JP2001238677A - ピラン−２−オン類の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 １種または２種以上のカルボニルCoA 化
合物を、ポリケタイド合成酵素遺伝子を含有する微生物
の培養物、菌体または菌体処理物で処理し、一般式
(I)： または一般式（II）： [式(I) 、(II)において、Ｒ₁ 、Ｒ₂ 、Ｒ₃ は、プロト
ンあるいは炭素数１から8までの飽和あるいは不飽和の
アルキル基を示す。Ｒ₁ 、Ｒ₂ 、Ｒ₃ は、同一であって
もよく、異なっていてもよい。] で表されるピラン−２
−オン類に変換させることを特徴とする、ピラン−２−
オン類の製造方法。 【効果】 本発明によれば、医薬品、農薬などの合成中
間体として、また、感熱転写紙の添加剤として重要なピ
ラン−２−オン類を安価に製造することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ピラン−２−オン
類を製造する方法に関する。本発明で製造されるピラン
−２−オン類は、医薬品、農薬などの合成中間体とし
て、また、感熱転写紙の添加剤として重要である。

【０００２】

【従来の技術】ピラン−２−オン類、例えば６−メチル
−４−ヒドロキシ−２Ｈ−ピラン−２−オンの製造方法
としてデヒドロ酢酸を加圧下（1kg/cm²）、高温（95-10
5℃）、高濃度の硫酸存在下で合成する方法（USP 45700
03 ）が公知である。しかし、このような高温高圧条件
下での製造には煩雑な操作が必要であり、ピラン−２−
オン類を安価に提供することは困難である。

【０００３】また、微生物を利用してピラン−２−オン
類を製造する方法についてはカビの培養液中の二次代謝
産物として単離、同定された例はあるが、該化合物を製
造することを目的とした文献などは見いだせない。従っ
て、安価なピラン−２−オン類の製造方法の開発が望ま
れていた。

【０００４】ポリケタイドは、脂肪酸生合成に類似した
機構によりアセチルCoA を出発単位として、マロニルCo
A が脱炭酸しながら次々に結合して生じるβ−ケトメチ
レン鎖から導かれる化合物の総称である。本発明者らは
先に放線菌Streptomycesが有するポリケタイド合成酵素
（RppA）が、マロニルCoAを実質的な原料として1,3,6,8
-テトラヒドロキシナフタレンを合成することを見いだ
している（特願平11−155526号参照）。通常微生物にお
けるポリケタイド合成酵素としては大分子量の多機能酵
素タンパク質よりなるタイプＩポリケタイド合成酵素と
単機能な数種類の酵素タンパク質の集合体よりなるタイ
プIIポリケタイド合成酵素が知られているが、上記酵素
（RppA）は、一つの酵素の作用により1,3,6,8-テトラヒ
ドロキシナフタレンを生成する点、またアセチルCoAで
はなく、マロニルCoAを基質とする点において、公知の
ポリケタイド合成酵素とは全く異なる新規な反応を行う
酵素であると考えられる。

【０００５】rppA遺伝子（ [Ueda, K. et al., J.Antib
iot, 48(7), 643-646 (1995)] に基づく）をプローブと
したサザンハイブリダイゼーションにより、本遺伝子は
放線菌Sreptomycesに広く存在していることが明らかと
なっている。一方、コンピューターによるホモロジー検
索の結果、Pseudomonas fluorescensによる2,4-ジアセ
チルフロログルシノール（2,4-diacetylphloroglucino
l）の生合成遺伝子クラスター [Bangra M. G. et al.,
Mol. Plant-Mirobe Interract. 9, 83-90 (1996)] およ
びAmycolatopsis orientalisによるバンコマイシン生合
成遺伝子クラスター [van Wageningen, A. M. A. et a
l., Chem. Biol. 5, 155-162 (1998) 、Hammond, S. J.
et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun. 344-346 (198
2)] にrppA遺伝子との相同性が認められた。さらに微生
物が生産するFuraquinocinsの分子中に存在するナフト
キノン環が、1,3,6,8-テトラヒドロキシナフタレンを経
由して生合成される可能性が高いこと [Shin-ya, K. et
al., Tetrahedron Lett. 31, 6025-6026 (1990)] 、ま
た、1,3,6,8-テトラヒドロキシナフタレンが、メラニン
の前駆体であることから、rppA遺伝子はストレプトマイ
セス（Streptomyces）属に限らず多くの単細胞微生物に
も存在しているものと考えられる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
のポリケタイド合成酵素遺伝子を含有する微生物を利用
してピラン−２−オン類を製造する方法を提供すること
にある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
を解決するために鋭意検討した結果、ストレプトマイセ
ス（Streptomyces）属に属する放線菌が有するポリケタ
イド合成酵素（植物特異的シャルコンシンターゼホモロ
グともいう）（RppA）が、驚くべきことに１種または２
種以上のカルボニルCoA 化合物を基質としてピラン−２
−オン類を合成することを見いだし、本発明を完成させ
るに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、カルボニルCoA 化合
物を、ポリケタイド合成酵素遺伝子を含有する微生物の
培養物、菌体または菌体処理物で処理し、一般式 (I)：

