WO2017170180A1 - 神経分化能を亢進させる神経幹細胞用培地 - Google Patents

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松本　拓也
育恵 原田
将 千田
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味の素株式会社
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    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)

Definitions

  • the present invention relates to a culture medium and a culture method for neural stem cells and / or neural progenitor cells. More specifically, the present invention relates to a medium for enhancing the neural differentiation ability of neural stem cells and / or neural progenitor cells, a method for enhancing the neural differentiation ability of neural stem cells and / or neural progenitor cells using the medium, and the like. .
  • Neural stem cells are undifferentiated cells that have self-replicating ability and multipotency, and are various cells of the nervous system (neural cells and neural progenitors), and glial cells (astro). Cells, oligodendrocytes, etc.) and glial progenitor cells, etc.). Neural stem cells and neural progenitor cells are attracting attention as a source of biomaterials in regenerative medicine because they can transplant themselves and supply cells that are difficult to grow in normal adults such as nerve cells.
  • Neural stem cells are thought to be capable of producing functional neural cells in vivo when transplanted into a living body because they have proliferative and multi-differentiation potentials.
  • tumors can be obtained by transplanting proliferating neural stem cells.
  • the use of neural progenitor cells differentiated from neural stem cells in vitro in regenerative medicine has been studied.
  • proliferating cells are mixed into the prepared neural progenitor cells and remain. .
  • Non-Patent Document 1 describes that when human erythroleukemia cell line K562 cells, which are blood cells, are cultured in a glutamine-free medium, differentiation into erythrocytes is promoted.
  • Non-Patent Document 2 describes that when C6 glioma cells, which are rat glioma cells, are cultured in a glutamine-free medium, differentiation into oligodendrocyte-like cells is promoted.
  • An object of the present invention is to enhance a neural differentiation ability of neural stem cells and / or neural progenitor cells and a neural differentiation ability of neural stem cells and / or neural progenitor cells using the medium. Is to provide a method.
  • the present inventors have found that in a medium from which one or more amino acids selected from the group consisting of L-glutamine, L-asparagine and L-aspartic acid have been removed, It has been found that when stem cells are cultured, the proliferation ability of the cells is suppressed and the neuronal differentiation ability of the cells is enhanced.
  • a medium from which one or more amino acids selected from the group consisting of L-glutamine, L-asparagine and L-aspartic acid are removed neural stem cells can be passaged while maintaining enhanced neuronal differentiation ability. It was. When neural stem cells with enhanced neuronal differentiation ability were differentiated into neural cells, a population of neurons with low proliferative potential and a high proportion of differentiated cells was obtained. Based on these findings, further studies have been made and the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • (1) A culture medium for neural stem cells and / or neural progenitor cells substantially free of L-glutamine.
  • Any of (1) to (4), including L-tryptophan, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-threonine, L-valine, L-leucine, L-isoleucine and L-histidine A medium according to any one of the above.
  • the medium according to any one of (1) to (5) which is a medium for enhancing neural differentiation ability of neural stem cells and / or neural progenitor cells.
  • the medium according to any one of (1) to (6) which is a serum-free medium.
  • a method for culturing neural stem cells and / or neural progenitor cells comprising culturing neural stem cells and / or neural progenitor cells in the medium according to any one of (1) to (7).
  • the method according to (8) which is a method for producing neural stem cells and / or neural progenitor cells with enhanced neural differentiation ability.
  • a method for producing a neuron comprising the following steps: (I) culturing neural stem cells and / or neural progenitor cells in the medium according to any one of (1) to (7) to obtain neural stem cells and / or neural progenitor cells with enhanced neural differentiation ability; (II) Culturing the neural stem cells and / or neural progenitor cells obtained in step (I) with enhanced neural differentiation ability under conditions for inducing neural differentiation to obtain a neural cell population. (12) A neural stem cell and / or neural progenitor cell obtained by the method of (9) having enhanced neural differentiation ability. (13) A culture preparation comprising a neural stem cell and / or neural progenitor cell, and the medium according to any one of (1) to (7).
  • the medium of the present invention has an effect of enhancing the neural differentiation ability of neural stem cells and / or neural progenitor cells.
  • neural stem cells and / or neural progenitor cells are cultured by the culturing method of the present invention, neural stem cells and / or neural progenitor cells with suppressed proliferation ability but enhanced neural differentiation ability can be obtained. Since neural stem cells and / or neural progenitor cells with enhanced nerve differentiation ability produce many nerve cells by differentiation induction culture, it becomes possible to efficiently produce nerve cells. Further, since the neuron population produced in this way has few proliferating cells, the risk of tumor formation when the neuron is transplanted into the living body is reduced, and it can contribute to the development of a safer treatment method.
  • FIG. 1 is a graph showing an effect of promoting neuronal differentiation by an L-glutamine-removing medium.
  • Neural stem cells were cultured for 4 days in a medium containing L-glutamine (Full) or a medium not containing L-glutamine ( ⁇ Gln) (Day 4) (FIGS. 1A and B).
  • the proliferation of neural stem cells was reduced (FIG. 1B).
  • the medium was replaced with a neural differentiation induction medium and cultured for 21 days (Day 25), and the nerve cells were immunostained.
  • FIG. 1C shows the expression intensity of NeuroD1 and Synapsin1.
  • the left bar of each item indicates Full, and the right bar indicates ⁇ Gln.
  • the proliferation curve of neural stem cells cultured for 20 days in a medium not containing L-glutamine showed linearity (FIG. 1E).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of analysis of intracellular amino acid content. Horizontal axis: quantified amino acids, vertical axis: amino acid content per number of cells (nmol / 1 ⁇ 10 6 cells).
  • FIG. 3 is a diagram showing the organic acid content during the TCA cycle per cell number.
  • the left bar of each item indicates Full, and the right bar indicates ⁇ Gln.
  • FIG. 4 is a diagram showing apoptosis in neural stem cells.
  • the present invention relates to a culture medium for neural stem cells and / or neural progenitor cells (hereinafter collectively referred to as the medium of the present invention), a method for culturing neural stem cells and / or neural progenitor cells using the culture medium (hereinafter, These are also collectively referred to as the culture method of the present invention), and neural stem cells and / or neural progenitor cells and the like obtained by the method with enhanced neural differentiation ability are provided.
  • neural stem cells are multi-differentiation into neural cells (neural cells and glial cells (astrocytes, oligodendrocytes, etc.) and their progenitor cells). It means an undifferentiated cell that maintains multipotency and has the ability to self-replicate.
  • a neural stem cell is an epidermis as long as it has the ability to finally generate nerve cells and glial cells (astrocytes, oligodendrocytes, etc.) and no special manipulation such as initialization is applied.
  • It is a cell that does not substantially produce cells other than the nervous system such as system cells, blood cells, and muscle cells. “Substantially does not produce” refers to a state in which 90% or more of the cells produced by neural stem cells are either nerve cells or glial cells (astrocytes, oligodendrocytes, etc.) and their progenitor cells.
  • a neural progenitor cell is an undifferentiated cell having a division ability and a cell having an ability to finally differentiate into one or more types of nerve cells.
  • a neural progenitor cell refers to a cell that is destined to ultimately produce a neuronal cell and that does not substantially produce anything other than the neural cell and its progenitor cells.
  • a glial progenitor cell is an undifferentiated cell derived from a neural stem cell and having a dividing ability, and is one of astrocytes, oligodendrocytes, microglia, ependymal cells, Schwann cells or their progenitor cells. It refers to a cell that has the ability to differentiate into a cell and that does not substantially differentiate into a nerve cell.
  • neural stem cells and neural progenitor cells are difficult to distinguish strictly, they may be used interchangeably as “neural stem cells and / or neural progenitor cells” in this specification.
  • mammal-derived neural stem cells and / or neural progenitor cells are usually used.
  • mammals include rodents such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, rabbit eyes such as rabbits, ungulates such as pigs, cows, goats, horses, and sheep, cats such as dogs and cats, and humans Primates such as, monkeys, rhesus monkeys, marmosets, orangutans and chimpanzees, but are not limited to these.
  • the neural stem cells and / or neural progenitor cells used in the present invention are preferably rodents such as mice or primate neural stem cells and / or neural progenitor cells such as humans, more preferably human neural stem cells and / or Or it is a neural progenitor cell.
  • Neural stem cells and / or neural progenitor cells used in the present invention are those derived from pluripotent stem cells, those isolated from living tissues, or directly induced to differentiate from fibroblasts without passing through pluripotent stem cells ( Matsui T, et al., Stem Cells. 2012 Jun; 30 (6): 1109-19), etc., which are cells that maintain the undifferentiation and maintain the multipotency as described above and have the ability to generate neurons. There is no particular limitation as long as it is maintained.
  • the neural stem cells and / or neural progenitor cells used in the present invention are preferably derived from pluripotent stem cells, and more preferably derived from induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • a method for producing neural stem cells and / or neural progenitor cells from pluripotent stem cells a method known per se can be used.
  • a method for producing a pluripotent stem cell-derived neural stem cell and / or neural progenitor cell a method of forming a neural stem cell and / or neural progenitor cell via embryoid body formation by suspension culture of the pluripotent stem cell (Bain G et al., Dev Biol.
  • ES cells monolayer cultured pluripotent stem cells
  • GSK3 glycogen synthase kinase 3
  • TGF- ⁇ transforming growth factor ⁇
  • a pluripotent stem cell is an immature cell having self-renewal ability and differentiation / proliferation ability, and is a cell having the ability to differentiate into all tissues and cells constituting a living body excluding the placenta.
  • pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells) (Takahashi K et al., Cell. 2007 Nov 30; 131 (5): 861-72), sperm stem cells ( mGS cells) (Kanatsu-Shinohara M et al., Biol Reprod. 2007 Jan; 76 (1): 55-62), embryonic germ cells (Matsui Y et al., Cell. 1992 Sep 4; 70 (5): 841-7) Etc.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • mGS cells sperm stem cells
  • the cells are neural stem cells.
  • cells are suspended in a serum-free medium containing EGF and bFGF, and the cultured cell mass is subjected to a dispersion treatment, followed by adhesion culture in a differentiation-inducing medium described in Examples below. It can be confirmed using as an indicator that both nerve cells and glial cells are produced.
  • Neural stem cells can also be confirmed by a gene known to be expressed in neural stem cells, a transcription product thereof, a protein, etc. (neural stem cell marker).
  • neural stem cell markers examples include the cytoskeletal proteins nestin (Nestin; Science, 276, 66 (1997)), SOX1 (SEX (sex determining region Y) -box1), SOX2 (SRY (sex determining region Y)- box2), Pax6 (paired box 6), Ki67, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), fatty acid binding protein 7 (also referred to as Fabp7, BLBP), and the like, and those skilled in the art appropriately combine these markers to obtain a desired It can be confirmed that it is a neural stem cell.
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • Fabp7 fatty acid binding protein 7
  • a cell is a neural progenitor cell.
  • cells are cultured in suspension in a serum-free medium containing EGF and bFGF, and the cultured cell mass is dispersed in a differentiation-inducing medium described in the examples described later. When culture is performed, it can be confirmed as an index that neurons are produced and glial cells are not produced.
  • neural progenitor cells can be confirmed by a gene known to be expressed in neural progenitor cells, its transcription product, protein, etc. (neural progenitor cell marker). Examples of genes expressed in neural progenitor cells include, but are not limited to, Tbr2, MASH1, Nestin, NeuroD1, and the like. Those skilled in the art can confirm that the cells are neural progenitor cells by appropriately combining these markers. Examples of neural progenitor cells include, but are not limited to, cells that are SOX2 negative and nestin positive.
  • a neuron means a cell that is a functional unit of the nervous system.
  • Nerve cells usually consist of cell bodies and neurites (eg, axons, dendrites), but have neurites such as nascent juvenile neurons, retinal amacrine cells, and granulocytes of the olfactory bulb. There are also no neurons (nonpolar neurons). When neurons are classified according to their morphology, they are classified into nonpolar neurons, unipolar neurons, pseudo-unipolar neurons, bipolar neurons, and multipolar neurons. Include.
  • the nerve cell includes a central nervous system nerve cell and a peripheral nervous system nerve cell.
  • the nerve cell may be a motor nerve cell, a sensory nerve cell, or an intervening nerve cell.
  • neurons examples include dopaminergic neurons, noradrenergic neurons, adrenergic neurons, serotonergic neurons, acetylcholinergic neurons, ⁇ -aminobutyric acid neurons, glutamatergic neurons However, it is not limited to these.
  • Whether a cell is a nerve cell can be confirmed by a gene known to be expressed in the nerve cell, its transcription product, protein, etc. (nerve cell marker).
  • markers of differentiated neurons include MAP2 (microtubule associated protein 2), neurofilament, synapsin 1, ⁇ III tubulin, NeuN (neurospecific nuclear protein), FOX3 (Forkhead AM, PS) poly (neurally cellular cell adhesion molecule), Doublecortin, Peripherin and the like.
  • MAP2 microtubule associated protein 2
  • neurofilament neurofilament
  • synapsin 1 ⁇ III tubulin
  • NeuN neurospecific nuclear protein
  • FOX3 Formhead AM, PS
  • Doublecortin Doublecortin
  • Peripherin and the like.
  • the medium of the present invention contains L-glutamine (2-amino-4-carbamoylbutyric acid), L-asparagine (2-amino-3-carbamoylpropionic acid) and L -One or more amino acids selected from the group consisting of aspartic acid (2-aminobutanedioic acid) (herein, also referred to as "neural differentiation-related amino acid”) are characterized by being substantially free.
  • the selected “neurogenic differentiation-related amino acid” may be one (L-glutamine, L-asparagine, or L-aspartic acid) (in this case, the medium of the present invention is related to the other two types of neuronal differentiation). 2) (a combination of L-glutamine and L-aspartic acid, a combination of L-glutamine and L-aspartic acid, or a combination of L-asparagine and L-aspartic acid)
  • the medium may contain one other neuronal differentiation-related amino acid) and may be all three (L-glutamine, L-asparagine, and L-aspartic acid).
  • the present invention provides a medium characterized by being substantially free of any one amino acid selected from the group consisting of L-glutamine, L-asparagine and L-aspartic acid.
  • the medium of the present invention may contain either one or both of the other two types of neuronal differentiation-related amino acids that are not selected.
  • the medium of the present invention may be a medium for enhancing the neural differentiation ability of neural stem cells and / or neural progenitor cells.
  • By culturing neural stem cells and / or neural progenitor cells in the medium of the present invention it becomes possible to enhance the neuronal differentiation ability of the cells.
  • neural stem cells and / or neural progenitor cells cultured in the medium of the present invention are differentiated into neural cells, the number of proliferating cells in the resulting neural cell population is reduced. For this reason, it becomes possible to provide a nerve cell useful for nerve cell transplantation treatment, and a neural stem cell and / or a neural progenitor cell suitable for preparation of a nerve cell for nerve cell transplantation treatment can be provided.
  • the medium is substantially free of one or more amino acids selected from the group consisting of L-glutamine, L-asparagine, and L-aspartic acid
  • the medium is substantially free of one or more amino acids selected from the group consisting of L-glutamine, L-asparagine, and L-aspartic acid
  • standard medium amino acid concentration equivalent L-glutamine 0.3-3.0 mM (eg, 2.5 mM); L-asparagine 0.05-1.0 mM (eg, 0.05 mM) ); L-aspartic acid 0.05-1.0 mM (eg, 0.05 mM)) compared to when cultured in a control medium having the same composition except that it contains the selected neuronal differentiation-related amino acid.
