JP2013523174A - 方法及び組合せ - Google Patents
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Abstract
Description
−培養される真核細胞のサンプルを提供し;
−細胞スキャフォールド材に前記サンプルを適用し;及び
−そこに適用された細胞を有する前記細胞スキャフォールド材を細胞培養に適した条件下に維持する
ことを含む、真核細胞の培養方法を提供する。細胞スキャフォールド材はスパイダーシルクタンパク質のポリマーを含む。
−真核細胞のサンプルを提供し;
−細胞スキャフォールド材に前記サンプルを適用し;
−そこに適用された細胞を有する該細胞スキャフォールド材を細胞培養に適した条件下に維持し;及び
−前記細胞スキャフォールド材から細胞のサンプルを調製する
ことを含む、真核細胞の調製方法を提供する。細胞スキャフォールド材はスパイダーシルクタンパク質のポリマーを含む。
外皮系の細胞
角質化上皮細胞
表皮角化細胞(分化表皮細胞)
表皮基底細胞(幹細胞)
手指爪及び足指爪の角化細胞
爪床基底細胞(幹細胞)
髄質毛幹細胞
皮質毛幹細胞
角質毛幹細胞
角質毛根鞘細胞
ハクスレー層の毛根鞘細胞
ヘレン層の毛根鞘細胞
外部毛根鞘細胞
毛母細胞(幹細胞)
ウエット重層上皮細胞
角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道及び膣の重層扁平上皮の表面上皮細胞
角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道及び膣の基底細胞(幹細胞)
尿管上皮細胞(裏層膀胱及び尿管)
外分泌分泌上皮細胞
唾液腺粘膜細胞(多糖類リッチ分泌)
唾液腺漿液細胞(糖タンパク質酵素リッチ分泌)
舌のフォンエブネル腺細胞(味蕾を洗浄)
乳腺細胞(乳汁分泌)
涙腺細胞(涙分泌)
耳の耳道腺細胞(ロウ分泌)
エクリン汗腺暗細胞(糖タンパク質分泌)
エクリン汗腺明細胞(小分子分泌)
アポクリン汗腺細胞(臭分泌、性ホルモン感受性)
眼瞼のモル(Moll)細胞の腺(特化した汗腺)
皮脂腺細胞(脂質リッチの皮脂分泌)
鼻のボウマン腺細胞(嗅上皮を洗浄)
十二指腸のブルンネル腺細胞(酵素及びアルカリ粘液)
精嚢細胞(精子が泳ぐためのフルクトースを含有する、精液成分を分泌)
前立腺細胞(精液成分を分泌)
尿道球腺細胞(粘液分泌)
バルトリン腺細胞(膣液分泌)
リトレ細胞腺(粘液分泌)
子宮内膜細胞(炭水化物分泌)
呼吸及び消化管の単離された杯細胞(粘液分泌)
胃内壁粘液細胞(粘液分泌)
胃腺酵素源細胞(ペプシノーゲン細胞)
胃腺酸分泌細胞、壁細胞(塩酸分泌)
腸クロム親和性細胞様(ECL)細胞(ヒスタミンを放出)
膵腺房細胞(重炭酸塩及び消化酵素分泌)
小腸のパネート細胞(リソザイム分泌)
肺のII型肺細胞(サーファクタント分泌)
肺のクララ細胞
ホルモン分泌細胞
下垂体前葉細胞
成長ホルモン産生細胞
乳腺刺激ホルモン分泌細胞
甲状腺刺激ホルモン産生細胞
性腺刺激ホルモン産生細胞
副腎皮質刺激因子
メラノサイト刺激ホルモンを分泌する脳下垂体中葉細胞
巨大細胞の神経分泌細胞
オキシトシン分泌
バソプレシン分泌
腸管及び気道細胞
ランゲルハンス島に含まれる細胞:
アルファ細胞(グルカゴンを生成)、ベータ細胞(インスリン生成細胞)、デルタ 細胞(ソマトスタチン生成細胞)、pp細胞(膵臓ポリペプチドを生成)、イプシ ロン細胞(グレリンを生成)
セロトニンを分泌
エンドルフィンを分泌
ガストリンを分泌
セクレチンを分泌
コレシストキンを分泌
ボンベシンを分泌
甲状腺細胞
甲状腺上皮細胞
傍濾胞細胞
副甲状腺細胞
副甲状腺主細胞
好酸性細胞
副腎細胞
クロム親和性細胞
ステロイドホルモンを分泌(ミネラルコルチコイド類、アンドロゲン類及び糖コル チコイド類)
テストステロンを分泌する精巣のライディッヒ細胞
エストロゲンを分泌する卵胞の内卵胞膜細胞
プロゲステロンを分泌する破裂した卵胞の黄体細胞
顆粒膜黄体細胞
内卵胞膜細胞
傍糸球体細胞(レニン分泌)
腎臓の密集斑細胞
腎臓の極周囲細胞
腎臓のメサンギウム細胞
肝細胞(肝臓細胞)
白色脂肪細胞(脂肪細胞/芽細胞)
褐色脂肪細胞
肝臓脂質細胞
腎臓
腎糸球体壁細胞
腎糸球体上皮細胞
腎近位尿細管刷子縁細胞
腎集合管細胞
その他
I型肺細胞(肺の裏層エアスペース)
膵管細胞(房心細胞)
平滑筋導管細胞(汗腺、唾液腺、乳腺等のもの)
主細胞
間在細胞
導管細胞(精嚢、前立腺)
腸刷子縁細胞(微絨毛を有する)
外分泌腺線条導管細胞
胆嚢上皮細胞
精巣輸出管無線毛細胞
精巣上体主細胞
精巣上体基底細胞
微小血管内皮細胞
血管及びリンパ管の内皮有窓細胞
血管及びリンパ管の内皮連続細胞
血管及びリンパ管の内皮脾細胞
滑膜細胞(裏層関節腔、ヒアルロン酸分泌)
漿膜細胞(裏層の腹膜、胸膜及び心膜腔)
扁平細胞(耳の裏層外リンパ腔)
扁平細胞(耳の裏層内リンパ腔)
微絨毛を有する内リンパ嚢の円柱細胞(耳の裏層内リンパ層)
微絨毛のない内リンパ嚢の円柱細胞(耳の裏層内リンパ層)
暗細胞(耳の裏層内リンパ腔)
前庭膜細胞(耳の裏層内リンパ腔)
血管条基底細胞(耳の裏層内リンパ腔)
血管条周辺細胞(耳の裏層内リンパ腔)
クラウディウス細胞(耳の裏層内リンパ腔)
ベトヒャー細胞(耳の裏層内リンパ腔)
脈絡膜叢細胞(脳脊髄液分泌)
軟膜くも膜扁平細胞
眼の色素性毛様体上皮細胞
眼の非色素性毛様体上皮細胞
角膜内皮細胞
ペッグ細胞(Peg cell)(卵管のもの)
軌道線毛細胞
輸卵管線毛細胞
子宮内膜線毛細胞(メス)
精巣網線毛細胞(オス)
精巣輸出管線毛細胞(オス)
中枢神経系の線毛上衣細胞(裏層脳腔)
エナメル芽上皮細胞(歯のエナメル分泌)
耳の前庭器の半月面上皮細胞(プロテオグリカン分泌)
コルチ器官の歯間上皮細胞(有毛細胞を覆う蓋膜を分泌)
疎性結合組織線維芽細胞
角膜線維芽細胞(角膜実質細胞)
腱線維芽細胞
骨髄細網組織線維芽細胞
他の非上皮性線維芽細胞
周皮細胞
椎間板の随核細胞
セメント芽細胞/セメント細胞(歯根の骨類似セメント分泌)
象牙芽細胞/象牙細胞(歯の象牙質の分泌)
硝子軟骨細胞
線維軟骨細胞
弾性軟骨細胞
骨芽細胞/骨細胞
骨前駆細胞(osteoprogenitor cell)(骨芽細胞の幹細胞)
眼の硝子体の硝子質細胞(hyalocyte)
耳の外リンパ腔の星状細胞
肝星細胞(伊東細胞)
膵星細胞
骨格筋細胞
赤色骨格筋細胞(ゆっくり)
白色骨格筋細胞(早い)
中間骨格筋細胞(intermediate skeletal muscle cell)
筋紡錘の核嚢細胞
筋紡錘の核鎖細胞
衛星細胞(幹細胞)
心筋細胞
通常の心筋細胞
結節性心筋細胞
プルキンエ線維細胞
平滑筋細胞(様々なタイプ)
外分泌腺の筋上皮細胞
巨核球(血小板前駆体)
単球
結合組織マクロファージ(様々なタイプ)
上皮性ランゲルハンス細胞
破骨細胞(骨中)
樹状細胞(リンパ組織中)
ミクログリア細胞(中枢神経系中)
好中球顆粒球
好酸球顆粒球
好塩基球顆粒球
マスト細胞
ヘルパーT細胞
サプレッサーT細胞
細胞傷害性T細胞
ナチュラルキラーT細胞
B細胞
ナチュラルキラー細胞
網状赤血球
血液及び免疫系に関連した前駆体(様々なタイプ、例えば巨核球、骨髄芽球)
感覚変換器細胞
コルチ器官の聴覚内有毛細胞
コルチ器官の聴覚外有毛細胞
嗅上皮の基底細胞(嗅神経細胞の幹細胞)
低温変性一次感覚ニューロン
高温変性一次感覚ニューロン
表皮のメルケル細胞(タッチセンサー)
嗅覚受容神経
痛覚感受性一次感覚ニューロン(様々なタイプ)
眼の網膜の視細胞:
光受容杆体
眼の光受容青感性錐体細胞
眼の光受容緑感性錐体細胞
眼の光受容赤感性錐体細胞
自己受容性一次感覚ニューロン(様々なタイプ)
接触感応性一次感覚ニューロン(様々なタイプ)
I型頸動脈体細胞(血液pHセンサー)
II型頸動脈体細胞(血液pHセンサー)
耳の前庭器のI型有毛細胞(加速及び重力)
耳の前庭器のII型有毛細胞(加速及び重力)
I型味蕾細胞
自律神経細胞
コリン作動性神経細胞(様々なタイプ)
アドレナリン作動性神経細胞(様々なタイプ)
ペプチド作動性神経細胞(様々なタイプ)
感覚器官及び末梢ニューロン支持細胞
コルチ器官の内柱細胞
コルチ器官の外柱細胞
コルチ器官の内支持細胞
コルチ器官の外支持細胞
コルチ器官の境界細胞
コルチ器官のヘンゼン細胞
前庭器支持細胞
味蕾支持細胞
嗅上皮支持細胞
シュワン細胞
衛星細胞(封緘末梢神経細胞体)
腸グリア細胞
中枢神経系ニューロン及びグリア細胞
アストロサイト(様々なタイプ)
ニューロン細胞(かなり多くの種類、未だ十分には分類分けされていない)
オリゴデンドロサイト
紡錘状ニューロン
松果体細胞(メラトニン生成)
レンズ細胞
前レンズ上皮細胞
クリスタリン含有レンズ
水晶体線維細胞
メラニン形成細胞
網膜色素上皮細胞
卵原細胞/卵母細胞
精細胞
精母細胞
精祖細胞(精母細胞の幹細胞)
精子
卵胞細胞
セルトリ細胞(精巣中)
胸腺上皮細胞
胚性幹細胞
成体幹細胞(例えば、造血幹細胞、内皮幹細胞、上皮幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細 胞)
前駆細胞(神経前駆細胞、リンパ球前駆細胞、衛星細胞、内皮前駆細胞、骨膜前駆体、 膵前駆細胞、筋肉の衛星細胞、造血前駆細胞)
羊水幹細胞(多能性であり、脂肪生成細胞、骨原性細胞、筋原細胞、内皮細胞、肝細胞、 及びニューロン線細胞への分化が可能)
人工多能性幹細胞
消化器系:唾液腺、食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、直腸及び肛門を用いた、食物の消化及び処理。
