CN108271374A - 具有改进的活性的新颖p450-bm3变体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有改进的活性的改进的P450‑BM3变体。在一些实施方案中，P450‑BM3变体对宽范围的底物表现出改进的活性。

Description

具有改进的活性的新颖P450-BM3变体
本申请要求2015年7月7日提交的美国临时专利申请系列号62/189,281的优先权，在此通过引用以其整体出于所有目的并入本文。
发明领域
本发明提供了具有改进的活性的改进的P450-BM3变体。在一些实施方案中，P450-BM3变体对宽范围的底物表现出改进的活性。
对序列表、表格或计算机程序的引用
序列表的正式副本作为ASCII格式化文本文件经由EFS-Web与说明书同时被提交，具有文件名“CX2-150USP1_ST25.txt”，创建日期2015年7月7日，且大小为99.6千字节。经由EFS-Web提交的序列表为说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文。
发明背景
细胞色素P450单加氧酶(“P450s”)包含在自然世界中普遍存在的一大组广泛分布的血红素酶。从巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)获得的细胞色素P450-BM3(“P450-BM3”)催化长链脂肪酸、醇类和酰胺的NADPH依赖性羟基化，以及不饱和脂肪酸的环氧化(参见，例如，Narhi和Fulco,J.Biol.Chem.,261:7160-7169[1986]；和Capdevila等,J.Biol.Chem.,271:2263-22671[1996])。P450-BM3的独特之处在于该酶的还原酶(65kDa)和单加氧酶(55kDa)结构域是融合的并作为足以自催化的120kDa酶产生。尽管这些酶已经成为许多研究的主题，但本领域对表现出对宽范围的底物的高酶促活性水平的改进的P450仍然存在需求。
发明概述
本发明提供了具有改进的活性的改进的P450-BM3变体。在一些实施方案中，P450-BM3变体对宽范围的底物表现出改进的活性。一种重组细胞色素P450-BM3变体，所述重组细胞色素P450-BM3变体与包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16中列出的序列的多肽序列具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，本发明的重组细胞色素P450-BM3变体氧化至少三种有机底物。在一些另外的实施方案中，重组细胞色素P450-BM3变体氧化选自以下的至少一种有机底物：氯雷他定(loratadine)、伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)和双氯芬酸(diclofenac)。
本发明还提供了分离的重组多核苷酸序列，所述分离的重组多核苷酸序列编码本文提供的重组细胞色素P450-BM3多肽变体。在一些实施方案中，分离的重组多核苷酸序列包括SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、或15。
本发明还提供了表达载体，所述表达载体包含至少一种本文提供的多核苷酸序列。在一些另外的实施方案中，载体包含至少一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与适合在合适的宿主细胞中表达多核苷酸序列的至少一个调节序列可操作地连接。在一些实施方案中，宿主细胞为原核细胞或真核细胞。在一些另外的实施方案中，宿主细胞为原核细胞。在一些另外的实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)。本发明还提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含本文提供的载体。
本发明还提供了用于产生至少一种重组细胞色素P450-BM3变体的方法，所述方法包括将本文提供的宿主细胞在使得该宿主细胞产生本文提供的至少一种重组细胞色素P450-BM3变体的条件下培养。在一些另外的实施方案中，该方法还包括回收至少一种重组细胞色素P450变体的步骤。
附图简述
图1提供了本文描述的筛选方法中使用的底物的结构。双氯芬酸用于HTP筛选以检测/排序有益的多样性。剩余底物用于验证进化的BM3变体对未用于HTP筛选的底物为有活性的。
图2提供了对于MCYP-1.2-A12谱系获得的结果的图解总结。
图3提供了对于MCYP-1.2.-A05谱系获得的结果的图解总结。
发明描述
本发明提供了具有改进的活性的改进的P450-BM3变体。在一些实施方案中，P450-BM3变体对宽范围的底物表现出改进的活性。P450-BM3酶由于融合的还原酶与血红素结构域之间有效的电子传递在P450单加氧酶中表现出最高的催化速率(参见，例如，Noble等，Biochem.J.,339:371-379[1999]；和Munro等，Eur.J.Biochem.,239:403-409[2009])。因此，P450-BM3为用于操作生物技术过程的非常期望的酶(参见，例如，Sawayama等，Chem.,15:11723-11729[2009]；Otey等，Biotechnol.Bioeng.,93:494-499[2006]；Damsten等，Biol.Interact.,171:96-107[2008]；以及Di Nardo和Gilardi,Int.J.Mol.Sci.,13:15901-15924)。然而，本领域对表现出对宽范围的底物的活性的P450酶仍然存在需求。本发明提供了与亲本P450-BM3序列(即，SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、和/或16)相比对宽范围的底物具有改进的酶促活性的P450-BM3变体。
在一些实施方案中，本发明提供了为多种有机底物(参见例如，图1)的氧化提供改进的总转化百分比/周转数的P450-BM3变体。特别地，在本发明的开发期间，基于HTP筛选结果鉴定和重组有益的多样性。
缩写和定义：
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。通常，本文使用的命名和下文描述的细胞培养、分子遗传学、微生物学、有机化学、分析化学和核酸化学的实验室程序是本领域熟知且常用的那些。此类技术是熟知的并被描述于本领域技术人员熟知的许多教科书和参考著作中。对于化学合成和化学分析使用了标准技术或其修改形式。本文(上文和下文两者)提及的所有专利、专利申请、文章和出版物，在此通过引用明确并入本文。
尽管本发明的实践中可使用类似或等同于本文描述那些的任何合适的方法和材料，本文描述了一些方法和材料。应当理解本发明不限于所描述的特定方法论、方案和试剂，因为取决于本领域技术人员使用其的情况，这些可以改变。因此，下文即将定义的术语通过参考本申请作为整体被更充分地描述。本文(上文和下文两者)提及的所有专利、专利申请、文章和出版物，在此通过引用明确并入本文。
此外，除非上下文另外清楚地指示，如本文使用的单数“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指示物。
数值范围包括限定该范围的数字。因此，本文公开的每个数值范围意图包括落在此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同此类较窄数值范围在本文被全部清楚地写出。还意图本文公开的每个最大的(或最小的)数值限制包含每个较低(或较高)的数值限制，如同在本文中此类较低(或较高)数值限制被清楚地写出。
术语“约”意指特定值的可接受误差。在一些情况下，“约”意指在给定值范围的0.05％、0.5％、1.0％或2.0％内。在一些情况下，“约”意指在给定值的1、2、3或4个标准差内。
此外，本文所提供的标题不是可以通过参考本申请作为整体而被具有的本发明的各个方面或实施方案的限制。因此，下文即将定义的术语通过参考本申请作为整体而被更充分地描述。尽管如此，为了便于理解本发明，许多术语定义如下。
除非另外指示，分别地，核酸以5'至3'方向从左到右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左至右书写。
如本文使用的，术语“包含(comprising)”及其同根词以其包含性含义被使用(即，等同于术语“包括(including)”及其相应的同根词)。
“EC”数字指Nomenclature Committee of the International Union ofBiochemistry and Molecular Biology(生物化学和分子生物学国际联合命名委员会)(NC-IUBMB)的酶命名法。该IUBMB生化分类是基于酶催化的化学反应的酶数字分类系统。
“ATCC”指American Type Culture Collection(美国典型培养物保藏中心)，其生物保藏收集包括基因和菌株。
“NCBI”指National Center for Biological Information(美国国家生物技术信息中心)和在其中提供的序列数据库。
如本文使用的，“细胞色素P450-BM3”和“P450-BM3”指从巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)获得的催化长链脂肪酸、醇类和酰胺的NADPH依赖性羟基化，以及不饱和脂肪酸的环氧化的细胞色素P450酶。
“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文可互换使用，以表示不管长度或翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)通过酰胺键共价连接的至少两个氨基酸的聚合物。
“氨基酸”通过其通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号在本文被提及。同样地，核苷酸可以通过其通常可接受的单字母代码被提及。
当提及细胞、多核苷酸或多肽使用时，术语“工程化”、“重组”、“非天然存在的”和“变体”指如下材料或与该材料的天然或自然形式对应的材料：已经以自然界中本来不存在的方式被修饰或与其相同但由合成材料和/或通过使用重组技术操作产生/获得。
如本文使用的，“野生型”和“天然存在的”指在自然界中发现的形式。例如野生型多肽或多核苷酸序列为生物体中存在的序列，其可从天然来源分离且未通过人为操作被有意识地修饰。
“编码序列”指编码蛋白的氨基酸序列的核酸的部分(例如，基因)。
在本文中使用术语“序列同一性百分比(％)”以指多核苷酸和多肽之间的比较，并通过跨比较窗比较两条最佳比对的序列来确定，其中多核苷酸或多肽序列在比较窗中的部分与参考序列相比可以包括添加或缺失(即，空位)，以用于两个序列的最佳比对。百分比可以如下计算：通过确定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目，以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。可选地，百分比可以如下计算：通过确定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基或者核酸碱基或氨基酸残基与空位对齐的位置的数目，以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。本领域技术人员理解，存在许多可用于比对两个序列的已建立的算法。用于比较的最佳序列比对可以如下进行，例如，如本领域已知的，通过Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482[1981])、通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法(Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443[1970)、通过Pearson和Lipman的相似度检索方法(Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444[1988])、通过这些算法的计算机实现(例如，在GCG Wisconsin软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过目测。适合确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的实例包括，但不限于，BLAST和BLAST 2.0算法，其由Altschul等描述(分别参见，Altschul等，J.Mol.Biol.,215:403-410[1990]；以及Altschul等，1977,Nucl.Acids Res.,3389-3402[1977])。用于进行BLAST分析的软件为通过美国国家生物技术信息中心网站公共可得的。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，当所述短字与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足一些正值的阀值评分T。T被称为邻近字评分阈值(参见，Altschul等，同上)。这些最初的邻近字击中(word hit)用作启动检索的种子以找到更长的包含它们的HSP。然后字击中沿着每个序列的两个方向延伸直到累积比对评分不能增加的程度。对于核苷酸序列，累积评分使用参数M(对于匹配残基对的奖励评分；永远＞0)和N(对于错配残基的惩罚评分；永远＜0)计算。对于氨基酸序列，评分矩阵用于计算累积评分。当以下情况时，每一个方向中的字击中的延伸被终止：累积比对评分从其最大达到值下降了量X；由于累积一个或更多个负评分残基比对，累积得分达到0或以下；或到达任一序列末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用以下作为缺省值：字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4、以及两个链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下作为缺省值：字长(W)为3，期望值(E)为10和BLOSUM62评分矩阵(参见，Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915[1989])。序列比对与％序列同一性的示例性确定可以使用GCG Wisconsin软件包(Accelrys、Madison WI)中的BESTFIT或GAP程序，使用提供的缺省参数。
“参考序列”指用作序列比较的基础的指定序列。参考序列可以是更大序列的子集，例如，全长基因或多肽序列的区段。通常，参考序列为至少20个核苷酸或氨基酸残基的长度、至少25个残基的长度、至少50个残基的长度、至少100个残基的长度或核酸或多肽的全长。因为两个多核苷酸或多肽可以各自(1)包括在两个序列之间相似的序列(即，完整序列的一部分)，和(2)可以还包括在两个序列之间趋异的(divergent)序列，所以两个(或更多个)多核苷酸或多肽之间的序列比较通常通过比较两个多核苷酸或多肽在“比较窗”上的序列以鉴定和比较序列局部区域的相似性来进行。在一些实施方案中，“参考序列”可以是基于基本氨基酸序列，其中参考序列是可以在基本序列中具有一个或更多个变化的序列。“比较窗”指至少约20个连续核苷酸位置或氨基酸残基的概念性区段，其中序列可以与至少20个连续核苷酸或氨基酸的参考序列进行比较，并且其中序列在比较窗中的部分与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，可以包括20％或更少的添加或缺失(即，空位)以用于两个序列的最佳比对。比较窗可以比20个连续残基更长，并任选地包括30、40、50、100或更长的窗。
