KR20180132787A - 신경 분화능을 항진시키는 신경 줄기 세포용 배지 - Google Patents

신경 분화능을 항진시키는 신경 줄기 세포용 배지 Download PDF

Info

Publication number
KR20180132787A
KR20180132787A KR1020187031746A KR20187031746A KR20180132787A KR 20180132787 A KR20180132787 A KR 20180132787A KR 1020187031746 A KR1020187031746 A KR 1020187031746A KR 20187031746 A KR20187031746 A KR 20187031746A KR 20180132787 A KR20180132787 A KR 20180132787A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
medium
cells
neural
stem cells
neural stem
Prior art date
Application number
KR1020187031746A
Other languages
English (en)
Inventor
타쿠야 마쓰모토
이쿠에 하라타
쇼 센다
Original Assignee
아지노모토 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아지노모토 가부시키가이샤 filed Critical 아지노모토 가부시키가이샤
Publication of KR20180132787A publication Critical patent/KR20180132787A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0031—Serum-free culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0623—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은, L-글루타민, L-아스파라긴 및 L-아스파라긴산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 실질적으로 포함하지 않는 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포 배지, 및 당해 배지를 사용한 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 배양 방법 등을 제공한다.

Description

신경 분화능을 항진시키는 신경 줄기 세포용 배지
본 발명은 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 배양 배지, 및 배양 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 분화능을 항진시키는 배지 및 당해 배지를 사용하여 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 분화능을 항진시키는 방법 등에 관한 것이다.
근위축성 측색 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병 등의 난치성 신경 질환이나 신경 손상을 치료하는 방법의 하나로서, 최근, 신경 세포나 신경 줄기 세포를 생체로 이식하는 방법의 개발에 기대가 모아지고 있다. 신경 줄기 세포란, 자기 복제능을 갖고, 다분화능(multipotency)을 갖는 미분화된 세포이며, 신경계의 다양한 세포(신경 세포 및 신경 전구 세포(neural progenitor), 및 신경아교 세포(glial cell)(아스트로사이트, 올리고덴드로사이트 등), 및 신경아교 전구 세포 등)을 만들어내는 능력을 가진 세포이다. 신경 줄기 세포 및 신경 전구 세포는, 그 자체를 이식하는 것 외에, 신경 세포 등의 통상 성체에서 증식하기 어려운 세포를 공급할 수 있기 때문에, 재생 의료에서의 생체 재료의 제공원으로서 주목을 모으고 있다.
신경 줄기 세포는 증식능과 다분화능을 갖기 때문에, 생체에 이식하면 생체 내에서 기능적인 신경계 세포를 생산할 수 있다고 여겨지고 있지만, 한편으로 증식 능이 있는 신경 줄기 세포를 이식함으로써 종양화되는 것이 우려된다. 이 때문에, 미리 시험관내에서(in vitro) 신경 줄기 세포로부터 분화시킨 신경 전구 세포를 재생 의료에 사용하는 것이 검토되고 있지만, 이 경우도 작제한 신경 전구 세포에 증식능이 있는 세포가 혼입되어 잔존할 리스크가 있다. 이식 후의 신경 세포 중에 증식성의 세포가 혼입되어 종양을 형성하는 것을 피하기 위해서는 증식성의 세포를 가능한 포함하지 않도록 하는 것이 중요하다. 비증식성의 신경 세포에 의한 치료를 행할 경우에는 신경 줄기 세포로부터 신경 세포로 고효율로 분화 가능한 것이 중요하다. 따라서, 신경 줄기 세포로부터 신경계 세포를 고효율로 생산시키는 방법의 개발이나, 얻어진 분화 후의 신경계 세포 중에 포함되는 증식성의 세포를 저감시키는 것과 같은 신경계 세포의 조제 방법의 개발이 중요한 과제가 된다.
그런데, 글루타민을 포함하지 않는 배지에 대하여, 지금까지 몇가지의 보고가 이루어져 있다.
비특허문헌 1에는, 혈구계의 세포인 인간 적백혈병 세포주 K562 세포를 글루타민 불포함 배지에서 배양했을 때에 적혈구로의 분화가 촉진되는 것이 기재되어있다.
또한 비특허문헌 2에는, 래트(rat)의 신경교종(glioma) 세포인 C6 신경교종 세포를 글루타민 불포함 배지에서 배양하면 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte)와 같은 세포로의 분화가 촉진되는 것이 기재되어 있다.
하지만, 글루타민, 아스파라긴 및 아스파라긴산으로 이루어진 하나 이상의 아미노산을 포함하지 않는 배지가 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 분화능이나 신경 세포 생산능에 어떤 영향을 주는지에 대해서는 전혀 밝혀져 있지 않다.
비특허문헌 1: Canh Hiep N 등, 「Depletion of glutamine enhances sodium butyrate-induced erythroid differentiation of K562 cells.」 The Journal of Biochemistry. 2012 Dec; 152(6):509-519. 비특허문헌 2: Martin M 등, 「Energetic and morphological plasticity of C6 glioma cells grown on 3-D support; effect of transient glutamine deprivation.」Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 1998 Dec; 30(6):565-78.
본 발명의 목적은, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 분화능을 항진시키는 것이 가능한 배지 및 당해 배지를 사용하여 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 분화능을 항진시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 상기 목적을 달성하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, L-글루타민, L-아스파라긴 및 L-아스파라긴산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 제거한 배지 중에서 신경 줄기 세포를 배양하면, 당해 세포의 증식능이 억제되고, 또한 당해 세포의 신경 분화능이 항진되는 것을 발견하였다. L-글루타민, L-아스파라긴 및 L-아스파라긴산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 제거한 배지를 사용하면, 항진된 신경 분화능을 유지한 채로 신경 줄기 세포를 계대(繼代; passage)할 수 있었다. 신경 분화능이 항진된 신경 줄기 세포로부터 신경 세포로 분화시키면, 증식성이 낮고 분화된 세포의 비율이 많은 신경 세포 집단을 얻을 수 있었다. 이러한 지견에 기초하여, 더욱 검토를 거듭하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) L-글루타민을 실질적으로 포함하지 않는, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포 배양용 배지.
(2) L-글루타민 농도가 100μM 이하인, (1)에 기재된 배지.
(3) L-글루타민을 포함하지 않는, (1) 또는 (2)에 기재된 배지.
(4) 홀로트랜스페린(holotransferrin)을 포함하는, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 배지.
(5) L-트립토판, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-트레오닌, L-발린, L-류신, L-이소류신 및 L-히스티딘을 포함하는, (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 배지.
(6) 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 분화능을 항진하기 위한 배지인, (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 배지.
(7) 무혈청 배지인, (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 배지.
(8) (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 배지 중에서 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 배양하는 것을 포함하는, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 배양 방법.
(9) 신경 분화능이 항진된 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 제조하기 위한 방법인, (8)에 기재된 방법.
(10) 배양 기간이 4일 이상인, (8) 또는 (9)에 기재된 방법.
(11) 이하의 공정을 포함하는 신경 세포의 작제 방법:
(Ⅰ) (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 배지 중에서 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 배양하여, 신경 분화능이 항진된 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 얻는 공정;
(Ⅱ) 공정 (Ⅰ)에서 얻은 신경 분화능이 항진된 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 신경 세포 분화 유도 조건 하에서 배양하여 신경 세포 집단을 얻는 공정.
(12) (9)의 방법에 의해 얻어지는, 신경 분화능이 항진된 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포.
(13) 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포, 및 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 배지를 포함하여 이루어진, 배양 조제물.
본 발명의 배지는, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 분화능을 항진시키는 효과를 갖는다. 본 발명의 배양 방법에 의해, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 배양하면, 증식능이 억제되어 있지만 신경 분화능이 항진된 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 얻을 수 있다. 신경 분화능이 항진된 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포는 분화 유도 배양에 의해 많은 신경 세포를 생산하므로, 효율적으로 신경 세포를 작제하는 것이 가능해진다. 또한, 이렇게 작제된 신경 세포 집단은 증식성의 세포가 적기 때문에 신경 세포를 생체에 이식했을 때의 종양화의 리스크가 경감되어 보다 안전한 치료 방법의 개발에 공헌할 수 있다.
[도 1] 도 1은 L-글루타민 제거 배지에 의한 신경 분화의 촉진 효과를 나타내는 도면이이다. L-글루타민을 포함하는 배지(완전) 또는 L-글루타민을 포함하지 않는 배지(ΔGln)에서 신경 줄기 세포를 4일간 배양하였다(4일째)(도 1A 및 도 1B). L-글루타민을 포함하지 않은 배지에서 배양한 신경 줄기 세포에서는 신경 줄기 세포의 증식성이 저하되어 있었다(도 1B). 상기 배지에서 4일간 배양 후, 신경 분화 유도 배지로 바꾸어 21일간 배양하고(25일째), 신경 세포를 면역염색하였다. L-글루타민을 포함하는 배지(완전)와 비교하여, L-글루타민을 포함하지 않는 배지(ΔGln)에서 배양한 신경 줄기 세포는, 많은 신경 세포를 생산하였다(도 1C). 도 1D에 NeuroD1, Synapsin1의 발현 강도를 나타낸다. 도 1D 중, 각 항목의 왼쪽 바(bar)가 완전, 오른쪽 바가 ΔGln을 나타낸다. L-글루타민을 포함하지 않는 배지에서 20일간 배양한 신경 줄기 세포의 증식 곡선은 직선성을 나타냈다(도 1E).
[도 2] 도 2는 세포내 아미노산 함유량의 분석 결과를 나타내는 도면이다. 가로축: 정량한 아미노산, 세로축: 세포수당 아미노산 함유량(nmol/1×106세포). 각 항목의 왼쪽 바가 완전, 오른쪽 바가 ΔGln을 나타낸다.
[도 3] 도 3은 세포수당의 TCA 사이클 중의 유기산 함유량을 나타내는 도면이다. 각 항목의 왼쪽 바가 완전, 오른쪽 바가 ΔGln을 나타낸다.
[도 4] 도 4는 신경 줄기 세포에서의 아폽토시스(apoptosis)를 나타내는 도면이다.
본 발명은, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포 배양용 배지(이하, 이것들을 총칭하여 본 발명의 배지라고도 함), 당해 배지를 사용한 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 배양 방법(이하, 이들을 총칭하여 본 발명의 배양 방법이라고도 함) 및 당해 방법에 의해 얻어지는, 신경 분화능이 항진된 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포 등을 제공한다.
(1) 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포
본 명세서 중 신경 줄기 세포란 신경계 세포(신경 세포 및 신경아교 세포(아스트로사이트(astrocyte), 올리고덴드로사이트 등) 및 이들의 전구 세포)로의 다분화능(multipotency)을 유지하고 자기 복제능을 갖는 미분화된 세포를 의미한다. 구체적으로는, 신경 줄기 세포란, 신경 세포 및 신경아교 세포(아스트로사이트, 올리고 덴드로사이트 등)을 최종적으로 만들어내는 능력을 갖고, 또한 초기화 등의 특별한 조작을 가하지 않는 한에 있어서, 표피계 세포, 혈구계 세포, 근육 세포 등의 신경계 이외의 세포를 실질적으로 만들어내지 않는 세포이다. 실질적으로 만들어내지 않는다란, 신경 줄기 세포가 만들어내는 세포 중 90% 이상이 신경 세포 및 신경아교 세포(아스트로사이트, 올리고덴드로사이트 등) 및 이들의 전구 세포 중 어느 하나인 상태를 가리킨다.