  • the concentration of the selected neuronal differentiation-related amino acid in the medium is reduced enough to enhance the neuronal differentiation ability of neural stem cells and / or neural progenitor cells.
  • the medium is substantially free of L-glutamine
  • L-glutamine when neural stem cells and / or neural progenitor cells are cultured in the medium, L-glutamine is equivalent to a standard medium L-glutamine concentration (0 .Neural differentiation potential of neural stem cells and / or neural progenitor cells is enhanced compared to when cultured in a control medium having the same composition except for containing 3-3.0 mM (eg, 2.5 mM)) This means that the concentration of L-glutamine in the medium has been reduced to a sufficient extent. The same applies to other nerve differentiation-related amino acids.
  • substantially free of one or more amino acids selected from the group consisting of L-glutamine, L-asparagine and L-aspartic acid means not only the selected neuronal differentiation-related amino acids, Dipeptide for substitution of selected neuronal differentiation-related amino acid (a dipeptide containing a selected neuronal differentiation-related amino acid residue, which is degraded by peptidase or the like in the medium to supply the selected neuronal differentiation-related amino acid It also means that it does not contain a substance that provides the selected neuronal differentiation-related amino acid, such as a dipeptide).
  • substantially free of L-glutamine means not only L-glutamine but also dipeptides of L-glutamine and amino acids such as L-alanyl L-glutamine in the medium (substitute for L-glutamine) Is also substantially free of dipeptide for use.
  • substantially free of L-asparagine means that not only L-asparagine but also dipeptides for substitution of L-asparagine (eg, L-alanyl L-asparagine) are substantially contained in the medium. Means not included.
  • substantially free of L-aspartic acid means not only L-aspartic acid but also dipeptides for substitution of L-aspartic acid (eg, L-alanyl L-aspartic acid) in the medium. Is also substantially not included.
  • a medium substantially free of L-glutamine means that the concentration of L-glutamine in the medium (the total concentration of L-glutamine and a dipeptide for L-glutamine substitution) is usually 100 ⁇ M or less, preferably 10 ⁇ M or less. More preferably 100 nM or less, most preferably 0 nM.
  • a medium substantially free of L-asparagine means that the concentration of L-asparagine in the medium (the total concentration of L-asparagine and dipeptide for L-asparagine substitution) is usually 10 ⁇ M or less, preferably 100 nM or less More preferably 1 nM or less, most preferably 0 nM.
  • a medium substantially free of L-aspartic acid means that the concentration of L-aspartic acid in the medium (the total concentration of L-aspartic acid and L-aspartic acid-substituting dipeptide) is usually 10 ⁇ M or less. It refers to a medium that is preferably 100 nM or less, more preferably 1 nM or less, and most preferably 0 nM. In this specification, not including the selected neuronal differentiation-related amino acid means that the concentration of the neuronal differentiation-related amino acid is 0 nM.
  • neural differentiation ability means the ability of neural stem cells and / or neural progenitor cells to differentiate into neural cells.
  • the medium of the present invention has an effect of enhancing the neural differentiation ability of neural stem cells and / or neural progenitor cells.
  • “To enhance the neural differentiation ability of neural stem cells and / or neural progenitor cells” means that the concentration of the selected neural differentiation-related amino acids and the neural stem cells and / or neural progenitor cells cultured in the medium of the present invention are standard. Except for a medium amino acid concentration (L-glutamine 0.3-3.0 mM; asparagine 0.05-1.0 mM; aspartic acid 0.05-1.0 mM).
  • a medium amino acid concentration L-glutamine 0.3-3.0 mM; asparagine 0.05-1.0 mM; aspartic acid 0.05-1.0 mM.
  • Neural stem cells and / or neural progenitor cells also simply referred to as comparative control cells in the present specification
  • cultured in a comparative control medium having cultured under neuronal differentiation conditions for example, in the presence of N2 and B27.
  • the number of nerve cells generated from the neural stem cells and / or neural progenitor cells per fixed number of cells is greater than that of the control, or for a certain period after the start of culture. Number nerve cells produced before reaching the means that more than a comparative control.
  • “enhance neural differentiation ability of neural stem cells and / or neural progenitor cells” means neural stem cells cultured in the medium of the present invention and / or The composition of the present invention is the same as that of the medium of the present invention except that the neural progenitor cells and the L-glutamine concentration are equivalent to the standard medium L-glutamine concentration (0.3-3.0 mM (eg, 2.5 mM)).
  • neural cells are produced by culturing neural stem cells and / or neural progenitor cells cultured in a comparative control medium having neural cell differentiation conditions (for example, in the presence of N2 and B27), one neural stem cell and / or Or, it means that the number of nerve cells generated from neural progenitor cells is larger than that of the comparison control, or that the number of nerve cells produced from the start of culture until reaching a certain period is larger than that of the comparison control.
  • the medium of the present invention is not particularly limited as long as the components other than the selected neuronal differentiation-related amino acid can achieve enhancement of the neuronal differentiation ability of neural stem cells and / or neural progenitor cells, and normal neural stem cells and / or A composition used for maintenance culture of neural progenitor cells can be appropriately employed.
  • the medium of the present invention may be prepared as a basal medium obtained by removing selected nerve differentiation-related amino acids from the composition of a medium usually used for culturing mammalian cells.
  • the basal medium is not particularly limited as long as the desired effect can be achieved.
  • BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium , ⁇ MEM medium, DMEM medium, F-12 medium, DMEM / F12 medium, IMDM / F12 medium, ham medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, or a mixed medium thereof can be used for culturing animal cells.
  • a medium can be mentioned.
  • a basal medium what removed the neuronal differentiation related amino acid selected from the composition of the medium normally used for pluripotent stem cell culture
  • StemFit registered trademark
  • AK medium Alkaolin
  • Essential 8 medium Life Technologies
  • mTeSR1 medium STMCELL Technologies (STEMCELL Tech), TeSR2 technology (STEMCELLH technologies)) StemCells, Inc.
  • TeSR TM -E6 StemCells, Inc.
  • TeSR TM -E6 StemCells, Inc.
  • TeSR TM -E6 StemCells, Inc.
  • TeSR TM -E6 StemCells, Inc.
  • TeSR TM -E6 StemCells, Inc.
  • TeSR TM -E6 StemCells, Inc.
  • TeSR TM -E6 StemCells, Inc.
  • TeSR TM -E6 StemCells, Inc.
  • TeSR TM -E6 StemC
  • the medium of the present invention is preferably a chemically defined medium (CDM) whose components are chemically determined from the viewpoint of avoiding mixing of chemically undecided components.
  • the medium of the present invention is preferably a serum-free medium from the viewpoint of avoiding contamination with chemically undetermined components.
  • the “serum-free medium” in the present invention means a medium that does not contain unconditioned or unpurified serum.
  • a medium containing a purified blood-derived component or animal tissue-derived component for example, a growth factor such as bFGF
  • a growth factor such as bFGF
  • the serum-free medium may contain a serum replacement.
  • serum substitutes include serum albumin, fatty acids, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol or 3 ′ thiolglycerol, or equivalents thereof as appropriate.
  • a serum replacement can be prepared, for example, by the method described in WO98 / 30679.
  • a commercially available product may be used as a serum substitute.
  • examples of such commercially available serum substitutes include Knockout TM Serum Replacement (manufactured by Life Technologies: hereinafter referred to as KSR), Chemically-defined Lipid concentrated (manufactured by Life Technologies, Life Technologies). N2 (Life Technologies), but is not limited thereto.
  • the medium of the present invention contains all essential amino acids (L-leucine, L-lysine, L-phenylalanine, L-isoleucine, L-threonine, L-histidine, L-methionine, L-tryptophan and L-valine). Including.
  • the concentration of the essential amino acid contained in the medium of the present invention is exemplified below, although it is not particularly limited as long as enhancement of neural differentiation ability of neural stem cells and / or neural progenitor cells can be achieved: L-leucine 0.005-100 mM, preferably 0.5-20 mM; L-lysine 0.005-100 mM, preferably 1-20 mM; L-phenylalanine 0.005-100 mM, preferably 0.5-10 mM; L-isoleucine 0.005-100 mM, preferably 0.5-20 mM; L-threonine 0.005-100 mM, preferably 0.5-10 mM; L-histidine 0.005-100 mM, preferably 0.5-10 mM L-methionine 0.005-100 mM, preferably 0.5-5 mM; L-tryptophan 0.005-100 mM, preferably 0.05-1 mM; L-valine 0.005-100 m
  • the concentration combinations of each essential amino acid include L-leucine 0.005-100 mM, L-lysine 0.005-100 mM, L-phenylalanine 0.005-100 mM, L-isoleucine 0.005-100 mM, L-threonine 0 .005-100 mM, L-histidine 0.005-100 mM, L-methionine 0.005-100 mM, L-tryptophan 0.005-100 mM, and L-valine 0.005-100 mM, but not limited thereto .
  • the medium of the present invention comprises all essential amino acids (L-leucine 0.5-20 mM, L-lysine 1-20 mM, L-phenylalanine 0.5-10 mM, L-isoleucine 0.5-20 mM, L -Threonine 0.5-10 mM, L-histidine 0.5-10 mM, L-methionine 0.5-5 mM, L-tryptophan 0.05-1 mM and L-valine 0.5-10 mM).
  • essential amino acids L-leucine 0.5-20 mM, L-lysine 1-20 mM, L-phenylalanine 0.5-10 mM, L-isoleucine 0.5-20 mM, L -Threonine 0.5-10 mM, L-histidine 0.5-10 mM, L-methionine 0.5-5 mM, L-tryptophan 0.05-1 mM and L-valine 0.5-10 mM).
  • the medium of the present invention preferably contains all non-essential amino acids (L-alanine 0.2-2 mM, L-arginine 1-10 mM, glycine 1-10 mM, other than L-glutamine, L-asparagine and L-aspartic acid, L-glutamic acid 0.5-10 mM, L-cysteine 0.5-10 mM, L-serine 0.5-10 mM, L-tyrosine 0.5-10 mM, L-proline 0.5-5 mM).
  • non-essential amino acids L-alanine 0.2-2 mM, L-arginine 1-10 mM, glycine 1-10 mM, other than L-glutamine, L-asparagine and L-aspartic acid, L-glutamic acid 0.5-10 mM, L-cysteine 0.5-10 mM, L-serine 0.5-10 mM, L-tyrosine 0.5-10 mM, L-proline
  • the concentration of L-glutamine in the medium is 0.3-3.0 mM. Is preferred.
  • the concentration of L-asparagine in the medium is 0.05-1.0 mM. Is preferred.
  • the concentration of L-aspartic acid in the medium is 0.05-1.0 mM. It is preferable.
  • the medium of the present invention may contain a natural amino acid such as L-cystine in addition to the amino acid described above.
  • the medium of the present invention may further contain a medium additive.
  • medium additives include vitamins, proteins such as cytokines and growth factors, L-ascorbic acid, L-ascorbyl magnesium phosphate, sodium pyruvate, 2-aminoethanol (ethanolamine), glucose, sodium bicarbonate, HEPES, Insulin, progesterone, sodium selenate, putrescine and the like are exemplified, but not limited thereto.
  • the additive is preferably contained within a concentration range known per se.
  • the medium of the present invention may or may not contain L-ascorbic acid.
  • the medium of the present invention may further contain holotransferrin.
  • Transferrin bound to iron is called holotransferrin
  • transferrin not bound to iron is called apotransferrin.
  • holotransferrin includes a molecule in which one molecule of apotransferrin and one iron ion are bound, and a molecule in which one molecule of apotransferrin and two iron ions are bound.
  • the concentration of holotransferrin contained in the medium is not particularly limited as long as a desired effect such as enhancement of neural differentiation ability of neural stem cells and / or neural progenitor cells can be achieved, 0.01 to 100 ⁇ g / ml, preferably 0.1 to 6.5 ⁇ g / ml, more preferably 0.1 to 5 ⁇ g / ml.
  • a nucleic acid sequence encoding human transferrin includes NM_001063 (NCBI Accession No.), and an amino acid sequence of human transferrin includes, but is not limited to, NP_001054.
  • a commercially available reagent Sigma Aldrich
  • the medium of the present invention may contain a growth factor (for example, EGF: 10 to 100 ng / mL, bFGF: 10 to 100 ng / ml, etc.) used for subculture of neural stem cells and / or neural progenitor cells. .
  • a growth factor for example, EGF: 10 to 100 ng / mL, bFGF: 10 to 100 ng / ml, etc.
  • the medium of the present invention may contain a fatty acid.
  • Fatty acids contained in the medium of the present invention include oleic acid, linoleic acid, ⁇ -linolenic acid, ⁇ -linolenic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidonic acid, icosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, butyric acid, acetic acid, palmitoleic acid, Herbic acid (valeric acid), caproic acid, enanthic acid (heptylic acid), caprylic acid, pelargonic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid, pentadecylic acid, margaric acid, xenoic acid, eleostearic acid, arachidic acid, 8, Examples thereof include, but are not limited to, 11-eicosadienoic acid, 5,8,11-eicosatrienoic acid, behenic acid, lignoceric acid,
  • the medium of the present invention contains sodium bicarbonate, selenium, transferrin, insulin, bFGF and 2-aminoethanol in a basal medium that does not contain selected neuronal differentiation-related amino acids (eg, L-glutamine, asparagine, or aspartic acid).
  • selected neuronal differentiation-related amino acids eg, L-glutamine, asparagine, or aspartic acid.
  • the pH of the medium of the present invention is preferably about 5.0 to about 8.5, more preferably about 6.0 to about 8.0.
  • the medium is preferably subjected to sterilization such as filtration sterilization using a membrane filter or the like.
  • the form of the medium of the present invention is not particularly limited as long as the desired effect of the present invention can be obtained, and can be prepared, for example, as a liquid medium, a semi-fluid medium, and a solid medium. Moreover, you may prepare the culture medium of this invention as a powder form. By preparing the powder form, transportation and storage can be extremely easy. Such a powdered medium can be easily converted into a liquid medium by adding sterilized water or the like immediately before use and sterilizing with a membrane filter or the like as necessary.
  • the medium of the present invention can be used for any culture method such as adhesion culture, suspension culture, embedded culture, tissue culture and the like.
  • the present invention includes culturing neural stem cells and / or neural progenitor cells in the medium of the present invention described above, and culturing neural stem cells and / or neural progenitor cells.
  • a method also referred to herein as the culture method of the present invention is provided.
  • the culture method of the present invention is preferably a method for producing neural stem cells and / or neural progenitor cells having enhanced neural differentiation ability.
  • the concentration of one or more amino acids selected from the group consisting of L-glutamine, L-asparagine and L-aspartic acid in the medium is By reducing the concentration to “not included” and then culturing, the neural differentiation ability of neural stem cells and / or neural progenitor cells can be enhanced.
  • the present invention can also be regarded as a method for enhancing the neural differentiation ability of such neural stem cells and / or neural progenitor cells.
  • the concentration of the selected nerve differentiation-related amino acid can be reduced by switching the medium used for culture from a medium containing the selected nerve differentiation-related amino acid at a predetermined concentration to the medium of the present invention.
  • the medium before switching is diluted about 10-fold. If the medium is exchanged by a normal operation, the amount of the medium before the exchange is estimated to be about 1/100 volume at most. For example, the medium after switching is immediately after the medium switching to several hours later. By substituting with, it is estimated that the medium containing the neuronal differentiation-related amino acid is diluted at least about 1,000 times.