在用于指定的氨基酸或多核苷酸序列的编号的情况下，“对应于”、“参考于”或“相对于”指当指定的氨基酸或多核苷酸序列与参考序列相比较时指定的参考序列残基的编号。换言之，给定的聚合物的残基数目或残基位置关于参考序列被指定，而不是通过给定的氨基酸或多核苷酸序列内残基的实际数字位置被指定。例如，给定的氨基酸序列，诸如工程化P450-BM3的氨基酸序列可以通过引入空位以与参考序列比对而优化两条序列之间的残基匹配。在这些情况中，尽管存在空位，在给定的氨基酸或多核苷酸序列中的残基的编号关于与其比对的参考序列作出。
“氨基酸差异”或“残基差异”指在多肽序列的一个位置处氨基酸残基相对于参考序列中对应位置处的氨基酸残基的差异。本文中氨基酸差异的位置通常被称为“Xn”，其中n指残基差异所基于的参考序列中的对应位置。例如，“与SEQ ID NO:2相比在位置X93处的残基差异”指在对应于SEQ ID NO:2的位置93的多肽位置处的氨基酸残基的差异。因此，如果SEQ ID NO:2的参考多肽在位置93处具有丝氨酸，则“与SEQ ID NO:2相比在位置X93处的残基差异”指在对应于SEQ ID NO:2的位置93的多肽位置处除了丝氨酸以外的任何残基的氨基酸取代。在本文的大多数实例中，在一个位置处的特定氨基酸残基差异指示为“XnY”，其中“Xn”指定如以上描述的对应位置，并且“Y”为在工程化多肽中发现的氨基酸的单字母标识符(即，与参考多肽中的不同的残基)。在一些实例中(例如，在表2-9中)，本公开内容还提供由常规符号“AnB”表示的特定氨基酸差异，其中A为参考序列中的残基的单字母标识符，“n”为在参考序列中的残基位置的数字，并且B为工程化多肽的序列中残基取代的单字母标识符。在一些情况下，本公开内容的多肽相对于参考序列可以包含一个或更多个氨基酸残基，其由相对于参考序列存在残基差异的一列指定位置指示。在一些实施方案中，当多于一个氨基酸可以在多肽的特定残基位置中使用时，可以使用的多种氨基酸残基由“/”分开(例如，X307H/X307P或X307H/P)。本申请包括包含包括保守和非保守的氨基酸取代的任一个/或两者的一个或更多个氨基酸差异的工程化多肽序列。
“保守氨基酸取代”指用具有相似侧链的不同残基来取代残基，并且因此通常包括用相同或相似的氨基酸定义类别中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。例如但不限于，具有脂肪族侧链的氨基酸可以被另一个脂肪族氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)取代；具有羟基侧链的氨基酸被另一个具有羟基侧链的氨基酸(例如，丝氨酸和苏氨酸)取代；具有芳香族侧链的氨基酸被另一个具有芳香族侧链的氨基酸(例如，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸)取代；具有碱性侧链的氨基酸被另一个具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸和精氨酸)取代；具有酸性侧链的氨基酸被另一个具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸或谷氨酸)取代；和/或疏水性氨基酸或亲水性氨基酸分别被另一个疏水性氨基酸或亲水性氨基酸取代。
“非保守取代”指用具有显著不同的侧链特性的氨基酸取代多肽中的氨基酸。非保守取代可以使用定义的组之间而不是之内的氨基酸，并且影响：(a)取代区域中的肽骨架的结构(例如，脯氨酸取代甘氨酸)，(b)电荷或疏水性，或(c)侧链堆积。例如但不限于，示例性非保守取代可以是用碱性或脂肪族氨基酸取代酸性氨基酸；用小氨基酸取代芳香族氨基酸；和用疏水性氨基酸取代亲水性氨基酸。
“缺失”指通过从参考多肽去除一个或更多个氨基酸的多肽修饰。缺失可以包括去除1个或更多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸或者20个或更多个氨基酸、多达组成参考酶的氨基酸总数的10％、或多达氨基酸总数的20％，同时保留酶促活性和/或保留工程化P450-BM3酶的改进的特性。缺失可以涉及多肽的内部和/或端部。在多个实施方案中，缺失可以包括连续的区段或可以是不连续的。
“插入”指通过从参考多肽添加一个或更多个氨基酸的多肽修饰。插入可以在多肽的内部或至羧基或氨基末端。如本文使用的插入包括如本领域已知的融合蛋白。插入可以是氨基酸的连续区段或由天然存在的多肽中的一个或更多个氨基酸分开。
在本文可互换使用的“功能片段”或“生物活性片段”指如下多肽：所述多肽具有氨基末端和/或羧基末端缺失和/或内部缺失，但其中剩余的氨基酸序列与和它相比的序列(例如，本发明的全长工程化P450-BM3)中的对应位置相同，并且保留全长多肽的基本上所有的活性。
“分离的多肽”指如下多肽：所述多肽与其天然伴随的其他污染物例如蛋白、脂质和多核苷酸基本上分开。该术语包括已从它们天然存在的环境或表达系统(例如，宿主细胞或体外合成)中取出或纯化的多肽。重组P450-BM3多肽可以存在于细胞内、存在于细胞培养基中，或以多种形式(诸如裂解物或分离的制品)制备。因此，在一些实施方案中，重组P450-BM3可以是分离的多肽。
“基本上纯的多肽”指如下组合物，在所述组合物中多肽物类为存在的优势物类(即，在摩尔或重量基础上，它比在该组合物中的任何其他单独的大分子物类更丰富)，并且当目标物类构成存在的大分子物类的按摩尔或％重量计至少约50％时，通常为基本上纯化的组合物。然而，在一些实施方案中，包含P450-BM3的组合物包含少于50％纯的(例如，约10％、约20％、约30％、约40％、或约50％)的P450-BM3。通常，基本上纯的P450-BM3组合物构成该组合物中存在的所有大分子物类的按摩尔或重量％计约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约90％或更多、约95％或更多以及约98％或更多。在一些实施方案中，将目标物类纯化至基本的均一性(即，通过常规检测方法不能在组合物中检测出污染物物类)，其中该组合物基本上由单一大分子物类组成。溶剂物类、小分子(<500道尔顿)和元素离子物类不被认为是大分子物类。在一些实施方案中，分离的重组P450-BM3多肽为基本上纯的多肽组合物。
“改进的酶特性”指与参考P450-BM3多肽和/或野生型P450-BM3多肽或另一种工程化P450-BM3多肽相比表现出在任何酶特性中的改进的工程化P450-BM3多肽。改进的特性包括但不限于诸如以下的特性：增加的蛋白表达、增加的热活性(thermoactivity)、增加的热稳定性、增加的pH活性、增加的稳定性、增加的酶活性、增加的底物特异性或亲和力、增加的比活性、增加的对底物或终产物抑制的抗性、增加的化学稳定性、改进的化学选择性、改进的溶剂稳定性、增加的对酸性pH的耐受性、增加的对蛋白水解活性的耐受性(即，降低的对蛋白水解的敏感性)、降低的聚集、增加的溶解度、和改变的温度谱。
“增加的酶促活性”或“增强的酶促活性”指工程化P450-BM3多肽的改进的特性，其可以被表示为与参考P450-BM3酶相比，比活性(例如产生的产物/时间/重量蛋白)的增加或底物向产物的转化百分比(例如在指定的时间段使用指定量的P450-BM3，起始量的底物向产物的转化百分比)的增加。确定酶活性的示例性方法被提供于实施例中。可以影响与酶活性相关的任何特性，包括经典酶特性Km、Vmax或kcat，它们的改变可以导致增加的酶促活性。酶活性的改进可以是从对应野生型酶的酶活性的约1.1倍到相比于天然存在的P450-BM3或P450-BM3多肽所源自的另一种工程化P450-BM3的多达2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、150倍、200倍或更多的酶促活性。
“转化”指底物向对应的产物的酶促转化(或生物转化)。“转化百分比”指在指定条件下在一定时间段内被转化为产物的底物的百分比。因此，P450-BM3多肽的“酶促活性”或“活性”可以表示为在指定的时间段内底物向产物的“转化百分比”。
具有“通用性特性(generalist properties)”的酶(或“通用性酶”)指与亲本序列相比，对宽范围的底物表现出改进的活性的酶。通用性酶对于每种可能的底物不必表现出改进的活性。特别地，本发明提供了具有通用性特性的P450-BM3变体，因为它们相对于亲本基因对宽范围的空间和电子不同的底物表现出相似或改进的活性。另外，本文提供的通用性酶被工程化为跨越宽范围的不同的API样分子被改进以增加代谢物/产物的产生。
“杂交严格度”指在核酸杂交中的杂交条件，诸如洗涤条件。通常，杂交反应在较低严格度的条件下进行，随后是不同的但较高严格度的洗涤。术语“中度严格杂交”指允许靶DNA结合以下互补的核酸的条件，所述互补的核酸与靶DNA具有约60％同一性，优选地约75％同一性，约85％同一性，与靶多核苷酸具有大于约90％同一性。示例性中度严格条件为等同于在42℃于50％甲酰胺、5×Denhart溶液、5×SSPE、0.2％SDS中杂交，随后是在42℃于0.2×SSPE、0.2％SDS中洗涤的条件。“高严格度杂交”通常指与如对指定的多核苷酸序列在溶液条件下确定的热解链温度Tm相差约10℃或更小的条件。在一些实施方案中，高严格度条件指以下的条件：其仅允许在65℃于0.018M NaCl中形成稳定的杂交体的那些核酸序列的杂交(即，如果杂交体在65℃于0.018M NaCl中为不稳定的，它在如本文考虑的高严格度条件下将为不稳定的)。可以提供高度严格度条件，例如通过在等同于在42℃于50％甲酰胺、5×Denhart溶液、5×SSPE、0.2％SDS中杂交，随后是在65℃于0.1×SSPE和0.1％SDS中洗涤的条件。另一个高度严格度条件为在等同于在65℃于包含0.1％(w:v)SDS的5×SSC中杂交并且在65℃于包含0.1％SDS的0.1×SSC中洗涤的条件。其他高严格度杂交条件，以及中度严格条件描述于以上引用的参考文献中。
“密码子优化的”指将编码蛋白的多核苷酸的密码子改变为特定生物体中优先使用的那些密码子，使得所编码的蛋白在感兴趣的生物体中被更有效表达。尽管遗传密码为简并的，即大多数氨基酸由被称为"同义"("synonyms")或"同义"("synonymous")密码子的几个密码子表示，但熟知的是，特定生物体的密码子使用为非随机的和对于特定的密码子三联体有偏好的。就给定的基因、具有共同功能或祖先起源的基因、高度表达的蛋白相对于低拷贝数蛋白和生物体基因组的聚集蛋白编码区域而言，这种密码子使用偏向可能更高。在一些实施方案中，可以对编码P450-BM3酶的多核苷酸进行密码子优化，用于从选择用于表达的宿主生物体的优化产生。
“控制序列”在本文中指包括对本申请的多核苷酸和/或多肽的表达必要或有利的所有组分。每一个控制序列可以是对于编码多肽的核酸序列天然的或外来的。此类控制序列包括，但不限于，前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子序列、信号肽序列、起始序列和转录终止子。在最小程度上，控制序列包括启动子和转录及翻译终止信号。控制序列可以与接头一起被提供，以用于导入促进控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区域的连接的特定限制性位点的目的。
“可操作地连接”在本文被定义为如下配置：在所述配置中控制序列适当放置(即，以功能关系)在相对于感兴趣的多核苷酸的位置处，使得控制序列指导或调节感兴趣的多核苷酸和/或多肽的表达。
“启动子序列”指被宿主细胞识别用于感兴趣的多核苷酸诸如编码序列的表达的核酸序列。启动子序列包含介导感兴趣的多核苷酸的表达的转录控制序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因来获得。
“合适的反应条件”指在酶促转化反应溶液中的那些条件(例如，酶载量、底物载量、温度、pH、缓冲液、助溶剂等的范围)，在上述条件下本申请的P450-BM3多肽能够将底物转化为期望的产物化合物。示例性的“合适的反应条件”被提供于本申请中并且通过实施例来说明。“载量”，诸如在“化合物载量”或“酶载量”中，指在反应起始时成分在反应混合物中的浓度或量。在酶促转化反应过程的情况下，“底物”指由P450-BM3多肽作用的化合物或分子。在酶促转化过程的情况下，“产物”指从P450-BM3多肽对底物的作用产生的化合物或分子。
如本文使用的术语“培养”指微生物细胞群体在任何合适的条件(例如，使用液体、凝胶或固体培养基)下的生长。
重组多肽可以使用本领域已知的任何合适的方法产生。编码感兴趣的野生型多肽的基因可以被克隆到载体诸如质粒中，并且在期望的宿主诸如大肠杆菌等中表达。重组多肽的变体可以通过本领域已知的多种方法产生。事实上，存在本领域技术人员熟知的很多不同的诱变技术。另外，诱变试剂盒还从许多商业分子生物学供应商可得。方法可用于做出在指定的氨基酸(定点)上的特定取代、在基因的局部区域中的特异性(区域特异性)或随机突变、或在整个基因内的随机诱变(例如，饱和诱变)。本领域的技术人员已知生成酶变体的许多合适的方法，包括，但不限于，使用PCR的单链DNA或双链DNA的定点诱变、盒式诱变、基因合成、易错PCR、改组、和化学饱和诱变或本领域已知的任何其他合适方法。用于DNA和蛋白工程化的方法的非限制性实例被提供于以下专利中：美国专利第6,117,679号；美国专利第6,420,175号；美国专利第6,376,246号；美国专利第6,586,182号；美国专利第7,747,391号；美国专利第7,747,393号；美国专利第7,783,428号；和美国专利第8,383,346号。在变体产生之后，可以对它们筛选任何期望的特性(例如，高或增加的活性或低或降低的活性、增加的热活性、增加的热稳定性和/或酸性pH稳定性等)。在一些实施方案中，可使用“重组P450-BM3多肽”(在本文中还被称为“工程化P450-BM3多肽”、“变体P450-BM3酶”和“P450-BM3变体”)。
如本文使用的，“载体”为用于将DNA序列导入到细胞中的DNA构建体。在一些实施方案中，载体为被可操作地连接至能够影响DNA序列中编码的多肽在合适宿主中的表达的合适的控制序列的表达载体。在一些实施方案中，“表达载体”具有可操作地连接至DNA序列(例如，转基因)以驱动在宿主细胞中表达的启动子序列，并且在一些实施方案中，还包含转录终止子序列。
如本文使用的，术语“表达”包括参与多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译和翻译后修饰。在一些实施方案中，该术语还包括多肽从细胞中的分泌。
如本文使用，术语“产生”指蛋白和/或其他化合物从细胞的产生。意图是，该术语包括参与多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译和翻译后修饰。在一些实施方案中，该术语还包括多肽从细胞中的分泌。
如本文使用的，如果氨基酸或核苷酸序列(例如，启动子序列、信号肽、终止子序列等)与它被可操作地连接至其的另一个序列在自然界中未缔合，则这两个序列为异源的。
如本文使用的，术语“宿主细胞”和“宿主菌株”指用于包含本文提供的DNA(例如，编码P450-BM3变体的多核苷酸)的表达载体的合适的宿主。在一些实施方案中，宿主细胞为已用使用如本领域已知的重组DNA技术构建的载体转化或转染的原核细胞或真核细胞。
术语“类似物”意指与参考多肽具有多于70％序列同一性，但少于100％序列同一性(例如，多于75％、78％、80％、83％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性)的多肽。在一些实施方案中，类似物意指这样的多肽，所述多肽包含一个或更多个非天然存在的氨基酸残基以及天然存在的氨基酸，所述一个或更多个非天然存在的氨基酸残基包括但不限于高精氨酸、鸟氨酸和正缬氨酸。在一些实施方案中，类似物还包括一个或更多个D-氨基酸残基和两个或更多个氨基酸残基之间的非肽键。
术语“有效量”意指足以产生期望的结果的量。本领域一般技术人员可以通过使用常规实验确定有效量是多少。