内分泌系:視床下部、下垂体又は脳下垂体、松果体又は松果腺、膵臓、甲状腺、副甲状腺及び副腎(adrenals)、すなわち副腎(adrenal gland)等、内分泌腺により作成されるホルモンを使用する体内の情報交換。
排泄系:体液バランス、電解質バランス及び尿の排出に関連した、腎臓、尿管、膀胱及び尿道。
外皮系:皮膚、毛髪及び爪。
リンパ系:内皮を含む、リンパを移動させる血管及び結節及びリンパ、血流と組織との間のリンパの移動に関与する構造体。
免疫系:白血球、扁桃腺、咽頭扁桃腺、胸腺及び脾臓を用いた、病原体に対する防御。
筋系:筋肉を用いた運動
神経系:脳、脊髄、末梢神経及び神経を用いた、情報の収集、移動及び処理。
生殖器系:性器、例えば卵巣、ファロピウス管、子宮、膣、乳腺、精巣、精管、精嚢、前立腺及び陰茎。
呼吸器系:呼吸に使用される器官、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺及び横隔膜。
骨格系:骨、軟骨、靱帯及び腱を有する、構造体の支持及び保護。
スパイダーシルクタンパク質の反復断片から誘導される70〜300のアミノ酸残基の反復断片;
スパイダーシルクタンパク質のC末端断片から誘導される70〜120のアミノ酸残基のC末端断片;及び場合によっては
スパイダーシルクタンパク質のN末端断片から誘導される100〜160のアミノ酸残基のN末端断片
を含む。
QANTPWSSPNLADAFINSF(M/L)SA(A/I)SSSGAFSADQLDDMSTIG(D/N/Q)TLMSAMD(N/S/K)MGRSG(K/R)STKSKLQALNMAFASSMAEIAAAESGG(G/Q)SVGVKTNAISDALSSAFYQTTGSVNPQFV(N/S)EIRSLI(G/N)M(F/L)(A/S)QASANEV(配列番号:8)
を構成する。
L(AG)nL、例えばLA1G1A2G2A3G3A4G4A5G5L;
L(AG)nAL、例えばLA1G1A2G2A3G3A4G4A5G5A6L;
L(GA)nL、例えばLG1A1G2A2G3A3G4A4G5A5L;又は
L(GA)nGL、例えばLG1A1G2A2G3A3G4A4G5A5G6L
1.−培養される真核細胞のサンプルを提供し;
−細胞スキャフォールド材に前記サンプルを適用し;及び
−そこに適用された細胞を有する該細胞スキャフォールド材を細胞培養に適した条件下に維持する
ことを含む真核細胞の培養方法において、
前記細胞スキャフォールド材が、140〜600のアミノ酸残基からなり、
スパイダーシルクタンパク質の反復断片から誘導される70〜300のアミノ酸残基の反復断片;
スパイダーシルクタンパク質のC末端断片から誘導される70〜120のアミノ酸残基のC末端断片;及び場合によっては
スパイダーシルクタンパク質のN末端断片から誘導される100〜160のアミノ酸残基のN末端断片
を含むスパイダーシルクタンパク質のポリマーを含むことを特徴とする方法。
−細胞スキャフォールド材に、該サンプルを適用し;
−そこに適用された細胞を有する前記細胞スキャフォールド材を細胞培養に適した条件下に維持し;及び
−該細胞スキャフォールド材から細胞のサンプルを調製する
ことを含む真核細胞の調製方法において、
前記細胞スキャフォールド材が、140〜600のアミノ酸残基からなり、
スパイダーシルクタンパク質の反復断片から誘導される70〜300のアミノ酸残基の反復断片;
スパイダーシルクタンパク質のC末端断片から誘導される70〜120のアミノ酸残基のC末端断片;及び場合によっては
スパイダーシルクタンパク質のN末端断片から誘導される100〜160のアミノ酸残基のN末端断片
を含む、スパイダーシルクタンパク質のポリマーを含むことを特徴とする方法。
5.前記哺乳動物細胞が器官の主要組織から誘導される、項目4に記載の方法。
6.前記哺乳動物細胞が、幹細胞及びベータ細胞を含むランゲルハンス島からの細胞からなる群から選択される、項目4又は5に記載の方法。
7.前記細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、羊水幹細胞及び前駆細胞から選択され、さらに胚性幹細胞、成体幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選択される、項目6に記載の方法。
8.前記細胞が胚性幹細胞である、項目7に記載の方法。
9.前記細胞が、神経前駆細胞、間葉系前駆細胞及び造血前駆細胞からなる群から選択される前駆細胞である、項目7に記載の方法。
10.前記細胞が、造血、神経、間葉系、乳房、内皮、上皮及び嗅覚の幹細胞からなる群から選択され、特に造血、神経及び間葉系幹細胞からなる群から選択される成体幹細胞である、項目7に記載の方法。
11.前記細胞が、ランゲルハンス島由来の細胞、例えばベータ細胞である、項目6に記載の方法。
13.前記哺乳動物細胞が、少なくとも1のニューロスフェアとして提供される神経幹細胞である、項目10に記載の方法。
14.前記哺乳動物細胞が、少なくとも1のランゲルハンス島として提供されるベータ細胞である、項目11に記載の方法。
15.前記哺乳動物細胞が、例えば肝細胞、線維芽細胞、角化細胞及び内皮細胞からなる群から選択される体細胞である、項目1−5のいずれか1項に記載の方法。
16.前記細胞がヒト細胞である、任意の上述した項目に記載の方法。
NTは100〜160のアミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、該断片はスパイダーシルクタンパク質から誘導されるN末端断片であり、
REPは70〜300のアミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、該断片は、L(AG)nL、L(AG)nAL、L(GA)nL、及びL(GA)nGLからなる群から選択され、ここで、
nは2〜10の整数であり、
各個々のAセグメントは8〜18のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、0〜3のアミノ配列残基はAlaではなく、残りのアミノ酸残基はAlaであり;
各個々のGセグメントは12〜30のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、少なくとも40%のアミノ酸残基はGlyであり;
各個々のLセグメントは0〜20のアミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列であり;
CTは70〜120のアミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、該断片はスパイダーシルクタンパク質から誘導されるC末端断片である、上述した項目のいずれかに記載の方法。
19.前記スパイダーシルクタンパク質が細胞結合モチーフを有する、上述した項目のいずれかに記載の方法。
20.前記細胞結合モチーフが、少なくとも1のペプチド結合を介して、スパイダーシルクタンパク質の残りの部分にカップリングしているオリゴペプチドである、項目19に記載の方法。
21.前記オリゴペプチドが、スパイダーシルクタンパク質の残りの部分のN末端にカップリングしている、項目20に記載の方法。
22.前記オリゴペプチドが、RGD、RGE、IKVAV、YIGSR、EPDIM及びNKDILからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目20−21のいずれか1項に記載の方法。
23.前記細胞スキャフォールド材が、フィルム、泡、繊維及び繊維-メッシュからなる群から選択される物理的形態である、上述した項目のいずれかに記載の方法。
−細胞スキャフォールド材;
の組合せにおいて、
前記細胞スキャフォールド材が140〜600のアミノ酸残基からなり、
スパイダーシルクタンパク質の反復断片から誘導される70〜300のアミノ酸残基の反復断片;
スパイダーシルクタンパク質のC末端断片から誘導される70〜120のアミノ酸残基のC末端断片;及び場合によっては
スパイダーシルクタンパク質のN末端断片から誘導される100〜160のアミノ酸残基のN末端断片
を含む、スパイダーシルクタンパク質のポリマーを含むことを特徴とする組合せ。
26.前記哺乳動物細胞が器官の主要組織から誘導される、項目25に記載の組合せ。
27.前記哺乳動物細胞が、幹細胞及びベータ細胞を含むランゲルハンス島からの細胞からなる群から選択される、項目25又は26に記載の組合せ。
28.前記細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、特に人工多能性幹細胞、羊水幹細胞及び前駆細胞から選択され、さらに胚性幹細胞、成体幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選択される、項目27に記載の組合せ。
29.前記細胞が胚性幹細胞である、項目28に記載の組合せ。
30.前記細胞が、神経前駆細胞、間葉系前駆細胞及び造血前駆細胞からなる群から選択される前駆細胞である、項目28に記載の組合せ。
31.前記細胞が、造血、神経、間葉系、乳房、内皮、上皮及び嗅覚の幹細胞からなる群から選択される、特に造血、神経及び間葉系幹細胞からなる群から選択される成体幹細胞である、項目28に記載の組合せ。
32.前記細胞が、ランゲルハンス島からの細胞、例えばベータ細胞である、項目27に記載の組合せ。