  • general maintenance media for pluripotent stem cells and neural stem cells include L-glutamine of about 0.3 to 3.0 mM, L-asparagine of about 0.05 to 1.0 mM, L -Aspartic acid is contained in an amount of about 0.05 to 1.0 mM. Therefore, for example, neural stem cells and / or neural progenitor cells are maintained and cultured in a medium containing L-glutamine at a concentration of 0.3 to 3.0 mM, and the medium is substantially free of L-glutamine.
  • the L-glutamine concentration is from 0.3 to 3.0 mM, for example, 100 ⁇ M or less, preferably 10 ⁇ M or less, more preferably 100 nM or less, even more preferably. Is 1 nM or less, and is most preferably reduced to 0 nM to enhance the neural differentiation ability of neural stem cells and / or neural progenitor cells. Further, for example, neural stem cells and / or neural progenitor cells are maintained and cultured in a medium containing L-asparagine at a concentration of 0.1 to 1.0 mM, and the medium is substantially free of L-asparagine.
  • the L-asparagine concentration is from 0.1 to 1.0 mM, for example, 10 ⁇ M or less, preferably 100 nM or less, more preferably 1 nM or less. Preferably, it is reduced to 0 nM to enhance the neural differentiation ability of neural stem cells and / or neural progenitor cells. Further, neural stem cells and / or neural progenitor cells are maintained and cultured in a medium containing L-aspartic acid at a concentration of 0.1 to 1.0 mM, and the medium is substantially free of L-aspartic acid.
  • the L-aspartic acid concentration is from 0.1 to 1.0 mM, for example, 10 ⁇ M or less, preferably 100 nM or less, more preferably 1 nM or less. Most preferably, it is reduced to 0 nM to enhance the neural differentiation ability of neural stem cells and / or neural progenitor cells.
  • the neural stem cells and / or neural progenitor cells used in the culture method of the present invention are preferably isolated. “Isolation” means that an operation to remove a target component or a factor other than cells has been performed, and the state existing in nature has been removed.
  • the purity of “isolated neural stem cells and / or neural progenitor cells” is usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably Is 90% or more, more preferably 99% or more, and most preferably 100%.
  • the concentration of neural stem cells and / or neural progenitor cells in the medium is not particularly limited as long as it has a desired effect, but is usually 5 ⁇ 10 3 to 10 5 cells / cm 3 , preferably 10 4 to 3 ⁇ 10 4 pieces / cm 3 .
  • the culture conditions in the culture method of the present invention are not particularly limited as long as the desired effect can be achieved, except that the medium of the present invention is used, and normal neural stem cells and / or nerves are used depending on the purpose of the culture. Culture conditions used for culturing progenitor cells can be appropriately employed.
  • the incubator used for culturing the cells is not particularly limited as long as the desired effect can be achieved.
  • Flask, tissue culture flask, dish, petri dish, tissue culture dish, multi-dish examples thereof include a microplate, a microwell plate, a multiplate, a multiwell plate, a microslide, a chamber slide, a petri dish, a tube, a tray, a culture bag, and a roller bottle.
  • the incubator used for cell culture may be cell-adhesive or non-cell-adhesive, and is appropriately selected according to the purpose.
  • the cell-adhesive incubator is coated with any cell-supporting substrate such as an extracellular matrix (ECM) or an artificial material that mimics their functions for the purpose of improving the adhesion with cells on the surface of the incubator. Can be.
  • ECM extracellular matrix
  • the culture temperature is not particularly limited as long as the desired effect can be achieved, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is about 1-10%, preferably about 2-5%.
  • the oxygen concentration is usually 1 to 40%, but is appropriately selected depending on the culture conditions.
  • neural stem cells and / or neural progenitor cells can be cultured by a method known per se such as adhesion culture, suspension culture, tissue culture and the like.
  • the period for culturing neural stem cells and / or neural progenitor cells in the culture method of the present invention is usually 2 days or more, preferably, as long as a desired effect such as enhancement of neural differentiation ability can be achieved. Is 4 days or longer, more preferably 8 days or longer.
  • the neural stem cells and / or neural progenitor cells may be dispersed by a method known per se. Examples of the method for dispersing the cells include treatment with a chelating agent (eg, EDTA), an enzyme (eg, trypsin, collagenase) and the like, and mechanical dispersion (eg, pipetting).
  • the present invention cultivates neural stem cells and / or neural progenitor cells in the above-mentioned medium of the present invention, followed by differentiation induction culture into neural cells.
  • a method for producing a nerve cell also referred to herein as the method for producing a nerve cell of the present invention.
  • the nerve cell population means a population of cells including nerve cells.
  • the neural cell population can include cells other than neural cells.
  • the nerve cell population is not particularly limited as long as it includes nerve cells, but usually 1% or more, preferably 5% or more, more preferably 20% or more, and further preferably 40% or more of the cells in the cell population are nerve cells. It is.
  • the nerve cell production method of the present invention By using the nerve cell production method of the present invention, it becomes possible to produce many nerve cells with high efficiency in a short period of time. Further, the neuronal cell population obtained by the method for producing neuronal cells of the present invention has a low proportion of proliferating cells contained in the neuronal cell population, and therefore has a low risk of tumorigenesis when used for cell transplantation therapy. Therefore, the nerve cell produced by the nerve cell production method of the present invention can be suitably used for transplantation treatment.
  • the nerve cell production method of the present invention includes the following steps: (I) culturing neural stem cells and / or neural progenitor cells in the medium of the present invention to obtain neural stem cells and / or neural progenitor cells with enhanced neural cell differentiation ability; (II) Culturing the neural stem cells and / or neural progenitor cells obtained in step (I) with enhanced neural differentiation ability under conditions for inducing neural differentiation to obtain a neural cell population.
  • neural stem cells and / or neural progenitor cells are cultured in the medium of the present invention for a period sufficient for enhancing the ability of neural differentiation (for example, 2 days or more, preferably 4 days or more, more preferably 8 days or more). ) It can be achieved by culturing.
  • Other culture conditions are in accordance with the description of the culture method of the present invention.
  • the nerve cell differentiation induction conditions in the step (II) are not particularly limited as long as differentiation of neural stem cells and / or neural progenitor cells into nerve cells can be achieved, and culture conditions used for induction of differentiation into desired nerve cells. Can be adopted as appropriate.
  • Examples of neural stem cell and / or neural progenitor cell adhesion culture methods include Flanagan LA et al., J Neurosci Res. 2006 Apr; 83 (5): 845-56, Conti L et al., PLoS Biology. 2005 Sep; 3 (9): e283.
  • Neural stem cells and / or neural progenitor cells in suspension culture means culturing neural stem cells and / or neural progenitor cells in a non-adherent condition in a culture medium or a feeder cell (if used) in a medium.
  • suspension culture methods of neural stem cells and / or neural progenitor cells include the neurosphere method (Reynolds BA and Weiss S., Science, USA, 1992 Mar 27; 255 (5052): 1707-10.), Serum-free aggregation. Examples thereof include suspension culture methods (SFEB method, SFEBq method; Watanabe et al., Nature Neuroscience 8, 288-296 (2005)).
  • the tissue culture of neural stem cells and / or neural progenitor cells is a method of culturing a tissue containing neural stem cells and / or neural progenitor cells as a tissue piece such as a slice or the entire tissue.
  • a tissue culture of neural stem cells and / or neural progenitor cells O'Rourke NA et al., Science. 1992 Oct 9; 258 (5080): 299-302. , Komuro H et al., Science. 1992 Aug 7; 257 (5071): 806-9. And the slice culture method described in the above.
  • Neural cell differentiation inducing conditions are well known to those skilled in the art, and those skilled in the art can appropriately employ desired neuronal differentiation inducing conditions.
  • the concentration of neural stem cells and / or neural progenitor cells in the medium in step (II) is not particularly limited as long as it has the desired effect, but is usually 5 ⁇ 10 3 to 10 5 cells / cm 3 , preferably 10 4 to 3 ⁇ 10. 4 pieces / cm 3 .
  • the culture conditions in the differentiation-inducing culture in step (II) are not particularly limited as long as a desired effect such as a reduction in the proportion of proliferating cells can be achieved, and a known culture method is appropriately selected according to the purpose of the culture. Can be adopted.
  • the incubator used for culturing the cells is not particularly limited as long as the desired effect can be achieved. Flask, tissue culture flask, dish, petri dish, tissue culture dish, Examples include multi-dish, micro-plate, micro-well plate, multi-plate, multi-well plate, micro-slide, chamber slide, petri dish, tube, tray, culture bag, and roller bottle.
  • the incubator used for cell culture may be cell-adhesive or non-cell-adhesive, and is appropriately selected according to the purpose.
  • the cell-adhesive incubator is coated with any cell-supporting substrate such as an extracellular matrix (ECM) or an artificial material that mimics their functions for the purpose of improving the adhesion with cells on the surface of the incubator. Can be.
  • ECM extracellular matrix
  • the culture temperature is not particularly limited as long as the desired effect can be achieved, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is about 1-10%, preferably about 2-5%.
  • the oxygen concentration is usually 1 to 40%, but is appropriately selected depending on the culture conditions.
  • neural stem cells and / or neural progenitor cells can be cultured by a method known per se such as adhesion culture, suspension culture, tissue culture and the like.
  • the period of culturing neural stem cells and / or neural progenitor cells is not particularly limited as long as a desired effect such as production of nerve cells with reduced proliferation can be achieved.
  • the culture is continued until nerve cells appear.
  • the appearance of nerve cells can be confirmed by evaluating the expression of the above-mentioned nerve cell markers.
  • the differentiation-inducing culture is performed by culturing neural stem cells and / or neural progenitor cells having enhanced neural differentiation ability in a differentiation-inducing medium.
  • a differentiation induction medium used in the differentiation induction culture of step (II), neural stem cells and / or The period for culturing neural progenitor cells is usually 10 days or longer, preferably 21 days or longer, more preferably 60 days or longer.
  • culturing in a differentiation-inducing medium it is usually replaced with a fresh medium once every three days, preferably once every two days.
  • a differentiation-inducing medium in step (II), it is preferable to disperse neural stem cells and / or neural progenitor cells and subject the dispersed cells to differentiation-inducing culture.
  • a differentiation-inducing medium it is preferable to use a cell-adhesive container in step (II).
  • the composition of the differentiation-inducing medium used in step (II) is not particularly limited as long as it can achieve differentiation of neural stem cells and / or neural progenitor cells into neural cells, and a known neural cell differentiation-inducing medium may be used. it can. It is preferable that the differentiation-inducing medium does not contain substances that maintain the undifferentiation of neural stem cells such as EGF and bFGF.
  • the differentiation induction medium used in step (II) may be prepared using a medium usually used for culturing mammalian cells as a basal medium.
  • the basal medium is not particularly limited as long as the desired effect can be achieved.
  • BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium , ⁇ MEM medium, DMEM medium, F-12 medium, DMEM / F12 medium, IMDM / F12 medium, ham medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, or a mixed medium thereof can be used for culturing animal cells.
  • a medium can be mentioned.
  • the differentiation-inducing medium used in step (II) is preferably a chemically defined medium (CDM) in which the components are chemically determined from the viewpoint of avoiding mixing of chemically undecided components.
  • the differentiation-inducing medium is preferably a serum-free medium from the viewpoint of avoiding contamination with chemically undecided components.
  • the “serum-free medium” in the present invention means a medium that does not contain unconditioned or unpurified serum.
  • a medium containing a purified blood-derived component or animal tissue-derived component is also included in the serum-free medium unless it contains unconditioned or unpurified serum.
  • the serum-free medium may contain a serum replacement.
  • serum substitutes include those that appropriately contain serum albumin, fatty acids, non-essential amino acids, transferrin, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol or 3 ′ thiolglycerol, or equivalents thereof. Can do.
  • a serum replacement can be prepared, for example, by the method described in WO98 / 30679.
  • a commercially available product may be used as a serum substitute.
  • Such commercially available serum substitutes include, for example, Knockout TM Serum Replacement (manufactured by Life Technologies: hereinafter, also referred to as KSR), Glutamax TM (manufactured by Life Technologies Ligonidics), and Chemically-defined Technologies. Manufactured), B27 (Life Technologies), N2 (Life Technologies), but are not limited thereto.
  • the differentiation-inducing medium used in step (II) may further contain a medium additive.
  • Medium additives include vitamins, proteins such as cytokines and growth factors, L-ascorbic acid, magnesium L-ascorbyl phosphate, sodium pyruvate, 2-aminoethanol, glucose, sodium bicarbonate, HEPES, insulin, progesterone, Examples include, but are not limited to, sodium selenate and putrescine.
  • the additive is preferably contained within a concentration range known per se.
  • the differentiation-inducing medium used in step (II) may contain L-glutamine, L-asparagine and L-aspartic acid.
  • the differentiation-inducing medium used in step (II) may contain a fatty acid.
  • Fatty acids contained in the differentiation induction medium include oleic acid, linoleic acid, ⁇ -linolenic acid, ⁇ -linolenic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidonic acid, icosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, butyric acid, acetic acid, palmitoleic acid, valeric acid (Valeric acid), caproic acid, enanthic acid (heptylic acid), caprylic acid, pelargonic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid, pentadecylic acid, margaric acid, xenoic acid, eleostearic acid, arachidic acid, 8,11 -Eicosadienoic acid, 5,8,11-eicosatrienoic acid, behenic acid, lignoceric acid, ner
  • the pH of the differentiation induction medium is preferably about 5.0 to about 8.5, more preferably about 6.0 to about 8.0.
  • the medium is preferably subjected to sterilization such as filtration sterilization using a membrane filter or the like.
  • the differentiation-inducing medium is based on DMEM / F12 medium, transferrin, Glutamax, B27 supplement, N2 supplement, glucose, sodium bicarbonate, HEPES, insulin, progesterone, sodium selenide and putrescine including.
  • the period for culturing the cells in step (II) is not particularly limited as long as differentiation induction into nerve cells can be achieved, but usually 10 days or more, preferably 21 days or more, more Preferably it is 60 days or more.
  • Step (II) may be differentiated into a specific type of nerve cell.
  • the method for producing a nerve cell of the present invention may further comprise a step (III) of isolating a nerve cell from a nerve cell population following the steps (I) and (II).
  • Isolation of nerve cells from the nerve cell population can be performed by a method known per se. Examples of methods for isolating nerve cells from a population of nerve cells include a method of isolating by flow cytometry using an antibody against an extracellular antigen that exists specifically for a desired nerve cell, and a desired nerve cell-specific presence. Examples include, but are not limited to, isolation using microbeads to which antibodies against extracellular antigens are bound. Isolation of neuronal cell populations can also be achieved by removing neural progenitor cells and neural stem cells that are expected to be contaminated.
  • neural stem cells and / or neural progenitor cells with enhanced neural differentiation ability The present invention provides neural stem cells and / or neural progenitor cells (neural stem cells and / or neural progenitors of the present invention) obtained by the culture method of the present invention. Cell).
  • the neural stem cells and / or neural progenitor cells of the present invention have enhanced neural differentiation ability.
  • the neural stem cells and / or neural progenitor cells of the present invention are cultured for 2 days or longer, preferably 4 days or longer, more preferably 8 days or longer in the medium of the present invention. Can be obtained. Other culture conditions are in accordance with the description of the culture method of the present invention.
  • the neural stem cells and / or neural progenitor cells of the present invention are preferably isolated. “Isolation” means that an operation to remove a target component or a factor other than cells has been performed, and the state existing in nature has been removed.