본 명세서 중 신경 전구 세포(neural progenitor)란, 분열능을 갖는 미분화된 세포로서 1종 이상의 신경 세포로 최종적으로 분화하는 능력을 갖는 세포를 가리킨다. 신경 전구 세포는, 신경 세포를 최종적으로 만들어내도록 운명이 결정되고, 또한 신경 세포 및 이의 전구 세포 이외를 실질적으로 만들어내지 않는 세포를 가리킨다. 신경아교 전구 세포(glial progenitor)란, 신경 줄기 세포에서 유래하고, 분열능을 갖는 미분화된 세포로서 아스트로사이트, 올리고덴드로사이트, 마이크로글리아(microglia), 상의 세포(ependymal cell), 슈반 세포(Schwann cell) 중 하나 또는 이들의 전구 세포로 분화하는 능력을 갖고, 또한 신경 세포로 실질적으로 분화하지 않는 세포를 가리킨다.
신경 줄기 세포 및 신경 전구 세포는 엄밀하게 구별하는 것이 곤란하기 때문에, 본 명세서 중 「신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포」로서 구별 없이 사용되는 경우가 있다.
본 발명에서는, 통상, 포유 동물 유래의 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포가 사용된다. 포유 동물로서는 예를 들어 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트 등의 설치류, 토끼 등의 토끼목, 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 유제목, 개, 고양이 등의 식육목(carnivora), 인간, 원숭이, 히말라야 원숭이(Macaca mulatta), 마모셋, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류 등이 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용되는 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포는 바람직하게는 마우스 등의 설치류 또는 인간 등의 영장류의 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포이며, 보다 바람직하게는 인간 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포이다.
본 발명에 사용되는 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포는 다능성 줄기 세포 유래의 것, 생체 조직으로부터 분리한 것, 섬유아세포 등으로부터 다능성 줄기 세포를 경유하지 않고 직접 분화 유도한 것(Matsui T 등, Stem Cells. 2012 Jun; 30 (6): 1109-19) 등이 열거되고, 상기에 기재된 미분화능을 유지하고 다분화능을 유지하는 세포로서 신경 세포를 만들어내는 능력을 유지하는 한, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 사용되는 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포는 바람직하게는 다능성 줄기 세포 유래의 것이며, 보다 바람직하게는 유도 다능성 줄기 세포(iPS 세포) 유래의 것이다.
다능성 줄기 세포로부터 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 작제하는 방법으로서는 자체 공지의 방법을 사용할 수 있다. 다능성 줄기 세포 유래의 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 작제 방법의 예로서는 다능성 줄기 세포의 부유 배양을 행하여 배엽체 형성을 경유하여 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 형성시키는 방법(Bain G 등, Dev Biol. 1995 Apr; 168(2): 342-57 등), 스토로마 세포(stromal cell) 등을 피더 세포(feeder cell)로서 사용하는 방법, bFGF를 포함하는 무혈청 배지 중에서 다능성 줄기 세포의 부유 배양을 행하는 방법(Watanabe K 등, Nat Neurosci. 2005 Mar; 8(3): 288-96 등), SMAD 시그널 저해제 Noggin 및 SB431542의 존재 하에서 다능성 줄기 세포(ES 세포 등)를 접착 배양하는 방법(Chambers SM 등, Nat Biotechnol. 2009 Mar; 27(3): 275-80), 단층 배양 한 다능성 줄기 세포(ES 세포 등)를 글리코겐 신타제 키나제 3(glycogen synthase kinase 3)(GSK3) 저해제, 형질전환 성장인자 β(transforming growth factor β)(TGF-β) 저해제, Notch 시그널 저해제 존재 하에서 배양하는 방법(Li W 등, Proc Natl Acad Sci USA. 2011 May 17; 108(20): 8299-304) 등이 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 명세서 중 다능성 줄기 세포란, 자기 복제능 및 분화/증식능을 갖는 미숙 한 세포로서 태반을 제외한 생체를 구성하는 모든 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 다능성 줄기 세포의 예로서는, 배아성(embryonic) 줄기 세포(ES 세포), 유도 다능성 줄기 세포(iPS 세포)(Takahashi K 등, Cell. 2007 Nov 30; 131(5): 861-72), 정자 줄기 세포(mGS 세포)(Kanatsu-Shinohara M 등, Biol Reprod. 2007 Jan; 76(1): 55-62), 배아성 생식 세포(Matsui Y 등, Cell. 1992 Sep 4; 70(5): 841-7) 등이 열거된다.
세포가 신경 줄기 세포인 것은, 예를 들어, 세포를 EGF 및 bFGF를 포함하는 무혈청 배지 중에서 부유 배양하고, 배양한 세포괴를 분산 처리 후에 후술하는 실시예에 기재된 분화 유도 배지 중에서 접착 배양을 행하고, 신경 세포 및 신경아교 세포 둘 다 생산하는 것을 지표로서 확인할 수 있다.
또한, 신경 줄기 세포는 신경 줄기 세포에서 발현하는 것이 알려져 있는 유전자, 이의 전사 산물, 단백질 등(신경 줄기 세포 마커)에 의해 확인할 수 있다.
신경 줄기 세포 마커의 예로서는 세포 골격 단백질인 네스틴(Nestin; Science, 276, 66(1997)), SOX1(SRY(성 결정 영역 Y(sex determining region Y))-box1), SOX2(SRY(성 결정 영역 Y)-box2), Pax6(paired box 6), Ki67, 증식 세포핵 항원(PCNA), 지방산 결합 단백질 7(Fabp7, BLBP라고도 함) 등이 알려져 있고, 당업자는 이들 마커를 적절히 조합하여 원하는 신경 줄기 세포인 것을 확인할 수 있다.
세포가 신경 전구 세포인 것은, 예를 들어, 세포를 EGF 및 bFGF를 포함하는 무혈청 배지 중에서 부유 배양하고, 배양한 세포괴를 분산 처리 후에 후술하는 실시예에 기재된 분화 유도 배지 중에서 접착 배양을 행하였을 때에 신경 세포를 생산하고 신경아교 세포를 생산하지 않는 것을 지표로서 확인할 수 있다.
또한, 신경 전구 세포는, 신경 전구 세포에서 발현하는 것이 알려져 있는 유전자, 그 전사 산물, 단백질 등(신경 전구 세포 마커)에 의해 확인할 수 있다. 신경 전구 세포에서 발현하는 유전자로서는 Tbr2, MASH1, 네스틴, NeuroD1 등이 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다. 당업자는 이들 마커를 적절히 조합하여 세포가 신경 전구 세포인 것을 확인할 수 있다.
신경 전구 세포의 예로서는 SOX2 음성 및 네스틴 양성인 세포가 열거되지만, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서 중 신경 세포(neuron)는 신경계의 기능적 단위가 되는 세포를 의미한다. 통상, 신경 세포는 세포체와 신경 돌기(예, 축색, 수상 돌기)로 구성되지만, 발생기의 유약(幼若; juvenile) 뉴런, 망막의 아마크린 세포(amacrine cell), 후구(嗅球; olfactory bulb)의 과립 세포 등의 신경 돌기를 갖지 않는 신경 세포(무극성 신경 세포)도 존재한다. 신경 세포는 형태별로 분류한 경우, 무극성 신경 세포, 단극성 신경 세포, 위단극성(pseudounipolar) 신경 세포, 쌍극성 신경 세포, 다극성 신경 세포로 분류되며, 본 명세서 중 신경 세포는 이들 전부를 포함한다.
신경 세포는 중추 신경계 신경 세포 및 말초 신경계 신경 세포를 포함한다. 신경 세포는 운동 신경 세포라도 좋고, 감각 신경 세포라도 좋고, 개재 신경 세포라도 좋다. 신경 세포의 예로서는 도파민 작동성 신경 세포, 노르아드레날린 작동성 신경 세포, 아드레날린 작동성 신경 세포, 세로토닌 작동성 신경 세포, 아세틸콜린 작동성 신경 세포, γ아미노부티르산 작동성 신경 세포, 글루타민산 작동 성 신경 세포 등이 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다.
세포가 신경 세포인 것은, 신경 세포에서 발현하는 것이 알려져 있는 유전자, 이의 전사 산물, 단백질 등(신경 세포 마커)에 의해 확인할 수 있다.
분화된 신경 세포의 마커의 예로서는, MAP2(microtubule associated protein 2), 뉴로필라멘트(neurofilament), 시냅신(synapsin) 1, βⅢ 튜불린(tubulin), NeuN(neuronal specific nuclear protein), FOX3(Forkhead box protein), 칼빈딘(calbindin), PSA-NCAM(polysialylated neural cell adhesion molecule), 더블코르틴(Doublecortin), 페리페린(Peripherin) 등이 열거된다.
신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포가 생산하는 세포가 신경 세포인지 아닌지는 예를 들어, 상술한 마커에 의해 확인할 수 있다.
(2) 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포 배양용 배지
본 발명의 배지는 L-글루타민(2-아미노-4-카르바모일부티르산), L-아스파라긴(2-아미노-3-카르바모일프로피온산) 및 L-아스파라긴산(2-아미노부탄2산)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산(본 명세서 중 「신경 분화 관련 아미노산」이라고도 함)을 실질적으로 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.
선택되는 「신경 분화 관련 아미노산」은, 1종(L-글루타민, L-아스파라긴, 또는 L-아스파라긴산)이라도 좋고(이 경우, 본 발명의 배지는 다른 2종의 신경 분화 관련 아미노산을 함유할 수 있음), 2종(L-글루타민 및 L-아스파라긴의 조합, L-글루타민 및 L-아스파라긴산의 조합, 또는 L-아스파라긴과 L-아스파라긴산의 조합)이라도 좋고(이 경우, 배지는 다른 1종의 신경 분화 관련 아미노산을 함유할 수 있음), 3종 모두(L-글루타민, L-아스파라긴 및 L-아스파라긴산)라도 좋다.
일 형태로서, 본 발명은 L-글루타민, L-아스파라긴 및 L-아스파라긴산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 1종의 아미노산을 실질적으로 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 배지를 제공한다. 당해 형태에 있어서, 본 발명의 배지는 선택되지 않은 다른 2종의 신경 분화 관련 아미노산 중 어느 한쪽, 또는 양쪽을 포함하고 있어도 좋다.
본 발명의 배지는 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 분화능을 항진하기 위한 배지일 수 있다. 본 발명의 배지 중에서 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 배양함으로써, 당해 세포의 신경 분화능을 항진시키는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명의 배지 중에서 배양한 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 신경 세포로 분화시키면, 얻어지는 신경 세포 집단에서는 증식성 세포의 수가 저감된다. 따라서, 신경 세포 이식 치료에 유용한 신경 세포를 제공하는 것이 가능해지고, 신경 세포 이식 치료용의 신경 세포의 작제에 적합한 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 제공할 수 있다.
본 명세서 중, 「배지가 L-글루타민, L-아스파라긴 및 L-아스파라긴산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 실질적으로 포함하지 않는다」란, 당해 배지 중에서 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 배양했을 때에 표준적인 배지 아미노산 농도 상당(L-글루타민 0.3 내지 3.0mM(예, 2.5mM); L-아스파라긴 0.05 내지 1.0mM(예, 0.05mM); L-아스파라긴산 0.05 내지 1.0mM(예, 0.05mM))의 당해 선택된 신경 분화 관련 아미노산을 함유하는 것 이외에는 조성이 동일한 대조 배지 중에서 배양했을 때와 비교하여 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 분화능이 항진되기에 충분할 정도로 배지 중의 선택된 신경 분화 관련 아미노산의 농도가 저감되어 있는 것을 의미한다.
예를 들어, 「배지가 L-글루타민을 실질적으로 포함하지 않는다」란, 당해 배지 중에서 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 배양했을 때에 L-글루타민을 표준적인 배지 L-글루타민 농도 상당(0.3 내지 3.0mM(예, 2.5mM))을 함유하는 것 이외에는 조성이 동일한 대조 배지 중에서 배양했을 때와 비교하여 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 분화능이 항진되기에 충분할 정도로 배지 중의 L-글루타민 농도가 저감되어 있는 것을 의미한다. 다른 신경 분화 관련 아미노산에 대해서도 마찬가지이다.
본 명세서 중, 「L-글루타민, L-아스파라긴 및 L-아스파라긴산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 실질적으로 포함하지 않는다」란, 선택된 신경 분화 관련 아미노산뿐만 아니라 선택된 신경 분화 관련 아미노산의 대체용 디펩티드(선택된 신경 분화 관련 아미노산 잔기를 포함하는 디펩티드로서, 배지 중에서 펩티다아제 등에 의해 분해됨으로써 당해 선택된 신경 분화 관련 아미노산을 공급하는 디펩티드) 등의 배지 중에 선택된 신경 분화 관련 아미노산을 제공하는 물질도 포함하지 않는 것을 의미한다.
본 명세서 중, 「L-글루타민을 실질적으로 포함하지 않는다」란, 배지 중에 L-글루타민뿐만 아니라 L-알라닐 L-글루타민 등의 L-글루타민과 아미노산의 디펩티드(L-글루타민 대체용 디펩티드)도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.
