JP2000342269A - １，３，６，８−テトラヒドロキシナフタレンの微生物学的または酵素的製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 1,3,6,8-テトラヒドロキシナフタレンの微生
物学的または酵素的製造法を提供する。 【解決手段】 放線菌ポリケタイド合成酵素をコードす
るRppA遺伝子、または該酵素遺伝子の相補的配列とハイ
ブリダイズしかつマロニルCoAから1,3,6,8-テトラヒド
ロキシナフタレンへの変換活性をもつ酵素をコードする
遺伝子、を含有する微生物細胞、あるいはマロニルCoA
から1,3,6,8-テトラヒドロキシナフタレンへの変換活性
を含む該微生物細胞からの調製物を用いて、基質として
のマロニルCoAまたは該微生物細胞内でマロニルCoAを産
生可能な物質を1,3,6,8-テトラヒドロキシナフタレンに
変換し、回収して該1,3,6,8-テトラヒドロキシナフタレ
ンを製造する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物学的または
酵素的に1,3,6,8-テトラヒドロキシナフタレンを製造す
る方法に関する。本発明で製造される1,3,6,8-テトラヒ
ドロキシナフタレンは、メラニンの合成原料として、あ
るいは医薬品、農薬などの合成中間体として、また、各
種ポリマーの添加剤として重要である。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】1,3,
6,8-テトラヒドロキシナフタレンを有機合成的手法によ
り製造した例として、ジエチル1,3-アセトンジカルボン
酸を原料として、6工程により1,3,6,8-テトラヒドロキ
シナフタレンを製造する方法(P.M.Baker et al. Chem.
Commun.(1968）71-72、B.W.Bycroft et al. J. Chem.
Soc.,Chem.Commun. (1974) 443）、クロモトロピン酸
（chromoropic acid）からの合成法（H. Tanaka et al.
Agric. Biol. Chem.,27, 48 (1963)）、およびカブリ
ン酸メチルエステル（methylcurvulinate）からの合成
法（A. Kamal et al. Tetrahedron 19, 111 (1963)）な
どが公知である。しかし、このように多工程しかも煩雑
な操作が必要な製造法では安価に1,3,6,8-テトラヒドロ
キシナフタレンを提供することは困難である。

【０００３】一方、微生物を利用して1,3,6,8-テトラヒ
ドロキシナフタレンを製造する方法については、該化合
物が、カビのメラニン合成中間体として単離、同定され
た例はあるが、該化合物を製造することを目的とした文
献等は見いだせない。このようなことから安価な1,3,6,
8-テトラヒドロキシナフタレンの製造法の開発が望まれ
ていた。本発明の目的は、微生物学的または酵素的に1,
3,6,8-テトラヒドロキシナフタレンを製造する方法を提
供することである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意検討した結果、放線菌Streptomycesが
有するポリケタイド合成酵素（植物特異的シャルコンシ
ンターゼホモログともいう）（RppA）が、驚くべきこと
に植物特異的シャルコンシンターゼとは全く異なる反応
を触媒し、マロニルCoAを実質的な原料として1,3,6,8-
テトラヒドロキシナフタレンを合成することを見いだ
し、本発明を完成するに到った。

【０００５】すなわち本発明は、配列表の配列番号２に
示すアミノ酸配列を有する放線菌ポリケタイド合成酵素
をコードするrppA遺伝子、または該酵素遺伝子の相補的
配列とハイブリダイズしかつマロニルCoAから1,3,6,8-
テトラヒドロキシナフタレンへの変換活性をもつ酵素を
コードする遺伝子、を含有する微生物細胞、あるいはマ
ロニルCoAから1,3,6,8-テトラヒドロキシナフタレンへ
の変換活性を含む該微生物細胞からの調製物を用いて、
基質としてのマロニルCoAまたは該微生物細胞内でマロ
ニルCoAを産生可能な物質を1,3,6,8-テトラヒドロキシ
ナフタレンに変換し、回収して該1,3,6,8-テトラヒドロ
キシナフタレンを製造する方法を提供する。

【０００６】本発明の実施態様において、該rppA遺伝子
は配列番号１の1596〜2714の塩基配列を含むものであ
る。本発明の別の実施態様において、該酵素はいずれ
も、約42kDaの分子量を有するポリペプチドのホモ二量
体から成るものである。本発明の別の実施態様におい
て、該微生物細胞はストレプトマイセス（Streptomyce
s）属に属する放線菌細胞である。本発明の別の実施態
様において、該微生物細胞は組換え体細胞である。その
ような組換え体細胞の例は細菌または酵母細胞である。