术语“分离的”和“纯化的”用于指从与其天然缔合的至少一种其他组分分开的分子(例如，分离的核酸、多肽等)或其他组分。术语“纯化的”不要求绝对纯度，而是意图作为相对定义。
工程化P450-BM3多肽：
在一些实施方案中，工程化P450-BM3多肽通过将包含编码至少一种工程化P450-BM3多肽的至少一种多核苷酸序列的微生物在有利于产生工程化P450-BM3多肽的条件下培养来产生。在一些实施方案中，从所得的培养基和/或细胞中回收工程化P450-BM3多肽。
本发明提供了具有P450-BM3活性的示例性工程化P450-BM3多肽(即，P450-BM3变体)。实施例提供了显示将特定氨基酸序列特征与工程化P450-BM3多肽的功能活性关联的序列结构信息的表。该结构-功能相关信息以相对于参考工程化多肽的特定氨基酸残基差异来提供，如实施例中指示的。实施例还提供了示例性工程化P450-BM3多肽的实验确定的活性数据。
在一些实施方案中，具有P450-BM3活性的本发明的工程化P450-BM3多肽包含：a)与参考序列SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、和/或16具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；b)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、和/或16相比在一个或更多个氨基酸位置处的氨基酸残基差异；并且c)所述工程化P450-BM3多肽与参考序列相比表现出选自以下的改进的特性：i)增强的催化活性、ii)降低的蛋白水解敏感性、iii)增加的对酸性pH的耐受性、iv)减少的聚集、v)对一系列底物增加的活性(即，具有宽底物范围的酶)、或i)、ii)、iii)、或iv)的任何组合。
在一些实施方案中，表现出改进的特性的工程化P450-BM3多肽具有与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和/或16的至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或在约100％的氨基酸序列同一性，和与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和/或16相比在一个或更多个氨基酸位置(诸如与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和/或16或者与SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、14和/或16具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性的序列相比在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、14个、15个、20个或更多个氨基酸位置)处的氨基酸残基差异。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和/或16相比在一个或更多个位置处的残基差异将包括至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，工程化P450-BM3多肽为表2-9的任一个中列出的多肽。
在一些实施方案中，表现出改进的特性的工程化P450-BM3与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和/或16具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％氨基酸序列同一性。
在一些实施方案中，工程化P450-BM3多肽包含由本发明涵盖的工程化P450-BM3多肽的功能片段。功能片段具有其所源自的工程化P450-BM3多肽(即，亲本工程化P450-BM3)的至少95％、96％、97％、98％或99％的活性。功能片段包含至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％及甚至99％的工程化P450-BM3的亲本序列。在一些实施方案中，功能片段被截短了少于5个、少于10个、少于15个、少于10个、少于25个、少于30个、少于35个、少于40个、少于45个和少于50个氨基酸。
具有改进的活性的变体：
在一些实施方案中，具有P450-BM3活性的本发明的工程化P450-BM3多肽包含：a)与参考序列SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、和/或16或者其片段具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；b)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、和/或16相比在一个或更多个氨基酸位置处的氨基酸残基差异；并且c)所述工程化P450-BM3多肽与SEQ ID NO:2相比表现出改进的特性。
在一些实施方案中，表现出改进的活性的工程化P450-BM3多肽具有与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和/或16的至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性，和与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和/或16相比在一个或更多个氨基酸位置(诸如与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和/或16或者与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和/或16具有至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大的氨基酸序列同一性的序列相比在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、14个、15个、20个或更多个氨基酸位置)处的氨基酸残基差异。
在一些实施方案中，当所有其他测定条件基本上相同时，工程化P450-BM3多肽与参考P450-BM3多肽相比具有改进的活性。在一些实施方案中，该活性可以在使用任何合适的测定系统监测酶促活性以评价最大的酶活性(例如，kcat)的条件下进行测量。在其他实施方案中，该活性可以在产生最大活性的二分之一、五分之一、十分之一或更少活性的底物浓度下进行测量。根据任一种分析方法，工程化多肽具有为参考P450-BM3的酶促活性的约1.0倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、或更多的改进的活性水平。在一些实施方案中，当通过任何标准测定(包括但不限于实施例中描述的测定)测量时，工程化P450-BM3多肽与参考P450-BM3相比具有改进的活性。
鉴于本文提供的指导，还考虑了示例性工程化多肽中的任一个可以被用作用于合成其他工程化P450-BM3多肽的起始氨基酸序列，例如通过随后轮的进化，所述进化通过添加来自其他多肽的多种氨基酸差异和本文描述的其他残基位置的新的组合。另外的改进可以通过在贯穿较早轮的进化维持未改变的残基位置处包含氨基酸差异来生成。
编码工程化多肽的多核苷酸、表达载体和宿主细胞：
本发明提供了编码本文描述的工程化P450-BM3多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸被可操作地连接至控制基因表达的一个或更多个异源调节序列，以创建能够表达多肽的重组多核苷酸。包含编码工程化P450-BM3多肽的异源多核苷酸的表达构建体可以被引入适当的宿主细胞以表达对应的P450-BM3多肽。
如对本领域技术人员将是明显的，蛋白序列的可得性和对应于多种氨基酸的密码子的知识提供能够编码主题多肽的所有多核苷酸的说明。遗传密码子的简并性，其中相同氨基酸由可选的或同义的密码子编码，允许制备极大数目的核酸，所有这些核酸编码工程化P450-BM3多肽。因此，知道了特定的氨基酸序列后，本领域技术人员可以通过以不改变蛋白的氨基酸序列的方式简单改变一个或更多个密码子的序列来制备任何数目的不同核酸。在这方面，本发明具体地考虑了可以通过基于可能的密码子选择来选择组合来制备编码本文描述的多肽的多核苷酸的每一种可能的改变，并且对于本文描述的任何多肽，所有此类改变，包括表2-9中提供的变体以及SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、和/或16，被认为具体地公开。
在多种实施方案中，密码子被优选地选择为适应在其中产生蛋白的宿主细胞。例如，细菌中使用的优选的密码子被用于在细菌中的表达。因此，编码工程化P450-BM3多肽的密码子优化的多核苷酸在全长编码区的约40％、50％、60％、70％、80％或大于90％的密码子位置处包含优选的密码子。
在一些实施方案中，如以上描述的，多核苷酸编码具有本文公开的特性的具有P450-BM3活性的工程化多肽，其中所述多肽包含与参考序列(例如，SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、和/或16)具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列，或如在表2-9的任一个中公开的任何变体的氨基酸序列，和与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、和/或16的参考多肽或如表2-9的任一个中公开的氨基酸序列相比的一个或更多个残基差异(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸残基位置)。在一些实施方案中，参考序列选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和/或16。
在一些实施方案中，多核苷酸能够与选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、和/或15的参考多核苷酸序列或其互补序列或者编码本文提供的变体P450-BM3多肽的多核苷酸序列在高度严格条件下杂交。在一些实施方案中，能够在高度严格条件下杂交的多核苷酸编码P450-BM3多肽，所述P450-BM3多肽包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、和/或16相比具有一个或更多个参见差异的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码本文提供的工程化P450-BM3多肽中的任何一个的分离的多核苷酸以多种方式被操作，以提供所述多肽的表达。在一些实施方案中，编码多肽的多核苷酸作为表达载体来提供，其中存在一个或更多个控制序列来调节多核苷酸和/或多肽的表达。取决于表达载体，在分离的多核苷酸插入载体之前对分离的多核苷酸的操作可以是期望的或必要的。利用重组DNA方法改变多核苷酸和核酸序列的技术在本领域中是熟知的。
在一些实施方案中，控制序列包括，除了其他序列以外，启动子、前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列和转录终止子。如本领域已知的，合适的启动子可以基于使用的宿主细胞来选择。对于细菌宿主细胞，用于指导本申请的核酸构建体的转录的合适启动子包括，但不限于从以下获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因及原核β-内酰胺酶基因(参见，例如，Villa-Kamaroff等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 75:3727-3731[1978])，以及tac启动子(参见，例如，DeBoer等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 80:21-25[1983])。用于丝状真菌宿主细胞的示例性启动子包括从以下的基因获得的启动子：米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定型α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶和尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(参见，例如WO 96/00787)，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的启动子的杂合体)，和其突变启动子、截短启动子和杂合启动子。示例性酵母细胞启动子可以来自以下的基因：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的启动子是本领域已知的(参见例如，Romanos等，Yeast 8:423-488[1992])。
在一些实施方案中，控制序列为合适的转录终止子序列，转录终止子序列是由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列被可操作地连接至编码多肽的核酸序列的3'末端。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。例如，用于丝状真菌宿主细胞的示例性转录终止子可以从以下的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。用于酵母宿主细胞的示例性终止子可以从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子是本领域已知的(参见例如，Romanos等，同上)。
在一些实施方案中，控制序列为合适的前导序列，前导序列是一种对由宿主细胞的翻译重要的mRNA的非翻译区域。前导序列被可操作地连接至编码多肽的核酸序列的5'末端。可以使用在所选择的宿主细胞中有功能的任何前导序列。用于丝状真菌宿主细胞的示例性前导序列从以下的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶。用于酵母宿主细胞的适合的前导序列包括，但不限于，从以下的基因获得的那些：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶，酿酒酵母α-因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列也可以是多腺苷酸化序列，多腺苷酸化序列是一种可操作地连接至核酸序列的3'末端的序列，并且其在转录时，被宿主细胞识别为将多腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。在所选择的宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列可用于本发明中。用于丝状真菌宿主细胞的示例性多腺苷酸化序列包括，但不限于来自以下的基因的那些：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α葡糖苷酶。用于酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列也是本领域已知的(参见例如，Guo和Sherman,Mol.Cell.Bio.,15:5983-5990[1995])。