【０００９】

【化１】

【００１０】または一般式（II）：

【００１１】

【化２】

【００１２】[式(I) 、(II)において、Ｒ₁ 、Ｒ₂ 、Ｒ
₃ は、プロトンあるいは炭素数１から8までの飽和ある
いは不飽和のアルキル基を示す。Ｒ₁ 、Ｒ₂ 、Ｒ₃ は、
同一であってもよく、異なっていてもよい。] で表され
るピラン−２−オン類に変換させることを特徴とする、
ピラン−２−オン類の製造方法である。以下、本発明を
詳細に説明する。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明方法によるピラン−２−オ
ン類の製造のための基質としては、カルボニルCoA 化合
物を用いる。カルボニルCoA 化合物としては、プロピオ
ニルCoA、ブチリルCoA、バレリルCoA、ヘキサノイルCo
A、ヘプタノイルCoA、オクタノイルCoA、ノナノイルCoA
などの飽和脂肪酸CoA、アクリロイルCoA、クロトノイル
CoA、メタクロイルCoAなどの不飽和脂肪酸CoA、アセト
アセチルCoA、マロニルCoA、メチルマロニルCoAなどの
ケト酸CoAなどが挙げられる。

【００１４】また、上記のカルボニルCoA化合物は、こ
れらを反応系において生成できる物質を使用してもよ
く、例えばグルコース、フラクトース、廃糖蜜などの糖
類、有機酸、脂肪酸などが挙げられる。使用するカルボ
ニルCoA 化合物の種類によって前記一般式(I) または(I
I)で表されるピラン−２−オン類のＲ₁ 、Ｒ₂ およびＲ
₃ の官能基が決定される。

【００１５】カルボニルCoA化合物の使用量は濃度（重
量）としては反応系あたり0.05%から20%、好ましくは0.
1%から15%とすればよい。

【００１６】本発明において、ポリケタイド合成酵素遺
伝子としては、ストレプトマイセス（Streptomyces）属
に属する放線菌由来のrppA遺伝子を用いることができ、
その塩基配列を後記配列表の配列番号１のヌクレオチド
番号1596〜2714に、また対応のタンパク質のアミノ酸配
列を配列番号２に示される。

【００１７】本発明にいう微生物としては、rppA遺伝子
を含む微生物の他に、該rppA遺伝子の相補的配列とハイ
ブリダイズし、かつマロニルCoAから1,3,6,8-テトラヒ
ドロキシナフタレンへの変換活性をもつ酵素をコードす
る遺伝子を含む微生物も包含される。ここでハイブリダ
イゼーション条件は特に制限はなく（高、中もしくは
低）ストリンジェントまたは非ストリンジェントのいず
れでも良いが、好ましくはストリンジェントなハイブリ
ダイゼーション条件である。ハイブリダイゼーション条
件は、温度およびイオン強度を適宜選択して決定でき
が、一般に温度が高いと、またはイオン強度が低いとス
トリンジェントが高まることが知られている。

【００１８】上記の微生物は、rppA遺伝子、または該rp
pA遺伝子の相補的配列とハイブリダイズし、かつマロニ
ルCoAから1,3,6,8-テトラヒドロキシナフタレンへの変
換活性をもつ酵素をコードする遺伝子を有するものであ
れば特に制限はなく、好気性、通性嫌気性および嫌気性
微生物のいずれでもよく、例えばストレプトマイセス
（Streptomyces）属に属する放線菌やその他の属の放線
菌が挙げられる。

【００１９】本発明においては、上記の微生物を培地中
で培養して得られる培養物をそのままか、該培養物から
遠心分離などの集菌操作によって得られる菌体、若しく
は菌体処理物を用いることができる。

【００２０】本発明にいう「微生物の菌体」とは、該微
生物の培養物から遠心分離などの集菌操作によって得ら
れるものをいう。

【００２１】また、本発明にいう「微生物の菌体処理
物」とは、たとえば、遠心分離などにより菌体を回収し
適当な緩衝液などに懸濁したもの、菌体を有機溶媒など
で処理したもの、菌体を加温処理したもの、菌体を破砕
して目的とする酵素を分画したもの、菌体、菌体処理物
または酵素を多糖類やポリアクリルアミドなどで固定化
したものをいう。

【００２２】微生物の培養物、菌体または菌体処理物の
使用量は、反応系あたりのRppA酵素量に換算して通常約
0.0001%から約15%（重量）とすればよいが、この範囲に
限定されず本反応が起こりうる量であればよい。

【００２３】本発明で使用する微生物は、上記遺伝子を
発現可能なように適当なベクタープラスミドに挿入して
形質転換させた遺伝子組換え体であってもよい。ここで
「発現可能なように」とは、上記遺伝子プロモーターに
作動可能なように連結されていることを意味する。

【００２４】上記rppA遺伝子は、Streptomyces griseus
から、Ueda, K. et al., J. Antibiot., 48(7), 638-64
6 (1995)に記載の方法によって得ることが可能である。
また、該rppA遺伝子の相補的配列とハイブリダイズし、
かつマロニルCoAから1,3,6,8-テトラヒドロキシナフタ
レンへの変換活性をもつ酵素をコードする遺伝子は、rp
pA遺伝子の塩基配列の一部をたとえば部位特異的突然変
異誘発法等の慣用技術を用いて置換、欠失、付加等の改
変を行うことによって作製可能である。