【０００７】植物特異的シャルコンシンターゼホモログ
（RppA）は、本発明者らが先に放線菌から見いだしたも
のであり、該植物特異的シャルコンシンターゼホモログ
をコードする遺伝子（rppA）は、赤褐色色素の生産性を
付与する遺伝子としてストレプトマイセス属と大腸菌に
クローニングされた（Ueda et al., J. Antibiot. (199
5)48,638-646；特にそのFig.3中のORF1に相当する遺伝
子であり、その塩基配列は後記配列表の配列番号１のヌ
クレオチド番号1596〜2714に、また対応のタンパク質の
アミノ酸配列は配列番号２に示されている。）。さらな
る検討の結果、RppAは約40kDaのタンパク質をコードし
ていること、アミノ酸配列が植物特異的シャルコン合成
酵素と30%の相同性を有することなどが判明した。しか
し、その機能は全く不明であった。

【０００８】微生物におけるポリケタイド合成酵素とし
ては大分子量の多機能酵素タンパク質よりなるタイプI
ポリケタイド合成酵素と単機能な数種類の酵素タンパク
質の集合体よりなるタイプIIポリケタイド合成酵素が公
知であり、これらの合成酵素は、脂肪酸合成酵素のよう
にCoA誘導体を順次縮合する活性が認められている（Hop
wood D. A., Chem. Rev. 97, 2465-2497 (1997)、Hutch
inson C. R., et al.Annu. Rev. Microbiol.49, 201-23
8 (1995)、Katz L. et al., Annu. Rev. Microbiol. 4
7, 875-912 (1993)、Tin-Wein Yu, et al. ,J. Am. Che
m. Soc.120, 7749-7789 (1998)）。

【０００９】しかしながら、驚くべきことに本発明者ら
が見いだした酵素（RppA）は、一つの酵素の作用により
ポリケタイドの一つである1,3,6,8-テトラヒドロキシナ
フタレンを生成するものである。しかも、スターターと
してアセチルCoAは使用せず、マロニルCoAのみを使用す
ることから、公知のポリケタイド合成酵素とは全く異な
った新規な反応を行なう酵素であることは明らかであ
る。また、rppA遺伝子をプローブとしたサザンハイブリ
ダイゼーションにより、本遺伝子が放線菌Streptomyces
属に広く存在していることが明らかとなっている。

【００１０】一方、コンピュータによるホモロジー検索
の結果、Pseudomonas fluorescensによる2,4-ジアセチ
ルフロログルシノール（2,4-diacetylphloroglucinol）
の生合成遺伝子クラスター（Bangra M. G. et al., Mo
l. Plant-Microbe Interact.9, 83-90 (1996)）およびA
mycolatopsis orientalisによるバンコマイシン生合成
遺伝子クラスター（van Wageningen, A. M. A. et al.,
Chem. Biol.5, 155-162 (1998)、Hammond, S. J. et a
l., J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1982, 344-346 (198
2)）にRppAとの相同性が認められた。さらに、微生物が
生産するFuraquinocinsの分子中に存在するナフトキノ
ン環が、1,3,6,8-テトラヒドロキシナフタレンを経由し
て生合成される可能性が高いこと（Shin-ya, K. et a
l., Tetrahedron Lett. 31, 6025-6026 (1990)）、ま
た、1,3,6,8-テトラヒドロナフタレンが、メラニンの前
駆体であることから、rppAから生産されるポリケタイド
合成酵素はストレプトマイセス属に限らず多くの単細胞
微生物にも存在しているものと考えられる。

【００１１】この点で、本発明における微生物細胞に
は、rppA遺伝子を含む微生物細胞の他に、該rppA遺伝子
の相補的配列とハイブリダイズしかつマロニルCoAから
1,3,6,8-テトラヒドロキシナフタレンへの変換活性をも
つ酵素をコードする遺伝子を含む微生物細胞も包含され
る。ここでハイブリダイゼーション条件は特に制限はな
く（高、中もしくは低）ストリンジェントまたは非スト
リンジェントのいずれでもよいが、好ましくはストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件である。ハイブ
リダイゼーション条件は、温度およびイオン強度を適宜
選択して決定できる。一般に温度が高いと、またはイオ
ン強度が低いとストリンジェンシィが高まることが知ら
れている。

【００１２】本明細書中で使用される「調製物」とは、
微生物菌体の処理物、たとえば、遠心分離などにより菌
体を回収し適当な緩衝液などで懸濁したもの、菌体を有
機溶媒などで処理したもの、菌体を加温処理をしたも
の、菌体を破砕して目的とする酵素を分画したもの、菌
体、菌体処理物または酵素を多糖類やポリアクリルアミ
ドなどで固定化したものなどを意味する。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明で使用する微生物は、rppA
遺伝子、または該rppA遺伝子の相補的配列とハイブリダ
イズしかつマロニルCoAから1,3,6,8-テトラヒドロキシ
ナフタレンへの変換活性をもつ酵素をコードする遺伝
子、を有するものであれば特に制限はなく、好気性、通
性嫌気性及び嫌気性微生物のいずれでもよく、例えばSt
reptomyces属に属する放線菌やその他の属の放線菌、あ
るいは上記遺伝子を発現可能なように適当なベクタープ
ラスミドに挿入して形質転換させた遺伝子組換え体など
を挙げることができる。ここで「発現可能なように」と
は、上記遺伝子がプロモーターに作動可能に連結されて
いることを意味する。

