JP2013500724A5 - - Google Patents

Description

関連する態様において、本発明は、高比活性を有するＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現に有用である動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、および既知組成の培地を提供する。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質である。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）タンパク質を発現させるための方法であって、少なくとも約２μＭの濃度の亜鉛、または少なくとも約０．５ｍＭの濃度のカルシウムのうちの少なくとも１つを含む培養培地中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む、方法。
（項目２）
前記培養培地は、少なくとも約２μＭの亜鉛を含有する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記培養培地は、約２μＭ〜約１２μＭの間の亜鉛を含有する、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記培養培地は、少なくとも約５μＭの亜鉛を含有する、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記培養培地は、約５μＭ〜約１２μＭの間の亜鉛を含有する、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記培養培地は、少なくとも約０．５ｍＭのカルシウムを含有する、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記培養培地は、約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭの間のカルシウムを含有する、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記培養培地は、少なくとも２μＭの亜鉛と、少なくとも約０．５ｍＭのカルシウムと、を含有する、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記培養培地は、少なくとも約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）をさらに含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記培養培地は、少なくとも約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）をさらに含む、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記培養培地は、約２ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌの間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する、項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記培養培地は、少なくとも約０．５ｍｇ／Ｌのポリアミンをさらに含む、項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記ポリアミンは、プトレシンである、項目１２に記載の応法。
（項目１４）
前記培養培地は、約２ｍｇ／Ｌ〜約８ｍｇ／Ｌの間のプトレシンを含有する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記培養培地は、動物性タンパク質を含まない、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記培養培地は、既知組成培地である、項目１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
前記細胞は、バクテリア細胞、酵母細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、および哺乳類細胞から成る群より選択される、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記哺乳類細胞は、ヒト細胞系、ハムスター細胞系、およびマウス細胞系から成る群より選択される細胞系である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記細胞系は、ＣＨＯ細胞系、ＢＨＫ細胞系、およびＨＥＫ細胞系から成る群より選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記細胞系は、ＣＨＯ細胞系である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする前記核酸は、誘導性プロモーターをさらに含む、項目１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記方法は、回分細胞培養法を含む、項目１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記回分細胞培養は、反復回分細胞培養である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記回分細胞培養は、流加回分細胞培養である、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記方法は、連続細胞培養を含む、項目１〜２１および２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記連続細胞培養は、連続浮遊細胞培養を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記連続細胞培養は、連続付着細胞培養を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記培養は、ケモスタット様式で実施される、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記培養は、灌流様式で実施される、項目２６または２７に記載の方法。
（項目３０）
前記細胞を培養するためにマイクロキャリアが使用される、項目２７または２９に記載の方法。
（項目３１）
前記マイクロキャリアは、多孔質マイクロキャリアである、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記培養は、少なくとも７日間維持される、項目２３および２５〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記培養は、少なくとも１ヶ月間維持される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記培養は、少なくとも２ヶ月間維持される、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記培養は、約３５℃〜約３７℃の間の温度で維持される、項目１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記培養は、約６．９〜約７．３の間のｐＨで維持される、項目１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記培養は、約７．０５〜約７．１５の間のｐＨで維持される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記ＡＤＡＭＴＳタンパク質はＡＤＡＭＴＳ１３である、項目１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
前記培養培地中の前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の比活性は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質当り少なくとも約６００Ｕである、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記培養培地中の前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の比活性は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質当り少なくとも約８００Ｕである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記培養は、１日につき１Ｌの培養物当り少なくとも約４００ＵのＡＤＡＭＴＳ１３活性（Ｕ／Ｌ／Ｄ）をもたらす、項目３８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
前記培養は、１日につき１Ｌの培養物当り少なくとも約８００ＵのＡＤＡＭＴＳ１３活性（Ｕ／Ｌ／Ｄ）をもたらす、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
ＡＤＡＭＴＳ組成物を産生するための方法であって、
（ａ）動物性タンパク質を含まない培養培地中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養するステップと、
（ｂ）前記培養物から上清の分画を除去するステップと、
（ｃ）あらゆる残留細胞を除去するために、濾過または遠心分離のステップを実施するステップと、
（ｄ）前記ＡＤＡＭＴＳタンパク質を濃縮するために、限外濾過ステップを実施するステップと、
（ｅ）少なくとも約０．５μＭｎの亜鉛と、少なくとも約０．１ｍＭのカルシウムとを含む緩衝液を用いて、透析濾過を実施し、それによってＡＤＡＭＴＳ組成物を調製するステップと、を含む、方法。
（項目４４）
細胞を培養する前記ステップは、回分細胞培養を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
細胞を培養する前記ステップは、連続細胞培養を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
前記培養培地は、カルシウムを含有する、項目４３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目４７）
前記培養培地は、少なくとも０．５ｍＭのカルシウムを含有する、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記培養培地は、亜鉛を含有する、項目４３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
（項目４９）
前記培養培地は、少なくとも２μＭの亜鉛を含有する、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記培養培地は、ニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する、項目４３〜４９のいずれか１項に記載の方法。
（項目５１）
前記培養培地は、少なくとも２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記透析緩衝液は、少なくとも約５μＭの亜鉛と、少なくとも約２ｍＭのカルシウムと、を含有する、項目４３〜５１のいずれか１項に記載の方法。
（項目５３）
前記ＡＤＡＭＴＳタンパク質はＡＤＡＭＴＳ１３である、項目４３〜５２のいずれか１項に記載の方法。
（項目５４）
前記ＡＤＡＭＴＳ１３の比活性の約２０％未満が、前記ステップ（ｃ）の終わりと前記ステップ（ｅ）の終わりの間に失われる、項目４３〜５３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５５）
前記ＡＤＡＭＴＳ１３の比活性の約１０％未満が、前記ステップ（ｃ）の終わりと前記ステップ（ｅ）の終わりの間に失われる、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも約１０００Ｕ／ｍｇの比活性を有する、項目４３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目５７）
前記ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも約１５００Ｕ／ｍｇの比活性を有する、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
項目１〜４２のいずれか１項に記載の方法に従って、細胞培養物中にＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させることを含む方法により調製される、ＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物。
（項目５９）
項目４３〜５７のいずれか１項に記載の方法に従う方法により調製される、ＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物。