【００２５】あるいは、rppA遺伝子の塩基配列に基づい
て作製したプライマーまたは縮重プローブを用いるポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはサザンもしくはノー
ザンハイブリダイゼーションを利用して、放線菌を含む
細菌、菌類などの微生物から目的遺伝子を得ることもで
きる。取得された遺伝子は、必要に応じて、ＰＣＲまた
はクローニング技術を用いて増幅しうる。次いで、増幅
された遺伝子は適切な発現ベクターに組み込んで組換え
ベクターを作製し、さらに該ベクターによって適切な宿
主細胞を形質転換し、適切な培地中に培養して、目的の
微生物を得ることができる。遺伝子クローニング、形質
転換などの技術については、たとえばSambrook, J. et
al., Molecular Cloning A Laboratory Mannual Second
Edition(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s, NYに記載されており、これらの手法を適宜選択して
利用できる。

【００２６】遺伝子組換え体の例としては、本発明者ら
によって作製されたE. coli BL21/pET-RppAを挙げるこ
とができ、この菌株は、平成11年5月27日付けで寄託番
号FERMP-17402にて通産省工業技術院生命工学工業技術
研究所（茨城県つくば市東１丁目１−３）に寄託されて
いる。また、エシェリヒア属細菌に加えて、上記遺伝子
をサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、トリ
コスポロン属、ピチア属などに属する酵母；バチラス
属、セラチア属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテ
リウム属、シュードモナス属などに属する細菌などの宿
主ベクター系で発現させることも可能である。その他の
微生物たとえば糸状菌などの菌類も宿主として使用でき
る。

【００２７】発現ベクターは宿主細胞内で自律複製可能
または相同組み換え可能であるとともに、プロモーター
に加えてリボゾーム結合配列、転写終結配列、複製開始
点なども適宜含みうる。発現ベクターの例は、細菌の場
合、pBtrp2, pBTac1, pBTac2（ベーリンガーマンハイム
社）、pQE（キアゲン社）、pET（ノバジェン社）、pBlu
escript（ストラタジーン社）など、酵母の場合、pXT1,
pSG5, pSVK3, pBPV,pMSG, pSVL SV40（ストラタジーン
社）である。

【００２８】宿主細胞への遺伝子の導入は、たとえばカ
ルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレ
クトロポレーション法などの一般的な方法で実施でき
る。本発明で使用される酵素は、宿主細胞内での遺伝子
発現の際に、分泌形態または非分泌形態で産生されう
る。特に分泌形態で発現される場合には、該酵素はその
Ｎ末端にシグナルペプチド配列を有する形態で翻訳され
ねばならず、したがって、該酵素をコードする遺伝子の
すぐ5'-端に該シグナルペプチドをコードするＤＮＡを
連結したものを発現ベクターに組み込む必要がある。

【００２９】rppA遺伝子の相補的配列とハイブリダイズ
し、かつマロニルCoAから1,3,6,8-テトラヒドロキシナ
フタレンへの変換活性をもつ酵素をコードする遺伝子を
含有する微生物細胞の他の生成例としては、rppA遺伝子
を含有するストレプトマイセス(Streptomyces) 属細
菌、たとえばStreptomyces griseusを紫外線や化学変異
剤で処理してrppA遺伝子を突然変異させたものも含まれ
る。あるいは、従来の微生物スクリーニング法により天
然界から採取されたものであってもよい。

【００３０】前記一般式 (I)または（II）で表されるピ
ラン−２−オン類を製造するための微生物の調製用培地
としては、菌の生育する培地であれば特に制限はなく、
例えば、グルコース、シュークロースなどの糖類を炭素
源として、アンモニウム塩や硝酸塩などの無機窒素源、
あるいは酵母エキス、マルツエキスなどの有機窒素源、
さらに各種無機塩やビタミン類などを含有した培養液で
好気的、または嫌気的に１日から１ヶ月程度培養を行え
ばよい。また、rppA遺伝子を導入した遺伝子組換え体の
場合にも、これらの遺伝子組換え体が生育可能な培地を
用いて培養を行えばよく、効率よくrppA遺伝子を発現さ
せるために使用した発現プラスミドの誘導剤などを添加
することも有効であり、大腸菌の発現プラスミドpUC19
に対しては例えば、isopropyl-β-galactopyranoside(I
PTG)などを用いると高い活性が得られることがあり好ま
しい。

【００３１】反応または生産温度は、微生物の種類によ
って一般に異なるため特に限定されないが、0〜60℃、
好ましくは10〜50℃が望ましい。また、ｐＨは通常約5
〜約9であるが、この範囲に限定されない。

【００３２】反応後、メタノール、エタノールなどによ
る沈殿法、酢酸エチルなどの有機溶媒を用いた抽出法な
どの公知の方法により、反応液または培養液から目的と
するピラン−２−オン類を容易に回収することができ
る。