34.前記哺乳動物細胞が、少なくとも1のニューロスフェアとして提供される神経幹細胞である、項目31に記載の組合せ。
35.前記哺乳動物細胞が、少なくとも1のランゲルハンス島として提供されるベータ細胞である、項目30に記載の組合せ。
36.前記哺乳動物細胞が、例えば肝細胞、線維芽細胞、角化細胞及び内皮細胞からなる群から選択される体細胞である、項目24−26のいずれか1項に記載の組合せ。
37.前記細胞がヒト細胞である、項目24−36のいずれか1項に記載の組合せ。
NTは100〜160のアミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、該断片はスパイダーシルクタンパク質から誘導されるN末端断片であり、
REPは70〜300のアミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、該断片は、L(AG)nL、L(AG)nAL、L(GA)nL、及びL(GA)nGLからなる群から選択され、ここで、
nは2〜10の整数であり、
各個々のAセグメントは8〜18のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、0〜3のアミノ配列残基はAlaではなく、残りのアミノ酸残基はAlaであり;
各個々のGセグメントは12〜30のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、少なくとも40%のアミノ酸残基はGlyであり;
各個々のLセグメントは0〜20のアミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列であり;
CTは70〜120のアミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、該断片はスパイダーシルクタンパク質から誘導されるC末端断片である、項目24−37のいずれか1項に記載の組合せ。
40.前記スパイダーシルクタンパク質が細胞結合モチーフを有する、項目24−39のいずれか1項に記載の組合せ。
41.前記細胞結合モチーフが、少なくとも1のペプチド結合を介して、スパイダーシルクタンパク質の残りの部分にカップリングしているオリゴペプチドである、項目40に記載の組合せ。
42.前記オリゴペプチドが、スパイダーシルクタンパク質の残りの部分のN末端にカップリングしている、項目41に記載の組合せ。
43.前記オリゴペプチドが、RGD、RGE、IKVAV、YIGSR、EPDIM及びNKDILからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目41−42のいずれか1項に記載の組合せ。
44.前記細胞スキャフォールド材が、フィルム、泡、繊維及び繊維-メッシュからなる群から選択される物理的形態である、項目24−43のいずれか1項に記載の組合せ。
組換えスパイダーシルクにおける造血及び間葉系幹細胞
その直接の微小環境からの好ましくない影響に対して極めて敏感であることが知られている造血幹細胞(HSC)と、種々の生物分解性の天然又は合成スキャフォールドに接着し、そこで増殖することが示されている間葉系幹細胞(MSC)を、上述のように、4RepCTを含む組換えスパイダーシルクマトリックスで培養した。HSCを4RepCTの発泡体で培養し、Falcon 1008プラスチック及びレトロネクチン被覆プレートで培養されたHSC:sと比較して、それらの分化能力及びそれらの表現型は維持されていた。MSCは、4RepCTで増殖させた場合のコントロールと比較して、類似した細胞数及び分化を示し、4RepCTのフィルム及び発泡体において増殖させた場合、中胚葉系列、例えば骨、軟骨及び脂肪細胞の細胞において分化能力を維持していた。
組換えスパイダーシルクタンパク質の発現
組換えスパイダーシルクタンパク質4RepCT(配列番号:2)を、先に記載したようにして産生させた(Hedhammarら (2008), 上掲)。簡潔に述べると、4RepCT発現のために、ベクターと共に、大腸菌.BL21(DE3)細胞(Merck Biosciences)を、カナマイシンを含むLB培地中において、30℃で、0.8−1のOD600になるまで増殖させ、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドで誘導させ、さらに室温で3時間、インキュベートした。その後、細胞を収集し、リゾチームとDNアーゼIが補填された20mMのトリス-HCl(pH8.0)に再懸濁させた。完全に溶解させた後、15000gで遠心分離した上清を、Niセファロース(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)が充填されたカラムに充填した。300mMのイミダゾールを用い、結合したタンパク質を溶出させる前に、カラムを広範囲に洗浄した。標的タンパク質を含む画分をプールし、20mMのトリス-HCl(pH8.0)で透析した。室温で1−2時間、1:1000(w/w)のトロンビン:融合タンパク質の比率を用いたタンパク質切断により、4RepCTをタグから放出させた。放出されたHis TrxHisタグを除去するために、切断混合物を第2のNiセファロースカラムに充填し、フロースルーを収集した。タンパク質含有量を280nmでの吸光度で測定した。
精製した4RepCTタンパク質を、上掲のStarkら(2007)に記載されたようにして、繊維中に自己組織化させた。ついで、非組織培養処理されたファルコン皿(Falcon 1008)での培養に使用する前に、繊維をより小さな小片に切断した。0.2−2.0mlのタンパク質溶液で、ファルコン1008皿を被覆し、空気乾燥させ、皿の底部に薄層の形成を可能にすることにより、フィルムを調製した。さらに、いくつかのファルコン1008皿を、タンパク質溶液を激しく攪拌した後に得られた発泡体で被覆し、24時間空気乾燥させ、皿の底部に3Dマトリックスを形成させた。137Cs源(Gammacell, Atomic Energy of Canada, Ottawa, Canada)により送達される280Gyのγ線に暴露することにより、繊維、フィルムまたは発泡体を有する皿を滅菌した。
健康なBalb/cマウスを殺し、大腿を取り除いた。骨髄(BM)細胞を、10mMのHEPESバッファー(HH; GIBCO)で緩衝されたハンクス平衡塩溶液を用い、大腿部から流した。BM細胞を、製造者の使用説明書に従い、系列細胞枯渇キット(Miltenyi Biotec)を用いた系列枯渇の後、又は直接使用し、3×105及び5×104細胞/皿にて、それぞれ、マウス幹細胞因子(mSCF、100ng/ml;Immunex, Seattle, WA)及びmIL-3 (30ng/ml;Genentech, San Francisco, CA)が補填された無血清DMEM(Wognumら (2000), Hum Gene Ther 11:2129-2141)において培養した。
4RepCTの存在下での培養の前後に、マウス骨髄細胞を、表現型分析のために収集した。簡潔に述べると、細胞を、0.5%(vol/vol)のウシ血清アルブミン(BSA;Sigma, St Louis, MO)、0.05%(wt/vol)のアジ化ナトリウム、及び0.45%(wt/vol)のグルコース(Merck, Darmstadt, Germany)(HBN)を含むハンクス緩衝HEPES溶液(HHBS)で2回洗浄し、モノクローナル抗体(MoAbs)の非特異的結合を防止するために、2%(vol/vol)の通常の熱失活マウス血清を含有する50μlのHBNに再懸濁させ、続いて、次の表面マーカー:c-kit、sca-1、CD4、CD8、CD11b及びB220(BD Biosciences, San Jose, CA)に対して生じたMoAbsと共に、30分インキュベートした。細胞をHBNで2回洗浄し、死亡細胞をヨウ化プロピジウム(PI、Sigma)に基づく分析から除去した。細胞サンプルをFACSCalibur フローサイトメーターを使用して測定し、10000のリストのモードイベントを収集し、Cellquestソフトウェア(BD Biosciences, San Jose, CA)を使用して分析した。
5×104のマウスBM細胞又は1×103の系列枯渇したBM細胞(lin−/−)を、濃縮DMEMに入った0.8%(wt/vol)のメチルセルロース(Methocel A4M Premium grade, Dow Chemical Co, Barendrecht, The Netherlands)、1%(wt/vol)のBSA、0.3mg/mlのヒトトランスフェリン、0.1μmol/lの亜セレン酸ナトリウム、1mg/lのヌクレオシド(シチジン、アデノシン、ウリジン、グアノシン、2'-デオキシシチジン、2'-デオキシアデノシン、チミジン、及び2'-デオキシグアノシン;Sigma)、0.1mmol/lのβ-メルカプトエタノール、15μmol/lのリノール酸、15μmol/lのコレステロール、10μg/mlのインスリン、100U/mlのペニシリン、及び100μg/mlのストレプトマイシンを含有する、1mlの無血清半固体状メチルセルロース培養培地にて、ファルコン1008(直径35mm)のペトリ皿に配した。顆粒球/マクロファージコロニー形成(CFU-GM)を、10ng/mlのmIL-3、100ng/mlのmSCF、及び20ng/mlのGM-CSFを添加することにより刺激し、培養の8-10日目にスコア化した。赤芽球バースト形成細胞(BFU-E)の成長は、100ng/mlのmSCF及び4U/mlのヒトエリスロポエチン(hEPO;Behringwerke, Marburg, Germany)により誘発させ、8-10日後に計測したが、赤芽球コロニー形成単位(CFU-E)の成長はhEPO単独で刺激し、2日後に計測した。巨核球前記細胞(CFU−-Meg)を、100ng/mlのmSCF、10ng/mlのmIL-3m、及び10ng/mlのmTPO(Genentech, San Francisco, CA)が補填された0.275の%寒天培地にて刺激した。10日後にコロニーを乾燥させ、アセチルコリンエステラーゼポジティブ細胞に対して染色し、数え上げた。