본 명세서 중, 「L-아스파라긴을 실질적으로 포함하지 않는다」란, 배지 중에 L-아스파라긴뿐만 아니라 L-아스파라긴의 대체용 디펩티드(예, L-알라닐 L-아스파라긴)도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.
본 명세서 중, 「L-아스파라긴산을 실질적으로 포함하지 않는다」란, 배지 중에 L-아스파라긴산뿐만 아니라, L-아스파라긴산의 대체용 디펩티드(예, L-알라닐 L-아스파라긴산)도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.
「L-글루타민을 실질적으로 포함하지 않는 배지」란, 당해 배지 중의 L-글루타민 농도(L-글루타민과 L-글루타민 대체용 디펩티드의 합계 농도)가 통상 100μM 이하, 바람직하게는 10μM 이하, 더욱 바람직하게는 100nM 이하이며, 가장 바람직하게는 0nM인 배지를 가리킨다.
「L-아스파라긴을 실질적으로 포함하지 않는 배지」란, 당해 배지 중의 L-아스파라긴 농도(L-아스파라긴과 L-아스파라긴 대체용 디펩티드의 합계 농도)가 통상 10μM 이하, 바람직하게는 100nM 이하, 더욱 바람직하게는 1nM 이하이며, 가장 바람직하게는 0nM인 배지를 가리킨다.
「L-아스파라긴산을 실질적으로 포함하지 않는 배지」란, 당해 배지 중의 L-아스파라긴산 농도(L-아스파라긴산과 L-아스파라긴산 대체용 디펩티드의 합계 농도)가 통상 10μM 이하, 바람직하게는 100nM 이하, 더욱 바람직하게는 1nM 이하이며, 가장 바람직하게는 0nM인 배지를 가리킨다.
본 명세서 중, 선택된 신경 분화 관련 아미노산을 포함하지 않는다란 당해 신경 분화 관련 아미노산의 농도가 0nM임을 가리킨다.
본 명세서 중 「신경 분화능」이란, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포가 신경 세포로 분화하는 능력을 의미한다.
본 발명의 배지는 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 분화능을 항진시키는 효과를 갖는다.
「신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 분화능을 항진시킨다」란, 본 발명의 배지 중에서 배양한 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포와 선택된 신경 분화 관련 아미노산의 농도가 표준적인 배지 아미노산 농도(L-글루타민 0.3 내지 3.0mM; 아스파라긴 0.05 내지 1.0mM; 아스파라긴산 0.05 내지 1.0mM) 상당인 것 이외에는 본 발명의 배지와 동일한 조성을 갖는 비교 대조 배지 중에서 배양한 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포(본 명세서 중, 단순히 비교 대조 세포라고도 함)를 신경 세포 분화 조건 하(예를 들어, N2 및 B27 존재 중)에서 배양하여 신경 세포를 작제했을 때에 일정 세포수 당의 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포에서 발생하는 신경 세포수가 비교 대조보다도 많은 것, 또는 배양 개시 후부터 일정 기간에 도달할 때까지의 사이에 생산되는 신경 세포수가 비교 대조보다 많은 것을 의미한다.
예를 들어, 선택된 신경 분화 관련 아미노산이 L-글루타민인 경우 「신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 분화능을 항진시킨다」란 본 발명의 배지 중에서 배양한 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포와 L-글루타민의 농도가 표준적인 배지 L-글루타민 농도 상당(0.3 내지 3.0mM(예, 2.5mM))인 것 이외에는 본 발명의 배지와 동일한 조성을 갖는 비교 대조 배지 중에서 배양한 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 신경 세포 분화 조건 하(예를 들어, N2 및 B27 존재 중)에서 배양하여 신경 세포를 작제했을 때에 하나의 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포로부터 발생하는 신경 세포수가 비교 대조보다도 많은 것, 또는 배양 개시 후부터 일정 기간에 도달할 때까지의 사이에 생산되는 신경 세포수가 비교 대조보다 많은 것을 의미한다.
본 발명의 배지는 선택된 신경 분화 관련 아미노산 이외의 성분에 대해서는 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 분화능의 항진을 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 통상의 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 유지 배양에 사용되는 조성을 적절히 채용할 수 있다.
본 발명의 배지는 포유 동물 세포의 배양에 통상 사용되는 배지의 조성으로부터, 선택된 신경 분화 관련 아미노산을 제거한 것을 기초 배지로서 조제하여도 좋다. 기초 배지로서는 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지 , αMEM 배지, DMEM 배지, F-12 배지, DMEM/F12 배지, IMDM/F12 배지, 햄 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, 또는 이들의 혼합 배지 등, 동물 세포의 배양에 사용할 수 있는 배지를 들 수 있다. 또한, 다능성 줄기 세포 배양용으로서 통상 사용되는 배지의 조성으로부터 선택된 신경 분화 관련 아미노산을 제거한 것을 기초 배지로서 조제하여도 좋다.
시판의 다능성 줄기 세포 배양용의 기초 배지인 StemFit(등록상표) AK 배지(아지노모토), Essential 8 배지(Life Technologies), mTeSR1 배지(STEMCELL Technologies), TeSR2 배지(STEMCELL Technologies), RHB 배지(StemCells, Inc), TeSRTM-E6(STEMCELL Technologies), hESF-GRO 배지(니프로 가부시키가이샤), HESF-DIF 배지(니프로 가부시키가이샤), CSTI-7(가부시키가이샤 사이보 카가쿠 켄큐죠), Essential 6 배지(Life Technologies) 등의 조성으로부터, 선택된 신경 분화 관련 아미노산을 제거한 것을 기초 배지로서 조제할 수도 있다.
본 발명의 배지는 화학적으로 미결정된 성분의 혼입을 회피하는 관점에서 바람직하게는 함유 성분이 화학적으로 결정된 배지(Chemically defined medium; CDM)이다. 본 발명의 배지는 화학적으로 미결정된 성분의 혼입을 회피하는 관점에서 무혈청 배지인 것이 바람직하다. 본 발명에서의 「무혈청 배지」란, 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않는 배지를 의미한다. 본 발명에서는 정제된 혈액 유래 성분이나 동물 조직 유래 성분(예를 들어, bFGF 등의 증식 인자)을 포함하는 배지도 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않는 한, 무혈청 배지에 포함된다.
무혈청 배지는 혈청 대체물을 함유하고 있어도 좋다. 혈청 대체물로서는 예를 들어, 혈청 알부민, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올 또는 3'티올글리세롤, 또는 이들의 균등물 등을 적절히 함유하는 것을 들 수 있다. 이러한 혈청 대체물은 예를 들어, WO98/30679에 기재된 방법에 의해 조제할 수 있다. 혈청 대체물로서는 시판품을 이용해도 좋다. 이러한 시판의 혈청 대체물로서는 예를 들어　KnockoutTM Serum Replacement(Life Technologies사 제조: 이하, KSR이라고 기재하는 경우도 있음.), Chemically-defined Lipid concentrated(Life Technologies사 제조), B27(Life Technologies사), N2(Life Technologies사)가 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다.
통상, 본 발명의 배지는 모든 필수 아미노산(L-류신, L-리신, L-페닐알라닌, L-이소류신, L-트레오닌, L-히스티딘, L-메티오닌, L-트립토판 및 L-발린)을 포함한다.
신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 분화능의 항진을 달성할 수있는 한 특별히 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 배지에 포함되는 필수 아미노산의 농도는 각각 이하에 예시된다:
L-류신 0.005 내지 100mM, 바람직하게는 0.5 내지 20mM;
L-리신 0.005 내지 100mM, 바람직하게는 1 내지 20mM;
L-페닐알라닌 0.005 내지 100mM, 바람직하게는 0.5 내지 10mM;
L-이소류신 0.005 내지 100mM, 바람직하게는 0.5 내지 20mM;
L-트레오닌 0.005 내지 100mM, 바람직하게는 0.5 내지 10mM;
L-히스티딘 0.005 내지 100mM, 바람직하게는 0.5 내지 10mM;
L-메티오닌 0.005 내지 100mM, 바람직하게는 0.5 내지 5mM;
L-트립토판 0.005 내지 100mM, 바람직하게는 0.05 내지 1mM;
L-발린 0.005 내지 100mM, 바람직하게는 0.5 내지 10mM.
각 필수 아미노산의 농도의 조합으로서는 L-류신 0.005 내지 100mM, L-리신 0.005 내지 100mM, L-페닐알라닌 0.005 내지 100mM, L-이소류신 0.005 내지 100mM, L-트레오닌 0.005 내지 100mM, L-히스티딘 0.005 내지 100mM, L-메티오닌 0.005 내지 100mM, L-트립토판 0.005 내지 100mM 및 L-발린 0.005 내지 100mM이 예시되지만, 이에 한정되지 않는다.
보다 바람직하게는 본 발명의 배지는 모든 필수 아미노산(L-류신 0.5 내지 20mM, L-리신 1 내지 20mM, L-페닐알라닌 0.5 내지 10mM, L-이소류신 0.5 내지 20mM, L-트레오닌 0.5 내지 10mM, L-히스티딘 0.5 내지 10mM, L-메티오닌 0.5 내지 5mM, L-트립토판 0.05 내지 1mM 및 L-발린 0.5 내지 10mM)을 포함한다.
본 발명의 배지는 바람직하게는 L-글루타민, L-아스파라긴 및 L-아스파라긴산 이외의 모든 비필수 아미노산(L-알라닌 0.2 내지 2mM, L-아르기닌 1 내지 10mM, 글리신 1 내지 10mM, L-글루탐산 0.5 내지 10mM, L-시스테인 0.5 내지 10mM, L-세린 0.5 내지 10mM, L-티로신 0.5 내지 10mM, L-프롤린 0.5 내지 5mM)을 포함한다.
본 발명의 배지가 L-아스파라긴 및/또는 L-아스파라긴산을 실질적으로 포함하지 않고 L-글루타민을 포함하는 경우, L-글루타민의 배지 중의 농도는 0.3 내지 3.0mM인 것이 바람직하다.
본 발명의 배지가 L-글루타민 및/또는 L-아스파라긴산을 실질적으로 포함하지 않고 L-아스파라긴을 포함하는 경우, L-아스파라긴의 배지 중의 농도는 0.05 내지 1.0mM인 것이 바람직하다.
본 발명의 배지가 L-글루타민 및/또는 L-아스파라긴을 실질적으로 포함하지 않고 L-아스파라긴산을 포함하는 경우, L-아스파라긴산의 배지 중의 농도는, 0.05 내지 1.0mM인 것이 바람직하다.
본 발명의 배지는, 상술한 아미노산에 더하여, L-시스틴 등의 천연 아미노산을 포함하고 있어도 좋다.
본 발명의 배지는, 추가로 배지 첨가물을 함유하여도 좋다. 배지 첨가물로서는, 비타민류, 사이토카인 및 성장 인자 등의 단백질, L-아스코르브산, 인산L-아스코르빌마그네슘, 피루브산나트륨, 2-아미노에탄올(에탄올아민), 글루코오스, 탄산수소나트륨, HEPES, 인슐린, 프로게스테론, 셀렌산나트륨, 푸트레신 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되지 않는다. 첨가물은 자체 공지의 농도 범위 내에서 포함되는 것이 바람직하다. 본 발명의 배지는, L-아스코르브산을 포함해도 좋고, 포함하지 않아도 좋다.
본 발명의 배지는, 추가로 홀로트랜스페린을 포함하고 있어도 좋다. 철과 결합한 트랜스페린은 홀로트랜스페린, 철과 결합하고 있지 않은 트랜스페린은 아포트랜스페린이라고 불린다. 본 명세서 중, 홀로트랜스페린은, 아포트랜스페린 1분자와 철 이온 하나가 결합한 분자, 및 아포트랜스페린 1분자와 철 이온 2개가 결합한 분자를 포함한다.
본 발명의 배지가 홀로트랜스페린을 포함하는 경우, 배지에 포함되는 홀로트랜스페린의 농도는, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 분화능의 항진 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 0.01 내지 100μg/ml, 바람직하게는 0.1 내지 6.5μg/ml, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 5μg/ml이다.
인간 트랜스페린을 코드하는 핵산 서열로서는 NM_001063(NCBI Accession No.)이, 인간 트랜스페린의 아미노산 서열로는 NP_001054를 들 수 있는데, 이들에 한정되지 않는다.
홀로트랜스페린은, 시판의 시약(Sigma Aldrich)를 사용할 수도 있다.
본 발명의 배지는, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 계대 배양에 사용되는 증식 인자(예를 들어, EGF: 10 내지 100ng/mL, bFGF: 10 내지 100ng/ml 등)을 포함하고 있어도 좋다.
본 발명의 배지는, 지방산을 포함하여도 좋다. 본 발명의 배지에 포함되는 지방산으로서는, 올레산, 리놀레산, α-리놀렌산, γ-리놀렌산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키돈산, 이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산, 부티르산, 아세트산, 팔미톨레산, 길초산(발레르산), 카프로산, 에난트산(헵틸산), 카프릴산, 펠라르곤산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 펜타데실산, 마르가르산, 쿠센산, 엘레오스테아르산, 아라키드산, 8,11-에이코사디엔산, 5,8,11-에이코사트리엔산, 베헨산, 리그노세르산, 네르본산, 세로트산, 몬탄산, 멜리스산 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 배지에 포함되는 지방산은 포화 지방산이라도 좋고, 불포화 지방산이라도 좋다.
예를 들어, 본 발명의 배지는 선택된 신경 분화 관련 아미노산(예, L-글루타민, 아스파라긴 또는 아스파라긴산)을 포함하지 않는 기초 배지에 탄산수소나트륨, 셀레늄, 트랜스페린, 인슐린, bFGF 및 2-아미노에탄올을 첨가하여 조제할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.