【００３３】

【実施例】次に、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されないものでは
ない。 〔実施例１〕 （RppA酵素の製造) (1) rppA遺伝子発現ベクターの構築 rppA遺伝子を含むプラスミドpIJ486-RB44 [Ueda, K. et
al., J. Antibiot.,48(7), 638-646 (1995)] 10μl
に、制限酵素 HindIII用10倍濃度制限酵素反応用緩衝液
5μl、滅菌水33μl、制限酵素HindIII 2μlを加え、37
℃にて2時間反応させた後、制限酵素BamHI反応用10倍濃
度制限酵素反応用緩衝液5μlを添加し、BamHI 2μlを添
加して37℃にてさらに2時間反応させた。その後、アガ
ロース電気泳動を行い、1.5KbのDNA断片をゲルから切り
出しGENECLEAN III（BIO 101社）を用いて回収した。こ
のDNA断片を同様にしてHindIIIおよびBamHIで切断した
大腸菌ベクタープラスミドpUC19とライゲーションキッ
ト（宝酒造株式会社）を用いてライゲーションし、rppA
遺伝子を含むプラスミドpUC19-RB44を得た。

【００３４】rppAの開始コドンを含む領域（CCCATG）を
（CATATG）に変化させて制限酵素NdeI認識部位及びBamH
I 認識部位を導入するために、プライマー#1：5'-GCCAA
GCTTCATATGGCGACCCTGTGCCGACC-3'（配列番号３）とプラ
イマー#2：5'-GGAGCCGTTGCGCTCCAGGC-3'（配列番号４）
をプライマーとし、プラスミドpUC19-RB44を鋳型として
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行った。まず、プラス
ミドpUC19-RB44 1μl、10倍濃度の反応緩衝液10μl、1
0mM dNTP8μl、プライマー#1、#2各々1μl（100pmol濃
度に相当）、Expand HIGH Fidelity PCR System（BOEHR
INGER MANNHEIM社）1μlを加えて100μlとした。この溶
液について、98℃、20秒間（変性ステップ）、55℃、１
分間（アニーリングステップ）、72℃、１分間（伸長ス
テップ）のインキュベーションを20サイクル行った。反
応終了後、エタノール沈殿により増幅されたDNAを回収
し、20μlの滅菌水に溶解した。回収した増幅DNA5μlと
制限酵素HindIII用10倍濃度制限酵素反応用緩衝液5μ
l、滅菌水38μl、制限酵素HindIII 2μlを混合し、37℃
にて2時間反応させた後、制限酵素SphI用10倍濃度制限
酵素反応用緩衝液5μlを添加し、SphI 2μlを添加して3
7℃にてさらに2時間反応させた。同様にしてpUC19-RB44
を制限酵素HindIIIおよびSphIで切断してrppAのHindIII
-SphI部位を除去したものとライゲーションして、rppA
の開始コドンを含む領域（CCCATG）を（CATATG）に変化
させて制限酵素NdeI認識部位を導入した。このようにし
て作製した新たに制限酵素NdeI認識部位を導入したプラ
スミドをNdeIおよびBamHIにて切断し、アガロース電気
泳動を行い、1.5KbのDNA断片をゲルから切り出しGENECL
EAN IIIを用いて回収した。この断片を、同様にして制
限酵素NdeIおよびBamHIで切断したpET-16b（Novagen, M
adison, WI）に導入してpET-RppAを作製した。

【００３５】(2) 形質転換およびRppA酵素タンパクの産
生 上記発現プラスミドpET-RppAは、HisタグのついたMet-G
ly-(His)₁₀-(Ser)₂-Gly-His-Ile-Glu-Gly-Arg-His-RppA
A(配列番号５)という42.7kDaのポリペプチドを合成す
る。RppA発現プラスミドpET-RppAで形質転換した大腸菌
E. coli BL21/pET-RppAを100mg/Lのアンピシリンを含有
するLB培地にて26℃で16時間培養した。このようにして
得た培養液から遠心分離により菌体を分離し、0.85% Na
Clを含む10mM Tris.HCl(pH 7.5) 緩衝液にて洗浄し、20
mlの10mM Tris.HCl(pH 7.5) 緩衝液にて懸濁した。得ら
れた洗浄菌体を超音波処理により破砕し、無細胞抽出液
を作製した。得られた無細胞抽出液を10,000×gで20分
間遠心分離した上清を0.45μmのフィルターで濾過した
後、His-bind resin（Novagen）カラムにアプライし、6
0-600mMの直線的勾配によりHisタグのついたRppA酵素タ
ンパクを溶出した。

【００３６】〔実施例２〕（６−メチル−４−ヒドロキ
シ−２Ｈ−ピラン−２−オンの製造例） 0.3mM アセトアセチルCoA、0.3mM マロニルCoA、100mM
リン酸緩衝液(pH7.0)、実施例１で得られた RppA 150μ
g を含む全量300μl の反応液を調製し、これを30℃に
て１時間反応させた。6N HClを60μl添加することによ
り反応を停止させた。反応液を酢酸エチルで抽出し、Ｎ
₂ 気流下で酢酸エチルを留去させてメタノールに溶解さ
せた。このメタノール溶解物をLCAPCIMSマススペクトル
により分析した。ODS-80Ts（Tosoh社製）のカラムを用
いて2%の酢酸を含む5%から40%アセトニトリルによる直
線勾配（30分、0.8ml/min）、続いて、40〜100%同溶液
による直線勾配による分析により、９分のリテンション
タイムでピークが出現した。LC/MSによる分析の結果、
分子量が１２６であることを確認し、また各フラグメン
トイオン種も標品と同じパターンを示したことから反応
生成物が６−メチル−４−ヒドロキシ−２Ｈ−ピラン−
２−オンと同定した。