在一些实施方案中，控制序列为信号肽编码区域，其编码连接至多肽的氨基末端的氨基酸序列并将编码的多肽引导到细胞的分泌途径中。核酸序列的编码序列的5'末端可以固有地包含信号肽编码区域，其符合翻译阅读框地(in translation reading frame)与编码分泌多肽的编码区域的区段天然地连接。可选地，编码序列的5'末端可以包含对编码序列而言外来的信号肽编码区域。将表达的多肽引导到选择的宿主细胞的分泌途径中的任何信号肽编码区域可用于本文提供的工程化P450-BM3多肽的表达。用于细菌宿主细胞的有效的信号肽编码区域包括但不限于从以下的基因获得的信号肽编码区域：芽孢杆菌(Bacillus)NClB 11837生麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽是本领域已知的(参见例如，Simonen和Palva，Microbiol.Rev.,57:109-137[1993])。对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码区域包括但不限于从以下的基因获得的信号肽编码区：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶和胎毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶。用于酵母宿主细胞的有用的信号肽包括但不限于来自以下的基因的那些：酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶。
在一些实施方案中，控制序列为前肽编码区域，其编码定位在多肽的氨基末端处的氨基酸序列。产生的多肽被称为“前酶(proenzyme)”、“前多肽(propolypeptide)”或在某些情况下称为“酶原(zymogen)”)。前多肽可以通过催化或自动催化前肽从前多肽的裂解被转化为成熟活性多肽。前肽编码区域包括但不限于以下的基因：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)乳糖酶(参见，如WO95/33836)。当信号肽和前肽区域均存在于多肽的氨基末端时，前肽区域紧邻多肽的氨基末端定位并且信号肽区域紧邻前肽区域的氨基末端定位。
在一些实施方案中，还利用了调节序列。这些序列促进多肽表达相对于宿主细胞的生长的调节。调节系统的实例为促使基因的表达被开启或关闭以响应于化学或物理刺激的那些，所述化学或物理刺激包括调节性化合物的存在。在原核宿主细胞中，合适的调节序列包括但不限于lac、tac和trp操纵子系统。在酵母宿主细胞中，合适的调节系统包括但不限于ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，合适的调节序列包括但不限于TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。
在另一个方面，本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含编码工程化P450-BM3多肽的多核苷酸和取决于多核苷酸被引入到的宿主细胞的类型的一个或更多个表达调节区域，诸如启动子和终止子、复制起点等。在一些实施方案中，将以上描述的多种核酸和控制序列连接在一起以产生重组表达载体，其包含一个或更多个方便的限制位点以允许编码变体P450-BM3多肽的核酸序列在此类位点插入或取代。可选地，本发明的多核苷酸序列通过将多核苷酸序列或包含该多核苷酸的核酸构建体插入到适当的表达载体来表达。在创建表达载体时，编码序列位于载体中以使编码序列与用于表达的适当的控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其可以方便地经历重组DNA程序中并且可以导致变体P450-BM3多核苷酸序列的表达。载体的选择通常将取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性质粒或闭合的环状质粒。
在一些实施方案中，表达载体为自主复制载体(即，作为染色体外的实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，诸如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体)。载体可以包含用于确保自我复制的任何工具(means)。在一些可选的实施方案中，载体可以是当被引入到宿主细胞中时，被整合到基因组中并与其被整合进的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单一载体或质粒或者一起包含待引入到宿主细胞基因组中的总DNA的两种或多种载体或质粒，或者转座子。
在一些实施方案中，表达载体优选地包含一个或更多个可选择的标志物，其允许容易选择经转化的细胞。“可选择的标志物”为其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养型等的基因。细菌的可选择的标志物的实例包括但不限于，来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性诸如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的标志物。用于酵母宿主细胞的合适的标志物包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的可选择的标志物包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶(sulfate adenyltransferase))和trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)，以及其等同物。在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含编码本申请的至少一种工程化P450-BM3多肽的多核苷酸，所述多核苷酸被可操作地连接至一个或更多个控制序列用于在宿主细胞中表达工程化P450-BM3酶。用于在表达由本发明的表达载体编码的多肽中使用的宿主细胞是本领域熟知的，并且包括但不限于细菌细胞，诸如大肠杆菌、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、链霉菌属(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)细胞；真菌细胞，诸如酵母细胞(例如，酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)[ATCC保藏号201178])；昆虫细胞，诸如果蝇属(Drosophila)S2和夜蛾属(Spodoptera)Sf9细胞；动物细胞，诸如CHO、COS、BHK、293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。示例性宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)菌株(诸如，W3110(ΔfhuA)和BL21)。
因此，在另一个方面，本发明提供了用于产生工程化P450-BM3多肽的方法，其中所述方法包括将能够表达编码工程化P450-BM3多肽的多核苷酸的宿主细胞在适合该多肽表达的条件下培养。在一些实施方案中，该方法还包括分离和/或纯化如本文描述的P450-BM3多肽的步骤。
以上描述的宿主细胞的适当的培养基以及生长条件是本领域熟知的。用于表达P450-BM3多肽的多核苷酸可以通过本领域已知的多种方法被引入到细胞中。技术包括，除了其他以外，电穿孔、生物颗粒轰击法、脂质体介导的转染、氯化钙转染和原生质体融合。
具有本文公开的特性的工程化P450-BM3可以通过使编码天然存在的或工程化P450-BM3多肽的多核苷酸经历本领域中已知的和如本文所描述的诱变和/或定向进化方法来获得。示例性的定向进化技术为诱变和/或DNA改组(参见例如，Stemmer,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751[1994]；WO 95/22625；WO 97/0078；WO 97/35966；WO 98/27230；WO 00/42651；WO 01/75767和美国专利6,537,746)。可以使用的其他定向进化程序包括，除了其他以外，交错延伸过程(StEP)、体外重组(参见例如，Zhao等,Nat.Biotechnol.16:258–261[1998])、诱变PCR(参见例如，Caldwell等,PCR MethodsAppl.3:S136-S140[1994])、和盒式诱变(参见例如，Black等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:3525-3529[1996])。
例如，诱变和定向进化的方法可以容易地应用至多核苷酸，以生成可以被表达、筛选和测定的变体库。诱变和定向进化方法是本领域熟知的(参见例如，美国专利第5,605,793号、第5,830,721号、第6,132,970号、第6,420,175号、第6,277,638号、第6,365,408号、第6,602,986号、第7,288,375号、第6,287,861号、第6,297,053号、第6,576,467号、第6,444,468号、第5,811238号、第6,117,679号、第6,165,793号、第6,180,406号、第6,291,242号、第6,995,017号、第6,395,547号、第6,506,602号、第6,519,065号、第6,506,603号、第6,413,774号、第6,573,098号、第6,323,030号、第6,344,356号、第6,372,497号、第7,868,138号、第5,834,252号、第5,928,905号、第6,489,146号、第6,096,548号、第6,387,702号、第6,391,552号、第6,358,742号、第6,482,647号、第6,335,160号、第6,653,072号、第6,355,484号、第6,303,344号、第6,319,713号、第6,613,514号、第6,455,253号、第6,579,678号、第6,586,182号、第6,406,855号、第6,946,296号、第7,534,564号、第7,776,598号、第5,837,458号、第6,391,640号、第6,309,883号、第7,105,297号、第7,795,030号、第6,326,204号、第6,251,674号、第6,716,631号、第6,528,311号、第6,287,862号、第6,335,198号、第6,352,859号、第6,379,964号、第7,148,054号、第7,629,170号、第7,620,500号、第6,365,377号、第6,358,740号、第6,406,910号、第6,413,745号、第6,436,675号、第6,961,664号、第7,430,477号、第7,873,499号、第7,702,464号、第7,783,428号、第7,747,391号、第7,747,393号、第7,751,986号、第6,376,246号、第6,426,224号、第6,423,542号、第6,479,652号、第6,319,714号、第6,521,453号、第6,368,861号、第7,421,347号、第7,058,515号、第7,024,312号、第7,620,502号、第7,853,410号、第7,957,912号、第7,904,249号，和所有相关的非美国对应专利(counterparts)；Ling等，Anal.Biochem.,254:157-78[1997]；Dale等，Meth.Mol.Biol.,57:369-74[1996]；Smith,Ann.Rev.Genet.,19:423-462[1985]；Botstein等，Science,229:1193-1201[1985]；Carter,Biochem.J.,237:1-7[1986]；Kramer等,Cell,38:879-887[1984]；Wells等,Gene,34:315-323[1985]；Minshull等,Curr.Op.Chem.Biol.,3:284-290[1999]；Christians等,Nat.Biotechnol.,17:259-264[1999]；Crameri等,Nature,391:288-291[1998]；Crameri,等,Nat.Biotechnol.,15:436-438[1997]；Zhang等,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,94:4504-4509[1997]；Crameri等,Nat.Biotechnol.,14:315-319[1996]；Stemmer,Nature,370:389-391[1994]；Stemmer,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:10747-10751[1994]；WO 95/22625；WO 97/0078；WO 97/35966；WO 98/27230；WO 00/42651；WO 01/75767；WO 2009/152336，和美国专利第6,537,746号，其全部通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，诱变处理后获得的酶克隆通过使酶经历指定的温度(或其他测定条件，诸如测试酶对宽范围的底物的活性)，并测量热处理或其他测定条件之后剩余的酶活性的量进行筛选。然后包含编码P450-BM3多肽的多核苷酸的克隆被测序以鉴定核苷酸序列的改变(如果有)，并且用于在宿主细胞中表达酶。测量来自表达文库的酶活性可以使用本领域已知的任何合适的方法(例如，标准生物化学技术，诸如HPLC分析)来进行。
对于已知序列的工程化多肽，编码酶的多核苷酸可以根据已知的合成方法通过标准的固相方法制备。在一些实施方案中，多达约100个碱基的片段可以被单独地合成，然后连接(例如，通过酶促或化学连接方法(chemical ligation method)或聚合酶介导的方法)以形成任何期望的连续序列。例如，本文公开的多核苷酸和寡核苷酸可以使用经典的亚磷酰胺方法(参见例如，Beaucage等,Tetra.Lett.,22:1859-69[1981]；和Matthes等,EMBOJ.,3:801-05[1984])，如通常在自动合成方法中所实践的，通过化学合成制备。根据亚磷酰胺方法，寡核苷酸被合成(例如，在自动的DNA合成仪中)、纯化、退火、连接并克隆入适当的载体。
因此，在一些实施方案中，用于制备工程化P450-BM3多肽的方法可以包括：(a)合成编码包含选自表2-9的任一个中提供的任何变体的氨基酸序列以及SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、和/或16的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，和(b)表达由多核苷酸编码的P450-BM3多肽。在该方法的一些实施方案中，由多核苷酸编码的氨基酸序列可以任选地具有一个或几个(例如，多达3个、4个、5个或多达10个)氨基酸残基缺失、插入和/或取代。在一些实施方案中，氨基酸序列任选地具有1-2个、1-3个、1-4个、1-5个、1-6个、1-7个、1-8个、1-9个、1-10个、1-15个、1-20个、1-21个、1-22个、1-23个、1-24个、1-25个、1-30个、1-35个、1-40个、1-45个或1-50个氨基酸残基缺失、插入和/或取代。在一些实施方案中，氨基酸序列任选地具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、30个、35个、40个、45个或50个氨基酸残基缺失、插入和/或取代。在一些实施方案中，氨基酸序列任选地具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、18个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸残基缺失、插入和/或取代。在一些实施方案中，取代可以是保守取代或非保守取代。