Claims (40)

1. トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）タンパク質を発現させるための方法であって、少なくとも３μＭの亜鉛を含む培養培地中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含み、ここで、該方法に従って発現されたＡＤＡＭＴＳタンパク質は、１．５μＭの亜鉛を含む培養培地中で発現されたＡＤＡＭＴＳタンパク質と比較して、より高い比活性を有する、方法。
2. 前記培養培地は、３μＭ〜１２μＭの間の亜鉛を含有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記培養培地は、少なくとも５μＭの亜鉛を含有する、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記培養培地は、５μＭ〜１２μＭの間の亜鉛を含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記培養培地は、少なくとも０．５ｍＭのカルシウムを含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記培養培地は、０．５ｍＭ〜１．５ｍＭの間のカルシウムを含有する、請求項５に記載の方法。
7. 前記培養培地は、少なくとも２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記培養培地は、少なくとも７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌの間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記培養培地は、少なくとも０．５ｍｇ／Ｌのポリアミンをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記ポリアミンは、プトレシンである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌの間のプトレシンを含有する、請求項１１に記載の方法。
13. 前記培養培地は、動物性タンパク質を含まない、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記培養培地は、既知組成培地である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記細胞は、バクテリア細胞、酵母細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、および哺乳類細胞から成る群より選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記哺乳類細胞は、ヒト細胞系、ハムスター細胞系、およびマウス細胞系から成る群より選択される細胞系である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記細胞系は、ＣＨＯ細胞系、ＢＨＫ細胞系、およびＨＥＫ細胞系から成る群より選択される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記細胞系は、ＣＨＯ細胞系である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする前記核酸は、誘導性プロモーターをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記方法は、回分細胞培養を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記回分細胞培養は、反復回分細胞培養である、請求項２０に記載の方法。
22. 前記回分細胞培養は、流加回分細胞培養である、請求項２０に記載の方法。
23. 前記方法は、連続細胞培養を含む、請求項１〜１９および２１のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記連続細胞培養は、連続浮遊細胞培養を含む、請求項２３に記載の方法。
25. 前記連続細胞培養は、連続付着細胞培養を含む、請求項２３に記載の方法。
26. 前記培養は、ケモスタット様式で実施される、請求項２４に記載の方法。
27. 前記培養は、灌流様式で実施される、請求項２４または２５に記載の方法。
28. 前記細胞を培養するためにマイクロキャリアが使用される、請求項２５または２６に記載の方法。
29. 前記マイクロキャリアは、多孔質マイクロキャリアである、請求項２８に記載の方法。
30. 前記培養は、少なくとも７日間維持される、請求項２１および２３〜２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記培養は、少なくとも１ヶ月間維持される、請求項３０に記載の方法。
32. 前記培養は、少なくとも２ヶ月間維持される、請求項３１に記載の方法。
33. 前記培養は、３５℃〜３７℃の間の温度で維持される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
34. 前記培養は、６．９〜７．３の間のｐＨで維持される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
35. 前記培養は、７．０５〜７．１５の間のｐＨで維持される、請求項３４に記載の方法。
36. 前記ＡＤＡＭＴＳタンパク質はＡＤＡＭＴＳ１３である、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
37. 前記培養培地中の前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の比活性は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質当り少なくとも６００Ｕである、請求項３６に記載の方法。
38. 前記培養培地中の前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の比活性は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質当り少なくとも８００Ｕである、請求項３７に記載の方法。
39. 前記培養は、１日につき１Ｌの培養物当り少なくとも４００ＵのＡＤＡＭＴＳ１３活性（Ｕ／Ｌ／Ｄ）をもたらす、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
40. 前記培養は、１日につき１Ｌの培養物当り少なくとも８００ＵのＡＤＡＭＴＳ１３活性（Ｕ／Ｌ／Ｄ）をもたらす、請求項３９に記載の方法。