본 발명의 배지의 pH는 약 5.0 내지 8.5인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 약 6.0 내지 약 8.0으로 조정된다. 배지는 멤브레인 필터 등을 사용한 여과 멸균 등의 멸균 처리를 행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 배지의 형태는 본 발명의 원하는 효과를 얻을 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 액체 배지, 반유동 배지, 및 고형 배지의 형태로서 조제할 수 있다. 또한, 본 발명의 배지를 분말상의 형태로서 조제해도 좋다. 분말상의 형태로 조제함으로써 수송이나 보존이 극히 용이해질 수 있다. 이러한 분말상의 배지는 사용 직전에 멸균수 등을 첨가하고, 필요에 따라 멤브레인 필터 등을 사용하여 멸균함으로써 간편하게 액체 배지로 할 수 있다. 본 발명의 배지는, 접착 배양, 부유 배양, 포매 배양, 조직 배양 등 중 어느 배양 방법에도 사용할 수 있다.
(3) 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 배양 방법
본 발명은, 상기 본 발명의 배지 중에서 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 배양하는 것을 포함하는, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 배양 방법(본 명세서 중, 본 발명의 배양 방법이라고도 함)을 제공한다.
본 발명의 배지를 사용하여 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 배양함으로써, 신경 분화능이 항진된 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 얻는 것이 가능해진다. 특히, 본 발명의 배지를 사용하여 배양한 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를, 신경 세포로 분화시키면, 증식이 억제된 신경 세포 집단을 얻을 수 있기 때문에, 본 발명의 배양 방법은, 신경 세포 이식용의 신경 세포의 작제에 유용하다. 따라서, 본 발명의 배양 방법은, 바람직하게는 신경 분화능이 항진된 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 제조하기 위한 방법이다. 또한, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 유지 배양에 있어서, 배지 중의 L-글루타민, L-아스파라긴 및 L-아스파라긴산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산의 농도를, 당해 아미노산이 「실질적으로 포함되지 않는」 농도로까지 저감시켜, 계속 배양함으로써, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 분화능을 항진시킬 수 있다. 본 발명은, 이러한 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 분화능의 항진 방법이라고도 이해할 수 있다. 선택한 신경 분화 관련 아미노산의 농도의 저감은 배양에 사용하는 배지를 선택한 신경 분화 관련 아미노산을 소정의 농도로 함유하는 배지로부터 본 발명의 배지로 전환함으로써 실시할 수 있다. 신경 분화 관련 아미노산을 포함하는 배지 중에 세포를 현탁한 용액을 약 10배량의 ΔGln 배지에 현탁함으로써, 전환 전의 배지는 10배 정도로 희석된다. 통상의 조작에 의해 배지 교환을 행하면, 교환 전의 배지의 넘김(carrying over)은 많아도 1/100용량 정도로 추정되기 때문에, 예를 들어 배지 전환의 직후 내지 몇 시간 후까지 전환 후의 배지를 본 발명의 배지로 치환함으로써, 신경 분화 관련 아미노산을 포함하는 배지는 적어도 1,000배 정도로 희석된다고 추정된다. 상술한 바와 같이, 일반적인, 다능성 줄기 세포나 신경 줄기 세포의 유지용 배지에는, L-글루타민은 0.3 내지 3.0mM 정도, L-아스파라긴은 0.05 내지 1.0mM 정도, L-아스파라긴산은 0.05 내지 1.0mM 정도 포함된다. 그래서, 예를 들어, L-글루타민을 0.3 내지 3.0mM의 농도로 함유하는 배지 중에서 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 유지 배양하고, 그 배지를, L-글루타민을 실질적으로 포함하지 않는 본 발명의 배지로 교환하고, 이어서 유지 배양을 계속함으로써, L-글루타민 농도를 0.3 내지 3.0mM에서, 예를 들어, 100μM 이하, 바람직하게는 10μM 이하, 더욱 바람직하게는 100nM 이하, 보다 더 바람직하게는 1nM 이하이며, 가장 바람직하게는 0nM으로까지 저감시켜, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 분화능을 항진시킨다. 또한, 예를 들어, L-아스파라긴을 0.1 내지 1.0mM의 농도로 함유하는 배지 중에서 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 유지 배양하고, 그 배지를, L-아스파라긴을 실질적으로 포함하지 않는 본 발명의 배지로 교환하고, 이어서 유지 배양을 계속함으로써 L-아스파라긴 농도를 0.1 내지 1.0mM에서, 예를 들어, 10μM 이하, 바람직하게는 100nM 이하, 더욱 바람직하게는 1nM 이하이고, 가장 바람직하게는 0nM으로까지 저감시켜, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 분화능을 항진시킨다. 또한, L-아스파라긴산을 0.1 내지 1.0mM의 농도로 함유하는 배지 중에서 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 유지 배양하고, 그 배지를, L-아스파라긴산을 실질적으로 포함하지 않는 본 발명의 배지로 교환하고, 이어서 유지 배양을 계속함으로써, L-아스파라긴산 농도를 0.1 내지 1.0mM에서, 예를 들어, 10μM 이하, 바람직하게는 100nM 이하, 더욱 바람직하게는 1nM 이하이고, 가장 바람직하게는 0nM으로까지 저감시켜, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 분화능을 항진시킨다.
본 발명의 배양 방법에 있어서 사용되는 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포는, 바람직하게는 단리되어 있다. 「단리」란, 목적으로 하는 성분이나 세포 이외의 인자를 제거하는 조작이 이루어지고, 천연으로 존재하는 상태를 벗어나 있는 것을 의미한다. 「단리된 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포」의 순도(전체 세포수에서 차지하는 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 수의 백분율)는, 통상 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 100%이다.
본 발명의 배양 방법에서의, 배지 중의 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 농도는, 원하는 효과를 갖는 한 특별히 제한되지 않지만, 통상 5×103 내지 105개/cm3, 바람직하게는, 104 내지 3×104개/cm3이다.
본 발명의 배양 방법에서의 배양 조건은, 본 발명의 배지가 사용되는 것을 제외하고는, 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 배양의 목적에 따라 통상의 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 배양에 사용되는 배양 조건을 적절하게 채용할 수 있다.
본 발명의 배양 방법에 있어서, 세포의 배양에 사용되는 배양기는, 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티디쉬, 마이크로플레이트, 마이크로웰 플레이트, 멀티플레이트, 멀티웰 플레이트, 마이크로슬라이드, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 및 롤러 보틀 등을 들 수 있다.
세포의 배양에 사용되는 배양기는, 세포 접착성이라도 세포 비접착성이라도 좋고, 목적에 따라 적절하게 선택된다.
세포 접착성의 배양기는, 배양기의 표면의 세포와의 접착성을 향상시킬 목적으로, 세포 외 매트릭스(ECM) 등의 임의의 세포 지지용 기질 또는 그것들의 기능을 모방하는 인공물로 코팅된 것일 수 있다.
그밖의 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 예를 들어, 배양 온도는, 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 약 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. CO2 농도는, 약 1 내지 10%, 바람직하게는 약 2 내지 5%이다. 산소 농도는, 통상 1 내지 40%이지만, 배양 조건 등에 따라 적절히 선택된다.
본 발명의 배양 방법에 있어서, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포는, 접착 배양, 부유 배양, 조직 배양 등의 자체 공지의 방법에 의해 배양 가능하다.
신경 분화능의 항진 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되는 것은 아니지만, 본 발명의 배양 방법에서의 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 배양하는 기간은, 통상 2일간 이상, 바람직하게 4일간 이상, 보다 바람직하게는 8일간 이상이다. 본 발명의 배지 중에서 배양한 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 회수하고, 그 일부 또는 전부를 신선한 본 발명의 배지 중에 계대하고, 이어서 배양을 계속함으로써, 항진된 신경 분화능을 유지한 채로, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 계대 배양할 수 있다.
신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 계대하는 경우, 자체 공지의 방법에 의해 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 분산 처리해도 좋다. 세포를 분산 처리하는 방법의 예로서는, 킬레이트제(예, EDTA)나 효소(예, 트립신, 콜라게나제) 등에 의한 처리, 기계적인 분산(예, 피펫팅(pipetting)) 등의 조작을 들 수 있다.
(4) 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포로부터의 신경 세포의 작제 방법
본 발명은, 상기 본 발명의 배지 중에서 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 배양하고, 이어서 신경 세포로의 분화 유도 배양을 행하여 신경 세포 집단을 얻는 것을 특징으로 하는, 신경 세포 작제 방법(본 명세서 중, 본 발명의 신경 세포 작제 방법이라고도 함)을 제공한다.
본 명세서 중, 신경 세포 집단이란, 신경 세포를 포함하는 세포의 집단을 의미한다. 신경 세포 집단에는, 신경 세포 이외의 세포를 포함할 수 있다. 신경 세포 집단은, 신경 세포를 포함하는 한 특별히 제한은 없지만, 통상, 세포 집단 내의 세포의 1% 이상, 바람직하게는 5% 이상, 보다 바람직하게는 20% 이상, 더욱 바람직하게는 40% 이상이 신경 세포이다.
본 발명의 신경 세포 작제 방법을 사용함으로써, 단기간에 많은 신경 세포를 고효율로 작제하는 것이 가능해진다. 또한 본 발명의 신경 세포 작제 방법에 의해 얻어지는 신경 세포 집단은, 신경 세포 집단에 포함되는 증식성 세포의 비율이 낮기 때문에, 세포 이식 치료에 사용한 경우에 종양화의 리스크가 낮다. 따라서, 본 발명의 신경 세포 작제 방법에 의해 작제한 신경 세포는, 이식 치료에 적합하게 사용될 수 있다.
본 발명의 신경 세포 작제 방법은, 이하의 공정을 포함한다:
(Ⅰ) 본 발명의 배지 중에서 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 배양하여, 신경 세포 분화능이 항진된 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 얻는 공정;
(Ⅱ) 공정 (Ⅰ)에서 얻은 신경 분화능이 항진된 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 신경 세포 분화 유도 조건 하에서 배양하여 신경 세포 집단을 얻는 공정.
공정 (Ⅰ)은, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 본 발명의 배지 중에서, 신경 분화능의 항진에 충분한 기간(예를 들어, 2일 이상, 바람직하게는 4일 이상, 보다 바람직하게는 8일 이상) 배양함으로써 달성할 수 있다. 그밖의 배양 조건은, 본 발명의 배양 방법의 기재에 준한다.
공정 (Ⅱ)에서의 신경 세포 분화 유도 조건은, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 세포로의 분화를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 원하는 신경 세포로의 분화 유도에 사용되는 배양 조건을 적절하게 채용할 수 있다. 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 접착 배양 방법의 예로서는, Flanagan LA 등, J Neurosci Res. 2006 Apr; 83(5): 845-56, Conti L 등, PLoS Biology., 2005 Sep; 3(9): e283 등에 기재된 방법을 들 수 있다. 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 부유 배양이란, 배지 중에 있어서, 배양기 또는 피더 세포(사용되는 경우)에 대하여 비접착성의 조건 하에서 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 배양하는 것을 말한다. 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 부유 배양 방법의 예로서는, 뉴로스피어법(Reynolds BA and Weiss S., Science, USA, 1992 Mar 27; 255(5052): 1707-10.), 무혈청 응집 부유 배양법(SFEB 법, SFEBq법; Watanabe 등, Nature Neuroscience 8, 288-296(2005)) 등을 들 수 있다. 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 조직 배양이란, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 포함하는 조직을, 슬라이스 등의 조직편 또는 조직 전체로서 배양하는 방법이다. 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 조직 배양으로서는, O'Rourke NA 등, Science. 1992 Oct 9; 258(5080): 299-302., Komuro H 등, Science. 1992 Aug 7; 257(5071): 806-9.에 기재된 슬라이스 배양법 등을 들 수 있다. 신경 세포 분화 유도 조건은, 당업자에게 주지이며, 당업자는 원하는 신경 세포 분화 유도 조건을 적절하게 채용할 수 있다.
공정 (Ⅱ)에서의, 배지 중의 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 농도는, 원하는 효과를 갖는 한 특별히 제한되지 않지만, 통상 5×103 내지 105개/cm3, 바람직하게는, 104 내지 3×104개/cm3이다.