【００３７】〔実施例３〕（６−プロピル−４−ヒドロ
キシ−２Ｈ−ピラン−２−オンの製造例） 0.3mM ブチリルCoA、0.3mM マロニルCoA、100mM リン酸
緩衝液(pH7.0) 、実施例１で得られた RppA 150μg を
含む全量300μl の反応液を調製し、これを30℃にて１
時間反応させた。6N HClを60μl添加することにより反
応を停止させた。反応液を酢酸エチルで抽出し、Ｎ₂ 気
流下で酢酸エチルを留去させてメタノールに溶解させ
た。このメタノール溶解物をLCAPCIMSマススペクトルに
より分析した。ODS-80Ts（Tosoh社製）のカラムを用い
て2%の酢酸を含む5%から40%アセトニトリルによる直線
勾配（30分、0.8ml/min）、続いて、40〜100%同溶液に
よる直線勾配による分析により、19分のリテンションタ
イムでピークが出現した。LC/MSによる分析の結果、分
子量が１５４であることを確認し、反応生成物が６−プ
ロピル−４−ヒドロキシ−２Ｈ−ピラン−２−オンと同
定した。

【００３８】〔実施例４〕（６−ペンチル−４−ヒドロ
キシ−２Ｈ−ピラン−２−オンの製造例) 0.3mM ヘキシルCoA、0.3mM マロニルCoA、100mM リン酸
緩衝液(pH7.0) 、実施例１で得られた RppA 150μg を
含む全量300μl の反応液を調製し、これを30℃にて１
時間反応させた。6N HClを60μl添加することにより反
応を停止させた。反応液を酢酸エチルで抽出し、Ｎ₂ 気
流下で酢酸エチルを留去させてメタノールに溶解させ
た。このメタノール溶解物をLCAPCIMSマススペクトルに
より分析した。ODS-80Ts（Tosoh社製）のカラムを用い
て2%の酢酸を含む5%から40%アセトニトリルによる直線
勾配（30分、0.8ml/min）、続いて、40〜100%同溶液に
よる直線勾配による分析により、31分のリテンションタ
イムでピークが出現した。LC/MSによる分析の結果、分
子量が１８２であることを確認し、反応生成物が６−ペ
ンチル−４−ヒドロキシ−２Ｈ−ピラン−２−オンと同
定した。

【００３９】〔実施例５〕（３，６−ジメチル−４−ヒ
ドロキシ−２Ｈ−ピラン−２−オンの製造例) 0.3mM アセトアセチルCoA、0.3mM メチルマロニルCoA、
100mM リン酸緩衝液(pH7.0) 、実施例１で得られた Rpp
A 150μg を含む全量300μl の反応液を調製し、これを
30℃にて１時間反応させた。6N HClを60μl添加するこ
とにより反応を停止させた。反応液を酢酸エチルで抽出
し、Ｎ₂ 気流下で酢酸エチルを留去させてメタノールに
溶解させた。このメタノール溶解物をLCAPCIMSマススペ
クトルにより分析した。ODS-80Ts（Tosoh社製）のカラ
ムを用いて2%の酢酸を含む5%から40%アセトニトリルに
よる直線勾配（30分、0.8ml/min）、続いて、40〜100%
同溶液による直線勾配による分析により、11分のリテン
ションタイムでピークが出現した。LC/MSによる分析の
結果、分子量が１４０であることを確認し、反応生成物
が３，６−ジメチル−４−ヒドロキシ−２Ｈ−ピラン−
２−オンと同定した。

【００４０】〔実施例６〕（３，５−ジメチル−６−エ
チル−４−ヒドロキシ−Ｈ−ピラン−２，４−ジオンの
製造例) 0.3mM メチルマロニルCoA、100mM リン酸緩衝液(pH7.0)
、実施例１で得られた RppA 150μg を含む全量300μl
の反応液を調製し、これを30℃にて１時間反応させ
た。6N HClを60μl添加することにより反応を停止させ
た。反応液を酢酸エチルで抽出し、Ｎ₂ 気流下で酢酸エ
チルを留去させてメタノールに溶解させた。このメタノ
ール溶解物をLCAPCIMSマススペクトルにより分析した。
ODS-80Ts（Tosoh社製）のカラムを用いて2%の酢酸を含
む5%から40%アセトニトリルによる直線勾配（30分、0.8
ml/min）、続いて、40〜100%同溶液による直線勾配によ
る分析により、20分のリテンションタイムでピークが出
現した。LC/MSによる分析の結果、分子量が１６８であ
ることを確認し、反応生成物が３，５−ジメチル−６−
エチル−４−ヒドロキシ−Ｈ−ピラン−２，４−ジオン
と同定した。