ヒトの間葉系幹細胞(hMSC)をLonza (Verviers, Belgium)から購入した。細胞を、54%のDMEM-LG、36%のMCDB-201、10%のFCS、1mMのL-グルタミン及び1%のペニシリン/ストレプトマイシン(Reyesら(2001), Blood 98:2615-2625)からなる完全培地-1(CM-1)において培養した。細胞をトリプシン処理し、コンフルエンスが80-90%に達した時に継代培養し、培地を3-4日毎にリフレッシュした。
脂質生成分化について、MSC:sを、DMEM-LG、10%のFCS、1μMのデキサメタゾン、60μMのインドメタシン、500μMのイソブチルメチルキサンチン(IBMX)及び5μg/mlのインスリン(Sigma, St. Louis, USA)からなる脂質生成培地の存在下、21日間培養し、オイルレッドO(Sigma, St Louis, USA)で染色した。骨原性分化について、MSC:sを、DMEM-LG、10%のFCS、100nMのデキサメタゾン、10mMのβ-グリセロホスファート及び0.2mMのアスコルビン酸(Sigma, St. Louis, USA)からなる骨原性培地において、21日間維持した。リン酸カルシウム沈着物の存在を確認するために、細胞をアリザリンレッドS(Sigma, St. Louis, USA)で染色した。軟骨形成分化について、2.5×105の細胞を15mlのポリプロピレンチューブに沈降させ、自発的に形成された3次元ペレットを、DMEM-HG(Gibco)、100nMのデキサメタゾン、10ng/mlのTGFβ3(Peprotech, USA)、50μg/mlのアスコルビン酸、50mg/mlのITS+プレミックス(Becton Dickinson, USA)からなる軟骨形成培地において、21日間培養した。ペレット切片を組織学的研究のために調製し、軟骨形成系列の確認のためにアルシアンブルーで染色した。
4RepCT繊維の存在下における幹細胞の増殖及び分化
2回実施される3つの別々の実験において、4RepCTの小片の有無での、マウス骨髄細胞の増殖を研究した。結果を、100ng/mlのmSCF及び30ng/mlのmIL-3が補填された無血清培地での、マウス骨髄(BM)細胞の増殖における、4RepCTの存在下で4日間培養した影響を示す、表3に提示する。計測された細胞は赤芽球コロニー形成単位(CFU-E);赤芽球バースト形成細胞(BFU-E);コロニー形成単位-顆粒球/マクロファージ(CFU-GM);及びコロニー形成単位-巨核球(CFU-Meg)である。コントロールウェルと比較して、4RepCT繊維の存在下で4日間の培養した後、細胞数と形成されたコロニーの量との間には、有意な差異は見いだされなかった。
結果を、3回の別々の実験の平均±標準偏差として表す。全ての実験は2回実施した。
11×105BM細胞当たりのコロニー
2細胞×105
S.I.:0日に対して比較される刺激指数値
マウス骨髄細胞を系列枯渇させ(lin−/−)、mSCF及びmlL-3を含有する無血清培地において、4RepCTの発泡体でコーティングされた培養皿にて培養した。培養の4日後、lin−/−BM細胞の増殖及びコロニー形成単位の数を、10μg/cm2の濃度で、組換えフィブロネクチン断片CH-296(レトロネクチン: RN; Takara Shuzo, Otzu, Japan)でコーティングされたファルコン1008皿及び非組織培養処理された皿(35mm、ファルコン1008)において培養された陰性細胞株列の培養物と比較した。インビトロ赤芽球バースト形成細胞(BFU-E);コロニー形成単位-顆粒球/マクロファージ(CFU-GM);及びコロニー形成単位-巨核球(CFU-Meg)の数について、結果を表4に示す。
2回実施した実験の1つの結果を示す。
11×105BM細胞当たりのコロニー
2細胞×105
S.I.:0日に対して比較される刺激指数値
3回実施した実験の1つの結果を示す。データは絶対細胞数×105として表す。
S.I.:0日に対して比較される刺激指数値
組換えスパイダーシルクにおけるヒト胚性幹細胞
本実験は、組換えスパイダーシルク材料でのヒト胚性幹細胞の培養の可能性を示す。
標準的な6-ウェル組織培養プレートを調製した。プレートにおいて、3つのウェルはRGD-4RepCTフィルムを含有し、残りの3つのウェルは空であった。細胞結合モチーフRGDを有する4RepCTフィルムを、本質的に実施例1に記載したようにして調製した。組織培養プレートをさらに使用するまで、室温で乾燥したままにした。
細胞培養実験から選択された画像を、図8−12に提示する。
組換えスパイダーシルクにおけるマウス胚性幹細胞
背景
マウス胚性幹細胞(mESCs)は、フィーダー依存性(すなわち、マウス胚性線維芽細胞、MEFの層において培養する必要がある)、又はフィーダー独立性(通常、ゼラチンで培養)のいずれかとすることができる。mESCは、未分化を維持するために、培養培地に存在するLIF(白血病抑制因子)と共に培養する必要がある。それらの分化状態(又は幹細胞性の維持)は、多能性細胞がAPを発現し、ポジティブ染色されるため、アルカリホスファターゼ活性(AP)染色により、又は1セットの分化マーカー(遺伝子)の転写を測定することにより、決定することができる。
継代17におけるフィーダー-依存性mESC(R1)を解凍し、20%の熱失活したES細胞認定FBS(Invitrogen, カタログ番号16141-079)及び5×105単位/mlのLIF(Chemicon, ESG 1107)が補填されたグルタマックス(Invitrogen, カタログ番号31966-021)を含有するDMEMにて、60mmのペトリ皿中のMEFの層(照射、1日培養)に配した。2日後、細胞を収集し、ここの実施例に記載されたようにして調製した種々の4RepCTスキャフォールド(4RepCTの発泡体及び繊維-メッシュ、及びRGD-4RepCTの発泡体及び繊維-メッシュ)、並びに12-ウェルプレートのコントロール(MEF又はゼラチン)に播種した。分割比は1:7であった。培地を毎日交換し、細胞を2日毎(MEF又はゼラチン)、又は4日毎(4RepCTスキャフォールド)に分割させた。ゆっくりと増殖するため、スキャフォールドにおいて成長する細胞については、より長い分割期間を使用した。細胞が多能性を維持しているかどうかを評価するために、細胞を、4%のパラホルムアルデヒドを用いて1分固定し、ついで、各継代(p19、p20及びp21)の終わり、又は継代21のスキャフォールド上の細胞については3日後(ゼラチン又はMEF上の細胞については2日後)に、アルカリホスファターゼ活性ついて染色した(VECTOR Laboratoriesのキット)。つまり、スキャフォールド上に維持されている細胞は、p21の終わりに、全体で4+4+3=11日培養されたが、ゼラチン又はMEF上で維持された細胞は、p21の終わりに、2+2+2=6日培養された。顕微鏡写真を反転顕微鏡にて撮った。
ゼラチン上で成長したmESCは分化し始め、形態を失ったが、MEF上で成長した細胞は、3継代後でも、丸いコロニー形態及び幹細胞性を維持していた。mESCは、MEFと比較して、全てのスキャフォールドタイプにおけるコロニー数が少なかったことが示されていることから、MEFに対する結合性と比較して、発泡体及び繊維-メッシュの双方への結合度合いの低さが提示された。スキャフォールド上で成長したコロニー数は、ゼラチン上で成長したコロニー数とほぼ同じであった。
mESCは、4RepCT及びRGD-4RepCTの発泡体及び繊維-メッシュに結合し、増殖することが示されている。4日後、4RepCT及びRGD4RepCTの発泡体及び繊維-メッシュにおけるmESCは、大きなコロニーである可能性のため、分化し始めた。しかしながら、これらの細胞が、新規に調製されたスキャフォールドに播種され、3日間培養された場合は、4RepCT及びRGD-4RepCTの発泡体において、それらの幹細胞性を維持しており、コロニーの大きさは、2日後にMEFにおいて見られたものと類似していた。4RepCTの発泡体と比較して、RGD-4RepCTの発泡体においては、ゆっくりとした成長が観察された。ゼラチンで2日間維持された細胞は分化し始め、MEF上のmESCも、大きなコロニー(過剰成長)であるために、4日後に分化し始めるであろう。4RepCTの発泡体において、付着性、成長性及び幹細胞性の維持は、ゼラチンと比較して改善していた。
mESCは通常、それらの幹細胞性を維持するために、MEFにより提供される因子に依存しているため、本結果は驚くべきことである。
組換えスパイダーシルクにおける神経幹細胞(NSC)
材料及び方法
スキャフォールドを含有するウェル及びポジティブコントロールウェルの調製