공정 (Ⅱ)의 분화 유도 배양에서의 배양 조건은, 증식성 세포가 차지하는 비율이 저감되는 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 배양의 목적에 따라 공지의 배양 방법을 적절히 채용할 수 있다.
공정 (Ⅱ)의 분화 유도 배양에 있어서, 세포의 배양에 사용되는 배양기는, 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티디쉬, 마이크로플레이트, 마이크로웰 플레이트, 멀티플레이트, 멀티웰 플레이트, 마이크로슬라이드, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 및 롤러 보틀 등을 들 수 있다.
세포의 배양에 사용되는 배양기는, 세포 접착성이라도 세포 비접착성이라도 좋고, 목적에 따라 적절하게 선택된다.
세포 접착성의 배양기는, 배양기의 표면의 세포와의 접착성을 향상시킬 목적으로, 세포 외 매트릭스(ECM) 등의 임의의 세포 지지용 기질 또는 그것들의 기능을 모방하는 인공물로 코팅된 것일 수 있다.
그밖의 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 예를 들어, 배양 온도는, 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 약 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. CO2 농도는, 약 1 내지 10%, 바람직하게는 약 2 내지 5%이다. 산소 농도는, 통상 1 내지 40%이지만, 배양 조건 등에 따라 적절히 선택된다.
공정 (Ⅱ)의 분화 유도 배양에 있어서, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포는, 접착 배양, 부유 배양, 조직 배양 등의 자체 공지의 방법으로 배양 가능하다.
공정 (Ⅱ)의 분화 유도 배양에 있어서, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 배양하는 기간은, 증식성이 저감된 신경 세포의 생산 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 적어도 신경 세포가 출현할 때까지 배양이 계속된다. 신경 세포의 출현은, 상술한 신경 세포 마커의 발현을 평가함으로써 확인할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 분화 유도 배양은 분화 유도 배지 중에서 신경 분화능이 항진된 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 배양한다.
증식성이 저감된 신경 세포의 생산 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되는 것은 아니지만, 공정 (Ⅱ)의 분화 유도 배양에 있어서 분화 유도 배지를 사용하는 경우, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 배양하는 기간은, 통상 10일간 이상, 바람직하게는 21일간 이상, 보다 바람직하게는 60일간 이상이다. 분화 유도 배지 중에서 배양을 행할 경우, 통상 3일에 1회, 바람직하게는 2일에 1회 이상, 신선한 배지로 교환한다.
분화 유도 배지를 사용하는 경우, 공정 (Ⅱ)에 있어서, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 분산 처리하고, 분산 처리한 세포를 분화 유도 배양에 부치는 것이 바람직하다. 분화 유도 배지를 사용하는 경우, 공정 (Ⅱ)는, 세포 접착성의 용기를 사용하는 것이 바람직하다.
공정 (Ⅱ)에 있어서 사용되는 분화 유도 배지의 조성은, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 세포로의 분화를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 공지의 신경 세포 분화 유도용 배지를 사용할 수 있다.
분화 유도 배지는, EGF 및 bFGF 등의 신경 줄기 세포의 미분화성을 유지하는 물질을 포함하지 않는 것이 바람직하다.
공정 (Ⅱ)에 있어서 사용되는 분화 유도 배지는, 포유 동물 세포의 배양에 통상 사용되는 배지를 기초 배지로서 조제하여도 좋다. 기초 배지로서는, 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, F12 배지, DMEM/F12 배지, IMDM/F12 배지, 햄 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, 또는 이들의 혼합 배지 등, 동물 세포의 배양에 사용할 수 있는 배지를 들 수 있다.
공정 (Ⅱ)에 있어서 사용되는 분화 유도 배지는, 화학적으로 미결정된 성분의 혼입을 회피하는 관점에서, 바람직하게는, 함유 성분이 화학적으로 결정된 배지 (Chemically defined medium; CDM)이다. 분화 유도 배지는, 화학적으로 미결정된 성분의 혼입을 회피하는 관점에서, 무혈청 배지인 것이 바람직하다. 본 발명에서의 「무혈청 배지」란, 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않은 배지를 의미한다. 본 발명에서는, 정제된 혈액 유래 성분이나 동물 조직 유래 성분을 포함하는 배지도, 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않는 한 무혈청 배지에 포함된다.
무혈청 배지는, 혈청 대체물을 함유하고 있어도 좋다. 혈청 대체물로서는, 예를 들어, 혈청 알부민, 지방산, 비필수 아미노산, 트랜스페린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올 또는 3'티올글리세롤, 또는 이들의 균등물 등을 적절히 함유하는 것을 들 수 있다. 이러한 혈청 대체물은, 예를 들어, WO98/30679에 기재된 방법에 의해 조제할 수 있다. 혈청 대체물로서는 시판품을 이용해도 좋다. 이러한 시판의 혈청 대체물로서, 예를 들어　KnockoutTM Serum Replacement(Life Technologies사 제조: 이하, KSR라고 기재하는 경우도 있음.), GlutamaxTM(Life Technologies사 제조), Chemically-defined Lipid concentrated(Life Technologies사 제조), B27(Life Technologies사), N2(Life Technologies사)를 들 수 있는데, 이들에 한정되지 않는다.
공정 (Ⅱ)에 있어서 사용되는 분화 유도 배지는, 추가로 배지 첨가물을 함유해도 좋다. 배지 첨가물로서는, 비타민, 사이토카인 및 성장 인자 등의 단백질, L-아스코르브산, 인산L-아스코르빌마그네슘, 피루브산나트륨, 2-아미노에탄올, 글루코오스, 탄산수소나트륨, HEPES, 인슐린, 프로게스테론, 셀렌산나트륨, 푸트레신 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되지 않는다. 첨가물은 자체 공지의 농도 범위 내에서 포함되는 것이 바람직하다.
공정 (Ⅱ)에 있어서 사용되는 분화 유도 배지는, L-글루타민, L-아스파라긴과 L-아스파라긴산을 포함하고 있어도 좋다.
공정 (Ⅱ)에 있어서 사용되는 분화 유도 배지는, 지방산을 포함하여도 좋다. 분화 유도 배지에 포함되는 지방산으로서는, 올레산, 리놀레산, α-리놀렌산, γ-리놀렌산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키돈산, 이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산, 부티르산, 아세트산, 팔미톨레산, 길초산(발레르산), 카프로산, 에난트산(헵틸산), 카프릴산, 펠라르곤산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 펜타데실산, 마르가르산, 쿠센산, 엘레오스테아르산, 아라키드산, 8,11-에이코사디엔산, 5,8,11-에이코사트리엔산, 베헨산, 리그노세르산, 네르본산, 세로트산, 몬탄산, 멜리스산 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되지 않는다. 분화 유도 배지에 포함되는 지방산은 포화 지방산이라도 좋고, 불포화 지방산이라도 좋다.
분화 유도 배지의 pH는, 약 5.0 내지 8.5인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 약 6.0 내지 약 8.0으로 조정된다. 배지는, 멤브레인 필터 등을 사용한 여과 멸균 등의 멸균 처리를 행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시형태로서, 분화 유도 배지는, DMEM/F12 배지를 기초 배지로 하고, 트랜스페린, Glutamax, B27 서플리먼트, N2 서플리먼트, 글루코오스, 탄산수소나트륨, HEPES, 인슐린, 프로게스테론, 아셀렌산나트륨 및 푸트레신을 포함한다.
상기의 배지를 사용하는 경우, 공정 (Ⅱ)에서의, 세포를 배양하는 기간은 신경 세포로의 분화 유도를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 통상은, 10 일 이상, 바람직하게는 21일 이상, 보다 바람직하게는 60일 이상이다.
공정 (Ⅱ)는, 특정의 종류의 신경 세포로 분화시키는 것이라도 좋다.
본 발명의 신경 세포 작제 방법은, 공정 (Ⅰ), (Ⅱ)에 이어서, 추가로 공정 (Ⅲ) 신경 세포 집단으로부터 신경 세포를 단리하는 공정을 포함할 수 있다.
신경 세포 집단으로부터 신경 세포의 단리는, 자체 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.
신경 세포 집단으로부터 신경 세포를 단리하는 방법의 예로서는, 원하는 신경 세포 특이적으로 존재하는 세포외 항원에 대한 항체를 사용하여 유동 세포측정법(flow cytometry)에 의해 단리하는 방법, 원하는 신경 세포 특이적으로 존재하는 세포외 항원에 대한 항체를 결합시킨 마이크로비즈에 의해 단리하는 방법 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되지 않는다.
신경 세포 집단의 단리는, 혼입이 예상되는 신경 전구 세포 및 신경 줄기 세포를 제거함으로써도 달성될 수 있다.
(5) 신경 분화능이 항진된 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포
본 발명은, 상기 본 발명의 배양 방법에 의해 얻어지는, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포(본 발명의 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포)를 제공한다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포는 신경 분화능이 항진되어 있다.
본 발명의 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포는, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 본 발명의 배지 중에서, 통상, 2일 이상, 바람직하게는 4일 이상, 보다 바람직하게는 8일 이상 배양함으로써 얻을 수 있다. 그밖의 배양 조건은, 본 발명의 배양 방법의 기재에 준한다.
본 발명의 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포는, 바람직하게는 단리되어 있다. 「단리」란, 목적으로 하는 성분이나 세포 이외의 인자를 제거하는 조작이 이루어지고, 천연으로 존재하는 상태를 벗어나 있는 것을 의미한다. 「단리된 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포」의 순도(전체 세포 수에서 차지하는 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 수의 백분율)은, 통상 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 100%이다.
일 실시형태로서, 본 발명의 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포는 동결 보존시킨 상태로 제공될 수 있다. 본 발명의 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포는 동결 보존하는 것이 가능하고, 필요에 따라 융해·기면(起眠)하여 사용할 수 있다. 동결 보존은, 자체 공지의 세포 동결 보존 방법을 사용할 수 있다. 동결 보존의 예로서는, 본 발명의 조성물에 디메틸설폭사이드를 첨가하고, -80 내지 -200℃, 바람직하게는 -196℃(액체 질소 중)의 조건으로 본 발명의 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 보존한다.
(6) 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포 배양 조제물
본 발명은, 상기 본 발명의 배지 및 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 포함하는, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포 배양 조제물(본 발명의 배양 조제물)을 제공한다.
본 발명의 배양 조제물에서의 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포는, 생존하여, 증식하고 있는 세포이다.
본 발명의 배양 조제물에서의 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포는, 바람직하게는 단리되어 있다. 「단리」란, 목적으로 하는 성분이나 세포 이외의 인자를 제거하는 조작이 이루어지고, 천연으로 존재하는 상태를 벗어나 있는 것을 의미한다. 「단리된 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포」의 순도(전체 세포수에서 차지하는 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 수의 백분율)는, 통상 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 100%이다.
본 발명의 배양 조제물에 있어서, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포는, 본 발명의 배지 중에 존재한다. 일 형태에 있어서, 본 발명의 배양 조제물은, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의, 본 발명의 배지 중의 현탁액이다. 본 발명의 배양 조제물은, 적절한 용기 중에 봉입되어 있어도 좋다.
본 발명의 배양 조제물은, 상기 본 발명의 배양 방법의 실시에 유용하다.
일 실시형태로서, 본 발명의 배양 조제물은 동결 보존시킨 상태로 제공될 수 있다. 본 발명의 배양 조제물은, 동결 보존하는 것이 가능하고, 필요에 따라 융해·기면하여 사용할 수 있다. 동결 보존은, 자체 공지의 세포 동결 보존 방법을 사용할 수 있다. 동결 보존의 예로서는, 본 발명의 배양 조제물에 디메틸설폭사이드를 첨가하고, -80 내지 -200℃, 바람직하게는 -196℃(액체 질소 중)의 조건으로 본 발명의 배양 조제물을 보존한다.
이하에 실시예를 나타내어, 본 발명을 보다 상세하게 설명하겠지만, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 글루타민을 실질적으로 포함하지 않는 배지에서의 신경 줄기 세포의 배양법