【００１４】本発明におけるrppA遺伝子はStreptomyces
griseusから、Ueda, K. et. al.,J. Antibiot. (199
5),48(7), 638-646に記載の方法によって得ることが可
能である。また、該rppA遺伝子の相補的配列とハイブリ
ダイズしかつマロニルCoAから1,3,6,8-テトラヒドロキ
シナフタレンへの変換活性をもつ酵素をコードする遺伝
子は、rppA遺伝子の塩基配列の一部をたとえば部位特異
的突然変異誘発法等の慣用技術を用いて置換、欠失、付
加等の改変を行なうことによって作製可能であるし、あ
るいは、rppA遺伝子の塩基配列に基いて作製したプライ
マーまたは縮重プローブを用いるポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）またはサザンもしくはノーザンハイブリダイゼ
ーションを利用して放線菌を含む細菌、菌類などの微生
物から目的遺伝子を得ることができる。取得された遺伝
子は、必要に応じて、PCRまたはクローニング技術を用
いて増幅し得る。次いで、増幅された遺伝子は適切な発
現ベクターに組み込んで組換えベクターを作製し、さら
に該ベクターによって適切な宿主細胞を形質転換し、適
切な培地中に培養して、目的の微生物細胞を得ることが
できる。必要に応じて、該微生物細胞から上記定義の調
製物を得ることができる。遺伝子クローニング、形質転
換等の技術については、たとえばSambrook, J.et al.,
Molecular Cloning A Laboratory Mannual Second Edit
ion (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, N
Yに記載されており、これらの手法を適宜選択して利用
できる。

【００１５】遺伝子組み換え体の例としては、本発明者
らにより作製されたE. coli BL21/pET-RppAを挙げるこ
とができ、この菌株は平成11年5月27日付で寄託番号FER
M P-17402にて通産省工業技術院生命工学工業技術研究
所（茨城県つくば市東1丁目１−３）に寄託されてい
る。また、エシェリヒア属細菌に加えて、上記遺伝子を
サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、トリコ
スポロン属、ピチア属などに属する酵母；バチラス属、
セラチア属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウ
ム属、シュードモナス属などに属する細菌などの宿主ベ
クター系で発現させることも可能である。その他の微生
物たとえば糸状菌などの菌類も宿主として使用できる。

【００１６】発現ベクターは宿主細胞内で自律複製可能
または相同組換え可能であるとともに、プロモーターに
加えてリボソーム結合配列、転写終結配列、複製開始点
なども適宜含み得る。発現ベクターの例は、細菌の場
合、pBtrp2,pBTac1,pBTac2（ベーリンガーマンハイム
社）、pQE（キアゲン社）、pET（ノバジェン社）、pBlu
escript（ストラタジーン社）など、酵母の場合、pXT1,
pSG5、pSVK3,pBPV,pMSG,pSVL SV40（ストラタジーン
社）である。

【００１７】宿主細胞への遺伝子の導入は、たとえばカ
ルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレ
クトロポレーション法などの一般的な方法で実施でき
る。本発明方法で使用される酵素は、宿主細胞内での遺
伝子発現の際に、分泌形態または非分泌形態で産生され
うる。特に分泌形態で発現される場合には、該酵素はそ
のN末端にシグナルペプチド配列を有する形態で翻訳さ
れねばならず、したがって、該酵素をコードする遺伝子
のすぐ5'端に該シグナルペプチドをコードするDNAを連
結したものを発現ベクターに組み込む必要がある。

【００１８】rppA遺伝子の相補的配列とハイブリダイズ
しかつマロニルCoAから1,3,6,8-テトラヒドロキシナフ
タレンへの変換活性をもつ酵素をコードする遺伝子を含
有する微生物細胞の他の生成例には、rppA遺伝子を含有
するStreptomyces属細菌たとえばStreptomyces griseus
を紫外線や化学変異剤で処理してrppA遺伝子を突然変異
させたものも含まれる。あるいは、従来の微生物スクリ
ーニング法により天然界から採取されたものであっても
よい。