  • the purity of “isolated neural stem cells and / or neural progenitor cells” is usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably Is 90% or more, more preferably 99% or more, and most preferably 100%.
  • the neural stem cells and / or neural progenitor cells of the present invention can be provided in a cryopreserved state.
  • the neural stem cells and / or neural progenitor cells of the present invention can be cryopreserved, and can be used after thawing and sleeping as needed.
  • a cell cryopreservation method known per se can be used.
  • dimethyl sulfoxide is added to the composition of the present invention, and the neural stem cell and / or neural progenitor cell of the present invention is added under the conditions of ⁇ 80 to ⁇ 200 ° C., preferably ⁇ 196 ° C. (in liquid nitrogen). save.
  • Neural stem cell and / or neural progenitor cell culture preparation The present invention includes a neural stem cell and / or neural progenitor cell culture preparation (of the present invention) comprising the medium of the present invention and the neural stem cell and / or neural progenitor cell. Culture preparation).
  • the neural stem cell and / or neural progenitor cell in the culture preparation of the present invention is a living and proliferating cell.
  • the neural stem cells and / or neural progenitor cells in the culture preparation of the present invention are preferably isolated. “Isolation” means that an operation to remove a target component or a factor other than cells has been performed, and the state existing in nature has been removed.
  • the purity of “isolated neural stem cells and / or neural progenitor cells” is usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably Is 90% or more, more preferably 99% or more, and most preferably 100%.
  • neural stem cells and / or neural progenitor cells are present in the medium of the present invention.
  • the culture preparation of the present invention is a suspension of neural stem cells and / or neural progenitor cells in the medium of the present invention.
  • the culture preparation of the present invention may be enclosed in a suitable container.
  • the culture preparation of the present invention is useful for carrying out the culture method of the present invention.
  • the culture preparation of the present invention can be provided in a cryopreserved state.
  • the culture preparation of the present invention can be stored frozen, and can be used after thawing and sleeping as necessary.
  • a cell cryopreservation method known per se can be used.
  • dimethyl sulfoxide is added to the culture preparation of the present invention, and the culture preparation of the present invention is stored under conditions of ⁇ 80 to ⁇ 200 ° C., preferably ⁇ 196 ° C. (in liquid nitrogen).
  • Example 1 Method for culturing neural stem cells in medium substantially free of glutamine
  • LtNES cells Long-term self-renewing neuro epithelial-like cell cells (hereinafter referred to as “LtNES cells”) induction method EB (embryoid body) from iPS cells Transfer medium (final concentration 0.5-10 ⁇ g / mL), ethanolamine (final concentration 5-50 ⁇ M), human in a medium corresponding to the composition obtained by removing ascorbic acid and transferrin from E6 medium (Life Technologies or STEMCELL Technologies) The cells were cultured for 4 days in a medium supplemented with serum albumin (final concentration 0.1 to 5 mg / mL).
  • serum albumin final concentration 0.1 to 5 mg / mL
  • EB was seeded on a dish coated with poly-L-ornithine (PO) and cultured in the above medium for about 10 days to confirm that a Rosette-like structure was formed.
  • PO poly-L-ornithine
  • the Rosette portion was cut out, and suspension culture was performed for about 7 days in the above medium as a neurosphere.
  • Neurospheres were dispersed in trypsin / EDTA and cultured in RHB-A medium on a PO / laminin-coated dish to prepare LtNES cells.
  • LtNES cells derived from human pluripotent stem cells were suspended in a Full medium to prepare a cell suspension. A 1/10 amount of the cell suspension was added to the Full medium or ⁇ Gln medium, and the cells were cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 environment. In order to reduce the carry-in of the medium before the replacement, the medium was changed 2 hours after the start of the culture, and the culture was further continued. For this reason, it is estimated that the medium before exchange is diluted at least about 1,000 times. For passage of LtNES cells, incubation was performed at 37 ° C. for 1 minute in TrypLE Select, diluted with a medium, and then pipetted to obtain single cells.
  • FIG. 1A shows a microscope image of neural stem cells after 4 days of culture. Neural stem cells cultured in ⁇ Gln medium for 4 days showed the same morphology as neural stem cells cultured in Full medium.
  • Example 2 Verification of the effect of promoting the induction of nervous system cells
  • a differentiation induction experiment was performed.
  • neural stem cells were induced from iPS cells, and cultured for 4 days in an L-glutamine-free medium ( ⁇ Gln medium) or a control medium (Full medium). After the culture, TrypLE Select was added instead of the medium, and the cells were dispersed at 37 ° C. for 1 minute.
  • TrypLE Select was diluted with a medium, pipetting was performed, and seeding was carried out at 1.5 ⁇ 10 5 cells / well in a 48-well plate coated with poly-L-ornithine / fibronectin.
  • the cells were cultured for 21 days from Day 4 to Day 25 in a differentiation induction medium supplemented with 1 ⁇ N2 supplement (Life Technologies) and 1 ⁇ B27 supplement (Life Technologies) in DMEM / F-12 (Life Technologies) containing L-glutamine.
  • the cells were cultured in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 atmosphere. The medium was changed once every two days.
  • the cells after differentiation induction were shown to contain differentiated neurons that were ⁇ III tubulin positive. Neural stem cells cultured in ⁇ Gln medium produced more differentiated neural cells than neural stem cells cultured in Full medium. Therefore, it was shown that ⁇ Gln medium has an action of promoting differentiation of neural stem cells.
  • FIG. 1D The qPCR results are shown in FIG. 1D.
  • neurons derived from neural stem cells cultured with L-glutamine in ⁇ Gln medium the expression of synapsin 1 as a neuronal cell marker and NeuroD1 as a neuronal progenitor cell marker was enhanced.
  • Example 3 Verification of inhibitory effect on proliferation of nerve cells
  • 4 stem cells were cultured in a control medium (Full medium) or an L-glutamine-free medium ( ⁇ Gln medium). Cultured for days. The cultured cells were fixed with 4% paraformaldehyde phosphate buffer at room temperature for 20 minutes. The fixed cells were washed with PBS (Phosphate buffered saline), then incubated in ethanol at room temperature for 5 minutes and air-dried. Thereafter, the cells were stained with a 0.4% crystal violet methanol solution (Wako Pure Chemicals: 038-04862) for 20 minutes and washed with pure water.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • Crystal violet was eluted by adding 350 ⁇ L of 1% SDS aqueous solution and shaking for 20 minutes, and the number of cells was quantified by measuring the 570 nm absorbance of the eluate with a microplate reader SH-9000 (Corona Electric). It was. The results are shown in FIG. 1B.
  • the number of neural stem cells when cultured in ⁇ Gln medium for 4 days was less than when cultured in Full medium. Therefore, ⁇ Gln medium was shown to suppress the proliferation of neural stem cells.
  • Example 4 Verification of the proliferation effect of neural stem cells
  • neural stem cells were cultured for 4 days in a control medium (Full medium) or an L-glutamine-free medium ( ⁇ Gln medium). . Thereafter, the cells were cultured until the 20th day (total 5 passages), and the number of cells was measured on the 4th, 8th, 12th, 16th and 20th days of the culture. The result is shown in FIG. 1E.
  • the number of neural stem cells cultured in ⁇ Gln medium showed linear proliferation (FIG. 1E).
  • Example 5 Analysis of amino acids in culture medium
  • neural stem cells were cultured for 4 days or more in a control medium (Full medium) or an L-glutamine-free medium ( ⁇ Gln medium).
  • the cultured cells were lysed and collected using ice-cold methanol after removing the medium.
  • Intracellular amino acid content, keto acid and organic acid content for TCA cycle were analyzed. The analysis procedures for amino acids, keto acids, and organic acids are shown below.
  • ⁇ Amino acid analysis procedure> Collect 10 ⁇ L of the derivatization reaction sample of the sample solution, add 10 ⁇ L of the internal standard solution, shake 60 ⁇ L of Aminotag Wako APDS Tag Wako borate buffer solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and shake the aminotag Wako amino acid analysis reagent ( LC / MS) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 20 ⁇ L was added and shaken vigorously. Then, it heated at 55 degreeC for 10 minute (s) using the block heater. After cooling, 400 ⁇ L of the diluted solution was added to the reaction solution and shaken to prepare an analytical sample.
  • the analysis sample of the derivatization reaction solution uses a mixture of Aminotag Wako APDS Tag Wako eluent (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) as the mobile phase A, a mixture of 600 ⁇ L of acetonitrile and 400 ⁇ L of water as the B phase, and a C8 column as the stationary phase.
  • Amino Tag Wako APDS Tag Wako amino acid internal standard mixed solution (manufactured by Wako Pure Chemical) No. 650 ⁇ l of No. 1 was collected.
  • Analytical apparatus As an analytical apparatus, API4000 LC / MS / MS system (manufactured by AB SCIEX) was used. The results are shown in FIG. The intracellular amino acid content of cells cultured in ⁇ Gln medium changed, and a significant increase was observed for glycine, alanine, serine, threonine, and asparagine. Significant decreases were observed for glutamine, glutamic acid and aspartic acid.
  • ⁇ Keto acid analysis procedure> Preparation of derivatization reagent solution 10 mg of O- (2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl) -hydroxylamine was dissolved in 1 mL of a 0.1% aqueous solution of sodium hydroxide and acetonitrile mixed in equal parts. A reagent solution was obtained. Derivatization reaction of the sample solution 20 ⁇ L of the sample solution was placed in the reaction vial, 20 ⁇ L of the derivatization reagent solution was added, and after stirring well, the derivatization reaction was performed by leaving it in ice water for 30 minutes.
  • the analytical mobile phase of the derivatization reaction solution is 25 mM formic acid aqueous solution for liquid A, acetonitrile is used for liquid B, and a Ph column is used for the stationary phase.
  • the analytical sample is introduced into the LC / MS / MS system, and the mass corresponding to each keto acid. Detected by number.
  • Analytical apparatus As an analytical apparatus, API4000 LC / MS / MS system (manufactured by AB SCIEX) was used. ⁇ Quantitative procedure for organic acid> Preparation of derivatizing reagent solution 10 mg of 3-picolylamine was dissolved in DMSO solution containing 5% triethylamine to a concentration of 200 mM to obtain a derivatizing reagent solution. Preparation of condensing agent solution 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium hydrochloride was dissolved in DMSO to a concentration of 50 mM to obtain a condensing agent solution. .
  • Example 6 Verification of the presence or absence of cell death in cultured cells of L-glutamine-removed medium
  • a control medium Ferl medium
  • an L-glutamine-free medium ⁇ Gln medium
  • Neural stem cells were cultured for 4 days.
  • the cultured cells were fixed with 4% paraformaldehyde phosphate buffer for 20 minutes at room temperature.
  • the fixed cells were washed with PBS, and then immunostained with an antibody against cleaved caspase-3 as an apoptosis marker and Hoechst 33342 as a nuclear stain. The results are shown in FIG.
  • Example 7 Verification of nerve differentiation promoting effect by each non-essential amino acid-removing medium
  • Each essential amino acid (glutamine, asparagine, aspartic acid, glutamic acid, alanine, glycine, serine or proline) was removed from the Full medium described in Example 1.
  • a medium having the composition described above was prepared.
  • neural stem cells were induced from iPS cells and cultured in each non-essential amino acid-removed medium or full medium for 8-12 days. After the culture, TrypLE Select was added instead of the medium, and the cells were dispersed at 37 ° C. for 1 minute.
  • Table 1 shows the results of quantifying the neurite length of ⁇ III tubulin-positive cells by image analysis.
  • the symbols in Table 1 indicate the relative average neurite length when the control (Full) is 1, as ++:> 1.5, +: 1.5 to 0.3, ⁇ : 0.3>. It was.
  • a medium containing no glutamine, a medium containing no aspartic acid, and a medium containing no asparagine showed an effect of enhancing the neural differentiation ability of neural stem cells.
  • ADVANTAGE OF THE INVENTION it becomes possible to enhance the neural differentiation ability of a neural stem cell and / or a neural progenitor cell, and can reduce the human cost and monetary cost concerning neural stem cell and / or neural progenitor cell culture. .