(1) 장기간 자기-재생 신경 상피-유사 줄기 세포(Long-term self-renewing neuro epithelial-like stem cells)(이하 LtNES 세포) 유도법
iPS 세포로부터 EB(embryoid body)를 형성시키고, E6 배지(Life Technologies 또는 STEMCELL Technologies)에서 아스코르브산 및 트랜스페린을 제거한 조성에 상당하는 배지에 트랜스페린(최종 농도(終濃度) 0.5 내지 10μg/mL), 에탄올아민(최종 농도 5 내지 50μM), 인간 혈청 알부민(최종 농도 0.1 내지 5mg/mL)을 첨가한 배지 중에서 4일간 배양하였다. 폴리-L-오르니틴(PO) 코트한 dish에 EB를 파종하고, 상기 배지 중에서 10일 정도 배양하여, Rosette양의 구조가 형성되는 것을 확인하였다. Rosette 부분을 도려내어, 뉴로스피어로서 상기 배지 중에서 부유 배양을 7일 정도 행하였다. 뉴로스피어를 트립신/EDTA로 분산하여, PO/라미닌 코트한 dish 상에서 RHB-A 배지 중에서 배양하여, LtNES 세포를 작성하였다.
(2) LtNES 세포의 배양법
E6 배지(Life Technologies 또는 STEMCELL Technologies)에서 아스코르브산, 트랜스페린 및 L-글루타민을 제거한 조성에 상당하는 배지에, 트랜스페린(최종 농도 0.5 내지 10μg/mL), 에탄올아민(최종 농도 5 내지 50μM), 인간 혈청 알부민(최종 농도 0.1 내지 5mg/mL), 20ng/mL bFGF를 첨가하여, L-글루타민 불포함 배지(ΔGln 배지)를 작제하였다. 또한, L 글루타민(0.3 내지 3.0mM)을 함유하는 것 이외에는, ΔGln 배지와 구성이 동일한 대조 배지(Full 배지)를 작제하였다.
인간 다능성 줄기 세포로부터 유도한 LtNES 세포를 Full 배지에 현탁하여, 세포 현탁액을 작제하였다. Full 배지 또는 ΔGln 배지에 대하여 1/10량의 당해 세포 현탁액을 첨가하고, 37℃, 5% CO2 환경 하에서 배양을 행하였다. 교환 전의 배지의 넘김(carrying over)을 줄이기 위해, 배양 개시 2시간 후에 배지 교환을 실시하고, 추가로 배양을 계속하였다. 따라서, 교환 전의 배지는 적어도 1,000배 정도로는 희석되어 있다고 추정된다. LtNES 세포의 계대에는, TrypLE Select 내에서, 37℃, 1분간 인큐베이트를 행하고, 배지에서 희석하고, 그 후 피펫팅을 행하여, 단일의 세포로 하였다. 1.5×105cells/well(6well plate)에서 상기 배지 중에 분산시킨 세포를 파종하여 37℃, 5% CO2 환경 하에서 배양을 행하였다. 세포수 측정은, 트리판 블루(Life Technologies)에 의한 사세포 염색을 행한 후, 혈구 계산반(blood cell counting)으로 행하였다.
배양 4일 후의 신경 줄기 세포의 현미경상을 도 1A에 나타낸다. ΔGln 배지 중에서 4일간 배양한 신경 줄기 세포는, Full 배지에서 배양한 신경 줄기 세포와 동일한 형태를 나타냈다.
실시예 2: 신경계 세포 유도의 촉진 효과의 검증
L-글루타민 불포함 배지에서 배양한 세포의 분화능을 검증하기 위해, 분화 유도 실험을 행하였다.
실시예 1과 마찬가지로, iPS 세포로부터 신경 줄기 세포를 유도하고, L-글루타민 불포함 배지(ΔGln 배지) 또는 대조 배지(Full 배지) 중에서 4일간 배양을 행하였다.
배양 후, 배지 대신에 TrypLE Select를 첨가하고, 37℃, 1분간 인큐베이트하여 세포 분산 처리를 행하였다. TrypLE Select를 배지에서 희석 후, 피펫팅을 행하고, 폴리L오르니틴/피브로넥틴으로 코트한 48웰 플레이트에 1.5×105cells/well에서 파종하였다. L-글루타민을 포함하는 DMEM/F-12(Life Technologies)에, 1×N2 서플리먼트(Life Technologies), 1×B27 서플리먼트(Life Technologies)를 첨가한 분화 유도 배지 중에서 Day4 내지 Day25까지의 21일간 배양하였다. 세포의 배양은, 37℃, 5% CO2 분위기 하의 인큐베이터 내에서 행하였다. 배지 교환은 2일에 한 번 행하였다.
분화 유도 배양 후의 세포로부터 RNA를 추출하고, cDNA로 전사 후 qPCR을 행하여, Neuro D1 (Neurogenic differentiation 1) synapsin 1의 발현 강도를 측정하였다. 또한, 분화 유도 배양 후의 세포를 고정하고, 신경 세포 마커인 βⅢ 튜불린에 대한 항체를 사용한 형광 항체법에 의해 면역 염색을 행하였다.
면역 염색의 결과를 도 1C에 나타낸다. 분화 유도 후의 세포에는, βⅢ 튜불린 양성인 분화된 신경 세포가 포함되어 있는 것이 나타났다. ΔGln 배지에서 배양한 신경 줄기 세포는, Full 배지 중에서 배양한 신경 줄기 세포보다 많이 분화된 신경 세포를 생산하였다. 따라서, ΔGln 배지는, 신경 줄기 세포의 분화 촉진 작용을 갖는 것이 나타났다.
qPCR의 결과를 도 1D에 나타낸다. L-글루타민을 ΔGln 배지에서 배양한 신경 줄기 세포로부터 유도된 신경 세포 중에서는, 신경 세포 마커인 Synapsin1, 및 신경 전구 세포 마커인 NeuroD1의 발현이 항진되어 있었다.
실시예 3: 신경 세포의 증식성의 억제 효과의 검증
실시예 1에 기재된 신경 줄기 세포 배양 방법에 따라, 대조 배지(Full 배지) 또는 L-글루타민 불포함 배지(ΔGln 배지) 중에서 신경 줄기 세포를 4일간 배양하였다. 배양한 세포를, 4%-파라포름알데히드 인산 완충액에 의해 실온에서 20분간 고정하였다. 고정한 세포는 PBS(Phosphate buffered saline)로 세정한 후, 에탄올 중에서 실온에서 5분간 인큐베이트하고, 바람으로 건조시켰다. 그 후, 세포를 0.4% 크리스탈 바이올렛 메탄올 용액(와코 쥰야쿠: 038-04862)에서 20분간 염색하고, 순수로 세정을 행하였다. 1% SDS 수용액을 350μL 첨가하여 20분간 진탕함으로써 크리스탈 바이올렛을 용출하고, 용출액의 570nm 흡광도를 마이크로플레이트 리더 SH-9000(코로나 덴키사)로 측정함으로써, 세포수의 정량을 행하였다.
결과를 도 1B에 나타낸다. ΔGln 배지 중에서 4일간 배양했을 때의 신경 줄기 세포의 수는 Full 배지 중에서 배양한 경우보다도 적었다. 따라서, ΔGln 배지는, 신경 줄기 세포의 증식을 억제하는 것이 나타났다.
실시예 4: 신경 줄기 세포의 증식 효과의 검증
실시예 1에 기재된 신경 줄기 세포 배양 방법에 따라, 대조 배지(Full 배지) 또는 L-글루타민 불포함 배지(ΔGln 배지) 중에서 신경 줄기 세포를 4일간 배양하였다. 그 후 20일(total 5계대)까지 배양하고, 배양 4일째, 8일째, 12일째, 16일째, 20일째에 세포수를 계측하였다.
결과를 도 1E에 나타낸다. ΔGln 배지 중에서 배양한 신경 줄기 세포의 수는 직선적인 증식을 나타냈다(도 1E).
실시예 5: 배지 중의 아미노산의 분석
실시예 1에 기재된 신경 줄기 세포 배양 방법에 따라, 대조 배지(Full 배지) 또는 L-글루타민 불포함 배지(ΔGln 배지) 중에서 신경 줄기 세포를 4일간 이상 배양하였다. 배양한 세포를, 배지 제거 후 빙랭 메탄올을 사용하여 용해하여, 회수하였다. 세포 내의 아미노산량, TCA 사이클에 관한 케토산 및 유기산량을 분석하였다. 이하에, 아미노산, 케토산, 유기산의 분석 수순을 나타낸다.
<아미노산의 분석 수순>
시료 용액의 유도체화 반응
검체를 10μL 채취하고, 내표준 용액을 10μL 첨가하여, 아미노태그 와코 APDS 태그 와코용 붕산 완충액(와코 쥰야쿠 제조)을 60μL 넣어 진탕하고, 추가로 아미노태그 와코 아미노산 분석 시약(LC/MS용)(와코 쥰야쿠 제조)을 20μL 첨가하여 격렬하게 진탕하였다.
그 후, 블록 히터를 사용하여 55℃에서 10분간 가열하였다. 냉각 후, 반응 용액에 희석액을 400μL 첨가해서 진탕하여, 분석 시료로 하였다.
유도체화 반응 용액의 분석
시료는, 이동상으로서 A액에 아미노태그 와코 APDS 태그 와코용 용리액(와코 쥰야쿠 제조), B액에 아세토니트릴 600μL와 물 400μL를 혼합한 것을 사용하고, 고정상에 C8 컬럼을 사용하여 LC-MS/MS 시스템에 도입하고, 각 아미노산의 질량수로 검출하였다.
또한 내표준으로서, 아미노태그 와코 APDS 태그 와코용 아미노산 내부 표준 혼합액(와코 쥰야쿠 제조) No.1 650μl를 채취하고, No.2 50μL를 첨가하고, 50μM Put-d8과 물을 1:1:8의 비율로 혼합한 것을 사용하였다.
분석 장치
분석 장치는, API4000 LC/MS/MS 시스템(AB SCIEX 제조)을 사용하였다.
결과를 도 2에 나타낸다. ΔGln 배지 중에서 배양한 세포의 세포 내 아미노산 함유량이 변화하고 있고, 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 아스파라긴에 관하여 유의한 상승이 관찰되었다. 또한 글루타민, 글루탐산, 아스파라긴산에 관하여 유의한 감소가 관찰되었다.
<케토산의 분석 수순>
유도체화 시약 용액의 조제
O-(2,3,4,5,6-펜타플루오로벤질)-하이드록실아민 10mg을 0.1% 수산화나트륨 수용액과 아세토니트릴을 등량씩 혼합한 용액 1mL에 용해하여 유도체화 시약 용액으로 하였다.
시약 용액의 유도체화 반응
반응 유리병에 시료 용액 20μL를 넣고, 유도체화 시약 용액 20μL를 첨가하여 잘 교반한 후, 얼음물 중에서 30분간 정치하여 유도체화 반응을 행하였다. 그 후, 아세톤과 아세토니트릴을 등량씩 혼합한 용액을 10μL 첨가하고, 유도체화 반응을 정지시켰다. 그 후, 0.1% 수산화나트륨 수용액과 아세토니트릴을 등량씩 혼합한 용액 50μL를 첨가하여, 희석한 용액을 분석 시료로 하였다.
유도체화 반응 용액의 분석
이동상으로서 A액에 25mM 포름산 수용액, B액에 아세토니트릴, 고정상에 Ph 컬럼을 사용하고, 분석 시료를 LC/MS/MS 시스템에 도입하고, 각 케토산에 대응한 질량수로 검출하였다.
분석 장치
분석 장치는, API4000 LC/MS/MS 시스템(AB SCIEX 제조)을 사용하였다.
<유기산의 정량 수순>
유도체화 시약 용액의 조제
3-피콜릴아민 10mg을 5%의 트리에틸아민을 포함하는 DMSO 용액에 200mM가 되도록 용해하여 유도체화 시약 용액으로 하였다.
축합제 용액의 조제
4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염산염을 50mM가 되도록 DMSO에 용해하여 축합제 용액으로 하였다.
내표준 용액의 조제
각 유기산의 안정 동위체 표식 화합물의 농도가 100μM가 되도록 증류수에 용해하여, 내표준 원액으로 하였다. 각 내표준 원액을 등량 분취하고, 최종 농도 10μM가 되도록 증류수를 첨가하여, 내표준 용액으로 하였다.
검액의 유도체화 반응
반응 유리 병에 시료 용액 100μL를 넣고, 내부 표준액 10μL를 첨가하여, 잘 교반한 후, 회전 증발 농축기(rotary evaporator)로 감압 건고(乾固)하였다. 감압 건고한 시료에 10μL의 50% 아세토니트릴 용액과 15μL의 유도체화 시약 용액 및 30μL의 축합제 용액을 첨가하여, 용해한 후, 80℃에서 60분 가열하여 유도체화를 행하였다. 반응 용액 30μL를 유리병에 분취하고, 50mM 포름산암모늄 수용액 120μL를 첨가하여, 희석한 용액을 분석 시료로 하였다.
유도체화 반응 용액의 분석
이동상으로서 A액에 pH6으로 조정한 25mM 포름산암모늄 수용액, B액에 아세토니트릴, 고정상에 C8 컬럼을 사용하고, 분석 시료를 LC/MS/MS 시스템에 도입하여, 각 유기산에 대응한 질량수로 검출하였다.
분석 장치
분석 장치는, API4000 LC/MS/MS 시스템(AB SCIEX 제조)을 사용하였다.
결과를 도 3에 나타낸다. ΔGln 배지 중에서 배양한 세포의 세포 내의 TCA 사이클 관련된 유기산 함유량이 변화하고 있고, 피루브산에 관하여 유의한 상승이 관찰되었다. 또한 α-케토글루타르산, 시트르산, 이소시트르산, 푸마르산, 말산에 관하여 유의한 감소가 관찰되었다.
실시예 6: L-글루타민 제거 배지 배양 세포의 세포사 유무의 검증
실시예 1에 기재된 신경 줄기 세포 배양 방법에 따라, 대조 배지(Full 배지) 또는 L-글루타민 불포함 배지(ΔGln 배지) 중에서 신경 줄기 세포를 4일간 배양하였다. 배양한 세포를, 4% 파라포름알데히드 인산 완충액에 의해 실온에서 20분간 고정하였다. 고정한 세포는 PBS로 세정한 후, 아폽토시스(apoptosis) 마커인 절단된 카스파제-3(cleaved caspase-3)에 대한 항체 및 핵 염색제인 Hoechst33342를 사용하여 면역 염색을 행하였다. 결과를 도 4에 나타낸다.
L-글루타민 불포함 배지 중에서 배양한 신경 줄기 세포(ΔGln), 및 L-글루타민 함유 배지 중에서 배양한 신경 줄기 세포(대조군(Control)) 중 어느 것에 있어서도, 아폽토시스는 거의 관찰되지 않았다. 배지 중의 L-글루타민의 유무에 관계없이 아폽토시스는 거의 일어나지 않았다. 따라서, L-글루타민 불포함 배지에 있어서, 감수성이 높은 일부 세포의 세포사가 일어나 있는 것이 아님이 나타났다.
실시예 7: 각 비필수 아미노산 제거 배지에 의한 신경 분화 촉진 효과의 검증
실시예 1에 기재된 Full 배지로부터, 각 필수 아미노산(글루타민, 아스파라긴, 아스파라긴산, 글루타민산, 알라닌, 글리신, 세린 또는 프롤린)을 제거한 조성의 배지를 작제하였다. 실시예 1과 마찬가지로, iPS 세포로부터 신경 줄기 세포를 유도하고, 각 비필수 아미노산 제거 배지 또는 Full 배지 중에서 8 내지 12일간 배양하였다.
배양 후, 배지 대신에 TrypLE Select를 첨가하여, 37℃, 1분간 인큐베이트하여 세포 분산 처리를 행하였다. TrypLE Select를 배지에서 희석 후, 피펫팅을 행하고, 폴리L오르니틴/피브로넥틴으로 코트한 48 웰 플레이트에 1.5×105cells/well로 파종하였다. DMEM/F-12(Life Technologies)에 1×N2 서플리먼트(Life Technologies), 1×B27 서플리먼트(Life Technologies)를 첨가한 배지 중에서 20일간 배양하였다. 세포의 배양은, 37℃, 5% CO2 분위기 하의 인큐베이터 내에서 행하였다. 배지 교환은 2일에 한 번 행하였다.
배양 후의 세포를 고정하고, 신경 세포 마커인 βⅢ 튜불린에 대한 항체를 사용한 형광 항체법에 의해 면역 염색을 행하였다. βⅢ 튜불린 양성 세포의 신경 돌기 길이를 화상 해석에 의해 정량한 결과를 표 1에 나타낸다. 표 1 중의 기호는 컨트롤(Full)을 1로 했을 때의 상대적인 평균 신경 돌기 길이를, ++＞1.5, +:1.5 내지 0.3, -:0.3＞로 나타냈다. 글루타민을 포함하지 않은 배지, 아스파라긴산을 포함하지 않는 배지, 및 아스파라긴을 포함하지 않는 배지는, 신경 줄기 세포의 신경 분화능을 항진시키는 작용을 나타냈다.
Figure pct00001
본 발명에 의하면, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 분화능을 항진시키는 것이 가능해지고, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포 배양에 드는 인적 비용 및 금전적 비용을 삭감할 수 있다.
본 출원은, 일본에서 출원된 특원2016-071967(출원일: 2016년 3월 31일)을 기초로 하고 있고, 그 내용은 본 명세서에 전부 포함되는 것이다.