【００１９】1,3,6,8-テトラヒドロキシナフタレンを製
造するための微生物細胞の製造は、菌が生育する培地で
あれば特に制限はなく、例えば、グルコース、シューク
ロースなどの糖類を炭素源として、アンモニウム塩や硝
酸塩などの無機窒素源、あるいは酵母エキス、マルツエ
キスなどの有機窒素源、さらに各種無機塩やビタミン類
などを含有した培養液で好気的、または嫌気的に１日か
ら１ヶ月程度培養を行えばよい。また、rppA遺伝子を導
入した遺伝子組換え体の場合にも、これらの遺伝子組換
え体が生育可能な培地を用いて培養を行えばよく、効率
よくrppA遺伝子を発現させるためには使用した発現プラ
スミドの誘導剤などを添加することも有効であり、大腸
菌の発現プラスミドpUC19に対しては例えば、isopropyl
-b-galactopyranoside(IPTG)などを用いると高い活性が
得られることがあり好ましい。

【００２０】本発明により1,3,6,8-テトラヒドロキシナ
フタレンを製造するためには、上記微生物の培養液をそ
のまま用いることも可能であるが、遠心分離などにより
菌体を回収し適当な緩衝液などに懸濁したもの、菌体を
有機溶媒などで処理したもの、加温処理をしたものなど
の菌体処理物、また、菌体を破砕して目的とする酵素を
分画し使用することもできる。さらに、菌体、菌体処理
物あるいは酵素を多糖類やポリアクリルアミドなどで固
定化した菌体処理物も用いることもできる。これらの形
態については特に限定されるものでなく、目的に合わせ
て選択することができる。なお、Streptomyces gliseus
由来のRppAは約42kDaの分子量を有するポリペプチドの
ホモ二量体から成っている。

【００２１】本発明により1,3,6,8-テトラヒドロキシナ
フタレンを製造する場合、原料としては、直接的にはマ
ロニルCoAを使用することができる。マロニルCoAの濃度
（重量）としては反応系あたり0.05%から20%、好ましく
は0.1%から15%で行うことができる。また、原料とし
て、菌体内で実質的にマロニルCoAを生成するものであ
れば何でもよく、たとえばグルコース、フラクトース、
廃糖蜜などの糖類、脂肪酸などを用いることができる。

【００２２】微生物または調製物の添加量は、反応系あ
たりのRppA酵素量に換算して通常約0.0001％〜約15％
（重量）の範囲で使用可能であるが、この範囲に限定さ
れず本反応が起こり得る適量が使用される。反応または
生産温度は、微生物の種類によって一般に異なるため特
に限定されないが、0〜60℃、好ましくは10〜50℃が望
ましい。また、pHは通常約５〜約９であるが、この範囲
に限定されない。反応後、メタノール、エタノールなど
による沈殿法、酢酸エチルなどの有機溶媒を用いた抽出
法などの公知の方法により、反応液または培養液から1,
3,6,8-テトラヒドロキシナフタレンを容易に回収するこ
とができる。

【００２３】

【実施例】次に、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はそれらの実施例に限定されないものとす
る。実施例１ rppA遺伝子発現ベクターの構築および形質転換 rppA遺伝子を含むプラスミドpIJ486-RB44（Ueda, K. e
t. al., J. Antibiot.(1995),48(7), 638-646）10ulに
制限酵素HindIII用10倍濃度制限酵素反応用緩衝液5ul、
滅菌水33ul、制限酵素HindIII 2ulを加え、37℃にて2時
間反応させた後、BamHI用10倍濃度制限酵素反応用緩衝
液5ulを添加し、BamHI 2ulを添加して37℃にてさらに2
時間反応させた。その後、アガロース電気泳動を行い、
1.5KbのDNA断片をゲルから切り出しGENECLEAN III（BIO
101社）を用いて回収した。このDNA断片を同様にしてH
indIIIおよびBamHIで切断した大腸菌ベクタープラスミ
ドpUC19とライゲーションキット（宝酒造株式会社）を
用いてライゲーションし、rppA遺伝子を含むプラスミド
pUC19-RB44を得た。rppAの開始コドンを含む領域（CCCA
TG）を（CATATG）に変化させて制限酵素NdeI認識部位を
導入した。すなわち、プライマー#1：5'-GCCAAGCTTCATA
TGGCGACCCTGTGCCGACC-3'（配列番号３）とプライマー#
2：5'-GGAGCCGTTGCGCTCCAGGC-3'（配列番号４）をプラ
イマーとしてプラスミドpUC19-RB44を鋳型としてポリメ
ラーゼ連鎖反応（PCR）を行った。