4RepCT、IKVAV-4RepCT及びRGD-4RepCTを組換え的に生成させ、Hedhammarら(2008),上掲の記載に類似させて精製した。得られたタンパク質溶液の一画分を、Hedhammarら(2010), Biomacromolecules 11:953-959に記載されたようにして、リポ多糖類(lps)から精製した。実施例1に記載したように、スキャフォールド(フィルム、発泡体又は繊維)の調製に使用する前に、タンパク質溶液を滅菌濾過した(0.22μm)。半分のスキャフォールドを、リポ多糖類が枯渇したタンパク質溶液から作製した。細胞培養プレートに配する前に、2.8バール、蒸留水において、121℃で15分、オートクレーブ処理することにより繊維を滅菌した。スキャフォールドを疎水性の6-ウェル細胞培養プレート(Sarstedt)において調製した。ポジティブコントロールとして、ポリ-L-オルニチン及びフィブロネクチン(PORN)でコーティングされたウェルを使用した。「野生型」4RepCTを有する6-ウェルプレートの概略を、以下に付与する。
−各ウェルに2mlのポリ-L-オルニチン溶液を添加
−37℃で、細胞培養インキュベーターにおいて一晩インキュベート
−吸入によりポリ-L-オルニチン溶液を除去
−細胞培養インキュベーターにおいて2-4時間インキュベート
−PBS1xで2回洗浄
−各プレートの6つのウェルの5つに、4RepCTフィルムを持つ3つの6-ウェルポリスチレンプレート(Sarstedt)。空のウェルと1つの付加的なウェルを、上述に従い、フィブロネクチン及びポリ-L-オルニチンで被覆した。これらのプレートを、48-96時間、未分化状態のNSC細胞を増殖させるのに使用され、その後、該細胞は星状細胞、オリゴデンドロサイト及びニューロンに分化する(以下参照)。
−コントロールプレート:1つの6-ウェルポリスチレンプレート(Sarstedt)。第1列を上述に従い、フィブロネクチン及びポリ-L-オルニチンで被覆し、第2列をBSA(ウシ血清アルブミン)で被覆し、第3列は被覆しないままにした。
−4RepCTフィルムを有する7つの35mmポリスチレンプレート(Sarstedt)を、細胞死の率及び割合を特異的にかつ性格に分析するために調製した。
培地:
N2培地(500ml)
DMEM:F12(1:1)+L-グルタミン(500mlボトル;Gibco 11320-074)
1mlの50mg/mlトランスフェリン(Sigma T-1147;DMEM:F12に希釈)
100μlの100μMプロゲステロン
50μlの1Mプトレシン溶液
30μlの500μM亜セレン酸ナトリウム
1mlの12.5mg/mlインスリン
5mlのPen/Strep(100×)溶液
N2培地は、一次(組織誘導された、非細胞株)細胞の培養のための標準培地である。
ハンクス(500ml)
50mlの10×HBSS(Gibco 14170)、1.85gのNaHCO3及び1.95gのddH2Oに溶解させたHEPES、pH7.2に調節。フィルター滅菌。
ddH2Oにポリ-L-オルニチン(15μg/ml)が入ったもの。フィルター滅菌(Sigma P-3655)
ddH2Oにフィブロネクチン(1μg/ml)が入ったもの。フィルター滅菌(Sigma F-1141)
NaOH(10mM)
ddH2Oにプトレシン(1M)が入ったもの(Sigma P-5780)
EtOHにプロゲステロン(100μM)が入ったもの(Sigma S-5261)
ddH2Oに亜セレン酸ナトリウム(500μM)が入ったもの(Sigma P-8783)
PBSにFGF(10μg/ml)が入ったもの(R&D Systems, rhFGF-basic)
0.02MのHClにインスリン(12.5mg/ml)が入ったもの。滅菌濾過(Sigma I-6634)
DMEM:F12にトランスフェリン(50mg/ml)が入ったもの。滅菌濾過(Sigma T-1147)
神経幹細胞(NSC)を、妊娠したスプラーグドーリーE15.5ラットの胚の解離大脳皮質から得た。NSC:sを、N2サプリメントに富む、1ml/962mM2の無血清DMEM:F12培地において培養し、ポリ-L-オルニチン/フィブロネクチンどコーティングされた細胞培養皿において増殖させた。80%コンフルエンスに達するまで、10ng/mlのFGF2細胞を使用し、細胞を増殖状態で維持し、実験に使用する前に、2回継代した。第2継代後に、細胞を150000細胞/cm2で播種し、48時間培養した。細胞が未分化のままであるかを決定するために、ネスチンで染色した。
免疫細胞化学について、培養物をPBSで1回洗浄し、20分間、10%ホルマリン(Sigma)で固定した。次に、細胞を、PBS+0.1%のトリトンX100で、3×5分洗浄した。一次抗体を4℃で一晩インキュベートした(PBSで抗体希釈1:500+0.1%のトリトンX100+0.1%のBSA)。
50μMの5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU;Invitrogen)を添加した15分後に、10%ホルマリンを使用して細胞を固定し、続いて、供給者の推奨に従い、免疫細胞化学を行った。
スキャフォールドに付着した生存細胞と死亡細胞を区別するために、生存/死亡キット(Invitrogen)を使用した。製造者の推奨に従い、アッセイを始める前に、予め暖めておいたPBS(37℃)で、プレートを2回すすいだ。アッセイにより、生細胞(緑色)及び死亡細胞(赤色)を同定することができた。
繊維-メッシュ、発泡体又はフィルムにおいて成長及び拡大した場合の、神経幹細胞の増殖性及び生存率、及び星状細胞、ニューロン及びオリゴデンドロサイトへの分化の可能性における実験。特に示さないならば、全ての実験は3回実施した(n=3)。
48−72時間後、NSCは、発泡体及びフィルムにおいて、正常に増殖した。ウェルにおいて、プラスチックの一部をフィルム及び発泡体の隣に暴露させ、細胞はフィルム及び発泡体においてのみ成長した。形態はコントロール培養(ポリ-L-オルニチン及びフィブロネクチン)とは区別できなかった。ネスチンで染色した時(播種の48時間後)、4RepCTにおけるNSCの外観は、ポリ-L-オルニチン及びフィブロネクチンにおいて成長した細胞のものとは区別できなかった(図14)。
スパイダーシルクスキャフォールドにおける、ランゲルハンス島(A)と単一ベータ細胞、単独(B)又は他の細胞(C)との組合せ
背景
ランゲルハンス島の移植は、重度のI型糖尿病の、広範囲に適用可能な処置を見いだすための、最も前途有望なアプローチの一つである。残念ながら、現在利用可能な手順は、膵臓細胞の機能及び生存性が失われるための、低い効率性に悩んでいる(Alejandroら(2008), Transplantation 86:1783-1788)。成功率の低さは不完全に理解されているが、移植前、島の単離中、細胞を包囲する環境は破壊され、血管新生及び神経支配の喪失、細胞外マトリックスとの相互作用の変化に至る。このことは、制限された生存性及び機能の主要原因であることに暗示されている(van der Windtら (2007), Xenotransplantation 14:288-297; Kilkenny and Rocheleau (2008), Mol Endocrinol 22:196-205)。外分泌部分とは異なり、膵臓の内分泌部分は、それらが所有する基底膜を生成しないが、むしろその周囲の環境に依存し、正しいニッチが重要であるかもしれないことを、再度示唆している(Otonkoskiら (2008), Diabetes Obes Metab 10 Suppl 4:119-127)。
組換えスパイダーシルクタンパク質、4RepCT(配列番号:2)を、実施例1に記載したようにして調製されたスキャフォールド構造体の形成において、本質的にHedhammarら (2008), 上掲に記載したように調製した。RGD、IKVAV、及びYIGSR等、細胞外マトリックスに関連した種々の細胞結合モチーフの導入により、又はトリペプチドRGEの導入により修飾された変異体の形態、又は元来の形態4RepCTに、材料を使用した。他の変異体には、スピドロインN末端ドメイン(NT)及びC末端His-タグが含まれ、NT4RepCTHis(配列番号:5)と命名されたタンパク質が生じる
ランゲルハンス島(ヒト及び齧歯動物)
ヒト及びマウスの島からの細胞、例えばベータ細胞
内皮細胞
間葉系幹細胞
細胞単離
ヒトランゲルハンス島を、修正半自動消化-濾過法を使用することにより、スエーデンのウプサラ大学の臨床免疫学部会にて単離し、その後、栄養補助剤及び10%のヒト血清を含有する、CMRL-1066培地で培養した(Johanssonら (2008), Diabetes 57:2393-2401)。
4RepCTスキャフォールドと組合せたヒト島(20島/ウェル)を、栄養補助剤と共に、CMRL-1066において培養した (Johanssonら, 上掲)。
4RepCT スキャフォールドと組合せた単一の島細胞及び齧歯動物島(10島/ウェル)を、補填されたRPMI-1640培地において培養した(Nyqvistら, 上掲)。
商業的に入手可能な、骨髄から誘導されたヒト間葉系幹細胞を得、よく知られている方式で、供給者の使用説明書に従い、培養物に維持した。
多数(10-25)の島を、コントロールとして通常の培養プラスチック、及び4RepCTスキャフォールドの種々の変異体及び細胞結合モチーフに配した。特定の島培地を使用し、4RepCT及び島を5日間培養した。この期間、付着した島を毎日計測した。2日毎に培地交換を実施し、インスリン放出性を5日目に研究した。その後、4RepCTスキャフォールド内の島を、2週間まで培養し、その際に島の生存性を分析した。ヒトドナーからの島を使用する一実施態様においては、島を12週間培養した。