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Abstract

本発明は、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン及びＬ－アスパラギン酸からなる群より選択される１以上のアミノ酸を実質的に含まない神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞培地、及び当該培地を用いた神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養方法等を提供する。

Description

神経分化能を亢進させる神経幹細胞用培地
　本発明は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養培地、及び培養方法に関する。より詳細には、本発明は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進させる培地、及び当該培地を用いて神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進させる方法等に関する。
　筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病などの難治性神経疾患や神経損傷を治療する方法の１つとして、近年、神経細胞や神経幹細胞を生体へ移植する方法の開発に期待が寄せられている。神経幹細胞とは、自己複製能を有し、複分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する未分化な細胞であり、神経系の多様な細胞（神経細胞及び神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）、並びにグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト等）及びグリア前駆細胞等）を生み出す能力を有する細胞である。神経幹細胞及び神経前駆細胞は、それ自体を移植するほか、神経細胞等の通常成体で増殖し難い細胞を供給することができるため、再生医療における生体材料の提供源として注目を集めている。
　神経幹細胞は増殖能と複分化能を有するため、生体に移植すると生体内で機能的な神経系細胞を産生できると考えられているが、一方で増殖能のある神経幹細胞を移植することで腫瘍化することが懸念される。このため、あらかじめインビトロで神経幹細胞から分化させた神経前駆細胞を再生医療に用いることが検討されているが、この場合も作製した神経前駆細胞に増殖能のある細胞が混入し残存するリスクがある。移植後の神経系細胞中に増殖性の細胞が混入し腫瘍を形成するのを避けるためには、増殖性の細胞を極力含まないようにすることが重要となる。非増殖性の神経細胞による治療を行う場合には、神経幹細胞から神経細胞に高効率に分化可能であることが重要となる。従って、神経幹細胞から神経系細胞を高効率に産生させる方法の開発や、得られた分化後の神経系細胞中に含まれる増殖性の細胞を低減させるような神経系細胞の調製方法の開発が重要な課題となる。
　ところで、グルタミンを含まない培地について、これまでにいくつかの報告がなされている。
　非特許文献１には、血球系の細胞であるヒト赤白血病細胞株Ｋ５６２細胞をグルタミン不含培地で培養した際に、赤血球への分化が促進されることが記載されている。
　また非特許文献２には、ラットのグリオーマ細胞であるＣ６グリオーマ細胞をグルタミン不含培地で培養すると、オリゴデンドロサイト様の細胞への分化が促進されることが記載されている。
　しかしながら、グルタミン、アスパラギン及びアスパラギン酸からなる１以上のアミノ酸を含まない培地が神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の分化能や神経細胞産生能にどのような影響を与えるのかについては全く明らかになっていない。
Ｃａｎｈ　Ｈｉｅｐ　Ｎら、「Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｓｏｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒａｔｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｋ５６２　ｃｅｌｌｓ．」Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１２　Ｄｅｃ；１５２（６）：５０９－５１９． Ｍａｒｔｉｎ　Ｍら、「Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ　ａｎｄ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｃ６　ｇｌｉｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｇｒｏｗｎ　ｏｎ　３－Ｄ　ｓｕｐｐｏｒｔ；　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ．」Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ．１９９８　Ｄｅｃ；３０（６）：５６５－７８．
　本発明の目的は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の、神経分化能を亢進させることが可能な培地、及び当該培地を用いて神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の、神経分化能を亢進させる方法を提供することである。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン及びＬ－アスパラギン酸からなる群より選択される１以上のアミノ酸を除去した培地中で、神経幹細胞を培養すると、該細胞の増殖能が抑制され、かつ該細胞の神経分化能が亢進することを見出した。Ｌ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン及びＬ－アスパラギン酸からなる群より選択される１以上のアミノ酸を除去した培地を用いると、亢進した神経分化能を維持したまま、神経幹細胞を継代することができた。神経分化能が亢進した神経幹細胞から神経細胞へ分化させると、増殖性が低く分化した細胞の割合の多い神経細胞集団を得られた。これらの知見に基づき、更に検討を重ね、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）Ｌ－グルタミンを実質的に含まない、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞培養用培地。
（２）Ｌ－グルタミン濃度が１００μＭ以下である、（１）に記載の培地。
（３）Ｌ－グルタミンを含まない、（１）又は（２）に記載の培地。
（４）ホロトランスフェリンを含む、（１）～（３）のいずれかに記載の培地。
（５）Ｌ－トリプトファン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン及びＬ－ヒスチジンを含む、（１）～（４）のいずれかに記載の培地。
（６）神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進するための培地である、（１）～（５）のいずれかに記載の培地。
（７）無血清培地である、（１）～（６）のいずれかに記載の培地。
（８）（１）～（７）のいずれかに記載の培地中で、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養することを含む、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養方法。
（９）神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を製造するための方法である、（８）記載の方法。
（１０）培養期間が４日以上である、（８）又は（９）記載の方法。
（１１）以下の工程を含む神経細胞の作製方法：
（Ｉ）（１）～（７）のいずれかに記載の培地中で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養し、神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を得ること；
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得た神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を、神経細胞分化誘導条件下で培養し、神経細胞集団を得ること。
（１２）（９）の方法により得られる、神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞。
（１３）神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞、及び（１）～（７）のいずれかに記載の培地を含んでなる、培養調製物。
　本発明の培地は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進させる効果を有する。本発明の培養方法により、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養すると、増殖能が抑制されているが神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を得ることができる。神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、分化誘導培養により、多くの神経細胞を産生するため、効率的に神経細胞を作製することが可能となる。またこのように作製された神経細胞集団は増殖性の細胞が少ないため、神経細胞を生体に移植した際の腫瘍化のリスクが軽減され、より安全な治療方法の開発に貢献することができる。
図１は、Ｌ－グルタミン除去培地による神経分化の促進効果を示す図である。Ｌ－グルタミンを含む培地（Ｆｕｌｌ）、又はＬ－グルタミンを含まない培地(ΔＧｌｎ）で神経幹細胞を４日間培養した（Ｄａｙ４）（図１Ａ及びＢ）。Ｌ－グルタミンを含まない培地で培養した神経幹細胞においては、神経幹細胞の増殖性が低下していた（図１Ｂ）。上記培地で４日間培養後、神経分化誘導培地に置き換え、２１日間培養し（Ｄａｙ２５）、神経細胞を免疫染色した。Ｌ－グルタミンを含む培地（Ｆｕｌｌ）と比較して、Ｌ－グルタミンを含まない培地（ΔＧｌｎ）で培養した神経幹細胞は、多くの神経細胞を産生した（図１Ｃ）。図１Ｄに、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｓｙｎａｐｓｉｎ１の発現強度を示す。図１Ｄ中、各項目の左のバーがＦｕｌｌ、右のバーがΔＧｌｎを示す。Ｌ－グルタミンを含まない培地で２０日間培養した神経幹細胞の増殖曲線は直線性を示した（図１Ｅ）。 図２は、細胞内アミノ酸含有量の分析結果を示す図である。横軸：定量したアミノ酸、縦軸：細胞数あたりのアミノ酸含有量（ｎｍｏｌ／１ｘ１０６細胞）。各項目の左のバーがＦｕｌｌ、右のバーがΔＧｌｎを示す。 図３は、細胞数あたりのＴＣＡサイクル中の有機酸含有量を示す図である。各項目の左のバーがＦｕｌｌ、右のバーがΔＧｌｎを示す。 図４は、神経幹細胞におけるアポトーシスを示す図である。
　本発明は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞培養用培地（以下、これらを総称して本発明の培地ともいう）、当該培地を用いた神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養方法（以下、これらを総称して本発明の培養方法ともいう）、並びに該方法により得られる、神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞等を提供する。
　（１）神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞
　本明細書中、神経幹細胞とは、神経系細胞（神経細胞及びグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイトなど）、並びにそれらの前駆細胞）への複分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を維持し、自己複製能を有する未分化な細胞を意味する。具体的には、神経幹細胞とは、神経細胞及びグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイトなど）を最終的に生み出す能力を有し、かつ、初期化などの特別な操作を加えない限りにおいて、表皮系細胞、血球系細胞、筋肉細胞等の神経系以外の細胞を実質的に生み出さない細胞である。実質的に生み出さないとは、神経幹細胞の生み出す細胞のうち、９０％以上が、神経細胞及びグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイトなど）、並びにそれらの前駆細胞のいずれかである状態を指す。
　本明細書中、神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）とは、分裂能を有する未分化な細胞であって、１種以上の神経細胞に最終的に分化する能力を有する細胞を指す。神経前駆細胞は、神経細胞を最終的に生み出すよう運命決定され、かつ神経細胞及びその前駆細胞以外を実質的に生み出さない細胞を指す。グリア前駆細胞（ｇｌｉａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）とは、神経幹細胞に由来し、分裂能を有する未分化な細胞であって、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、上衣細胞、シュワン細胞のいずれか又はそれらの前駆細胞に分化する能力を有し、かつ神経細胞に実質的に分化しない細胞を指す。
　神経幹細胞及び神経前駆細胞は、厳密に区別することが困難なため、本明細書中「神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞」として区別なく使用される場合がある。
　本発明においては、通常、哺乳動物由来の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞が用いられる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において用いられる神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、好ましくはマウス等のげっ歯類又はヒト等の霊長類の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞であり、より好ましくは、ヒト神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞である。
　本発明に用いられる神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、多能性幹細胞由来のもの、生体組織から分離したもの、線維芽細胞などから多能性幹細胞を経由せずに直接分化誘導したもの（Ｍａｔｓｕｉ　Ｔら，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．２０１２　Ｊｕｎ；３０（６）：１１０９－１９）などが挙げられ、上記に記載の未分化性を維持し複分化能を維持する細胞であって神経細胞を生み出す能力を維持する限り、特に制限されない。本発明に用いられる神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、好ましくは多能性幹細胞由来のものであり、より好ましくは誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）由来のものである。
　多能性幹細胞から神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を作製する方法としては、自体公知の方法を用いることができる。多能性幹細胞由来の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の作製方法の例としては、多能性幹細胞の浮遊培養を行い胚葉体形成を経由して神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を形成させる方法（Ｂａｉｎ　Ｇら，Ｄｅｖ　Ｂｉｏｌ．１９９５　Ａｐｒ；１６８（２）：３４２－５７など）、ストローマ細胞等をフィーダー細胞として使う方法、ｂＦＧＦを含む無血清培地中で多能性幹細胞の浮遊培養を行う方法（Ｗａｔａｎａｂｅ　Ｋら，Ｎａｔ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００５　Ｍａｒ；８（３）：２８８－９６など）、ＳＭＡＤシグナル阻害剤Ｎｏｇｇｉｎ及びＳＢ４３１５４２の存在下で多能性幹細胞（ＥＳ細胞等）を接着培養する方法（Ｃｈａｍｂｅｒｓ　ＳＭら，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９　Ｍａｒ；２７（３）：２７５－８０）、単層培養した多能性幹細胞（ＥＳ細胞等）を、ｇｌｙｃｏｇｅｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｋｉｎａｓｅ　３（ＧＳＫ３）阻害剤、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　β（ＴＧＦ－β）阻害剤、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤存在下で培養する方法（Ｌｉ　Ｗら，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．２０１１　Ｍａｙ　１７；１０８（２０）：８２９９－３０４）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書中、多能性幹細胞とは、自己複製能及び分化／増殖能を有する未熟な細胞であって、胎盤を除く生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。多能性幹細胞の例としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋら，Ｃｅｌｌ．２００７　Ｎｏｖ　３０；１３１（５）：８６１－７２）、精子幹細胞（ｍＧＳ細胞）（Ｋａｎａｔｓｕ－Ｓｈｉｎｏｈａｒａ　Ｍら，Ｂｉｏｌ　Ｒｅｐｒｏｄ．２００７　Ｊａｎ；７６（１）：５５－６２）、胚性生殖細胞（Ｍａｔｓｕｉ　Ｙら，Ｃｅｌｌ．１９９２　Ｓｅｐ　４；７０（５）：８４１－７）などが挙げられる。
　細胞が神経幹細胞であることは、例えば、細胞をＥＧＦ及びｂＦＧＦを含む無血清培地中で浮遊培養し、培養した細胞塊を分散処理後に、後述の実施例に記載の分化誘導培地中で接着培養を行い、神経細胞及びグリア細胞のいずれをも産生することを指標として確認することができる。
　また、神経幹細胞は、神経幹細胞で発現することが知られている遺伝子、その転写産物、タンパク質など（神経幹細胞マーカー）により確認することもできる。
　神経幹細胞マーカーの例としては、細胞骨格タンパク質であるネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６，６６（１９９７））、ＳＯＸ１（ＳＲＹ（ｓｅｘ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ　Ｙ）－ｂｏｘ１）、ＳＯＸ２（ＳＲＹ（ｓｅｘ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ　Ｙ）－ｂｏｘ２）、Ｐａｘ６（ｐａｉｒｅｄ　ｂｏｘ　６）、Ｋｉ６７、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、脂肪酸結合タンパク質７（Ｆａｂｐ７、ＢＬＢＰともいう）などが知られており、当業者は、これらのマーカーを適宜組み合わせて所望の神経幹細胞であることを確認することができる。
　細胞が神経前駆細胞であることは、例えば、細胞をＥＧＦ及びｂＦＧＦを含む無血清培地中で浮遊培養し、培養した細胞塊を分散処理後に、後述の実施例に記載の分化誘導培地中で接着培養を行ったときに、神経細胞を産生しグリア細胞を産生しないことを指標として確認することができる。
　また、神経前駆細胞は、神経前駆細胞で発現することが知られている遺伝子、その転写産物、タンパク質など（神経前駆細胞マーカー）により確認することもできる。神経前駆細胞で発現する遺伝子としては、Ｔｂｒ２、ＭＡＳＨ１、ネスチン、ＮｅｕｒｏＤ１等が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、これらのマーカーを適宜組み合わせて細胞が神経前駆細胞であることを確認することができる。
　神経前駆細胞の例としては、ＳＯＸ２陰性かつネスチン陽性である細胞が挙げられるが、これに限定されない。
　本明細書中、神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）は、神経系の機能的単位となる細胞を意味する。通常、神経細胞は、細胞体と神経突起（例、軸索、樹状突起）から構成されるが、発生期の幼若ニューロン、網膜のアマクリン細胞、嗅球の顆粒細胞などの神経突起をもたない神経細胞（無極性神経細胞）も存在する。神経細胞は形態別に分類した場合、無極性神経細胞、単極性神経細胞、偽単極性神経細胞、双極性神経細胞、多極性神経細胞に分類され、本明細書中、神経細胞はこれらの全てを包含する。
　神経細胞は、中枢神経系神経細胞及び末梢神経系神経細胞を包含する。神経細胞は、運動神経細胞であってもよく、感覚神経細胞であってもよく、介在神経細胞であってもよい。神経細胞の例としては、ドーパミン作動性神経細胞、ノルアドレナリン作動性神経細胞、アドレナリン作動性神経細胞、セロトニン作動性神経細胞、アセチルコリン作動性神経細胞、γアミノ酪酸作動性神経細胞、グルタミン酸作動性神経細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
　細胞が神経細胞であることは、神経細胞で発現することが知られている遺伝子、その転写産物、タンパク質など（神経細胞マーカー）により確認することができる。
　分化した神経細胞のマーカーの例としては、ＭＡＰ２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２）、ニューロフィラメント、シナプシン１、βＩＩＩチューブリン、ＮｅｕＮ（ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＦＯＸ３（Ｆｏｒｋｈｅａｄ　ｂｏｘ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、カルビンジン、ＰＳＡ－ＮＣＡＭ（ｐｏｌｙｓｉａｌｙｌａｔｅｄ　ｎｅｕｒａｌ　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、Ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ、Ｐｅｒｉｐｈｅｒｉｎ等が挙げられる。
　神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞が産生する細胞が、神経細胞か否かは、例えば、上述のマーカーにより確認することができる。
　（２）神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞培養用培地