【００２４】すなわち、プラスミドpUC19-RB44 1ul、1
0倍濃度の反応緩衝液10ul、10mM dNTP 8ul、プライマー
#1、#2各々1ul（100pmol濃度相当）Expand HIGH Fideli
ty PCR System（BOEHRINGER MANNHEIM社）1ulを加えて1
00ulとした。この溶液について、98℃、20秒間（変性ス
テップ）、55℃、１分間（アニーリングステップ）、72
℃、１分間（伸長ステップ）のインキュベーションを20
サイクル行った。反応終了後、エタノール沈殿により増
幅されたDNAを回収し、20ulの滅菌水に溶解した。回収
した増幅DNA5ulと制限酵素HindIII用10倍濃度制限酵素
反応用緩衝液5ul、滅菌水38ul、制限酵素HindIII 2ulを
混合し、37℃にて2時間反応させた後、SphI用10倍濃度
制限酵素反応用緩衝液5ulを添加し、SphI 2ulを添加し
て37℃にてさらに2時間反応させた。同様にしてpUC19-R
B44を制限酵素HindIIIおよびSphIで切断してrppAのHind
III-SphI部位を除去したものとライゲーションして、rp
pAの開始コドンを含む領域（CCCATG）を（CATATG）に変
化させて制限酵素NdeI認識部位を導入したものを作製し
た。このようにして作製した新たに制限酵素NdeI認識部
位を導入したプラスミドをNdeIおよびBamHIにて切断
し、アガロース電気泳動を行い、1.5KbのDNA断片をゲル
から切り出しGENECLEAN IIIを用いて回収した。同様に
して制限酵素NdeIおよびBamHIで切断したpET-16b（Nova
gen,Madison,WI）に導入してpET-RppAを作製した。この
ようにして作製した発現プラスミドpET-RppAは、Hisタ
グのついたMet-Gly-(His)₁₀-(Ser)₂-Gly-His-Ile-Glu-G
ly-Arg-His-RppA(配列番号５)という42.7kDaのポリペプ
チドを合成する。

【００２５】RppA発現プラスミドpET-RppAで形質転換し
た大腸菌E. coli BL21/pET-RppA（FERM P-17402）を100
mg/Lのアンピシリンを含有するLB培地にて26℃で16時間
培養した。このようにして得た培養液から遠心分離によ
り菌体を分離し、0.85% NaClを含む10mM Tris.HCl(pH
7.5) 緩衝液にて洗浄し、20mlの10mM Tris.HCl(pH 7.5)
緩衝液にて懸濁した。得られた洗浄菌体を超音波処理
により破砕し、無細胞抽出液を作製した。得られた無細
胞抽出液を10,000×gで20分間遠心分離した上清を0.45u
mのフィルターで濾過した後、His-bind resin（Novage
n）カラムにアプライし、60-600mMの直線的勾配によりH
isタグのついたRppAタンパク質を溶出した。

【００２６】実施例２ 1,3,6,8-テトラヒドロキシナフタレンの製造例 1,3,6,8-テトラヒドロキシナフタレンの合成反応を以下
の反応液組成で行った。 0.2mMマロニルCoA（原料）、100mMTri-HCl（pH8.0）、1
mM EDTA、1 mMメルカプトエタノール、100ug RppA（実
施例１参照）、および全量 １ml。 反応は30℃にて１時間行い、6N HClを200ul添加するこ
とにより反応を停止させた。反応液を酢酸エチルで抽出
し、N₂気流下酢酸エチルを留去させてメタノールに溶解
させた。

【００２７】このメタノール溶解物をLCAPCIMSマススペ
クトルにより分析した。ODS-80Ts（Tosoh社製）のカラ
ムを用いて2%の酢酸を含む5%から40%のアセトニトリル
による直線勾配（30分 0.8ml/min）による分析により
標準である1,3,6,8-テトラヒドロキシナフタレンと同じ
14分のリテンションタイムでピークが出現し、LC/MSに
よる分析の結果、1,3,6,8-テトラヒドロキシナフタレン
と同じ分子量192であることも確認し、また各フラグメ
ントも標品と同じパターンを示したことから1,3,6,8-テ
トラヒドロキシナフタレンと同定した。

【００２８】

【発明の効果】本発明によれば、メラニンの合成原料と
して、あるいは医薬品、農薬などの合成中間体として、
また、各種ポリマーの添加剤として重要である1,3,6,8-
テトラヒドロキシナフタレンを安価に製造することが可
能である。