個々の島及び島細胞の双方、ヒト及び齧歯動物の双方におけるシグナル伝達を、種々の4RepCT-ベースのスキャフォールドにおいて、種々の期間、種々の成長、機能及び生存促進条件下で、無傷の島又は島細胞を培養した後に研究した。島細胞の成長、機能及び生存性を、種々のシグナル伝達経路における特定の行程に対するバイオセンサー、及び種々の蛍光染料を用いてモニターした。いくつかの重要な事象をテストした:グルコース代謝、遊離のCa2+([Ca2+]i)の細胞質濃度、増殖、及びアポトーシス/壊死。例えば、ATP生成、エキソサイトーシス、及び刺激誘発性インスリン遺伝子転写についてテストすることもできる。
島及び4RepCTの移植(例えば眼の前房への移植)を、P. O. Berggren's laboratory (Speierら(2008), Nat Protoc 3:1278-1286; Speierら(2008), Nat Med 14:574-578)において開発された方法に従い実施した。この方法では、生理学的及び糖尿病状態の双方にある生存生物体における、細胞の生存性、機能及び組込みを研究するための方法として、角膜を使用した。
A)島の培養
野生型、又は種々の細胞外マトリックスに関連した細胞結合モチーフ(例えば、RGD、RGE、IKVAV及びYIGSR等)の導入により修飾された変異体の双方の4RepCTの使用は、単離後の膵島の機能及び生存性を維持するための最適な環境を定める可能性がある。
単一細胞(主としてベータ細胞)を、肥満マウスの膵臓のランゲルハンス島(n=3)、及びヒト島(n=1)から単離した。単一細胞を配し、種々の4RepCT(導入されたモチーフを有する繊維、発泡体及びフィルム:なし(野生型;WT)、RGD、RGE、IKVAV及びYIGSR)において、3-7日間培養した。
単一マウスベータ細胞、ヒト内皮細胞、及びヒト間葉系幹細胞を、導入されるモチーフ:なし(野生型;WT)、RGD、RGE、IKVAV及びYIGSRを有する、4RepCTの発泡体状スキャフォールドに、 単独又は組合せて配し、培養した。間葉系幹細胞は、単独で培養された場合、スキャフォールド構造体に付着し、それに沿って成長した(図29)。
種々の4RepCTスキャフォールド(種々の型式及びペプチドモチーフを有するもの)を用いた島の培養により、細胞レベルでの糖尿病の潜在的処置方法の開発に関する、基本的研究が可能になる。
組換えスパイダーシルクにおける内皮細胞
血管の成長は、再生医療における組織工学に必須である。内皮細胞は血管成長の原因であり、このプロセスにより、ある種の状況において、例えば創傷治癒が誘発される。体内では、器官及び組織に応じて、多くの異なる種類の内皮細胞が存在する。組織に密接に接触して存在する内皮細胞は、微小血管内皮細胞として知られてる。
商業的に入手可能な微小血管内皮細胞は、よく知られている方法で、供給者の使用説明書に従い、培養物から得られ、維持される。
細胞を、種々のスキャフォールド材に添加し、研究した。細胞において、増殖アッセイ及びBD経路アッセイ(BD Biosciences)を含む、様々なアッセイを実施した。例えば、細胞機能アッセイ、アポトーシス及び壊死の生存/死亡アッセイ、及び組織学的アッセイを実施することも可能である。組織培養処理されたプラスチックプレートをコントロールとして使用した。
結果を図31及び32に提示する。種々の4RepCTスキャフォールドと共に、培養物において、内皮細胞は付着し、成長した。培養の3日後、それらの形態を分析し、細胞量を計測した。形態分析には、細胞結合モチーフを有する又は有さない、種々の物理的形態の4RepCTスキャフォールド上の細胞は付着し、生存していることが示された(図31及び32)。
内皮細胞は生存可能であり、4RepCTスキャフォールドで成長可能で、そこで増殖能力を示した。
組換えスパイダーシルクにおける線維芽細胞
4RepCTから調製されたスキャフォールドが、一次線維芽細胞に依存して足場の成長を支持し、細胞が生存しており、物質に付着し、それらの主要機能の一つを維持しており、すなわちI型コラーゲンを分泌することを示す実験を実施した。4RepCTスキャフォールドでは、組織培養処理されたプラスチックと比較して、細胞成長を支持する能力の増加が示された。インテグリン結合モチーフRGDの導入により、この細胞の支持能力がさらに改善された。野生型4RepCTとRGD-4RepCTにおける成長は、双方とも、血清タンパク質に無関係であることが示された。
細胞培養
新生児由来の一次ヒト皮膚線維芽細胞、HDFn(ECACC/HPA)を、5%のウシ胎児血清(Gibco)、ペニシリン及びストレプトマイシン(National Veterinary Institute, SVA, Sweden)が補填された、ダルベッコの改変イーグル培地栄養混合物F12HAM(Sigma)において培養した(図34-36及び38-41)。平行実験において、(図37及び42)、一次ヒト線維芽細胞(SF-HDF、PromoCell)を、25μg/mlのアスコルビン酸(Sigma)、及び5mMのL-グルタミン(SVA)が補填された無血清細胞培養培地PC-1(Lonza, Belgium)において培養した。3000細胞/cm2又は15000細胞/cm2の密度で、細胞を4RepCTスキャフォールドに播種した。全ての実験を、37℃、5%のCO2、湿度95%にて、継代8(継代4で実施された、図36及び41の例外を有する)において実施した。
精製後、付加的なN末端細胞結合モチーフRGD、IKVAV及びYIGSR、又はトリペプチドRGEを有する又は有さない、組換え的に発現した4RepCT(Hedhammarら(2008), 上掲)を、遠心濾過(Amicon Ultra, Millipore)により濃縮し、実施例1の記載に従い、スキャフォールドを調製する前に滅菌濾過した(0.22μm)。同様に、組換えNT4RepCTHisを調製した。2.8バール、蒸留水において、121℃で15分、オートクレーブ処理することにより繊維を滅菌した。スキャフォールドを疎水性の96-ウェル細胞培養プレート(Sarstedt)、又は細胞培養チャンバーガラススライド(LabTek)において調製した。ネガティブコントロール(HP)としてスキャフォールドを有さないウェル、ポジティブコントロール(TCT)として組織培養処理されたプレートを使用した。
96-ウェルプレートスキャフォールドにおいて成長した細胞を、アラマーブルー細胞生存率アッセイ(Molecular Probes)を用い、培養期間中、2日毎にモニターした。細胞培養培地で1:10に希釈されたアラマーブルーと共にインキュベートして4時間後、励起544/発光595での蛍光強度を、蛍光プレートリーダー(FarCyte, TECAN)を用い、培養物からの上清100μlにおいて測定した。50-64000細胞/ウェルの範囲内の標準曲線を確立し、これにより、細胞数(生存細胞)に対する蛍光強度の再計算が可能になった。各スキャフォールドタイプを6回分析した。
チャンバースライドにおけるスキャフォールド上で培養された細胞を、培養期間中、3日毎に、生存/死亡細胞、フィラメントアクチン又はI型コラーゲンについて染色した。共焦点顕微鏡(Leica)、緑の蛍光:488nMで励起/500−530nMで検出、赤の蛍光:543nMで励起/620−660で検出)の条件下で染色を視察し、Leica共焦点ソフトウェア(LCS)で写真を撮った。
上清を、2日毎に培養物から収集し、1:10に希釈し、製造者の使用説明書に従い、I型プロコラーゲンC-ペプチドEIAキット(TAKARA)を使用し、細胞培養培地への分泌中、I型プロコラーゲン分子から切断されたC-ペプチドについて分析した。Sunriseプレートリーダー(TECAN)を用いてOD450を測定し、Magellanソフトウエアを用いたデータ管理を使用して、オリジナルサンプルにおけるC-ペプチドの濃縮を達成した。pgC-ペプチド分泌/細胞に対して、データを再計算した。
4RepCTから調製された細胞培養スキャフォールド
フィルム、発泡体、繊維及び繊維-メッシュスキャフォールドを、4RepCTタンパク質溶液から、成功裏に調製した(図33)。
培養の初位相後に、スキャフォールドウェルに存在する生存細胞の数が多いことによって示されるように、4RepCTスキャフォールドは、TCTと比較して、一次線維芽細胞の成長及び増殖を支持する能力が増加していることが提示された(すなわち、7日目からは低播種密度、5日目からは高播種密度、図34)。しかしながら、初位相において、細胞は、TCTと比較して、スキャフォールド上で、幾分ゆっくりと成長しているように見えた。発泡体状スキャフォールドにおける生存細胞の数は、フィルム及び繊維-ベースのスキャフォールドよりも一貫して少ない。しかしながら、発泡体状スキャフォールドの利用しやすいスキャフォールド領域は推定が困難であり、他のスキャフォールド型式に対する直接比較は不可能である。繊維又は繊維-メッシュスキャフォールド下で4RepCTを添加することにより、支持能力はさらに増加した(図35)。
また、我々は、SF-HDF(無血清条件下で増殖した一次ヒト線維芽細胞)が、培養物に血清が存在しなくても、4RepCTのフィルム状スキャフォールド上で成長可能であることを示した(図37)。これにより、材料と細胞の相互作用が、表面に非特異的に結合しする血清タンパク質に依存しないが、スキャフォールドそれ自体が、そこでの成長のために、細胞に適した表面を提供することを証明した。