可以使用本领域已知的任何合适的测定，包括但并不限于本文描述的测定和条件，测量所表达的工程化P450-BM3多肽的任何期望的改进的特性(例如，活性、选择性、稳定性、酸耐受性、蛋白酶敏感性等)。
在一些实施方案中，使用用于蛋白纯化的熟知技术中的任何一种或更多种，将在宿主细胞中表达的工程化P450-BM3多肽的任一种从细胞和/或培养基中回收，用于蛋白纯化的熟知技术除了其他以外包括，溶菌酶处理、超声处理、过滤、盐析、超离心和色谱法。
用于分离P450-BM3多肽的色谱技术，除了其他以外，包括，反相色谱、高效液相色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、凝胶电泳和亲和色谱。用于纯化特定酶的条件部分地取决于因素诸如净电荷、疏水性、亲水性、分子量、分子形状等，并且对本领域技术人员将是明显的。在一些实施方案中，亲和技术可以用于分离改进的变体P450-BM3酶。在利用亲和色谱纯化的一些实施方案中，可使用特异性结合变体P450-BM3多肽的任何抗体。为了产生抗体，通过用P450-BM3多肽(例如，P450-BM3变体)或其片段注射来免疫多种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等。在一些实施方案中，P450-BM3多肽或片段借助于侧链官能基团或被附接至侧链官能基团的接头被附连至合适的载体，诸如BSA。
在一些实施方案中，工程化P450-BM3多肽通过包括以下的方法在宿主细胞中产生：将包含编码如本文描述的工程化P450-BM3多肽的多核苷酸序列的宿主细胞(例如，大肠杆菌菌株)在有利于工程化P450-BM3多肽产生的条件下培养，并从细胞和/或培养基中回收工程化P450-BM3多肽。
在一些实施方案中，工程化P450-BM3多肽从重组宿主细胞或细胞培养物中回收，并且它们通过本领域已知的任何合适的方法进一步纯化。在一些另外的实施方案中，纯化的P450-BM3多肽与其他成分和化合物组合以提供适当包含工程化P450-BM3多肽用于不同应用和用途的组合物和制剂(例如，药物组合物)。
可以结合以下非限制性实施例更好地理解本发明的前述和其他方面。提供实施例仅用于说明目的并且不意图以任何方式限制本发明的范围。
实验
提供以下实施例，包括实验和获得的结果，仅用于说明的目的，而不应被解释为限制本发明。
在下文的实验公开内容中，应用以下缩写：ppm(百万分率)；M(摩尔/升)；mM(毫摩尔/升)，uM和μΜ(微摩尔/升)；nM(纳摩尔/升)；mol(摩尔)；gm和g(克)；mg(毫克)；ug和μg(微克)；L和l(升)；ml和mL(毫升)；cm(厘米)；mm(毫米)；uM和μM(微米)；sec.(秒)；min(s)(分钟)；h(s)和hr(s)(小时)；U(单位)；MW(分子量)；rpm(每分钟转数)；℃(摄氏度)；CDS(编码序列)；DNA(脱氧核糖核酸)；RNA(核糖核酸)；NA(核酸；多核苷酸)；AA(氨基酸；多肽)；大肠杆菌W3110(常用的实验室大肠杆菌菌株，可从Coli Genetic Stock Center[CGSC]，NewHaven,CT获得)；HPLC(高压液相色谱)；SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)；PES(聚醚砜)；CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)；IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)；PMBS(硫酸多黏菌素B)；NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)；GDH(葡萄糖脱氢酶)；TON(周转数目)；FIOPC(相对于阳性对照的改进倍数)；TON(周转数目)；ESI(电喷雾电离)；LB(Luria肉汤)；TB(Terrific肉汤)；MeOH(甲醇)；Athens Research(Athens Research Technology,Athens,GA)；ProSpec(ProSpec Tany Technogene,East Brunswick,NJ)；Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)；Ram Scientific(Ram Scientific,Inc.,Yonkers,NY)；Pall Corp.(Pall,Corp.,Pt.Washington,NY)；Millipore(Millipore,Corp.,BillericaMA)；Difco(Difco Laboratories,BD Diagnostic Systems,Detroit,MI)；MolecularDevices(Molecular Devices,LLC,Sunnyvale,CA)；Kuhner(Adolf Kuhner,AG,Basel,Switzerland)；Cambridge Isotope Laboratories,(Cambridge Isotope Laboratories,Inc.,Tewksbury,MA)；Applied Biosystems(Applied Biosystems,part of LifeTechnologies,Corp.,Grand Island,NY),Agilent(Agilent Technologies,Inc.,SantaClara,CA)；Thermo Scientific(part of Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)；Fisher(Fisher Scientific,Waltham,MA)；Corning(Corning,Inc.,Palo Alto,CA)；Waters(Waters Corp.,Milford,MA)；GE Healthcare(GE Healthcare Bio-Sciences,Piscataway,NJ)；Pierce(Pierce Biotechnology(now part of Thermo FisherScientific),Rockford,IL)；Phenomenex(Phenomenex,Inc.,Torrance,CA)；Optimal(Optimal Biotech Group,Belmont,CA)；and Bio-Rad(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)。
实施例1
P450-BM3进化和表达载体的构建
P450-BM3变体的文库基于8个亲本序列SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、和16使用本领域已知的标准方法来产生。这些亲本菌株被用于通过重组有益的多样性来生成组合文库。这些亲本骨架菌株及其序列ID列于下文表1中，其中首先列出多核苷酸序列，随后是多肽序列。
将这些变体克隆到IPTG诱导型载体中，转化到大肠杆菌菌株BL21中，并铺板在补充有氯霉素(30μg/mL)的LB琼脂板上。将板在37℃生长16小时，然后挑取单个克隆并且添加至包含补充有氯霉素(30μg/mL)的LB培养基(250μL/孔)的96孔板(Corning)中。在将板在30℃和85％湿度以250rpm振荡20-24h以使培养物生长至饱和之后，使用等分试样(50μL)接种包含补充有以下的TB培养基(900μL)的2mL 96孔深板(Corning)：氯霉素(30μg/mL)、微量元素溶液(740ug/L四水合钼酸铵、5.8mg/L七水硫酸锌、620ug/L无水硼酸、1mg/L五水合硫酸铜、和4mg/L四水合氯化锰)、和0.05g/L柠檬酸铁(III)铵。在30℃和85％湿度以250rpm振荡至OD600为0.8–1.2之后，P450表达通过添加IPTG(500uM)和血红素前体5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)至最终浓度为500uM来诱导。将培养物在26℃、85％湿度以250rpm振荡24小时，然后将细胞离心并且在-80℃储存。
细胞裂解通过将细胞沉淀物重悬于具有包含磷酸钾，pH 8.0(100mM)，MgSO4(10mM)、DTT(1mM)、溶菌酶(1mg/mL)、PMBS(0.5mg/mL)、和DNA酶I(3μg/mL)的裂解缓冲液(300μL/well)的96孔板(Corning)中来完成。将裂解反应在室温使用台式振荡器(table top shaker)(设置8-10)振荡1.25小时。将裂解反应离心以沉淀细胞碎片，并且将上清液用于实施例2中描述的活性测定中。
为了产生冻干的蛋白粉末，将补充有氯霉素(30μg/mL)的LB琼脂板用包含在IPTG诱导型载体中的期望的巨大芽孢杆菌P450-BM3变体的大肠杆菌划线。将板在37℃生长16小时，然后选择单个克隆以接种包含补充有氯霉素(30μg/mL)的TB培养基(3mL)的15mLFalconTM管(Fisher)。将管在30℃和85％湿度以200rpm振荡20-24h以使培养物生长至饱和。然后，2.5mL过夜培养物用于接种包含补充有以下的TB培养基(250mL)的无菌1L烧瓶：氯霉素(30μg/mL)、微量元素溶液(如以上描述的)、和0.05g/L柠檬酸铁(III)铵。在30℃和85％湿度以250rpm振荡至OD600为0.8–1.2之后，P450表达通过添加IPTG(500uM)和血红素前体5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)至最终浓度为500uM来诱导。使培养物生长另外20-24小时，并且在预先称重的250mL离心瓶中在4℃以4000rpm离心20分钟。将上清液弃去，并且将包含细胞沉淀物的离心瓶称重。将沉淀物重悬于具有2mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液，pH 8.0中(每克细胞沉淀物5mL缓冲液)。将细胞使用微流化器匀浆器(microfluidizer homogenizer)裂解，并且将细胞和裂解物的悬浮液收集在无菌50mL离心管中。将样品在4℃以10,000rpm离心30分钟。将澄清的裂解物收集到塑料培养皿(plastic petri plate)中且并在冻干之前在-80℃冷冻。将含酶裂解物使用本领域已知的标准方法冻干。
实施例2
测定系统&结果
在该实施例中，描述了用于评价活性和通用性特性(即，对宽底物范围的活性)的测试系统。
I.对酶促活性的基于活性的高通量筛选(HTP)：
双氯芬酸(参见，图1)用作用于高通量(HTP)筛选测定的底物以检测具有改进的活性的变体。酶促活性筛选通过将60μL裂解物和120μL反应混合物添加至96-孔(2mL)板的每一个孔中来启动。反应混合物包含再循环系统(120mM磷酸钾、1.2mM NADP+、30mM葡萄糖和0.6mg/mL葡萄糖脱氢酶)、共溶剂(7.5％DMSO)和底物(3mM双氯芬酸)。将反应物在30℃、85％湿度以250rpm振荡4-24小时。通过将乙腈(400μL至1ml)添加至每一个孔来猝灭反应物。将猝灭的反应物离心以去除沉淀的蛋白，然后用HPLC和LCMS分析，如下文描述的。
II.通用性特性的验证：
酶储备液(～12μM)通过将～20mg每一种酶溶解于100mM磷酸钾缓冲液，pH 8.0(1mL)中来制备。每一种酶储备液溶液的浓度通过UV-可见吸收光谱法(在离心去除颗粒之后)来确定并且稀释以标准化在12μM血红素蛋白。底物溶液通过将每一种底物溶解于DMSO以达到最终浓度为20mM或40mM来制备。将反应混合物(235μL)，随后是酶溶液(50μL)添加至板中。将底物储备液溶液添加至酶溶液(15μL，以两个不同的浓度)。每一反应物包含100mM磷酸钾、1.0mM NADP+、25mM葡萄糖、0.5mg/mL葡萄糖脱氢酶、5％DMSO和在1mM或2mM的底物。除了双氯芬酸以外，还选择氯雷他定、伊马替尼和吉非替尼(参见，图1)作为底物，以验证改进的BM3变体。将反应物在30℃以450rpm震荡超过24小时。所有反应物用乙腈稀释至最终浓度为0.5mM底物。然后将板在20℃以3,000g离心1小时。将上清液用乙腈1:1稀释，使用0.4微米过滤器过滤，并且通过UPLC-MS分析。
III.HPLC、LCMS和UPLC-MS分析：
对于HPLC和LCMS分析，将150μL每种猝灭的反应物样品转移至96孔圆底板上，在配备有自动进样器的Agilent Technologies 1200系列上通过HPLC进行分析。将10μL猝灭的样品注射到Onyx Monolithic C18柱(2×50mm)上。将柱以0.5mL/min的恒定流速洗脱；用于洗脱反应产物的溶剂A(在H2O中的0.1％甲酸v/v)和溶剂B(在乙腈中的0.1％甲酸v/v)的条件为：0–1min，A/B 90:10；1-2min，A/B 80:20；2-4min，A/B 70:30；4-4.5min，A/B 60:40；4.5-4.9min，A/B 10:90，和4.9–5.3min，A/B 90:10。柱洗脱液在270nm处通过UV来监测。可选地，使用Surveyor Plus LC-PDA系统在Thermo LXQ离子阱系统上对一些底物进行通过LC-UV-MS的分析，以用于样品分离。将猝灭的样品(0.01ml)注射到Waters Xbridge C18柱(3×50mm，5μm)上。将柱以0.5mL/min的恒定流速洗脱；用于洗脱反应产物的溶剂A(在H2O中的0.1％甲酸v/v)和溶剂B(在乙腈中的0.1％甲酸v/v)的条件为：0–1.5min，A/B 90:10；1.5-5.5min，A/B 20:80；5.5-6.0min，A/B 1:99；6.0-6.25min，A/B 90:10；6.25-7.5min，A/B 90:10。柱洗脱液通过PDA(200-600nm)来监测，然后在正ESI模式(毛细管温度350℃，5kV喷雾电压)进行MS分析。对于运行的首个1.5分钟，将柱洗脱液释放至废弃物。对于剩余的LC运行，收集MS(m/z 125-1000扫描范围)和MS/MS两者。在第5次出现具有30秒的排斥持续时间之后，对占优势离子采用动态排除，对于第n个最强烈的离子，以数据依赖性方式获得MS/MS谱图。使用Xcalibur软件分析数据以确定底物和产物基础峰值及MS/MS跃迁
对于UPLC-MS分析，将猝灭并过滤的反应物转移至96孔HTP板，以在配备有自动进样器的Waters Acquity H-class系统上通过UPLC分析。将1uL猝灭的样品注射到AcquityUPLC HSS T3柱上，(1.8um；2.1×100mm)。将柱以0.6mL/min的恒定流速洗脱；用于洗脱反应产物的溶剂A(在H2O中的0.05％三氟乙酸v/v)和溶剂B(在乙腈中的0.05％三氟乙酸v/v)的条件为：0–2min，A/B 95:5；2-2.9min，A/B 5:95；2.9-3min，A/B 95:5；3-3.5min，A/B95:5。柱洗脱液通过PDA(200-600nm)来监测，然后在正ESI模式(去溶剂化温度350℃，3.25kV喷雾电压，锥孔电压(cone voltage)25V)进行MS分析。对于运行的首个0.7分钟，将柱洗脱液释放至废弃物。对于剩余的LC运行，收集MS(m/z 95-600扫描范围)和MS/MS两者。在第5次出现具有30秒的排斥持续时间之后，对占优势离子采用动态排除，对于第n个最强烈的离子，以数据依赖性方式获得MS/MS谱图。使用MassLynx和Virscidian软件分析数据以确定底物和产物基础峰值及MS/MS跃迁。
IV.结果