　本発明の培地は、Ｌ－グルタミン（２－アミノ－４－カルバモイル酪酸）、Ｌ－アスパラギン（２－アミノ－３－カルバモイルプロピオン酸）及びＬ－アスパラギン酸（２－アミノブタン二酸）からなる群より選択される１以上のアミノ酸（本明細書中、「神経分化関連アミノ酸」ともいう）を実質的に含まないことを特徴とする。
　選択される「神経分化関連アミノ酸」は、１種（Ｌ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン、又はＬ－アスパラギン酸）であってもよく（この場合、本発明の培地は他の２種の神経分化関連アミノ酸を含有し得る）、２種（Ｌ－グルタミン及びＬ－アスパラギンの組み合わせ、Ｌ－グルタミン及びＬ－アスパラギン酸の組み合わせ、又はＬ－アスパラギン及びＬ－アスパラギン酸の組み合わせ）であってもよく（この場合、培地は他の１種の神経分化関連アミノ酸を含有し得る）、３種全て（Ｌ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン、及びＬ－アスパラギン酸）であってもよい。
　一態様として、本発明は、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン及びＬ－アスパラギン酸からなる群より選択されるいずれか１種のアミノ酸を実質的に含まないことを特徴とする培地を提供する。該態様において、本発明の培地は、選択されない他の２種の神経分化関連アミノ酸のいずれか一方、又は両方を含んでいてもよい。
　本発明の培地は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進するための培地であり得る。本発明の培地中で、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養することにより、該細胞の神経分化能を亢進させることが可能となる。さらに、本発明の培地中で培養した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を、神経細胞へ分化させると、得られる神経細胞集団においては増殖性細胞の数が低減される。このため、神経細胞移植治療に有用な神経細胞を提供することが可能となり、神経細胞移植治療用の神経細胞の作製に適した、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を提供することができる。
　本明細書中、「培地がＬ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン及びＬ－アスパラギン酸からなる群より選択される１以上のアミノ酸を実質的に含まない」とは、該培地中で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養した時に、標準的な培地アミノ酸濃度相当（Ｌ－グルタミン　０．３－３．０ｍＭ（例、２．５ｍＭ）；Ｌ－アスパラギン　０．０５－１．０ｍＭ（例、０．０５ｍＭ）；Ｌ－アスパラギン酸　０．０５－１．０ｍＭ（例、０．０５ｍＭ））の当該選択された神経分化関連アミノ酸を含有すること以外は組成が同一な対照培地中で培養した時と比較して、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能が亢進されるのに十分な程度に、培地中の選択された神経分化関連アミノ酸の濃度が低減されていることを意味する。
　例えば、「培地がＬ－グルタミンを実質的に含まない」とは、該培地中で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養した時に、Ｌ－グルタミンを標準的な培地Ｌ－グルタミン濃度相当（０．３－３．０ｍＭ（例、２．５ｍＭ））を含有すること以外は組成が同一な対照培地中で培養した時と比較して、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能が亢進されるのに十分な程度に、培地中のＬ－グルタミン濃度が低減されていることを意味する。他の神経分化関連アミノ酸についても同様である。
　本明細書中、「Ｌ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン及びＬ－アスパラギン酸からなる群より選択される１以上のアミノ酸を実質的に含まない」とは、選択された神経分化関連アミノ酸のみならず、選択された神経分化関連アミノ酸の代替用ジペプチド（選択された神経分化関連アミノ酸残基を含むジペプチドであって、培地中でペプチダーゼ等により分解されることにより当該選択された神経分化関連アミノ酸を供給するジペプチド）等の、培地中に選択された神経分化関連アミノ酸を提供する物質をも含まないことを意味する。
　本明細書中、「Ｌ－グルタミンを実質的に含まない」とは、培地中にＬ－グルタミンのみならず、Ｌ－アラニルＬ－グルタミン等のＬ－グルタミンとアミノ酸とのジペプチド（Ｌ－グルタミン代替用ジペプチド）をも実質的に含まないことを意味する。
　本明細書中、「Ｌ－アスパラギンを実質的に含まない」とは、培地中にＬ－アスパラギンのみならず、Ｌ－アスパラギンの代替用ジペプチド（例、Ｌ－アラニルＬ－アスパラギン）をも実質的に含まないことを意味する。
　本明細書中、「Ｌ－アスパラギン酸を実質的に含まない」とは、培地中にＬ－アスパラギン酸のみならず、Ｌ－アスパラギン酸の代替用ジペプチド（例、Ｌ－アラニルＬ－アスパラギン酸）をも実質的に含まないことを意味する。
　「Ｌ－グルタミンを実質的に含まない培地」とは、該培地中のＬ－グルタミン濃度（Ｌ－グルタミンとＬ－グルタミン代替用ジペプチドとの合計濃度）が、通常、１００μＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、更に好ましくは１００ｎＭ以下であり、最も好ましくは０ｎＭである培地を指す。
　「Ｌ－アスパラギンを実質的に含まない培地」とは、該培地中のＬ－アスパラギン濃度（Ｌ－アスパラギンとＬ－アスパラギン代替用ジペプチドとの合計濃度）が、通常、１０μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、更に好ましくは１ｎＭ以下であり、最も好ましくは０ｎＭである培地を指す。
　「Ｌ－アスパラギン酸を実質的に含まない培地」とは、該培地中のＬ－アスパラギン酸濃度（Ｌ－アスパラギン酸とＬ－アスパラギン酸代替用ジペプチドとの合計濃度）が、通常、１０μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、更に好ましくは１ｎＭ以下であり、最も好ましくは０ｎＭである培地を指す。
　本明細書中、選択された神経分化関連アミノ酸を含まないとは、該神経分化関連アミノ酸の濃度が０ｎＭであることを指す。
　本明細書中、「神経分化能」とは、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞が、神経細胞へ分化する能力を意味する。
　本発明の培地は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進させる効果を有する。
　「神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進させる」とは、本発明の培地中で培養した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞と、選択された神経分化関連アミノ酸の濃度が標準的な培地アミノ酸濃度（Ｌ－グルタミン　０．３－３．０ｍＭ；アスパラギン　０．０５－１．０ｍＭ；アスパラギン酸　０．０５－１．０ｍＭ）相当であること以外は本発明の培地と同一の組成を有する比較対照培地中で培養した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞（本明細書中、単に比較対照細胞ともいう）とを、神経細胞分化条件下（例えば、Ｎ２及びＢ２７存在中）で培養して神経細胞を作製した時に、一定細胞数当たりの神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞から生じる神経細胞数が、比較対照よりも多いこと、あるいは培養開始後から一定期間に到達するまでの間に産生される神経細胞数が比較対照より多いことを意味する。
　例えば、選択された神経分化関連アミノ酸がＬ－グルタミンである場合、「神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進させる」とは、本発明の培地中で培養した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞と、Ｌ－グルタミンの濃度が標準的な培地Ｌ－グルタミン濃度相当（０．３－３．０ｍＭ（例、２．５ｍＭ））であること以外は本発明の培地と同一の組成を有する比較対照培地中で培養した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞とを、神経細胞分化条件下（例えば、Ｎ２及びＢ２７存在中）で培養して神経細胞を作製した時に、１つの神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞から生じる神経細胞数が、比較対照よりも多いこと、あるいは培養開始後から一定期間に到達するまでの間に産生される神経細胞数が比較対照より多いことを意味する。
　本発明の培地は、選択された神経分化関連アミノ酸以外の成分については、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能の亢進を達成し得る限り特に限定されず、通常の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の維持培養に使用される組成を適宜採用し得る。
　本発明の培地は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる培地の組成から、選択された神経分化関連アミノ酸を除去したものを基礎培地として調製してもよい。基礎培地としては、所望の効果を達成し得る限り特に限定されないが、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ　１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ－１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。また、多能性幹細胞培養用として通常用いられる培地の組成から選択された神経分化関連アミノ酸を除去したものを基礎培地として調製してもよい。
　市販の多能性幹細胞培養用の基礎培地である、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ培地（味の素）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　８培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＴｅＳＲ２培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＲＨＢ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，Ｉｎｃ．）、ＴｅＳＲＴＭ－Ｅ６（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｈＥＳＦ－ＧＲＯ培地（ニプロ株式会社）、ＨＥＳＦ－ＤＩＦ培地（ニプロ株式会社）、ＣＳＴＩ－７（株式会社細胞科学研究所）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　６培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等の組成から、選択された神経分化関連アミノ酸を除去したものを基礎培地として調製することもできる。
　本発明の培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、好ましくは、含有成分が化学的に決定された培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ；ＣＤＭ）である。本発明の培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、無血清培地であることが好ましい。本発明における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本発明では、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、ｂＦＧＦなどの増殖因子）を含む培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り、無血清培地に含まれる。
　無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、血清アルブミン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製：以下、ＫＳＲと記すこともある。）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ｂ２７（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｎ２（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）が挙げられるが、これらに限定されない。
　通常、本発明の培地は、全ての必須アミノ酸（Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－トリプトファン及びＬ－バリン）を含む。
　神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能の亢進を達成し得る限り特に限定されるものではないが、本発明の培地に含まれる必須アミノ酸の濃度は、それぞれ以下に例示される：
Ｌ－ロイシン　０．００５－１００ｍM、好ましくは０．５－２０ｍM；
Ｌ－リジン　０．００５－１００ｍM、好ましくは１－２０ｍM；
Ｌ－フェニルアラニン　０．００５－１００ｍM、好ましくは０．５－１０ｍM；
Ｌ－イソロイシン　０．００５－１００ｍM、好ましくは０．５－２０ｍM；
Ｌ－スレオニン　０．００５－１００ｍM、好ましくは０．５－１０ｍM；
Ｌ－ヒスチジン　０．００５－１００ｍM、好ましくは０．５－１０ｍM
Ｌ－メチオニン　０．００５－１００ｍM、好ましくは０．５－５ｍM；
Ｌ－トリプトファン　０．００５－１００ｍM、好ましくは０．０５－１ｍM；
Ｌ－バリン　０．００５－１００ｍM、好ましくは０．５－１０ｍM。
　各必須アミノ酸の濃度の組合せとしては、Ｌ－ロイシン　０．００５－１００mM、Ｌ－リジン　０．００５－１００mM、Ｌ－フェニルアラニン　０．００５－１００mM、Ｌ－イソロイシン　０．００５－１００mM、Ｌ－スレオニン　０．００５－１００mM、Ｌ－ヒスチジン　０．００５－１００mM、Ｌ－メチオニン　０．００５－１００mM、Ｌ－トリプトファン　０．００５－１００mM及びＬ－バリン　０．００５－１００mMが例示されるが、これに限定されない。
　より好ましくは、本発明の培地は、全ての必須アミノ酸（Ｌ‐ロイシン０．５－２０ｍM、Ｌ－リジン１－２０ｍM、Ｌ－フェニルアラニン０．５－１０ｍM、Ｌ－イソロイシン０．５－２０ｍM、Ｌ－スレオニン０．５－１０ｍM、Ｌ－ヒスチジン０．５－１０ｍM、Ｌ－メチオニン０．５－５ｍM、Ｌ－トリプトファン０．０５－１ｍM及びＬ－バリン０．５－１０ｍM）を含む。
　本発明の培地は、好ましくは、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン及びＬ－アスパラギン酸以外の全ての非必須アミノ酸（Ｌ－アラニン　０．２－２ｍM、Ｌ－アルギニン１－１０ｍM、グリシン１－１０ｍM、Ｌ－グルタミン酸０．５－１０ｍM、Ｌ－システイン０．５－１０ｍM、Ｌ－セリン０．５－１０ｍM、Ｌ－チロシン０．５－１０ｍM、Ｌ－プロリン０．５－５ｍM）を含む。
　本発明の培地が、Ｌ－アスパラギン及び／又はＬ－アスパラギン酸を実質的に含まず、Ｌ－グルタミンを含む場合、Ｌ－グルタミンの培地中の濃度は、０．３－３．０ｍＭであることが好ましい。
　本発明の培地が、Ｌ－グルタミン及び／又はＬ－アスパラギン酸を実質的に含まず、Ｌ－アスパラギンを含む場合、Ｌ－アスパラギンの培地中の濃度は、０．０５－１．０ｍＭであることが好ましい。
　本発明の培地が、Ｌ－グルタミン及び／又はＬ－アスパラギンを実質的に含まず、Ｌ－アスパラギン酸を含む場合、Ｌ－アスパラギン酸の培地中の濃度は、０．０５－１．０ｍＭであることが好ましい。
　本発明の培地は、上述のアミノ酸に加えて、Ｌ‐シスチン等の天然アミノ酸を含んでいてもよい。
　本発明の培地は、さらに培地添加物を含有してもよい。培地添加物としては、ビタミン類、サイトカイン及び成長因子などのタンパク質、Ｌ－アスコルビン酸、リン酸Ｌ－アスコルビルマグネシウム、ピルビン酸ナトリウム、２－アミノエタノール（エタノールアミン）、グルコース、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、インスリン、プロゲステロン、セレン酸ナトリウム、プトレシン等が挙げられるが、これらに限定されない。添加物は自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。本発明の培地は、Ｌ－アスコルビン酸を含んでもよく、含まなくてもよい。
　本発明の培地は、さらにホロトランスフェリンを含んでいてもよい。鉄と結合したトランスフェリンはホロトランスフェリン、鉄と結合していないトランスフェリンはアポトランスフェリンと呼ばれる。本明細書中、ホロトランスフェリンは、アポトランスフェリン１分子と鉄イオン１つが結合した分子、及びアポトランスフェリン１分子と鉄イオン２つが結合した分子を含む。
　本発明の培地がホロトランスフェリンを含む場合、培地に含まれるホロトランスフェリンの濃度は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能の亢進等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、０．０１～１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．１～６．５μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．１～５μｇ／ｍｌである。
　ヒトトランスフェリンをコードする核酸配列としてはＮＭ＿００１０６３（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．）が、ヒトトランスフェリンのアミノ酸配列としてはＮＰ＿００１０５４が挙げられるが、これらに限定されない。
　ホロトランスフェリンは、市販の試薬（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いることもできる。
　本発明の培地は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の継代培養に使用される増殖因子（例えば、ＥＧＦ：１０～１００ｎｇ／ｍＬ、ｂＦＧＦ：１０～１００ｎｇ／ｍｌ等）を含んでいてもよい。
　本発明の培地は、脂肪酸を含んでもよい。本発明の培地に含まれる脂肪酸としては、オレイン酸、リノール酸、α－リノレン酸、γ－リノレン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、イコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、酪酸、酢酸、パルミトレイン酸、吉草酸（バレリアン酸）、カプロン酸、エナント酸（ヘプチル酸）、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、マルガリン酸、クセン酸、エレオステアリン酸、アラキジン酸、８，１１－エイコサジエン酸、５，８，１１－エイコサトリエン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の培地に含まれる脂肪酸は飽和脂肪酸であってもよく、不飽和脂肪酸であってもよい。
　例えば、本発明の培地は、選択された神経分化関連アミノ酸（例、Ｌ－グルタミン、アスパラギン又はアスパラギン酸）を含まない基礎培地に炭酸水素ナトリウム、セレン、トランスフェリン、インスリン、ｂＦＧＦ及び２－アミノエタノールを添加して調製することができるが、これに限定されない。
　本発明の培地のｐＨは、約５．０～約８．５であることが好ましく、より好ましくは約６．０～約８．０に調整される。培地は、メンブレンフィルター等を用いた濾過滅菌などの滅菌処理を行うことが好ましい。
　本発明の培地の形態は、本発明の所望の効果が得られる限り特に限定されず、例えば、液体培地、半流動培地、及び固形培地の形態として調製することができる。また、本発明の培地を、粉末状の形態として調製してもよい。粉末状の形態に調製することにより、輸送や保存が極めて容易となり得る。かかる粉末状の培地は、使用直前に滅菌水等を添加し、必要に応じて、メンブレンフィルター等を用いて滅菌することにより、簡便に液体培地とすることができる。本発明の培地は、接着培養、浮遊培養、包埋培養、組織培養等のいずれの培養方法にも用いることができる。
　（３）神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養方法
　本発明は、上記本発明の培地中で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養することを含む、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養方法（本明細書中、本発明の培養方法ともいう）を提供する。