【００４１】

【発明の効果】本発明によれば、医薬品、農薬などの合
成中間体として、また、感熱転写紙の添加剤として重要
なピラン−２−オン類を安価に製造することが可能であ
る。

【００４２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Rayon Co., Ltd. <120> Process for preparing pyran-2-ons <130> P00-0093 <140> <141> <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2795 <212> DNA <213> Streptomyces griseus <220> <221> CDS <222> (1596)(2714) <300> <301> Ueda,K., Kim,K.M., Beppu,T. and Horinouchi,S. <302> Overexpression of a gene cluster encoding a chalcone synthase-like protein confers redbrown pigment production in Streptomyces griseus <303> J. Antibiotics <304> 48 <305> 7 <306> 638-646 <307> 1995 <400> 1 tggccagcgg cgggctccac gctccggcac cccggccgag gtgctgacgg aggagaccgt 60 ccgggccgtg ttcgacctcg acagccgcat catcgaggac cccgtgtcgg gtcggcccct 120 gatgctcccg atcggccgcc accacgtcct ggaccgggcc gacccgctga ccgtcgggga 180 gccgaccgcg tgaacgccgg ggcgtacgcc ccctgatcgg ctgactgctg tgcgtcactg 240 acatgtttcg gagagtgacg gggcacacag ggtaggtcgg acgccgggcc ccggtccggc 300 agacgccctt ttcctcgaag cggtcattgg gagaacctcg gtggagaaca cctcggtgca 360 gaacaaggaa accgtccgga actgtccttt cgactacgcg cacgagctgg agttcgaccc 420 ccagctcagg caattgctca ccgaggagcc ggtgtcccgc atccgtatgg cgtacggaga 480 gggcgaggcc tggctggtca cccgctacga ggacgtccgg acggtcacca ccgaccggcg 540 gttcagccgc agcgccgtcc tcggccggga cttcccccgg atgaccccgg agccgatcgt 600 gcaggcggag tccatcaacc tcatggaccc gcccgccagc agccggctgc ggggcctggt 660 ggccaagagc ttcaccccgc gtcgcgtcga gcagatgcgc ggcgggaccc agcgcgtggt 720 ggaccggctg ctggacgaga tggaggagga gggctcaccg ggcgacttcg tcgcccgggt 780 ctccgcgccg ctgccgctga tcaccatctg cgaggcactc gacatccccg aggcggaccg 840 gccctggctc cgggcccacg ccatgaccat gatgaacgtc ggggccgcgg gcaagcagga 900 cgcggtgcgc gccaaggcgg agctgcgcgg ctacttccag gagctgaccg ccgaccgccg 960 ccgctccccg ggcgaggacc tcatcagcac cctggccacc gcccgggacg gcgacgaact 1020 gctggacgac gacgagctgg ccgtcatggc gatggtcctg ctcatcaccg gccaggacac 1080 cacgacctac cagctcggca acatcgccta caccctgctc acccgcccgg acctgctgcg 1140 gtccctccgg gccgaaccgc agcggctgcc ccgcaccctg gaggagctgc tgcgccacat 1200 ccccttccgc aagggcgtcg gcatcccccg tatcgccctg gaggacgtgg agctctccgg 1260 cgtcctcatc aaggccggcg acgtggtgca cgtgtcctac ctgacggcca accgggactc 1320 cgccaagttc gaccgtcccg acgagctgga ccccgaccgg ccgaccatcc cccacatgac 1380 gttcggctgg ggcgcccacc actgcctggg cgcgccgctg gccaccatgg agctggaagt 1440 ggccttctcc acgctgctga cccgcttccc ggccctgcgt ctggacgtgc cgcccgagga 1500 cgtctcgtgg aacacgacgt ccatctggcg ttacccgctc gccctgcccg tcacatggtg 1560 acgagagcct ccgctccaga gaacgaggag aacccatggc gaccctgtgc cgaccggcca 1620 tcgctgtgcc cgagcacgtc atcacgatgc agcagaccct ggacctggcc cgggagaccc 1680 atgccgggca cccgcagcgc gacctcgtcc tgaggctcat ccagaacacc ggcgtccaga 1740 cccggcacct cgtgcagccc atcgagaaga ccctggcgca ccccggattc gaggtgcgca 1800 accaggtgta cgaggccgag gccaagaccc gggtccccga agtcgtccgg cgggcgctcg 1860 ccaacgccga gaccgagccg tccgagatcg acctgatcgt ctacgtctcc tgcacgggtt 1920 tcatgatgcc ctcgctgacc gcgtggatca tcaacagcat gggcttccgg cccgagaccc 1980 gccaactgcc catcgcccag ctcggctgtg cggcgggcgg cgcggcgatc aaccgcgcgc 2040 acgacttctg cgtggcctac cccgactcca acgtcctcat cgtgtcctgc gagttctgct 2100 cgctgtgcta ccagcccacc gacatcgggg tcggttccct gctctccaac ggactcttcg 2160 gcgacgcgct ctccgcggcc gtcgtacggg gacagggcgg caccggcatg cgcctggagc 2220 gcaacggctc ccacctggtg cccgacaccg aggactggat ctcctacgcg gtccgcgaca 2280 ccgggttcca cttccagctg gacaagcggg tcccgggcac catggagatg ctcgccccgg 2340 tgctcctgga cctggtcgac ctgcacggct ggtccgtccc gaacatggac ttcttcatcg 2400 tccacgcggg cggaccgcgc atcctggacg acctctgcca cttcctcgac ctgccgcccg 2460 agatgttccg ctacagccgg gccaccctca ccgaacgcgg caacatcgcg agctccgtcg 2520 tcttcgacgc gctggcgcgc ctcttcgacg acggcggcgc cgccgagtcc gcgcaggggc 2580 tcatcgccgg cttcggtccc ggcatcaccg ccgaggtggc cgtggggagt tgggccaagg 2640 aaggcctcgg ggcggacgtc ggacgcgacc tcgacgagct ggagctgacc gccggcgttg 2700 cgctgtccgg ctgaaccggc taaggcgacc gacggacggg gacgaaggaa cgggtgttcg 2760 cgcttcgcgg acgcactcgt gccgcgactg gatcc 2795 <210> 2 <211> 372 <212> PRT <213> Streptomyces griseus <300> <301> Ueda,K., Kim,K.M., Beppu,T. and Horinouchi,S. <302> Overexpression of a gene cluster encoding a chalcone synthase-like protein confers redbrown pigment production in