Claims (13)

  1. L-글루타민을 실질적으로 포함하지 않는, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포 배양용 배지.
  2. 제1항에 있어서, L-글루타민 농도가 100μM 이하인, 배지.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, L-글루타민을 포함하지 않는, 배지.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 홀로트랜스페린을 포함하는, 배지.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, L-트립토판, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-트레오닌, L-발린, L-류신, L-이소류신 및 L-히스티딘을 포함하는, 배지.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 신경 분화능을 항진하기 위한 배지인, 배지.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 무혈청 배지인, 배지.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 배지 중에서 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 배양하는 것을 포함하는, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 배양 방법.
  9. 제8항에 있어서, 신경 분화능이 항진된 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 제조하기 위한 방법인, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 배양 기간이 4일 이상인, 방법.
  11. 이하의 공정을 포함하는 신경 세포의 작제 방법:
    (Ⅰ) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 배지 중에서 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 배양하여, 신경 분화능이 항진된 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 얻는 공정;
    (Ⅱ) 공정 (Ⅰ)에서 얻은 신경 분화능이 항진된 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 신경 세포 분화 유도 조건 하에서 배양하여 신경 세포 집단을 얻는 공정.
  12. 제9항의 방법에 의해 얻어지는, 신경 분화능이 항진된 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포.
  13. 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포, 및 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 배지를 포함하여 이루어진, 배양 조제물.
KR1020187031746A 2016-03-31 2017-03-23 신경 분화능을 항진시키는 신경 줄기 세포용 배지 KR20180132787A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016071967 2016-03-31
JPJP-P-2016-071967 2016-03-31
PCT/JP2017/011870 WO2017170180A1 (ja) 2016-03-31 2017-03-23 神経分化能を亢進させる神経幹細胞用培地