【００２９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Rayon Co., Ltd. <120> Process for preparing 1,3,6,8-tetrahydroxynaphthalene microbially or enzymatically <130> P99-0321 <140> <141> <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2795 <212> DNA <213> Streptomyces griseus <220> <221> CDS <222> (1596)(2714) <300> <301> Ueda,K., Kim,K.M., Beppu,T. and Horinouchi,S. <302> Overexpression of a gene cluster encoding a chalcone synthase-like protein confers redbrown pigment production in Streptomyces griseu s <303> J. Antibiotics <304> 48 <305> 7 <306> 638-646 <307> 1995 <400> 1 tggccagcgg cgggctccac gctccggcac cccggccgag gtgctgacgg aggagaccgt 60 ccgggccgtg ttcgacctcg acagccgcat catcgaggac cccgtgtcgg gtcggcccct 120 gatgctcccg atcggccgcc accacgtcct ggaccgggcc gacccgctga ccgtcgggga 180 gccgaccgcg tgaacgccgg ggcgtacgcc ccctgatcgg ctgactgctg tgcgtcactg 240 acatgtttcg gagagtgacg gggcacacag ggtaggtcgg acgccgggcc ccggtccggc 300 agacgccctt ttcctcgaag cggtcattgg gagaacctcg gtggagaaca cctcggtgca 360 gaacaaggaa accgtccgga actgtccttt cgactacgcg cacgagctgg agttcgaccc 420 ccagctcagg caattgctca ccgaggagcc ggtgtcccgc atccgtatgg cgtacggaga 480 gggcgaggcc tggctggtca cccgctacga ggacgtccgg acggtcacca ccgaccggcg 540 gttcagccgc agcgccgtcc tcggccggga cttcccccgg atgaccccgg agccgatcgt 600 gcaggcggag tccatcaacc tcatggaccc gcccgccagc agccggctgc ggggcctggt 660 ggccaagagc ttcaccccgc gtcgcgtcga gcagatgcgc ggcgggaccc agcgcgtggt 720 ggaccggctg ctggacgaga tggaggagga gggctcaccg ggcgacttcg tcgcccgggt 780 ctccgcgccg ctgccgctga tcaccatctg cgaggcactc gacatccccg aggcggaccg 840 gccctggctc cgggcccacg ccatgaccat gatgaacgtc ggggccgcgg gcaagcagga 900 cgcggtgcgc gccaaggcgg agctgcgcgg ctacttccag gagctgaccg ccgaccgccg 960 ccgctccccg ggcgaggacc tcatcagcac cctggccacc gcccgggacg gcgacgaact 1020 gctggacgac gacgagctgg ccgtcatggc gatggtcctg ctcatcaccg gccaggacac 1080 cacgacctac cagctcggca acatcgccta caccctgctc acccgcccgg acctgctgcg 1140 gtccctccgg gccgaaccgc agcggctgcc ccgcaccctg gaggagctgc tgcgccacat 1200 ccccttccgc aagggcgtcg gcatcccccg tatcgccctg gaggacgtgg agctctccgg 1260 cgtcctcatc aaggccggcg acgtggtgca cgtgtcctac ctgacggcca accgggactc 1320 cgccaagttc gaccgtcccg acgagctgga ccccgaccgg ccgaccatcc cccacatgac 1380 gttcggctgg ggcgcccacc actgcctggg cgcgccgctg gccaccatgg agctggaagt 1440 ggccttctcc acgctgctga cccgcttccc ggccctgcgt ctggacgtgc cgcccgagga 1500 cgtctcgtgg aacacgacgt ccatctggcg ttacccgctc gccctgcccg tcacatggtg 1560 acgagagcct ccgctccaga gaacgaggag aacccatggc gaccctgtgc cgaccggcca 1620 tcgctgtgcc cgagcacgtc atcacgatgc agcagaccct ggacctggcc cgggagaccc 1680 atgccgggca cccgcagcgc gacctcgtcc tgaggctcat ccagaacacc ggcgtccaga 1740 cccggcacct cgtgcagccc atcgagaaga ccctggcgca ccccggattc gaggtgcgca 1800 accaggtgta cgaggccgag gccaagaccc gggtccccga agtcgtccgg cgggcgctcg 1860 ccaacgccga gaccgagccg tccgagatcg acctgatcgt ctacgtctcc tgcacgggtt 1920 tcatgatgcc ctcgctgacc gcgtggatca tcaacagcat gggcttccgg cccgagaccc 1980 gccaactgcc catcgcccag ctcggctgtg cggcgggcgg cgcggcgatc aaccgcgcgc 2040 acgacttctg cgtggcctac cccgactcca acgtcctcat cgtgtcctgc gagttctgct 2100 cgctgtgcta ccagcccacc gacatcgggg tcggttccct gctctccaac ggactcttcg 2160 gcgacgcgct ctccgcggcc gtcgtacggg gacagggcgg caccggcatg cgcctggagc 2220 gcaacggctc ccacctggtg cccgacaccg aggactggat ctcctacgcg gtccgcgaca 2280 ccgggttcca cttccagctg gacaagcggg tcccgggcac catggagatg ctcgccccgg 2340 tgctcctgga cctggtcgac ctgcacggct ggtccgtccc gaacatggac ttcttcatcg 2400 tccacgcggg cggaccgcgc atcctggacg acctctgcca cttcctcgac ctgccgcccg 2460 agatgttccg ctacagccgg gccaccctca ccgaacgcgg caacatcgcg agctccgtcg 2520 tcttcgacgc gctggcgcgc ctcttcgacg acggcggcgc cgccgagtcc gcgcaggggc 2580 tcatcgccgg cttcggtccc ggcatcaccg ccgaggtggc cgtggggagt tgggccaagg 2640 aaggcctcgg ggcggacgtc ggacgcgacc tcgacgagct ggagctgacc gccggcgttg 2700 cgctgtccgg ctgaaccggc taaggcgacc gacggacggg gacgaaggaa cgggtgttcg 2760 cgcttcgcgg acgcactcgt gccgcgactg gatcc 2795 <210> 2 <211> 372 <212> PRT <213> Streptomyces griseus <300> <301> Ueda,K., Kim,K.M., Beppu,T. and Horinouchi,S. <302> Overexpression of a gene cluster encoding a chalcone synthase-like protein confers redbrown pigment production in Streptomyces griseu s <303> J. Antibiotics <304> 48 <305> 7 <306> 638-646 <307> 1995 <400> 2 Met Ala Thr Leu Cys Arg Pro Ala Ile Ala Val Pro Glu His Val Ile 1 5 10 15 Thr Met Gln Gln Thr Leu Asp Leu Ala Arg Glu Thr His Ala Gly His 20 25 30 Pro Gln Arg Asp Leu Val Leu Arg Leu Ile Gln Asn Thr Gly Val Gln 35 40 45 Thr Arg His Leu Val Gln Pro Ile Glu Lys Thr Leu Ala His Pro Gly 50 55 60 Phe Glu Val Arg Asn Gln Val Tyr Glu Ala Glu Ala Lys Thr Arg Val 65 70 75 80 Pro Glu Val Val Arg Arg Ala Leu Ala Asn Ala Glu Thr Glu Pro Ser 85 90 95 Glu Ile Asp Leu Ile Val Tyr Val Ser Cys Thr Gly Phe Met Met Pro 100 105 110 Ser Leu Thr Ala Trp Ile Ile Asn Ser Met Gly Phe Arg Pro Glu Thr 115 120 125 Arg Gln Leu Pro Ile Ala Gln Leu Gly Cys Ala Ala Gly Gly Ala Ala 130 135 140 Ile Asn Arg Ala His Asp Phe Cys Val Ala Tyr Pro Asp Ser Asn Val 145 150 155 160 Leu Ile Val Ser Cys Glu Phe Cys Ser Leu Cys Tyr Gln Pro Thr Asp 165 170 175 Ile Gly Val Gly Ser Leu Leu Ser Asn Gly Leu Phe Gly Asp Ala Leu 180 185 190 Ser Ala Ala Val Val Arg Gly Gln Gly Gly Thr Gly Met Arg Leu Glu 195 200 205 Arg Asn Gly Ser His Leu Val Pro Asp Thr Glu Asp Trp Ile Ser Tyr 210 215 220 Ala Val Arg Asp Thr Gly Phe His Phe Gln Leu Asp Lys Arg Val Pro 225 230 235 240 Gly Thr Met Glu Met Leu Ala Pro Val Leu Leu Asp Leu Val Asp Leu 245 250 255 His Gly Trp Ser Val Pro Asn Met Asp Phe Phe Ile Val His Ala Gly 260 265 270 Gly Pro Arg Ile Leu Asp Asp Leu Cys His Phe Leu Asp Leu Pro Pro 275 280 285 Glu Met Phe Arg Tyr Ser Arg Ala Thr Leu Thr Glu Arg Gly Asn Ile 290 295 300 Ala Ser Ser Val Val Phe Asp Ala Leu Ala Arg Leu Phe Asp Asp Gly 305 310 315 320 Gly Ala Ala Glu Ser Ala Gln Gly Leu Ile Ala Gly Phe Gly Pro Gly 325 330 335 Ile Thr Ala Glu Val Ala Val Gly Ser Trp Ala Lys Glu Gly Leu Gly 340 345 350 Ala Asp Val Gly Arg Asp Leu Asp Glu Leu Glu Leu Thr Ala Gly Val 355 360 365 Ala Leu Ser Gly 370 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a PCR primer for amplification of rppA gene. <400> 3 gccaagcttc atatggcgac cctgtgccga cc 32 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a PCR primer for amplification of rppA gene. <400> 4 ggagccgttg cgctccaggc 20 <210> 5 <211> 393 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is an amino acid sequence of RppA to which amino acids comprising His tag are attached. <400> 5 Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His 1 5 10 15 Ile Glu Gly Arg His Met Ala Thr Leu Cys Arg Pro Ala Ile Ala Val 20 25 30 Pro Glu His Val Ile Thr Met Gln Gln Thr Leu Asp Leu Ala Arg Glu 35 40 45 Thr His Ala Gly His Pro Gln Arg Asp Leu Val Leu Arg Leu Ile Gln 50 55 60 Asn Thr Gly Val Gln Thr Arg His Leu Val Gln Pro Ile Glu Lys Thr 65 70 75 80 Leu Ala His Pro Gly Phe Glu Val Arg Asn Gln Val Tyr Glu Ala Glu 85 90 95 Ala Lys Thr Arg Val Pro Glu Val Val Arg Arg Ala Leu Ala Asn Ala 100 105 110 Glu Thr Glu Pro Ser Glu Ile Asp Leu Ile Val Tyr Val Ser Cys Thr 115 120 125 Gly Phe Met Met Pro Ser Leu Thr Ala Trp Ile Ile Asn Ser Met Gly 130 135 140 Phe Arg Pro Glu Thr Arg Gln Leu Pro Ile Ala Gln Leu Gly Cys Ala 145 150 155 160 Ala Gly Gly Ala Ala Ile Asn Arg Ala His Asp Phe Cys Val Ala Tyr 165 170 175 Pro Asp Ser Asn Val Leu Ile Val Ser Cys Glu Phe Cys Ser Leu Cys 180 185 190 Tyr Gln Pro Thr Asp Ile Gly Val Gly Ser Leu Leu Ser Asn Gly Leu 195 200 205 Phe Gly Asp Ala Leu Ser Ala Ala Val Val Arg Gly Gln Gly Gly Thr 210 215 220 Gly Met Arg Leu Glu Arg Asn Gly Ser His Leu Val Pro Asp Thr Glu 225 230 235 240 Asp Trp Ile Ser Tyr Ala Val Arg Asp Thr Gly Phe His Phe Gln Leu 245 250 255 Asp Lys Arg Val Pro Gly Thr Met Glu Met Leu Ala Pro Val Leu Leu 260 265 270 Asp Leu Val Asp Leu His Gly Trp Ser Val Pro Asn Met Asp Phe Phe 275 280 285 Ile Val His Ala Gly Gly Pro Arg Ile Leu Asp Asp Leu Cys His Phe 290 295 300 Leu Asp Leu Pro Pro Glu Met Phe Arg Tyr Ser Arg Ala Thr Leu Thr 305 310 315 320 Glu Arg Gly Asn Ile Ala Ser Ser Val Val Phe Asp Ala Leu Ala Arg 325 330 335 Leu Phe Asp Asp Gly Gly Ala Ala Glu Ser Ala Gln Gly Leu Ile Ala 340 345 350 Gly Phe Gly Pro Gly Ile Thr Ala Glu Val Ala Val Gly Ser Trp Ala 355 360 365 Lys Glu Gly Leu Gly Ala Asp Val Gly Arg Asp Leu Asp Glu Leu Glu 370 375 380 Leu Thr Ala Gly Val Ala Leu Ser Gly 385 390