　本発明の培地を用いて神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養することにより、神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を得ることが可能となる。特に、本発明の培地を用いて培養した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を、神経細胞へ分化させると、増殖が抑制された神経細胞集団を得ることができるため、本発明の培養方法は、神経細胞移植用の神経細胞の作製に有用である。従って、本発明の培養方法は、好ましくは神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を製造するための方法である。また、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の維持培養において、培地中のＬ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン及びＬ－アスパラギン酸からなる群より選択される１以上のアミノ酸の濃度を、該アミノ酸が「実質的に含まれない」濃度にまで低減させて、引き続き培養することにより、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進させることができる。本発明は、このような神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能の亢進方法ともとらえることが出来る。選択した神経分化関連アミノ酸の濃度の低減は、培養に用いる培地を、選択した神経分化関連アミノ酸を所定の濃度で含有する培地から、本発明の培地に切り替えることにより実施することが出来る。神経分化関連アミノ酸を含む培地中に細胞を懸濁した溶液を、約１０倍量のΔＧｌｎ培地に懸濁することで、切り替え前の培地は１０倍程度に希釈される。通常の操作により培地交換を行えば、交換前の培地の持ちこしは多くとも１／１００容量程度と見積もられるため、例えば培地切り替えの直後～数時間後までに切り替え後の培地を本発明の培地で置換することにより、神経分化関連アミノ酸を含む培地は少なくとも１，０００倍程度に希釈されると見積もられる。上述の様に、一般的な、多能性幹細胞や神経幹細胞の維持用培地には、Ｌ－グルタミンは０．３～３．０ｍＭ程度、Ｌ－アスパラギンは０．０５～１．０ｍＭ程度、Ｌ－アスパラギン酸は０．０５～１．０ｍＭ程度含まれる。そこで、例えば、Ｌ－グルタミンを０．３～３．０ｍＭの濃度で含有する培地中で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を維持培養し、その培地を、Ｌ－グルタミンを実質的に含まない本発明の培地に交換して、引き続き維持培養を継続することにより、Ｌ－グルタミン濃度を０．３～３．０ｍＭから、例えば、１００μＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、更に好ましくは１００ｎＭ以下、更により好ましくは１ｎＭ以下であり、最も好ましくは０ｎＭにまで低減させて、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進させる。また、例えば、Ｌ－アスパラギンを０．１～１．０ｍＭの濃度で含有する培地中で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を維持培養し、その培地を、Ｌ－アスパラギンを実質的に含まない本発明の培地に交換して、引き続き維持培養を継続することにより、Ｌ－アスパラギン濃度を０．１～１．０ｍＭから、例えば、１０μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、更に好ましくは１ｎＭ以下であり、最も好ましくは０ｎＭにまで低減させて、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進させる。また、Ｌ－アスパラギン酸を０．１～１．０ｍＭの濃度で含有する培地中で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を維持培養し、その培地を、Ｌ－アスパラギン酸を実質的に含まない本発明の培地に交換して、引き続き維持培養を継続することにより、Ｌ－アスパラギン酸濃度を０．１～１．０ｍＭから、例えば、１０μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、更に好ましくは１ｎＭ以下であり、最も好ましくは０ｎＭにまで低減させて、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進させる。
　本発明の培養方法において用いられる神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、好ましくは単離されている。「単離」とは、目的とする成分や細胞以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離された神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞」の純度（全細胞数に占める神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の数の百分率）は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％である。
　本発明の培養方法における、培地中の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の濃度は、所望の効果を有する限り特に制限されないが、通常５ｘ１０３～１０５個／ｃｍ３、好ましくは、１０４～３ｘ１０４個／ｃｍ３である。
　本発明の培養方法における培養条件は、本発明の培地が用いられることを除いては、所望の効果を達成し得る限り特に限定されず、培養の目的に応じて通常の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養に用いられる培養条件を適宜採用し得る。
　本発明の培養方法において、細胞の培養に用いられる培養器は、所望の効果を達成し得る限り特に限定されず、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリディッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルなどが挙げられる。
　細胞の培養に用いられる培養器は、細胞接着性であっても細胞非接着性であってもよく、目的に応じて適宜選ばれる。
　細胞接着性の培養器は、培養器の表面の細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等の任意の細胞支持用基質又はそれらの機能をミミックする人工物でコーティングされたものであり得る。
　その他の培養条件は、適宜設定できる。例えば、培養温度は、所望の効果を達成し得る限り特に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、約１～１０％、好ましくは約２～５％である。酸素濃度は、通常１～４０％であるが、培養条件などにより適宜選択される。
　本発明の培養方法において、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、接着培養、浮遊培養、組織培養などの自体公知の方法により培養可能である。
　神経分化能の亢進などの所望の効果を達成し得る限り特に制限されるものではないが、本発明の培養方法における神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養する期間は、通常２日間以上、好ましくは４日間以上、より好ましくは８日間以上である。本発明の培地中で培養した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を回収し、その一部又は全部を新鮮な本発明の培地中に継代し、引き続き培養を続けることにより、亢進された神経分化能を維持したまま、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を継代培養することができる。
　神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を継代する場合、自体公知の方法により神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を分散処理してもよい。細胞を分散処理する方法の例としては、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）や酵素（例、トリプシン、コラゲナーゼ）等による処理、機械的な分散（例、ピペッティング）などの操作が挙げられる。
　（４）神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞からの神経細胞の作製方法
　本発明は、上記本発明の培地中で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養し、続いて神経細胞への分化誘導培養を行い神経細胞集団を得ることを特徴とする、神経細胞作製方法（本明細書中、本発明の神経細胞作製方法ともいう）を提供する。
　本明細書中、神経細胞集団とは、神経細胞を含む細胞の集団を意味する。神経細胞集団には、神経細胞以外の細胞を含み得る。神経細胞集団は、神経細胞を含む限り特に制限はないが、通常、細胞集団内の細胞の１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは４０％以上が神経細胞である。
　本発明の神経細胞作製方法を用いることにより、短期間で多くの神経細胞を高効率に作製することが可能となる。また本発明の神経細胞作製方法により得られる神経細胞集団は、神経細胞集団に含まれる増殖性細胞の割合が低いため、細胞移植治療に用いた場合に腫瘍化のリスクが低い。従って、本発明の神経細胞作製方法により作製した神経細胞は、移植治療に好適に用いられ得る。
　本発明の神経細胞作製方法は、以下の工程を含む：
（Ｉ）本発明の培地中で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養し、神経細胞分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を得ること；
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得た神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を、神経細胞分化誘導条件下で培養し、神経細胞集団を得ること。
　工程（Ｉ）は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を本発明の培地中で、神経分化能の亢進に十分な期間（例えば、２日以上、好ましくは４日以上、より好ましくは８日以上）培養することにより達成することができる。その他の培養条件は、本発明の培養方法の記載に準ずる。
　工程（ＩＩ）における神経細胞分化誘導条件は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経細胞への分化を達成し得る限り特に限定されず、所望の神経細胞への分化誘導に使用される培養条件を適宜採用し得る。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の接着培養方法の例としては、Ｆｌａｎａｇａｎ　ＬＡら，Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　Ｒｅｓ．２００６　Ａｐｒ；８３（５）：８４５－５６、Ｃｏｎｔｉ　Ｌら，ＰＬｏＳ　Ｂｉｏｌｏｇｙ．，２００５　Ｓｅｐ；３（９）：ｅ２８３などに記載の方法が挙げられる。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の浮遊培養とは、培地中において、培養器又はフィーダー細胞（用いられる場合）に対して非接着性の条件下で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養することをいう。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の浮遊培養方法の例としては、ニューロスフィア法（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ　ＢＡ　ａｎｄ　Ｗｅｉｓｓ　Ｓ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ，１９９２　Ｍａｒ　２７；２５５（５０５２）：１７０７－１０．）、無血清凝集浮遊培養法（ＳＦＥＢ法、ＳＦＥＢｑ法；Ｗａｔａｎａｂｅら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　８，２８８－２９６（２００５））などが挙げられる。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の組織培養とは、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を含む組織を、スライスなどの組織片又は組織全体として培養する方法である。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の組織培養としては、Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ　ＮＡら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９２　Ｏｃｔ　９；２５８（５０８０）：２９９－３０２．、Ｋｏｍｕｒｏ　Ｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９２　Ａｕｇ　７；２５７（５０７１）：８０６－９．に記載のスライス培養法などが挙げられる。神経細胞分化誘導条件は、当業者に周知であり、当業者は所望の神経細胞分化誘導条件を適宜採用することができる。
　工程（ＩＩ）における、培地中の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の濃度は、所望の効果を有する限り特に制限されないが、通常５ｘ１０３～１０５個／ｃｍ３、好ましくは、１０４～３ｘ１０４個／ｃｍ３である。
　工程（ＩＩ）の分化誘導培養における培養条件は、増殖性細胞の占める割合が低減される等の所望の効果を達成し得る限り特に限定されず、培養の目的に応じて公知の培養方法を適宜採用し得る。
　工程（ＩＩ）の分化誘導培養において、細胞の培養に用いられる培養器は、所望の効果を達成し得る限り特に限定されず、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリディッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルなどが挙げられる。
　細胞の培養に用いられる培養器は、細胞接着性であっても細胞非接着性であってもよく、目的に応じて適宜選ばれる。
　細胞接着性の培養器は、培養器の表面の細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等の任意の細胞支持用基質又はそれらの機能をミミックする人工物でコーティングされたものであり得る。
　その他の培養条件は、適宜設定できる。例えば、培養温度は、所望の効果を達成し得る限り特に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、約１～１０％、好ましくは約２～５％である。酸素濃度は、通常１～４０％であるが、培養条件などにより適宜選択される。
　工程（ＩＩ）の分化誘導培養において、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、接着培養、浮遊培養、組織培養などの自体公知の方法により培養可能である。
　工程（ＩＩ）の分化誘導培養において、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養する期間は、増殖性の低減された神経細胞の産生などの所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、少なくとも神経細胞が出現するまで培養が継続される。神経細胞の出現は、上述の神経細胞マーカーの発現を評価することにより確認することが出来る。
　一実施態様において、分化誘導培養は、分化誘導培地中で、神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養する。
　増殖性の低減された神経細胞の産生などの所望の効果を達成し得る限り特に制限されるものではないが、工程（ＩＩ）の分化誘導培養において分化誘導培地を用いる場合、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養する期間は、通常１０日間以上、好ましくは２１日間以上、より好ましくは６０日間以上である。分化誘導培地中で培養を行う場合、通常３日に１回、好ましくは２日に１回以上、新鮮な培地に交換する。
　分化誘導培地を用いる場合、工程（ＩＩ）において、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を分散処理し、分散処理した細胞を分化誘導培養に付すことが好ましい。分化誘導培地を用いる場合、工程（ＩＩ）は、細胞接着性の容器を用いることが好ましい。
　工程（ＩＩ）において用いられる分化誘導培地の組成は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経細胞への分化を達成し得る限り特に制限されず、公知の神経細胞分化誘導用培地を用いることができる。
　分化誘導培地は、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ等の神経幹細胞の未分化性を維持する物質を含まないことが好ましい。
　工程（ＩＩ）において用いられる分化誘導培地は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製してもよい。基礎培地としては、所望の効果を達成し得る限り特に限定されないが、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ　１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ－１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。
　工程（ＩＩ）において用いられる分化誘導培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、好ましくは、含有成分が化学的に決定された培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ；ＣＤＭ）である。分化誘導培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、無血清培地であることが好ましい。本発明における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本発明では、精製された血液由来成分や動物組織由来成分を含む培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に含まれる。
　無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、血清アルブミン、脂肪酸、非必須アミノ酸、トランスフェリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製：以下、ＫＳＲと記すこともある。）、ＧｌｕｔａｍａｘＴＭ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ｂ２７（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｎ２（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）が挙げられるが、これらに限定されない。
　工程（ＩＩ）において用いられる分化誘導培地は、さらに培地添加物を含有してもよい。培地添加物としては、ビタミン類、サイトカイン及び成長因子などのタンパク質、Ｌ－アスコルビン酸、リン酸Ｌ－アスコルビルマグネシウム、ピルビン酸ナトリウム、２－アミノエタノール、グルコース、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、インスリン、プロゲステロン、セレン酸ナトリウム、プトレシン等が挙げられるが、これらに限定されない。添加物は自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。
　工程（ＩＩ）において用いられる分化誘導培地は、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン及びＬ－アスパラギン酸を含んでいてもよい。
　工程（ＩＩ）において用いられる分化誘導培地は、脂肪酸を含んでもよい。分化誘導培地に含まれる脂肪酸としては、オレイン酸、リノール酸、α－リノレン酸、γ－リノレン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、イコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、酪酸、酢酸、パルミトレイン酸、吉草酸（バレリアン酸）、カプロン酸、エナント酸（ヘプチル酸）、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、マルガリン酸、クセン酸、エレオステアリン酸、アラキジン酸、８，１１－エイコサジエン酸、５，８，１１－エイコサトリエン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。分化誘導培地に含まれる脂肪酸は飽和脂肪酸であってもよく、不飽和脂肪酸であってもよい。
　分化誘導培地のｐＨは、約５．０～約８．５であることが好ましく、より好ましくは約６．０～約８．０に調整される。培地は、メンブレンフィルター等を用いた濾過滅菌などの滅菌処理を行うことが好ましい。
　本発明の一実施態様として、分化誘導培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を基礎培地とし、トランスフェリン、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｂ２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、グルコース、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、インスリン、プロゲステロン、亜セレン化ナトリウム及びプトレシンを含む。
　上記の培地を用いる場合、工程（ＩＩ）における、細胞を培養する期間は、神経細胞への分化誘導を達成し得る限り特に限定されないが、通常は、１０日以上、好ましくは２１日以上、より好ましくは６０日以上である。
　工程（ＩＩ）は、特定の種類の神経細胞に分化させるものであってもよい。
　本発明の神経細胞作製方法は、工程（Ｉ）、（ＩＩ）に続いて、さらに工程（ＩＩＩ）神経細胞集団から神経細胞を単離する工程を含み得る。
　神経細胞集団からの神経細胞の単離は、自体公知の方法により行うことができる。
　神経細胞集団から神経細胞を単離する方法の例としては、所望の神経細胞特異的に存在する細胞外抗原に対する抗体を用いてフローサイトメトリーにより単離する方法、所望の神経細胞特異的に存在する細胞外抗原に対する抗体を結合させたマイクロビーズにより単離する方法等が挙げられるが、これらに限定されない。
　神経細胞集団の単離は、混入が予測される神経前駆細胞及び神経幹細胞を除去することによっても達成され得る。
　（５）神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞
　本発明は、上記本発明の培養方法によって得られる、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞（本発明の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞）を提供する。
　前述のとおり、本発明の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、神経分化能が亢進している。
　本発明の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を本発明の培地中で、通常は、２日以上、好ましくは４日以上、より好ましくは８日以上培養することにより得ることができる。その他の培養条件は、本発明の培養方法の記載に準ずる。
　本発明の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、好ましくは単離されている。「単離」とは、目的とする成分や細胞以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離された神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞」の純度（全細胞数に占める神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の数の百分率）は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％である。