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20180132787A true KR20180132787A (ko) 2018-12-12

Family

ID=59965594

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187031746A KR20180132787A (ko) 2016-03-31 2017-03-23 신경 분화능을 항진시키는 신경 줄기 세포용 배지

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20190024047A1 (ko)
EP (1) EP3438249A4 (ko)
JP (1) JP6981403B2 (ko)
KR (1) KR20180132787A (ko)
CN (1) CN108884444A (ko)
CA (1) CA3019089A1 (ko)
WO (1) WO2017170180A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200020463A (ko) * 2018-08-17 2020-02-26 고려대학교 산학협력단 태반유래 세포 조건화 배지를 이용하여 인간 상피세포로부터 인간 신경 줄기세포를 생산하는 방법

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022110180A1 (en) * 2020-11-30 2022-06-02 Zhejiang Huode Bioengineering Company Limited Generation of neural progenitor cells from embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells
US20220409855A1 (en) 2021-06-29 2022-12-29 Staffan Holmin Methods of delivering cells and therapeutic agents to organs and extravascular sites

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5734998A (en) 1997-01-10 1998-08-03 Life Technologies, Inc. Embryonic stem cell serum replacement
WO2004045592A2 (en) * 2002-11-20 2004-06-03 Neuronova Ab Compounds and methods for increasing neurogenesis
AU2003302707B2 (en) * 2002-12-02 2008-10-02 Anges Mg, Inc. Method for culturing neural stem cells using hepatocyte growth factor
EP1812556A4 (en) * 2004-10-05 2011-02-02 Univ Georgia NEURONAL PRECURSORS OF FEEDER-FREE HUMAN EMBRYONIC STEM CELL CULTURE
EP2543380B1 (en) * 2008-01-29 2016-11-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Neural stem cells proliferation promoting agent
EP2606126B1 (en) * 2010-08-19 2016-05-18 F.Hoffmann-La Roche Ag Conversion of somatic cells to induced reprogrammed neural stem cells (irnscs)
US20120052577A1 (en) * 2010-08-31 2012-03-01 The Regents Of The University Of California Culture system for stem cell propagation and neural and oligodendrocyte specification
CA2836483C (en) * 2011-05-20 2020-08-18 The Mclean Hospital Corporation Neuronal progenitor cells and uses

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200020463A (ko) * 2018-08-17 2020-02-26 고려대학교 산학협력단 태반유래 세포 조건화 배지를 이용하여 인간 상피세포로부터 인간 신경 줄기세포를 생산하는 방법

Also Published As

Publication number Publication date
US20190024047A1 (en) 2019-01-24
WO2017170180A1 (ja) 2017-10-05
CA3019089A1 (en) 2017-10-05
EP3438249A1 (en) 2019-02-06
CN108884444A (zh) 2018-11-23
JP6981403B2 (ja) 2021-12-15
EP3438249A4 (en) 2019-10-30
JPWO2017170180A1 (ja) 2019-02-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10828335B2 (en) Production of midbrain dopaminergic neurons and methods for the use thereof
US10626366B2 (en) Stem cell culture medium and method
US9487752B2 (en) Priming of pluripotent stem cells for neural differentiation
JP5761816B2 (ja) 多能性幹細胞から神経前駆細胞への分化誘導法
JP2020022480A (ja) 多能性幹細胞を未分化状態で培養する培地、細胞培養および方法
CN109072198B (zh) 产多巴胺神经祖细胞的制备方法
US20180016554A1 (en) Human serum albumin-containing culture medium for growth of neural stem cells
US20190024047A1 (en) Medium for neural stem cells enhancing neural differentiation ability
WO2018193949A1 (ja) ドパミン神経細胞の調製方法
US10968429B2 (en) Chelated iron-containing culture medium for neural stem cells
US20090075374A1 (en) Methods of generating epithelial lineage cells from embryoid bodies and pluripotent cells
JP2023532061A (ja) 遅延胚由来の哺乳類家畜多能性幹細胞
Rajala Development of human stem cell culture conditions for clinical cell therapy

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application