生成对大范围底物具有改进的活性的酶的能力需要优化底物结合和限速电子传递两者的进化方法。先前鉴定的通常优化了这两个参数的18个突变(参见，美国专利申请公布第2016/0010065号，其内容通过引用以其整体并且出于所有目的并入本文)使用表1-1中列出的来自96孔商购可得的MCYP组(MCYP-0343；Codexis)的8个可选骨架进行重组。该方法的目的是使用双氯芬酸作为筛选底物筛选来自构建在可选骨架上的每一个谱系的组合文库，以鉴定和选择改进的变体。针对一组化合物筛选最大改进的变体的冻干粉末，以确定对多种底物的改进量级(例如，通用性特性)。该方法被称为“通用性多样性的可转移性(transferability of generalist diversity)”。变体、筛选的底物和突变总结于表2至9中。图2为MCYP-1.2-A12谱系(表2-9中总结的8个谱系之一)的图解总结。在图2中，将筛选的每一种底物的转化百分比作为每一种筛选的酶的函数作图。在该图中，比较了两个进化的P450(变体16和17)与亲本骨架MCYP-1.2-A12的性能(在1mM底物载量的转化％)。如图2中示出的及表4中总结的，亲本骨架(MCYP-1.2-A12)对筛选的每一种底物表现出低活性。进化的变体(变体16和17)对筛选的4种底物中的3种具有改进的和显著的活性。对剩余谱系也观察到类似的趋势。比较了变体14和15与它们的亲本骨架MCYP-1.2-A07的性能(在1mM底物载量的转化％)。亲本骨架(MCYP-1.2-A07)的性能(在1mM底物载量的转化％)总结于表3中，并且对伊马替尼和吉非替尼表现出低活性，以及对双氯芬酸和氯雷他定表现出中度活性。进化的变体对所有4种底物表现出中度活性。对于每一个谱系，进化的变体对对应的亲本骨架显示很少至不具有活性的至少一种底物表现出活性，和/或对亲本骨架对其表现出活性的至少一种底物表现出改进的性能(在1mM底物载量的转化％)。
对MCYP-1.2-A05谱系观察到相同的趋势(参见，图3)，尽管MCYP-1.2-A05为嵌合体。P450结构域与枯草芽孢杆菌P450 86％相同。这些结果表明类似的突变/位置的组合应该赋予来自其他生物体的P450酶的改进。
在表2-9中，aTON被计算为([底物]*转化％/[P450])，并且bFIOPC被计算为TON(变体)/TON(亲本)或转化(变体)％/转化(亲本)％。下表提供了剩余条目的关键内容。
尽管已经参考具体的实施方案描述了本发明，可以做出多种改变并且可以替换等同物，以适应特定的情况、材料、物质的组成、方法、方法步骤(process step or steps)，从而实现本发明的益处，而不偏离所要求保护的范围。
本公开内容中引用的每一个和每个出版物和专利文件通过引用被并入本文用于在美国的所有目的，如同每个这样的出版物或文件被明确和分别指出以通过引用并入本文一样。出版物和专利文件的引用不被认为是任何此类文件是相关的现有技术的指示，也不构成对其内容或日期的承认。
序列表
<110> 科德克希思公司
罗伯特·奥斯本
韦丝娜·米切尔
崔钦育奈
张希云
埃里卡·M·米尔泽克
杰弗里·C·穆尔
<120> 具有改进的活性的新颖P450-BM3变体
<130> CX2-150USP1
<160> 16
<210> 1
<211> 3165
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P450_BM3
<400> 1
atgttaatga aacaggcaag cgcaatacct cagcccaaaa catacggacc tttaaaaaat 60
cttccgcatc tggaaaaaga acagctttct caatccttat ggcggatagc tgatgaattg 120
ggaccgattt tccgttttga ttttccggga gtatccagtg tttttgtgtc cggccacaat 180
cttgtggctg aagtgtgtga tgaagaacgg tttgataaaa gcattgaagg cgccttggaa 240
aaggttcgcg cattttccgg tgacggattg gccactagtt ggacgcatga gcctaactgg 300
agaaaagcgc acaacattct gatgccgacg ttcagccagc gggccatgaa ggactatcat 360
gagaaaatgg tcgatatcgc aacccagctg attcaaaagt ggagccggtt aaaccccaat 420
gaagaaattg atgtagcgga cgatatgaca cgtctgacgc ttgatacgat tgggttatgc 480
gggtttaact atcgattcaa cagcttttac cgagatcagc ctcatccatt tattacaagt 540
atggtccgtg cactggatga agcaatgaac aagctgcagc gagcaaatcc agacgaccca 600
gcttatgatg aaaacaagcg ccagtttcaa gaagatatca aggtgatgaa cgacctagtc 660
gacagcatta ttgcagagcg cagggcgaat ggagaccagg atgaaaaaga tttgctcgcc 720
cgcatgctga atgtggaaga tccggaaact ggtgaaaagc tcgacgacga aaatatccgc 780
tttcagatca tcacgttttt gattgccggc catgaaacaa caagcgggtt gctatccttt 840
gcgatttatt gtctgcttac acatccggaa aaactgaaaa aagctcagga ggaagcggat 900
cgcgtgttaa cggatgacac gcctgaatat aaacaaatcc agcagctcaa atacattcgg 960
atggttttaa atgaaaccct cagactgtat ccaacagctc cggctttttc tctatatgcg 1020
aaggaggata ctgttcttgg cggggaatat ccgatcagca aagggcagcc agtcactgtt 1080
ttaattccaa aactgcaccg ggatcaaaac gcttggggac cggatgcgga agatttccgt 1140
ccggaacggt ttgaagatcc ttcaagtatc cctcaccatg cgtataagcc gtttggaaac 1200
ggacagcgcg cttgtattgg catgcagttt gctcttcaag aagcgacaat ggttctcggt 1260
cttgtattaa agcattttga attgataaac catactggct acgaactaaa aatcaaagaa 1320
gcattaacga tcaagccgga tgattttaaa attactgtga aaccgcgaaa aacagcggca 1380
atcaatgtac agagaaaaga acaggcagaa cagtctgcta aaaaagtacg caaaaaggca 1440
gaaaacgctc ataatacgcc gctgcttgtg ctatacggtt caaatatggg aacagctgaa 1500
ggaacggcgc gtgatttagc agatattgca atgagcaaag gatttgcacc gcaggtcgca 1560
acgcttgatt cacacgccgg aaatcttccg cgcgaaggag ctgtattaat tgtaacggcg 1620
tcttataacg gtcatccgcc tgataacgca aagcaatttg tcgactggtt agaccaagcg 1680
tctgctgatg aagtaaaagg cgttcgctac tccgtatttg gatgcggcga taaaaactgg 1740
gctactacgt atcaaaaagt gcctgctttt atcgatgaaa cgcttgccgc taaaggggca 1800
gaaaacatcg ctgaccgcgg tgaagcagat gcaagcgacg actttgaagg cacatatgaa 1860
gaatggcgtg aacatatgtg gagtgacgta gcagcctact ttaacctcga cattgaaaac 1920
agtgaagata ataaatctac tctttcactt caatttgtcg acagcgccgc ggatatgccg 1980
cttgcgaaaa tgcacggtgc gttttcaacg aacgtcgtag caagcaaaga acttcaacag 2040
ccaggcagtg cacgaagcac gcgacatctt gaaattgaac ttccaaaaga agcttcttat 2100
caagaaggag atcatttagg tgttattcct cgcaactatg aaggaatagt aaaccgtgta 2160
acagcaaggt tcggcctaga tgcatcacag caaatccgtc tggaagcaga agaagaaaaa 2220
ttagctcatt tgccactcgc taaaacagta tccgtagaag agcttctgca atacgtggag 2280
cttcaagatc ctgttacgcg cacgcagctt cgcgcaatgg ctgctaaaac ggtctgcccg 2340
ccgcataaag tagagcttga agccttgctt gaaaagcaag cctacaaaga acaagtgctg 2400
gcaaaacgtt taacaatgct tgaactgctt gaaaaatacc cggcgtgtga aatgaaattc 2460
agcgaattta tcgcccttct gccaagcata cgcccgcgct attactcgat ttcttcatca 2520
cctcgtgtcg atgaaaaaca agcaagcatc acggtcagcg ttgtctcagg agaagcgtgg 2580
agcggatatg gagaatataa aggaattgcg tcgaactatc ttgccgagct gcaagaagga 2640
gatacgatta cgtgctttat ttccacaccg cagtcagaat ttacgctgcc aaaagaccct 2700
gaaacgccgc ttatcatggt cggaccggga acaggcgtcg cgccgtttag aggctttgtg 2760
caggcgcgca aacagctaaa agaacaagga cagtcacttg gagaagcaca tttatacttc 2820
ggctgccgtt cacctcatga agactatctg tatcaagaag agcttgaaaa cgcccaaagc 2880
gaaggcatca ttacgcttca taccgctttt tctcgcatgc caaatcagcc gaaaacatac 2940
gttcagcacg taatggaaca agacggcaag aaattgattg aacttcttga tcaaggagcg 3000
cacttctata tttgcggaga cggaagccaa atggcacctg ccgttgaagc aacgcttatg 3060
aaaagctatg ctgacgttca ccaagtgagt gaagcagacg ctcgcttatg gctgcagcag 3120
ctagaagaaa aaggccgata cgcaaaagac gtgtgggctg ggtaa 3165
<210> 2
<211> 1054
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P450_BM3
<400> 2
Met Leu Met Lys Gln Ala Ser Ala Ile Pro Gln Pro Lys Thr Tyr Gly
1 5 10 15
Pro Leu Lys Asn Leu Pro His Leu Glu Lys Glu Gln Leu Ser Gln Ser
20 25 30
Leu Trp Arg Ile Ala Asp Glu Leu Gly Pro Ile Phe Arg Phe Asp Phe
35 40 45
Pro Gly Val Ser Ser Val Phe Val Ser Gly His Asn Leu Val Ala Glu
50 55 60
Val Cys Asp Glu Glu Arg Phe Asp Lys Ser Ile Glu Gly Ala Leu Glu
65 70 75 80
Lys Val Arg Ala Phe Ser Gly Asp Gly Leu Ala Thr Ser Trp Thr His
85 90 95
Glu Pro Asn Trp Arg Lys Ala His Asn Ile Leu Met Pro Thr Phe Ser
100 105 110
Gln Arg Ala Met Lys Asp Tyr His Glu Lys Met Val Asp Ile Ala Thr
115 120 125
Gln Leu Ile Gln Lys Trp Ser Arg Leu Asn Pro Asn Glu Glu Ile Asp
130 135 140
Val Ala Asp Asp Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys
145 150 155 160
Gly Phe Asn Tyr Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro
165 170 175
Phe Ile Thr Ser Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu
180 185 190
Gln Arg Ala Asn Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln
195 200 205
Phe Gln Glu Asp Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Ser Ile Ile
210 215 220
Ala Glu Arg Arg Ala Asn Gly Asp Gln Asp Glu Lys Asp Leu Leu Ala
225 230 235 240
Arg Met Leu Asn Val Glu Asp Pro Glu Thr Gly Glu Lys Leu Asp Asp
245 250 255
Glu Asn Ile Arg Phe Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu
260 265 270
Thr Thr Ser Gly Leu Leu Ser Phe Ala Ile Tyr Cys Leu Leu Thr His
275 280 285
Pro Glu Lys Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ala Asp Arg Val Leu Thr
290 295 300
Asp Asp Thr Pro Glu Tyr Lys Gln Ile Gln Gln Leu Lys Tyr Ile Arg
305 310 315 320
Met Val Leu Asn Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Thr Ala Pro Ala Phe
325 330 335
Ser Leu Tyr Ala Lys Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Ile
340 345 350
Ser Lys Gly Gln Pro Val Thr Val Leu Ile Pro Lys Leu His Arg Asp
355 360 365