Streptomyces griseus <303> J. Antibiotics <304> 48 <305> 7 <306> 638-646 <307> 1995 <400> 2 Met Ala Thr Leu Cys Arg Pro Ala Ile Ala Val Pro Glu His Val Ile 5 10 15 Thr Met Gln Gln Thr Leu Asp Leu Ala Arg Glu Thr His Ala Gly His 20 25 30 Pro Gln Arg Asp Leu Val Leu Arg Leu Ile Gln Asn Thr Gly Val Gln 35 40 45 Thr Arg His Leu Val Gln Pro Ile Glu Lys Thr Leu Ala His Pro Gly 50 55 60 Phe Glu Val Arg Asn Gln Val Tyr Glu Ala Glu Ala Lys Thr Arg Val 65 70 75 80 Pro Glu Val Val Arg Arg Ala Leu Ala Asn Ala Glu Thr Glu Pro Ser 85 90 95 Glu Ile Asp Leu Ile Val Tyr Val Ser Cys Thr Gly Phe Met Met Pro 100 105 110 Ser Leu Thr Ala Trp Ile Ile Asn Ser Met Gly Phe Arg Pro Glu Thr 115 120 125 Arg Gln Leu Pro Ile Ala Gln Leu Gly Cys Ala Ala Gly Gly Ala Ala 130 135 140 Ile Asn Arg Ala His Asp Phe Cys Val Ala Tyr Pro Asp Ser Asn Val 145 150 155 160 Leu Ile Val Ser Cys Glu Phe Cys Ser Leu Cys Tyr Gln Pro Thr Asp 165 170 175 Ile Gly Val Gly Ser Leu Leu Ser Asn Gly Leu Phe Gly Asp Ala Leu 180 185 190 Ser Ala Ala Val Val Arg Gly Gln Gly Gly Thr Gly Met Arg Leu Glu 195 200 205 Arg Asn Gly Ser His Leu Val Pro Asp Thr Glu Asp Trp Ile Ser Tyr 210 215 220 Ala Val Arg Asp Thr Gly Phe His Phe Gln Leu Asp Lys Arg Val Pro 225 230 235 240 Gly Thr Met Glu Met Leu Ala Pro Val Leu Leu Asp Leu Val Asp Leu 245 250 255 His Gly Trp Ser Val Pro Asn Met Asp Phe Phe Ile Val His Ala Gly 260 265 270 Gly Pro Arg Ile Leu Asp Asp Leu Cys His Phe Leu Asp Leu Pro Pro 275 280 285 Glu Met Phe Arg Tyr Ser Arg Ala Thr Leu Thr Glu Arg Gly Asn Ile 290 295 300 Ala Ser Ser Val Val Phe Asp Ala Leu Ala Arg Leu Phe Asp Asp Gly 305 310 315 320 Gly Ala Ala Glu Ser Ala Gln Gly Leu Ile Ala Gly Phe Gly Pro Gly 325 330 335 Ile Thr Ala Glu Val Ala Val Gly Ser Trp Ala Lys Glu Gly Leu Gly 340 345 350 Ala Asp Val Gly Arg Asp Leu Asp Glu Leu Glu Leu Thr Ala Gly Val 355 360 365 Ala Leu Ser Gly 370 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a PCR primer for amplification of rppA gene. <400> 3 gccaagcttc atatggcgac cctgtgccga cc 32 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a PCR primer for amplification of rppA gene. <400> 4 ggagccgttg cgctccaggc 20 <210> 5 <211> 393 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is an amino acid sequence of RppA to which amino acids comprising His tag are attached. <400> 5 Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His 1 5 10 15 Ile Glu Gly Arg His Met Ala Thr Leu Cys Arg Pro Ala Ile Ala Val 20 25 30 Pro Glu His Val Ile Thr Met Gln Gln Thr Leu Asp Leu Ala Arg Glu 35 40 45 Thr His Ala Gly His Pro Gln Arg Asp Leu Val Leu Arg Leu Ile Gln 50 55 60 Asn Thr Gly Val Gln Thr Arg His Leu Val Gln Pro Ile Glu Lys Thr 65 70 75 80 Leu Ala His Pro Gly Phe Glu Val Arg Asn Gln Val Tyr Glu Ala Glu 85 90 95 Ala Lys Thr Arg Val Pro Glu Val Val Arg Arg Ala Leu Ala Asn Ala 100 105 110 Glu Thr Glu Pro Ser Glu Ile Asp Leu Ile Val Tyr Val Ser Cys Thr 115 120 125 Gly Phe Met Met Pro Ser Leu Thr Ala Trp Ile Ile Asn Ser Met Gly 130 135 140 Phe Arg Pro Glu Thr Arg Gln Leu Pro Ile Ala Gln Leu Gly Cys Ala 145 150 155 160 Ala Gly Gly Ala Ala Ile Asn Arg Ala His Asp Phe Cys Val Ala Tyr 165 170 175 Pro Asp Ser Asn Val Leu Ile Val Ser Cys Glu Phe Cys Ser Leu Cys 180 185 190 Tyr Gln Pro Thr Asp Ile Gly Val Gly Ser Leu Leu Ser Asn Gly Leu 195 200 205 Phe Gly Asp Ala Leu Ser Ala Ala Val Val Arg Gly Gln Gly Gly Thr 210 215 220 Gly Met Arg Leu Glu Arg Asn Gly Ser His Leu Val Pro Asp Thr Glu 225 230 235 240 Asp Trp Ile Ser Tyr Ala Val Arg Asp Thr Gly Phe His Phe Gln Leu 245 250 255 Asp Lys Arg Val Pro Gly Thr Met Glu Met Leu Ala Pro Val Leu Leu 260 265 270 Asp Leu Val Asp Leu His Gly Trp Ser Val Pro Asn Met Asp Phe Phe 275 280 285 Ile Val His Ala Gly Gly Pro Arg Ile Leu Asp Asp Leu Cys His Phe 290 295 300 Leu Asp Leu Pro Pro Glu Met Phe Arg Tyr Ser Arg Ala Thr Leu Thr 305 310 315 320 Glu Arg Gly Asn Ile Ala Ser Ser Val Val Phe Asp Ala Leu Ala Arg 325 330 335 Leu Phe Asp Asp Gly Gly Ala Ala Glu Ser Ala Gln Gly Leu Ile Ala 340 345 350 Gly Phe Gly Pro Gly Ile Thr Ala Glu Val Ala Val Gly Ser Trp Ala 355 360 365 Lys Glu Gly Leu Gly Ala Asp Val Gly Arg Asp Leu Asp Glu Leu Glu 370 375 380 Leu Thr Ala Gly Val Ala Leu Ser Gly 385 390