周囲のマトリックスへ細胞が付着している間、フィラメントアクチンは、結合により媒介される、膜結合レセプターに結合している。細胞内フィラメントアクチンを染色することにより、細胞と基底物質との間の結合タンパク質を、間接的に可視化することができる。この方法を用いて、我々は、HDFnが、実際に繊維(図38、左側パネル)、繊維-メッシュ、フィルム(図38、右側パネル)及び発泡体のスキャフォールドに、初期及び後期培養(1、4、7、10日)の双方で結合することを示すことができた。さらに、フィラメントアクチンと組合せてビンクリンを染色することで、無血清条件下、野生型(WT)フィルム、RGD、IKVAV、YIGSR及びNRC(NT4RepCTHis)においてSF-HDFを3時間培養した後に、限局的付着を検出することができた(図43)。これらの結果には種々の基質に対するインテグリン-媒介性付着が示されている。
全て異なる型式の4RepCT、すなわちフィルム、発泡体、繊維及び繊維-メッシュのスキャフォールドにおいて増殖させる場合、細胞はI型コラーゲンを生成した。よって、細胞は、4RepCTスキャフォールド材におけるインビトロでの培養中、それらの重要な機能の一つを維持している。分泌されたコラーゲンのレベル(分泌中に切断されたC-ペプチドにより測定)は、培養の最初の5日間で、培養培地中で増加していた(図39、左側上部パネル)。しかしながら、細胞当たりに生成されたコラーゲンの量は、播種の24-72時間後に最大に達し、TCTと比較して、任意の4RepCTスキャフォールドにおいて成長する細胞に対し、この時点では高くなっていた(図39、右側上部パネル)。コラーゲンの細胞内生成は、播種の1、4、7及び10日後、全てのスキャフォールド型で同じような程度であることが示された(図39に示す実施例、下部パネル)。
4RepCTスキャフォールドでの培養後、線維芽細胞がそれらの表現型を維持していることを検証するために、培養の14日後に、スキャフォールドから細胞を収集し、I型コラーゲンの分泌を評価するためのTCT、又はI型コラーゲンの細胞内染色のためのガラスのいずれかに再播種した。このことを実施することで、線維芽細胞がI型コラーゲンを生成し(図40、下部パネル)、分泌しており(図40、上部パネル)、よって、4RepCTスキャフォールドにおける比較的長時間の培養後でさえ、それらの最も重要な機能の一つを失っていないことが示された。
アラマーブルー生存率実験からの予備データには、4RepCTへのRGDの導入により、それぞれ3及び1日目から、フィルム及び繊維-メッシュのスキャフォールドにおいて成長する、生存細胞の全数が増加していることが示されている。経時的に、すなわち7日目から、細胞数はTCTウェルに存在する細胞計測も超える。平行セットアップにおいては、無血清細胞培養システムを使用すると、血清の不在下でさえ、一次線維芽細胞の成長向上が、RGDを有さない4RepCTTと比較して、RGD-4RepCTフィルムで達成されることが示された。よって、RGDの導入により、足場依存性細胞の成長を支持する、スキャフォールドの能力を、極めて改善することができ、その効果は、細胞培養培地に存在する血清成分に依存しない。また、結果には、RGDモチーフがスキャフォールド表面に、適切に暴露されることが示されている。
組換えスパイダーシルクにおける角化細胞
4RepCTから調製されたフィルム状スキャフォールドが、一次角化細胞の成長を支持し、細胞が物質に付着し、それらの特徴的形態を維持していることを示すために、実験を実施した。野生型4RepCT及び機能化された4RepCTの双方においる成長が、血清タンパク質に依存しないことが示された。
ヒトの皮膚から単離された角化細胞を、角化細胞の成長用に設計された無血清セットアップである、栄養補助剤を含有する角化細胞SFM(Gibco)において培養した。伝統的には、細胞の収集後に、10%のウシ胎児を不活性トリプシンに添加し、再播種時での結合を確実にした。現在のセットアップにおいて、この血清付加を伴う又は伴わない平行実験を実施した。先の実施例に記載されたように、4RepCTの野生型又は機能化されたフィルム状スキャフォールドにおいて、角化細胞を継代4(10000細胞/cm2)で播種した。テストされる機能化には、一般的な細胞結合モチーフRGD及びIKVAVが含まれるが、一般的な細胞結合モチーフYIGSR、及び/又は角化細胞-特異的モチーフEPDIM及びNKDILを含めることもできる。角化細胞-特異的マーカーをさらに使用し、培養の終わりに表現型を確実に維持させ、分化状態、例えばケラチン(K1、K5、K10、K6/K16/K17)、フィラグリン、Tob、G6K12、gp80及びMRP-8を測定した。
一次ヒト角化細胞を、細胞結合モチーフを有する又は有さない、4RepCTフィルムにおいて、4日間培養した。細胞は生存しており、1〜4日間、細胞の数は増加した(図44)。それらは、全培養期間中、全ての物質において、角化細胞の特徴的形態を示した(図45)。野生型、RGD及びIKVAVフィルムにおいて、限局的付着が検出され(4日目に分析)、テストされた物質に対する、インテグリン-媒介性付着が示された(図46)。結果は、播種前の血清付加とは無関係であり、よって、細胞は、厳密には無血清状態下で物質に結合した。
組換えスパイダーシルクにおける一次肝細胞
肝臓は固有の機能を有する必須器官である。現在、急性肝不全、例えば肝臓ベースの代謝疾患、及び慢性肝疾患のケースは、肝移植又は肝細胞治療により救済されている。残念なことに、現在の有用な肝細胞治療は、例えば多くの細胞が失われ、肝細胞移植中に生着しないため、最適ではない。肝細胞の宿主として提供され、それらを適所に維持するスキャフォールドにより、移植前に、これらの細胞を全生着させることができる。これにより、肝移植の新規な方法が開けた。
齧歯動物の肝細胞を、連続した機械的振揺により、コラゲナーゼ処理された肝臓を消化して単離し、分離し、10%のFBSが補填されたRPMI-1640培地で培養した。
肝細胞は繊維状及びフィルム状スキャフォールドに付着した(図47)。
また、肝細胞は、4RepCTを用いた培養において生存可能であった。
組織工学用の組換えスパイダーシルクタンパク質スキャフォールド
実験では、4RepCTにより、インビボの脊髄損傷のアノックスを再生可能であることが予期される。播種された細胞を有さない4RepCTスキャフォールド、及びヒト神経細胞及びヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞の生着と組合せた4RepCTスキャフォールドの双方を使用した。組織学的及び行動学的分析を使用し、結果を記載した。
動物手術
ラットの体重は、手術時、170-200gであった。手術の30分前に、動物にアトロピン(0.05mg/kg、腹腔内、NM Pharma AB)を注射した。Hypnorm(クエン酸フェンタニル、0.22mg/kg、及びフルアニゾン、6.8mg/kg、Janssen Pharmaceutical)とドルミカム(ミダゾラム、3.4mg/kg、Hoffman-La Roche)の混合物を用いて、ラットに麻酔をかけた。ラットの体温をモニターし、手術手順を通して38℃に維持した。
同様の実験において、上述したような4RepCT繊維の移植を、ヒト神経幹細胞及びヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞の生着と組合せた。地方倫理委員会に承認されている手順に従い、中絶を依頼した女性に同意書を記入してもらった後、ヒトの所定の中絶から細胞を得た。
後肢の運動機能を研究するため、ラットをオープンフィールド(150×64cm)で運動させ、少なくとも4分間観察した。後肢の機能、関節の動き、足の位置、荷重負荷、協調運動性、及びトウクリアランスを評価し、Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) Locomotor Rating Scale (Bassoら(1995), J Neurotrauma 12:1-21, Basso (2004), J Neurotrauma 21:395-404を参照)に従い、評価した。テストをビデオ記録し、処置に対する予備知識のない、少なくとも2人の独立した観察者は、各ラットを評価した。手術前、及び手術の1、2、6、12及び18週後に、動物を評価した。
順行的追跡を、製造者の記載に従い、1週間、頭頂葉皮質の複数の部位に、ビオチニル化デキストランアミン(BDA、Neurotrace)を注射することにより実施した。逆行性追跡を、病変の脊髄の3−5mm尾側に、フルオロゴールドを注射することにより実施した。BDAを損傷の脊髄尾側で可視化させることで、脊髄病変を通過するコルチコ-脊髄下行アクソンが可視化され、フルオロゴールド標識されたニューロンを、下行赤核脊髄ニューロンの再成長の証拠として、脳幹の赤核についてスクリーニングした。
病変の18週後、最後の行動評価をした後、ラットに致死量の静脈鎮静剤を付与し、100mlの無Ca2+タイロード液、続いて400mlのリン酸で緩衝された4%パラホルムアルデヒド(PFA, Merck)を、上行大動脈を通してかん流させた。全脳幹と病変を含む4−5cmの脊柱を解剖し、同じ固定液において2時間、後固定させ、4℃で少なくとも24時間、10%のスクロース中に凍結保存した。ついで、脊髄を脊柱から丁寧に切断し、コード及び脳幹をTissue-Tekに包埋し、凍結し、クリオスタットにおいて10μmに薄片化し、ゼラチンコーティングされたスライドに搭載した。