Gln Asn Ala Trp Gly Pro Asp Ala Glu Asp Phe Arg Pro Glu Arg Phe
370 375 380
Glu Asp Pro Ser Ser Ile Pro His His Ala Tyr Lys Pro Phe Gly Asn
385 390 395 400
Gly Gln Arg Ala Cys Ile Gly Met Gln Phe Ala Leu Gln Glu Ala Thr
405 410 415
Met Val Leu Gly Leu Val Leu Lys His Phe Glu Leu Ile Asn His Thr
420 425 430
Gly Tyr Glu Leu Lys Ile Lys Glu Ala Leu Thr Ile Lys Pro Asp Asp
435 440 445
Phe Lys Ile Thr Val Lys Pro Arg Lys Thr Ala Ala Ile Asn Val Gln
450 455 460
Arg Lys Glu Gln Ala Glu Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala
465 470 475 480
Glu Asn Ala His Asn Thr Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met
485 490 495
Gly Thr Ala Glu Gly Thr Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser
500 505 510
Lys Gly Phe Ala Pro Gln Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn
515 520 525
Leu Pro Arg Glu Gly Ala Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly
530 535 540
His Pro Pro Asp Asn Ala Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala
545 550 555 560
Ser Ala Asp Glu Val Lys Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly
565 570 575
Asp Lys Asn Trp Ala Thr Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp
580 585 590
Glu Thr Leu Ala Ala Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu
595 600 605
Ala Asp Ala Ser Asp Asp Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu
610 615 620
His Met Trp Ser Asp Val Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn
625 630 635 640
Ser Glu Asp Asn Lys Ser Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala
645 650 655
Ala Asp Met Pro Leu Ala Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val
660 665 670
Val Ala Ser Lys Glu Leu Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg
675 680 685
His Leu Glu Ile Glu Leu Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp
690 695 700
His Leu Gly Val Ile Pro Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val
705 710 715 720
Thr Ala Arg Phe Gly Leu Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala
725 730 735
Glu Glu Glu Lys Leu Ala His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val
740 745 750
Glu Glu Leu Leu Gln Tyr Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr
755 760 765
Gln Leu Arg Ala Met Ala Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val
770 775 780
Glu Leu Glu Ala Leu Leu Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu
785 790 795 800
Ala Lys Arg Leu Thr Met Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys
805 810 815
Glu Met Lys Phe Ser Glu Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro
820 825 830
Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala
835 840 845
Ser Ile Thr Val Ser Val Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly
850 855 860
Glu Tyr Lys Gly Ile Ala Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly
865 870 875 880
Asp Thr Ile Thr Cys Phe Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu
885 890 895
Pro Lys Asp Pro Glu Thr Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly
900 905 910
Val Ala Pro Phe Arg Gly Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu
915 920 925
Gln Gly Gln Ser Leu Gly Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser
930 935 940
Pro His Glu Asp Tyr Leu Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser
945 950 955 960
Glu Gly Ile Ile Thr Leu His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln
965 970 975
Pro Lys Thr Tyr Val Gln His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu
980 985 990
Ile Glu Leu Leu Asp Gln Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly Asp Gly
995 1000 1005
Ser Gln Met Ala Pro Ala Val Glu Ala Thr Leu Met Lys Ser Tyr Ala
1010 1015 1020
Asp Val His Gln Val Ser Glu Ala Asp Ala Arg Leu Trp Leu Gln Gln
1025 1030 1035 1040
Leu Glu Glu Lys Gly Arg Tyr Ala Lys Asp Val Trp Ala Gly
1045 1050
<210> 3
<211> 3150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P450_BM3
<400> 3
atgacaataa aggaaatgcc gcagccgaaa acgtttggag aacttaaaaa tttaccgtta 60
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P450_BM3
<400> 11
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Arg Tyr Ala Lys Asp Val Trp Ala Gly
1045
<210> 15
<211> 3150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P450_BM3
<400> 15
atgacaataa aggaaatgcc gcagccgaaa acgtttggag aacttaaaaa tttaccgtta 60
ttaaacacag ataaaccggt tcaagctttg atgaaaattg cggatgaatt aggagaaatc 120
tttaaattcg aggcgcctgg ttgtgtaacg cgctacttat caagtcagcg tctaattaaa 180
gaagcatgcg atgaatcacg ctttgataaa aacttaagtc aagcgcttaa atttgcacgt 240
gattttctgg gagacgggtt agtgacaagc tggacgcatg aaataaattg gaaaaaagcg 300
cataatatct tacttccaag ctttagtcag caggcaatga aaggctatca tgcgatgatg 360
gtcgatatcg ccgtgcagct tgttcaaaag tgggagcgtc taaatgcaga tgagcatatt 420
gaagtatcgg aagacatgac acgtttaacg cttgatacaa ttggtctttg cggctttaac 480
tatcgcttta acagctttta ccgagatcag cctcatccat ttattataag tatggtccgt 540
gcactggatg aagtaatgaa caagctgcag cgagcaaatc cagacgaccc agcttatgat 600
gaaaacaagc gccagtgtca agaagatatc aaggtgatga acgacctagt agataaaatt 660
attgcagatc gcaaagcaag gggtgaacaa agcgatgatt tattaacgca gatgctaaac 720
ggaaaagatc cagaaacggg tgagccgctt gatgacggga acattagcta tcaaattatt 780
acattcttaa ttgcgggaca cgaaacaaca agtggtcttt tatcatttgc gctgtatttc 840
ttagtgaaaa atccacatgt attacaaaaa gtagcagaag aagcagcacg agttctagta 900
gatcctgttc caagctacaa acaagtcaaa cagcttaaat atgtcggcat ggtcttaaac 960
gaagcgctgc gcttatggcc aactgctcct gcgttttccc tatatgcaaa agaagatacg 1020
gtgcttggag gagaatatcc tttagaaaaa ggcgacgaag taatggttct gattcctcag 1080
cttcaccgtg ataaaacaat ttggggagac gatgtggagg agttccgtcc agagcgtttt 1140
gaaaatccaa gtgcgattcc gcagcatgcg tttaaaccgt ttggaaacgg tcagcgtgcg 1200
tgtatcggtc agcagttcgc tcttcatgaa gcaacgctgg tacttggtat gatgctaaaa 1260
cactttgact ttgaagatca tacaaactac gagctcgata ttaaagaaac tttaacgtta 1320
aaacctgaag gctttgtggt aaaagcaaaa tcgaaaaaaa ttccgcttgg cggtattcct 1380
tcacctagca ctgaacagtc tgctaaaaaa gtacgcaaaa aggcagaaaa cgctcataat 1440
acgccgctgc ttgtgctata cggttcaaat atgggaacag ctgaaggaac ggcgcgtgat 1500
ttagcagata ttgcaatgag caaaggattt gcaccgcagg tcgcaacgct tgattcacac 1560
gccggaaatc ttccgcgcga aggagctgta ttaattgtaa cggcgtctta taacggtcat 1620
ccgcctgata acgcaaagca atttgtcgac tggttagacc aagcgtctgc tgatgaagta 1680
aaaggcgttc gctactccgt atttggatgc ggcgataaaa actgggctac tacgtatcaa 1740
aaagtgcctg cttttatcga tgaaacgctt gccgctaaag gggcagaaaa catcgctgac 1800
cgcggtgaag cagatgcaag cgacgacttt gaaggcacat atgaagaatg gcgtgaacat 1860
atgtggagtg acgtagcagc ctactttaac ctcgacattg aaaacagtga agataataaa 1920
tctactcttt cacttcaatt tgtcgacagc gccgcggata tgccgcttgc gaaaatgcac 1980
ggtgcgtttt caacgaacgt cgtagcaagc aaagaacttc aacagccagg cagtgcacga 2040
agcacgcgac atcttgaaat tgaacttcca aaagaagctt cttatcaaga aggagatcat 2100
ttaggtgtta ttcctcgcaa ctatgaagga atagtaaacc gtgtaacagc aaggttcggc 2160
ctagatgcat cacagcaaat ccgtctggaa gcagaagaag aaaaattagc tcatttgcca 2220
ctcgctaaaa cagtatccgt agaagagctt ctgcaatacg tggagcttca agatcctgtt 2280
acgcgcacgc agcttcgcgc aatggctgct aaaacggtct gcccgccgca taaagtagag 2340