【００３０】

【配列表フリーテキスト】配列番号３：rppA遺伝子の増
幅のためのPCRプライマーを示す。 配列番号４：rppA遺伝子の増幅のためのPCRプライマー
を示す。 配列番号５：Hisタグを含むアミノ酸が結合されたRppA
のアミノ酸配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA07 BA80 CA04 DA06 DA08 EA04 GA11 HA01 4B064 AC19 CA02 CA03 CA11 CA19 CC24 CD07 DA16 4B065 AA26X AA50Y AB01 AC14 CA27 CA60

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列
   を有する放線菌ポリケタイド合成酵素をコードするrppA
   遺伝子、または該酵素遺伝子の相補的配列とハイブリダ
   イズしかつマロニルCoAから1,3,6,8-テトラヒドロキシ
   ナフタレンへの変換活性をもつ酵素をコードする遺伝
   子、を含有する微生物細胞、あるいはマロニルCoAから
   1,3,6,8-テトラヒドロキシナフタレンへの変換活性を含
   む該微生物細胞からの調製物を用いて、基質としてのマ
   ロニルCoAまたは該微生物細胞内でマロニルCoAを産生可
   能な物質を1,3,6,8-テトラヒドロキシナフタレンに変換
   し、回収して該1,3,6,8-テトラヒドロキシナフタレンを
   製造する方法。
2. 【請求項２】 前記rppA遺伝子が配列番号１の1596〜27
   14の塩基配列を含む請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記酵素が約42kDaの分子量を有するポ
   リペプチドのホモ二量体から成るものである請求項１に
   記載の方法。
4. 【請求項４】 前記微生物細胞がストレプトマイセス属
   に属する放線菌細胞である請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記微生物細胞が組換え体細胞であるこ
   とを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記微生物細胞が細菌または酵母細胞で
   ある請求項５に記載の方法。