器官型培養におけるアクソンの再生を支持する組換えスパイダーシルクタンパク質スキャフォールド
この実験では、4RepCTスキャフォールドが、アクソンの再生を支持し、先導可能であることが示されるであろう。脊髄と脳幹の小片を、エクスビボ培養物に維持した。2つのこのような組織片に結合する4RepCTのスキャフォールドを適用することにより、再生アクソンにより、間隙に架橋する十分な支持体が提供されるであろう。実験には、インビボでの脊髄損傷において、ダメージを受けた組織のアクソン成長及び修復を支持する、4RepCTスキャフォールドの有用性が示されるであろう。
組換えスパイダーシルクに対するヒト胚性幹細胞
本実験は、上述の実施例2として報告された研究で組み立てられた、組換えスパイダーシルク材料でのヒト胚性幹細胞の培養の可能性をさらに探究する。
標準的な6ウェル組織培養プレートを調製した。プレートにおいて、3つのウェルは、次の4RepCT変異体:RGD-4RepCT、RGE-4RepCT、IKVAV-4RepCT、YIGSR-4RepCT及びNT4RepCTHisの一つを含んでおり、各プレートの残りの3つのウェルは空であった。NT4RepCTHis、及びペプチドモチーフを有する4RepCTの全てのフィルムを、本質的に実施例1に記載したようにして調製した。全体で15のプレートを実験に含めた(各4RepCT変異体では3回を表す)。プレートをさらに使用するまで、室温で乾燥したままにした。
細胞培養実験から選択された画像を図48−52に提示する。
後続する継代も、改善された形態及び増殖を生じた。
全てのコントロールウェルは、使用されたコントロール培養条件下でこのhESC系で予期されるであろう特徴及び形態を示した。細胞株は、全ての4RepCT変異体に対し、適合の兆候を示した。4RepCT変異体における第1継代では、最初の接着性、増殖性及び培養形態は乏しかった。しかしながら、後続する増殖及び継代では、全ての変異体のためのポジティブアルカリホスファターゼ染色を用い、コロニーが未分化細胞の形態的特徴を示す結果となった。
Claims (17)
- −培養される真核細胞のサンプルを提供し;
−前記サンプルを細胞スキャフォールド材に適用し;及び
−そこに適用された細胞を有する前記細胞スキャフォールド材を細胞培養に適した条件下に維持する
ことを含む真核細胞の培養方法において、
前記細胞スキャフォールド材が、140〜600のアミノ酸残基からなり、
スパイダーシルクタンパク質の反復断片から誘導される70〜300のアミノ酸残基の反復断片;
スパイダーシルクタンパク質のC末端断片から誘導される70〜120のアミノ酸残基のC末端断片;及び場合によっては
スパイダーシルクタンパク質のN末端断片から誘導される100〜160のアミノ酸残基のN末端断片
を含む、スパイダーシルクタンパク質のポリマーを含み、
前記真核細胞が、幹細胞、及びベータ細胞を含むランゲルハンス島由来の細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞であることを特徴とする方法。 - −真核細胞のサンプルを提供し;
−前記サンプルを細胞スキャフォールド材に適用し;
−そこに適用された細胞を有する前記細胞スキャフォールド材を細胞培養に適した条件下に維持し;及び
−前記細胞スキャフォールド材から細胞のサンプルを調製する
ことを含む真核細胞の調製方法において、
前記細胞スキャフォールド材が、140〜600のアミノ酸残基からなり、
スパイダーシルクタンパク質の反復断片から誘導される70〜300のアミノ酸残基の反復断片;
スパイダーシルクタンパク質のC末端断片から誘導される70〜120のアミノ酸残基のC末端断片;及び場合によっては
スパイダーシルクタンパク質のN末端断片から誘導される100〜160のアミノ酸残基のN末端断片
を含むスパイダーシルクタンパク質のポリマーを含み、
前記真核細胞が、幹細胞、及びベータ細胞を含むランゲルハンス島からの細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞であることを特徴とする方法。 - −真核細胞;及び
−細胞スキャフォールド材
の組合せにおいて、
前記細胞スキャフォールド材が140〜600のアミノ酸残基からなり、
スパイダーシルクタンパク質の反復断片から誘導される70〜300のアミノ酸残基の反復断片;
スパイダーシルクタンパク質のC末端断片から誘導される70〜120のアミノ酸残基のC末端断片;及び場合によっては
スパイダーシルクタンパク質のN末端断片から誘導される100〜160のアミノ酸残基のN末端断片
を含むスパイダーシルクタンパク質のポリマーを含み、
前記真核細胞が、幹細胞、及びベータ細胞を含むランゲルハンス島からの細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞である
ことを特徴とする組合せ。 - 前記細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹細胞から選択される幹細胞である、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法又は組合せ。
- 前記細胞が胚性幹細胞である、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法又は組合せ。
- 前記細胞が、神経前駆細胞、間葉系前駆細胞及び造血前駆細胞からなる群から選択される前駆細胞である、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法又は組合せ。
- 前記細胞が、造血、神経、間葉系、乳房、内皮、上皮及び嗅覚の幹細胞からなる群から選択される、特に造血、神経及び間葉系幹細胞からなる群から選択される成体幹細胞である、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法又は組合せ。
- 前記細胞が、ランゲルハンス島由来の細胞、特にベータ細胞である、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法又は組合せ。
- 前記真核細胞が単一細胞として提供される、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法又は組合せ。
- 前記哺乳動物細胞が、少なくとも1のニューロスフェアとして提供される神経幹細胞である、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法又は組合せ。
- 前記哺乳動物細胞が、少なくとも1のランゲルハンス島として提供されるベータ細胞である、請求項8に記載の方法又は組合せ。
- 前記スパイダーシルクタンパク質が、式REP-CT及びNT-REP-CTにより定められるタンパク質の群から選択され、ここで、
NTは100〜160のアミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、該断片はスパイダーシルクタンパク質から誘導されるN末端断片であり、
REPは70〜300のアミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、該断片は、L(AG)nL、L(AG)nAL、L(GA)nL、及びL(GA)nGLからなる群から選択され、ここで、
nは2〜10の整数であり、
各個々のAセグメントは8〜18のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、0〜3のアミノ配列残基はAlaではなく、残りのアミノ酸残基はAlaであり;
各個々のGセグメントは12〜30のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、少なくとも40%のアミノ酸残基はGlyであり;
各個々のLセグメントは0〜20のアミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列であり;
CTは70〜120のアミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、該断片はスパイダーシルクタンパク質から誘導されるC末端断片である、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法又は組合せ。 - 前記スパイダーシルクタンパク質が細胞結合モチーフを含む、請求項1から12のいずれか1項に記載の方法又は組合せ。
- 前記細胞結合モチーフが、少なくとも1のペプチド結合を介して、スパイダーシルクタンパク質の残りの部分にカップリングしているオリゴペプチドである、請求項13に記載の方法又は組合せ。
- 前記オリゴペプチドが、スパイダーシルクタンパク質の残りの部分のN末端にカップリングしている、請求項14に記載の方法又は組合せ。
- 前記オリゴペプチドが、RGD、RGE、IKVAV(配列番号:23)、YIGSR(配列番号:24)、EPDIM(配列番号:25)及びNKDIL(配列番号:26)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項14又は15に記載の方法又は組合せ。
- 前記細胞スキャフォールド材が、フィルム、発泡体、繊維及び繊維-メッシュからなる群から選択される物理的形態である、請求項1から16のいずれか1項に記載の方法又は組合せ。
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