【００４３】

【配列表フリーテキスト】配列番号３：rppA遺伝子の増
幅のためのPCRプライマーを示す。 配列番号４：rppA遺伝子の増幅のためのPCRプライマー
を示す。 配列番号５：Hisタグを含むアミノ酸が結合されたRppA
のアミノ酸配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA07 CA02 CA07 DA06 DA08 EA04 GA11 HA03 4B050 CC01 CC03 DD02 EE01 FF03E FF11E LL05 4B064 AE46 CA02 CA04 CA19 CA21 CC01 CC24 CD05 CE02 CE11 DA01 4B065 AA26X AA50X AA50Y AB01 AC14 AC16 BA02 BB01 BC01 BC03 BD01 BD14 BD15 CA04 CA18 CA43 CA44

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カルボニルCoA 化合物を、ポリケタイド
   合成酵素遺伝子を含有する微生物の培養物、菌体または
   菌体処理物で処理し、一般式 (I)： または一般式（II）： [式(I) 、(II)において、Ｒ₁ 、Ｒ₂ 、Ｒ₃ は、プロト
   ンあるいは炭素数１から8までの飽和あるいは不飽和の
   アルキル基を示す。Ｒ₁ 、Ｒ₂ 、Ｒ₃ は、同一であって
   もよく、異なっていてもよい。] で表されるピラン−２
   −オン類に変換させることを特徴とする、ピラン−２−
   オン類の製造方法。
2. 【請求項２】 カルボニルCoA 化合物が、プロピオニル
   CoA、ブチリルCoA、バレリルCoA、ヘキサノイルCoA、ヘ
   プタノイルCoA、オクタノイルCoA、ノナノイルCoA、ア
   クリロイルCoA、クロトノイルCoA、メタクロイルCoA、
   アセトアセチルCoA、及びメチルマロニルCoAから成る群
   から選ばれる１種または２種以上である、請求項１に記
   載の方法。
3. 【請求項３】 カルボニルCoA 化合物が、マロニルCoA
   と、プロピオニルCoA、ブチリルCoA、バレリルCoA、ヘ
   キサノイルCoA、ヘプタノイルCoA、オクタノイルCoA、
   ノナノイルCoA、アクリロイルCoA、クロトノイルCoA、
   メタクロイルCoA、アセトアセチルCoA、及びメチルマロ
   ニルCoAから成る群から選ばれる１種または２種以上の
   組み合わせである、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 ポリケタイド合成酵素遺伝子が、ストレ
   プトマイセス（Streptomyces）属に属する放線菌由来の
   rppA遺伝子または該酵素遺伝子の相補的基配列とハイブ
   リダイズし、かつマロニルCoAから1,3,6,8-テトラヒド
   ロキシナフタレンへの変換活性を有する酵素をコードす
   る遺伝子である、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 ストレプトマイセス（Streptomyces）属
   に属する放線菌由来のrppA遺伝子によりコードされる酵
   素が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有することを特
   徴とする、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 ストレプトマイセス（Streptomyces）属
   に属する放線菌由来のrppA遺伝子が、配列番号１の1596
   〜2714 の塩基配列を含む、請求項４記載の方法。
7. 【請求項７】 微生物がストレプトマイセス（Streptom
   yces）属に属する放線菌である、請求項１記載の方法。
8. 【請求項８】 微生物が遺伝子組換え体であることを特
   徴とする、請求項１記載の方法。