　一実施態様として、本発明の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は凍結保存させた状態で提供され得る。本発明の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、凍結保存することが可能であり、必要に応じて融解・起眠して使用することができる。凍結保存は、自体公知の細胞凍結保存方法を使用することができる。凍結保存の例としては、本発明の組成物にジメチルスルホキシドを加え、－８０～－２００℃、好ましくは－１９６℃（液体窒素中）の条件で本発明の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を保存する。
　（６）神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞培養調製物
　本発明は、上記本発明の培地及び神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を含む、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞培養調製物（本発明の培養調製物）を提供する。
　本発明の培養調製物における神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、生存し、増殖している細胞である。
　本発明の培養調製物における神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、好ましくは単離されている。「単離」とは、目的とする成分や細胞以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離された神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞」の純度（全細胞数に占める神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の数の百分率）は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％である。
　本発明の培養調製物において、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、本発明の培地中に存在する。一態様において、本発明の培養調製物は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の、本発明の培地中の懸濁液である。本発明の培養調製物は、適切な容器中に封入されていてもよい。
　本発明の培養調製物は、上記本発明の培養方法の実施に有用である。
　一実施態様として、本発明の培養調製物は凍結保存させた状態で提供され得る。本発明の培養調製物は、凍結保存することが可能であり、必要に応じて融解・起眠して使用することができる。凍結保存は、自体公知の細胞凍結保存方法を使用することができる。凍結保存の例としては、本発明の培養調製物にジメチルスルホキシドを加え、－８０～－２００℃、好ましくは－１９６℃（液体窒素中）の条件で本発明の培養調製物を保存する。
　以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：グルタミンを実質的に含まない培地での神経幹細胞の培養法
　（１）Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ　ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗｉｎｇ　ｎｅｕｒｏ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｌｉｋｅ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ（以下ＬｔＮＥＳ細胞）誘導法
　ｉＰＳ細胞よりＥＢ（ｅｍｂｒｙｏｉｄ　ｂｏｄｙ）を形成させ、Ｅ６培地（Ｌｉｆｅ　ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からアスコルビン酸及びトランスフェリンを除いた組成に相当する培地にトランスフェリン（終濃度０．５～１０μｇ／ｍＬ）、エタノールアミン（終濃度５～５０μＭ）、ヒト血清アルブミン（終濃度０．１～５ｍｇ／ｍＬ）を添加した培地中にて、４日間培養した。ポリ－Ｌ－オルニチン（ＰＯ）コートしたｄｉｓｈにＥＢを播種し、上記培地中で１０日程度培養し、Ｒｏｓｅｔｔｅ様の構造が形成されることを確認した。Ｒｏｓｅｔｔｅ部分をくり抜き、ニューロスフィアとして上記培地中で浮遊培養を７日程度行った。ニューロスフィアをトリプシン／ＥＤＴＡにて分散し、ＰＯ／ラミニンコートしたｄｉｓｈ上でＲＨＢ－Ａ培地中にて培養し、ＬｔＮＥＳ細胞を作成した。
　（２）ＬｔＮＥＳ細胞の培養法
　Ｅ６培地（Ｌｉｆｅ　ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からアスコルビン酸、トランスフェリン及びＬ－グルタミンを除いた組成に相当する培地に、トランスフェリン（終濃度０．５～１０μｇ／ｍＬ）、エタノールアミン（終濃度５～５０μＭ）、ヒト血清アルブミン（終濃度０．１～５ｍｇ／ｍＬ）、２０ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦを添加して、Ｌ－グルタミン不含培地（ΔＧｌｎ培地）を作製した。また、Ｌグルタミン（０．３－３．０ｍＭ）を含有すること以外は、ΔＧｌｎ培地と組成が同一な対照培地（Ｆｕｌｌ培地）を作製した。
　ヒト多能性幹細胞より誘導したＬｔＮＥＳ細胞をＦｕｌｌ培地に懸濁し、細胞懸濁液を作製した。Ｆｕｌｌ培地又はΔＧｌｎ培地に対して１／１０量の該細胞懸濁液を加え、３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養を行った。交換前の培地の持ち込みを減らすため、培養開始２時間後に培地交換を実施し、さらに培養を続けた。このため、交換前の培地は少なくとも１，０００倍程度には希釈されていると見積もられる。ＬｔＮＥＳ細胞の継代には、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ内で、３７℃、１分間インキュベートを行い、培地で希釈し、その後ピペッティングを行い、単一の細胞とした。１．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ）で上記培地中に分散させた細胞を播種し３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養を行った。細胞数測定は、トリパンブルー（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による死細胞染色を行った上で、血球計算盤で行った。
　培養４日後の神経幹細胞の顕微鏡像を図１Ａに示す。ΔＧｌｎ培地中で４日間培養した神経幹細胞は、Ｆｕｌｌ培地で培養した神経幹細胞と同様の形態を示した。
実施例２：神経系細胞誘導の促進効果の検証
　Ｌ－グルタミン不含培地で培養した細胞の分化能を検証するため、分化誘導実験を行った。
　実施例１と同様に、ｉＰＳ細胞より神経幹細胞を誘導し、Ｌ－グルタミン不含培地（ΔＧｌｎ培地）又は対照培地（Ｆｕｌｌ培地）中で４日間培養を行った。
　培養後、培地の代わりにＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃、１分間インキュベートして細胞分散処理を行った。ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを培地で希釈後、ピペッティングを行い、ポリＬオルニチン／フィブロネクチンでコートした４８ウェルプレートに１．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。Ｌ－グルタミンを含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、１ｘＮ２サプリメント（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１ｘＢ２７サプリメント（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した分化誘導培地中でＤａｙ４～Ｄａｙ２５までの２１日間培養した。細胞の培養は、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下のインキュベーター内で行った。培地交換は２日に一度行った。
　分化誘導培養後の細胞からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに転写後、ｑＰＣＲを行い、Ｎｅｕｒｏ　Ｄ１（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　１）、ｓｙｎａｐｓｉｎ　１の発現強度を測定した。また、分化誘導培養後の細胞を固定し、神経細胞マーカーであるβＩＩＩチューブリンに対する抗体を用いた蛍光抗体法により免疫染色を行った。
　免疫染色の結果を図１Ｃに示す。分化誘導後の細胞には、βＩＩＩチューブリン陽性である分化した神経細胞が含まれていることが示された。ΔＧｌｎ培地で培養した神経幹細胞は、Ｆｕｌｌ培地中で培養した神経幹細胞より、多くの分化した神経細胞を産生した。従って、ΔＧｌｎ培地は、神経幹細胞の分化促進作用を有することが示された。
　ｑＰＣＲの結果を図１Ｄに示す。Ｌ－グルタミンをΔＧｌｎ培地で培養した神経幹細胞から誘導された神経細胞中では、神経細胞マーカーであるＳｙｎａｐｓｉｎ１、及び神経前駆細胞マーカーであるＮｅｕｒｏＤ１の発現が亢進していた。
実施例３：神経細胞の増殖性の抑制効果の検証
　実施例１に記載の神経幹細胞培養方法に従って、対照培地（Ｆｕｌｌ培地）又はＬ－グルタミン不含培地（ΔＧｌｎ培地）中で、神経幹細胞を４日間培養した。培養した細胞を、４%-パラホルムアルデヒドりん酸緩衝液によって室温で２０分間固定した。固定した細胞はＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した後、エタノール中で室温にて５分間インキュベートし、風乾させた。その後、細胞を０．４％クリスタルバイオレットメタノール溶液（和光純薬：０３８－０４８６２）で２０分間染色し、純水で洗浄を行った。１％ＳＤＳ水溶液を３５０μＬ加えて２０分間振とうすることでクリスタルバイオレットを溶出し、溶出液の５７０ｎｍ吸光度をマイクロプレートリーダーＳＨ―９０００（コロナ電気社）で測定することにより、細胞数の定量を行った。
　結果を図１Ｂに示す。ΔＧｌｎ培地中で４日間培養した時の神経幹細胞の数は、Ｆｕｌｌ培地中で培養した場合よりも少なかった。従って、ΔＧｌｎ培地は、神経幹細胞の増殖を抑制することが示された。
実施例４：神経幹細胞の増殖効果の検証
　実施例１に記載の神経幹細胞培養方法に従って、対照培地（Ｆｕｌｌ培地）又はＬ－グルタミン不含培地（ΔＧｌｎ培地）中で、神経幹細胞を４日間培養した。その後２０日(ｔｏｔａｌ　５継代)まで培養し、培養４日目、８日目、１２日目、１６日目、２０日目で細胞数の計測を行った。
　結果を図１Ｅに示す。ΔＧｌｎ培地中で培養した神経幹細胞の数は直線的な増殖を示した(図１Ｅ)。
実施例５：培地中のアミノ酸の分析
　実施例１に記載の神経幹細胞培養方法に従って、対照培地（Ｆｕｌｌ培地）又はＬ－グルタミン不含培地（ΔＧｌｎ培地）中で、神経幹細胞を４日間以上培養した。培養した細胞を、培地除去後氷冷メタノールを用いて溶解し、回収した。細胞内のアミノ酸量、TCAサイクルに関するケト酸及び有機酸量を分析した。以下に、アミノ酸、ケト酸、有機酸の分析手順を示す。
〈アミノ酸の分析手順〉
試料溶液の誘導体化反応
　検体を１０μＬ採取し、内標準溶液を１０μＬ加え、アミノタグワコー　ＡＰＤＳタグワコー用ホウ酸緩衝液（和光純薬製）を６０μＬ入れ振とうし、さらにアミノタグワコー　アミノ酸分析試薬（ＬＣ/ＭＳ用）（和光純薬製）を２０μＬ加え激しく振とうした。
　その後、ブロックヒーターを用いて５５℃で１０分間加熱した。冷却後、反応溶液に希釈液を４００μＬ加え振とうし、分析試料とした。
誘導体化反応溶液の分析
　試料は、移動相としてＡ液にアミノタグワコー　ＡＰＤＳタグワコー用溶離液（和光純薬製）、Ｂ液にアセトニトリル６００μＬと水４００μＬを混合したものを用い、固定相にＣ８カラムを使用してＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムに導入し、各アミノ酸の質量数で検出した。
　また内標準として、アミノタグワコー　ＡＰＤＳタグワコー用アミノ酸内部標準混合液（和光純薬製）Ｎｏ．１を650μｌ採取し、Ｎｏ．２　５０μＬを添加し、５０μＭ Ｐｕｔ－ｄ８と水を１：１：８の割合で混合した物を用いた。
分析装置
　分析装置は、ＡＰＩ４０００　ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（ＡＢ　ＳＣＩＥＸ製）を用いた。
　結果を図２に示す。ΔＧｌｎ培地中で培養した細胞の細胞内アミノ酸含有量が変化しており、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、アスパラギンに関して有意な上昇が観察された。またグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸に関して有意な減少が観察された。
〈ケト酸の分析手順〉
誘導体化試薬溶液の調製
　Ｏ‐（２，３，４，５，６－ペンタフルオロベンジル）－ヒドロキシルアミン１０ｍｇを０．１％水酸化ナトリウム水溶液とアセトニトリルを等量ずつ混合した溶液１ｍＬに溶解し誘導体化試薬溶液とした。
試料溶液の誘導体化反応
　反応バイアルに試料溶液２０μＬを入れ、誘導体化試薬溶液２０μＬを加え、よく撹拌した後、氷水中で３０分間静置し誘導体化反応を行った。その後、アセトンとアセトニトリルを等量ずつ混合した溶液を１０μＬ加え、誘導体化反応を停止させた。その後、０．１％水酸化ナトリウム水溶液とアセトニトリルを等量ずつ混合した溶液５０μＬを加え、希釈した溶液を分析試料とした。
誘導体化反応溶液の分析
　移動相としてＡ液に２５ｍＭギ酸水溶液、Ｂ液にアセトニトリル、固定相にＰｈカラムを使用し、分析試料をＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムに導入し、各ケト酸に対応した質量数で検出した。
分析装置
　分析装置は、ＡＰＩ４０００　ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（ＡＢ　ＳＣＩＥＸ製）を用いた。
〈有機酸の定量手順〉
誘導体化試薬溶液の調製
　３－ピコリルアミン１０ｍｇを５％のトリエチルアミンを含むＤＭＳＯ溶液に２００ｍＭになるように溶解し誘導体化試薬溶液とした。
縮合剤溶液の調製
　４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルフォリニウム塩酸塩を５０ｍＭになるようにＤＭＳＯに溶解し縮合剤溶液とした。
内標準溶液の調製
　各有機酸の安定同位体標識化合物の濃度が１００μＭになるように蒸留水に溶解し、内標準原液とした。各内標準原液を等量分取し、最終濃度が１０μＭになるように蒸留水を加え、内標準溶液とした。
試料溶液の誘導体化反応
　反応バイアルに試料溶液１００μＬを入れ、内標準溶液１０μＬを加え、よく撹拌した後、ロータリーエバポレターで減圧乾固した。減圧乾固した試料に１０μＬの５０％アセトニトリル溶液と１５μＬの誘導体化試薬溶液及び３０μＬの縮合剤溶液を加え、溶解した後、８０℃で６０分加熱し誘導体化を行った。反応溶液３０μＬをバイアルに分取し、５０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液１２０μＬを加え、希釈した溶液を分析試料とした。
誘導体化反応溶液の分析
　移動相としてＡ液にｐＨ６に調整した２５ｍＭギ酸アンモニウム水溶液、Ｂ液にアセトニトリル、固定相にＣ８カラムを使用し、分析試料をＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムに導入し、各有機酸に対応した質量数で検出した。
分析装置
　分析装置は、ＡＰＩ４０００　ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（ＡＢ　ＳＣＩＥＸ製）を用いた。
　結果を図３に示す。ΔＧｌｎ培地中で培養した細胞の細胞内のTCAサイクルに関連する有機酸含有量が変化しており、ピルビン酸に関して有意な上昇が観察された。またαケトグルタル酸、クエン酸、イソクエン酸、フマル酸、リンゴ酸に関して有意な減少が観察された。
実施例６：Ｌ－グルタミン除去培地培養細胞の細胞死の有無の検証
　実施例１に記載の神経幹細胞培養方法に従って、対照培地（Ｆｕｌｌ培地）又はＬ－グルタミン不含培地（ΔＧｌｎ培地）中で、神経幹細胞を４日間培養した。培養した細胞を、４％パラホルムアルデヒドりん酸緩衝液によって室温で２０分間固定した。固定した細胞はＰＢＳで洗浄した後、ａｐｏｐｔｏｓｉｓマーカーであるｃｌｅａｖｅｄ　ｃａｓｐａｓｅ－３に対する抗体及び核染色剤であるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて免疫染色を行った。結果を図４に示す。
　Ｌ－グルタミン不含培地中で培養した神経幹細胞（ΔＧｌｎ）、及びＬ－グルタミン含有培地中で培養した神経幹細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ）のいずれにおいても、アポトーシスはほとんど観察されなかった。培地中のＬ－グルタミンの有無に関わらずアポトーシスはほとんど起こっていなかった。従って、Ｌ－グルタミン不含培地において、感受性の高い一部の細胞の細胞死が起こっているわけではないことが示された。
実施例７：各非必須アミノ酸除去培地による神経分化促進効果の検証
　実施例１に記載のＦｕｌｌ培地から、各必須アミノ酸（グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、セリン又はプロリン）を除いた組成の培地を作製した。実施例１と同様に、ｉＰＳ細胞より神経幹細胞を誘導し、各非必須アミノ酸除去培地又はＦｕｌｌ培地中で８－１２日間培養を行った。
　培養後、培地の代わりにＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃、１分間インキュベートして細胞分散処理を行った。ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを培地で希釈後、ピペッティングを行い、ポリＬオルニチン／フィブロネクチンでコートした４８ウェルプレートに１．５ｘ１０５　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１ｘＮ２サプリメント（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１ｘＢ２７サプリメント（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した培地中で２０日間培養した。細胞の培養は、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下のインキュベーター内で行った。培地交換は２日に一度行った。
　培養後の細胞を固定し、神経細胞マーカーであるβＩＩＩチューブリンに対する抗体を用いた蛍光抗体法により免疫染色を行った。βＩＩＩチューブリン陽性細胞の神経突起長を画像解析により定量した結果を表１に示す。表１中の記号はコントロール（Ｆｕｌｌ）を1としたときの相対的な平均神経突起長を、＋＋：＞１．５、＋：１．５～０．３、－：０．３＞として示した。グルタミンを含まない培地、アスパラギン酸を含まない培地、及びアスパラギンを含まない培地は、神経幹細胞の神経分化能を亢進させる作用を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明によれば、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進させることが可能となり、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞培養にかかる人的コスト及び金銭的コストを削減することができる。
　本出願は、日本で出願された特願２０１６－０７１９６７（出願日：２０１６年３月３１日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (13)

  1. 　Ｌ－グルタミンを実質的に含まない、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞培養用培地。
  2. 　Ｌ－グルタミン濃度が１００μＭ以下である、請求項１に記載の培地。
  3. 　Ｌ－グルタミンを含まない、請求項１又は２に記載の培地。
  4. 　ホロトランスフェリンを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の培地。
  5. 　Ｌ－トリプトファン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン及びＬ－ヒスチジンを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の培地。
  6. 　神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の神経分化能を亢進するための培地である、請求項１～５のいずれか一項に記載の培地。
  7. 　無血清培地である、請求項１～６のいずれか一項に記載の培地。
  8. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の培地中で、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養することを含む、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養方法。
  9. 　神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を製造するための方法である、請求項８記載の方法。
  10. 　培養期間が４日以上である、請求項８又は９記載の方法。
  11. 　以下の工程を含む神経細胞の作製方法：
    （Ｉ）請求項１～７のいずれか一項に記載の培地中で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養し、神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を得ること；
    （ＩＩ）工程（Ｉ）で得た神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を、神経細胞分化誘導条件下で培養し、神経細胞集団を得ること。
  12. 　請求項９の方法により得られる、神経分化能が亢進した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞。
  13. 　神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞、及び請求項１～７のいずれか一項に記載の培地を含んでなる、培養調製物。
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