cttgaagcct tgcttgaaaa gcaagcctac aaagaacaag tgctggcaaa acgtttaaca 2400
atgcttgaac tgcttgaaaa atacccggcg tgtgaaatga aattcagcga atttatcgcc 2460
cttctgccaa gcatacgccc gcgctattac tcgatttctt catcacctcg tgtcgatgaa 2520
aaacaagcaa gcatcacggt cagcgttgtc tcaggagaag cgtggagcgg atatggagaa 2580
tataaaggaa ttgcgtcgaa ctatcttgcc gagctgcaag aaggagatac gattacgtgc 2640
tttatttcca caccgcagtc agaatttacg ctgccaaaag accctgaaac gccgcttatc 2700
atggtcggac cgggaacagg cgtcgcgccg tttagaggct ttgtgcaggc gcgcaaacag 2760
ctaaaagaac aaggacagtc acttggagaa gcacatttat acttcggctg ccgttcacct 2820
catgaagact atctgtatca agaagagctt gaaaacgccc aaagcgaagg catcattacg 2880
cttcataccg ctttttctcg catgccaaat cagccgaaaa catacgttca gcacgtaatg 2940
gaacaagacg gcaagaaatt gattgaactt cttgatcaag gagcgcactt ctatatttgc 3000
ggagacggaa gccaaatggc acctgccgtt gaagcaacgc ttatgaaaag ctatgctgac 3060
gttcaccaag tgagtgaagc agacgctcgc ttatggctgc agcagctaga agaaaaaggc 3120
cgatacgcaa aagacgtgtg ggctgggtaa 3150
<210> 16
<211> 1049
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P450_BM3
<400> 16
Met Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys
1 5 10 15
Asn Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys
20 25 30
Ile Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Cys
35 40 45
Val Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp
50 55 60
Glu Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Ala Arg
65 70 75 80
Asp Phe Leu Gly Asp Gly Leu Val Thr Ser Trp Thr His Glu Ile Asn
85 90 95
Trp Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala
100 105 110
Met Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val
115 120 125
Gln Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Ser Glu
130 135 140
Asp Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn
145 150 155 160
Tyr Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Ile
165 170 175
Ser Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Val Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala
180 185 190
Asn Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Cys Gln Glu
195 200 205
Asp Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg
210 215 220
Lys Ala Arg Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr Gln Met Leu Asn
225 230 235 240
Gly Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Gly Asn Ile Ser
245 250 255
Tyr Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly
260 265 270
Leu Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu
275 280 285
Gln Lys Val Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro
290 295 300
Ser Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn
305 310 315 320
Glu Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Ala Phe Ser Leu Tyr Ala
325 330 335
Lys Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp
340 345 350
Glu Val Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp
355 360 365
Gly Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser
370 375 380
Ala Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala
385 390 395 400
Cys Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly
405 410 415
Met Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu
420 425 430
Asp Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys
435 440 445
Ala Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr
450 455 460
Glu Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn
465 470 475 480
Thr Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly
485 490 495
Thr Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro
500 505 510
Gln Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly
515 520 525
Ala Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn
530 535 540
Ala Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val
545 550 555 560
Lys Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala
565 570 575
Thr Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala
580 585 590
Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp
595 600 605
Asp Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp
610 615 620
Val Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys
625 630 635 640
Ser Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu
645 650 655
Ala Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu
660 665 670
Leu Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu
675 680 685
Leu Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile
690 695 700
Pro Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly
705 710 715 720
Leu Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu
725 730 735
Ala His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln
740 745 750
Tyr Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met
755 760 765
Ala Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu
770 775 780
Leu Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr
785 790 795 800
Met Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser
805 810 815
Glu Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile
820 825 830
Ser Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser
835 840 845
Val Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile
850 855 860
Ala Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys
865 870 875 880
Phe Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu
885 890 895
Thr Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg
900 905 910
Gly Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu
915 920 925
Gly Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr
930 935 940
Leu Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr
945 950 955 960
Leu His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val
965 970 975
Gln His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp
980 985 990
Gln Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly Asp Gly Ser Gln Met Ala Pro
995 1000 1005
Ala Val Glu Ala Thr Leu Met Lys Ser Tyr Ala Asp Val His Gln Val
1010 1015 1020
Ser Glu Ala Asp Ala Arg Leu Trp Leu Gln Gln Leu Glu Glu Lys Gly
1025 1030 1035 1040
Arg Tyr Ala Lys Asp Val Trp Ala Gly
1045

Claims (13)

1.一种重组细胞色素P450-BM3变体，所述重组细胞色素P450-BM3变体与包含SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、14或16中列出的序列的多肽序列具有至少90％序列同一性。
2.根据权利要求1所述的重组细胞色素P450-BM3变体，其中所述变体氧化至少三种有机底物。
3.根据权利要求2所述的重组细胞色素P450-BM3变体，其中所述有机底物选自氯雷他定、伊马替尼、吉非替尼和双氯芬酸。
4.一种重组多核苷酸序列，所述重组多核苷酸序列编码根据权利要求1所述的重组细胞色素P450-BM3变体。
5.根据权利要求4所述的重组多核苷酸序列，其中所述序列包括SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、或15。
6.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求4或5所述的多核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的载体，其中所述多核苷酸序列与适合在合适的宿主细胞中表达所述多核苷酸序列的调节序列可操作地连接。
8.根据权利要求6和/或7所述的载体，其中所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
9.根据权利要求8所述的载体，其中所述宿主细胞为原核细胞。
10.根据权利要求8和/或9所述的载体，其中所述宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)。
11.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求6和/或7所述的载体。
12.一种用于产生至少一种重组细胞色素P450-BM3变体的方法，所述方法包括将根据权利要求11所述的宿主细胞在使得所述宿主细胞产生根据权利要求1-3中任一项所述的重组细胞色素P450-BM3变体的条件下培养。
13.根据利要求12所述的方法，所述方法还包括回收所述至少一种重组细胞色素P450变体的步骤。
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