との水性混合物を調製すること、ここで、該絹タンパク質は水性混合物中に溶解したままである;
(c)前記絹タンパク質を前記真核細胞の存在下で水不溶性マクロ構造物へと集合させ、それにより真核細胞を培養するための足場材料を形成させること;及び
(d)細胞培養に適した条件下にて、前記足場材料内で真核細胞を維持すること、
を含む、前記方法。 - 前記マクロ構造物は、繊維、発泡体、薄膜、繊維メッシュ、カプセル及び網、好ましくは繊維又は発泡体から選択される形状にされる、請求項1に記載の方法。
- 前記真核細胞が、哺乳類細胞から選択され、好ましくは、内皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、骨格筋サテライト細胞、骨格筋筋芽細胞、シュワン細胞、膵臓β細胞、膵島細胞、肝細胞及びグリオーマ形成細胞などの初代細胞及び細胞系統;ならびに間葉系幹細胞などの幹細胞;又は少なくとも2つの異なる哺乳類細胞型の組合せから選択される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記絹タンパク質がカイコフィブロインなどのフィブロインである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記絹タンパク質がクモ糸タンパク質である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クモ糸タンパク質がタンパク質部分REP及びCTを含むか又はから成り、REPはL(AG)nL、L(AG)nAL、L(GA)nL、及びL(GA)nGL
(式中、
nは2〜10の整数であり;
個々のAセグメントが8〜18アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、前記アミノ酸残基のうち0〜3個はAlaではなく、かつ、残りのアミノ酸残基はAlaであり;
個々のGセグメントが12〜30アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、前記アミノ酸残基の少なくとも40%がGlyであり;及び
個々のLセグメントが0〜30アミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列である)
からなる群から選択される70〜300アミノ酸残基の反復フラグメントであり;及び
CTが、配列番号3又は配列番号68と少なくとも70%同一性を有する70〜120アミノ酸残基のフラグメントであり;
場合により含まれる前記細胞結合モチーフを前記クモ糸タンパク質の末端に、又は前記部分間、もしくは前記部分のいずれかの内に、好ましくは前記クモ糸タンパク質の末端に配置する、
請求項5に記載の方法。 - 前記絹タンパク質が、RGD、IKVAV(配列番号10)、YIGSR(配列番号11)、EPDIM(配列番号12)、NKDIL(配列番号:13)、GRKRK(配列番号14)、KYGAASIKVAVSADR(配列番号15)、NGEPRGDTYRAY(配列番号16)、PQVTRGDVFTM(配列番号17)、AVTGRGDSPASS(配列番号18)、TGRGDSPA(配列番号19)、CTGRGDSPAC(配列番号20)及びFNcc(配列番号9)から;及び好ましくは、FNcc、GRKRK、IKVAV、RGD及びCTGRGDSPACから、より好ましくは、FNcc及びCTGRGDSPACから選択される細胞結合モチーフなどの細胞結合モチーフを含み;
FNccが、C1X1X2RGDX3X4X5C2であり;
X1、X2、X3、X4及びX5の各々は、システイン以外の天然アミノ酸残基から独立して選択され;C1及びC2は、ジスルフィド結合により結合している、
請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。 - (i)真核細胞を培養するための足場材料;及び(ii)該足場材料と統合して増殖する真核細胞;を含む細胞培養製品の製造方法であって、
(a)水不溶性マクロ構造物へと集合することができる絹タンパク質の水溶液を設けること、ここで、前記絹タンパク質は場合により細胞結合モチーフを含む;
(b)前記真核細胞のサンプルと前記絹タンパク質との水性混合物を調製すること、ここで、前記絹タンパク質は水性混合物中に溶解したままである;及び
(c)前記絹タンパク質を前記真核細胞の存在下で水不溶性マクロ構造物へと集合させ、それにより前記真核細胞を培養するための足場材料を形成させること、
を含む、前記方法。 - 前記マクロ構造物が請求項2における定義の通りであり;及び/又は
前記真核細胞が請求項3における定義の通りであり;及び/又は
前記絹タンパク質が請求項4〜7のいずれか一項における定義の通りである、
請求項8に記載の細胞培養製品の製造方法。 - (i)水不溶性マクロ構造物へと集合することができる絹タンパク質の水不溶性マクロ構造物である真核細胞を培養するための足場材料、ここで前記絹タンパク質は場合により細胞結合モチーフを含む;及び(ii)前記足場材料と統合して増殖する真核細胞を含む細胞培養製品。
- 請求項8〜9のいずれか一項に記載の方法により取得可能である又は取得される、請求項10に記載の細胞培養製品。
- 真核細胞培養のための足場材料の形成における、前記細胞の存在下での、水不溶性マクロ構造物へと集合することができる絹タンパク質の使用であって、前記足場材料が前記絹タンパク質の水不溶性マクロ構造物であり;前記絹タンパク質は場合により細胞結合モチーフを含む、前記使用。
- 前記マクロ構造物が請求項2における定義の通りであり;及び/又は
前記真核細胞が請求項3における定義の通りであり;及び/又は
前記絹タンパク質が請求項4〜7のいずれか一項における定義の通りである、
請求項12に記載の使用。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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