JP2018520674A - 改善された活性を持つ新規のｐ４５０−ｂｍ３バリアント - Google Patents

Abstract

本発明は、改善された活性を持つ改善されたＰ４５０−ＢＭ３バリアントを提供する。一部の実施形態では、Ｐ４５０−ＢＭ３バリアントは、広範囲の基質にわたって改善された活性を呈する。本発明は、改善された活性を持つ改善されたＰ４５０−ＢＭ３バリアントを提供する。一部の実施形態では、Ｐ４５０−ＢＭ３バリアントは、広範囲の基質にわたって改善された活性を呈する。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に記載されている配列を含むポリペプチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、組換えシトクロムＰ４５０−ＢＭ３バリアント。

Description

本出願は、２０１５年７月７日に出願された米国仮特許出願第６２／１８９，２３１号の優先権を主張し、当該出願はその全体が全ての目的のために本明細書に参考として援用される。
本発明は、改善された活性を持つ改善されたＰ４５０−ＢＭ３バリアントを提供する。一部の実施形態では、Ｐ４５０−ＢＭ３バリアントは、広範囲の基質にわたって改善された活性を呈する。
配列表、表またはコンピュータープログラムの参照

配列表の公式な写しは、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介し、ＡＳＣＩＩフォーマットのテキストファイルとして、ファイル名「ＣＸ２−１５０ＵＳＰ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日２０１５年７月７日、およびサイズ９９．６キロバイトで、本明細書と同時に提出される。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（monooxgenase）（「Ｐ４５０」）は、自然界に遍在する広く分布しているヘム酵素の大きな群を含む。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍから取得されたシトクロムＰ４５０−ＢＭ３（「Ｐ４５０−ＢＭ３」）は、長鎖脂肪酸、アルコールおよびアミドのＮＡＤＰＨ依存性ヒドロキシル化、ならびに不飽和脂肪酸のエポキシ化を触媒する（例えば、NarhiおよびFulco、J. Biol. Chem.、２６１巻：７１６０〜７１６９頁［１９８６年］；ならびにCapdevilaら、J. Biol. Chem.、２７１巻：２２６３〜２２６７１頁［１９９６年］を参照）。Ｐ４５０−ＢＭ３は、酵素のレダクターゼ（６５ｋＤａ）ドメインおよびモノオキシゲナーゼ（５５ｋＤａ）ドメインが融合して触媒的に自己充足的な１２０ｋＤａ酵素として生成されるという点で、ユニークである。これらの酵素は、多数の研究の対象とされてきたが、当技術分野においては、広範囲の基質にわたって高レベルの酵素活性を呈する改善されたＰ４５０が依然として必要である。

NarhiおよびFulco、J. Biol. Chem.、２６１巻：７１６０〜７１６９頁［１９８６年］ Capdevilaら、J. Biol. Chem.、２７１巻：２２６３〜２２６７１頁［１９９６年］

本発明は、改善された活性を持つ改善されたＰ４５０−ＢＭ３バリアントを提供する。一部の実施形態では、Ｐ４５０−ＢＭ３バリアントは、広範囲の基質にわたって改善された活性を呈する。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に記載されている配列を含むポリペプチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、組換えシトクロムＰ４５０−ＢＭ３バリアント。一部の実施形態では、本発明の組換えシトクロムＰ４５０−ＢＭ３バリアントは、少なくとも３つの有機基質を酸化する。一部のさらなる実施形態では、組換えシトクロムＰ４５０−ＢＭ３バリアントは、ロラタジン、イマチニブ、ゲフィチニブ（geftinib）およびジクロフェナクから選択される少なくとも１つの有機基質を酸化する。

本発明は、本明細書において提供される組換えシトクロムＰ４５０−ＢＭ３ポリペプチドバリアントをコードする、単離された組換えポリヌクレオチド配列をさらに提供する。一部の実施形態では、単離された組換えポリヌクレオチド配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１５を含む。

本発明は、本明細書において提供される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。一部の追加の実施形態では、ベクターは、好適な宿主細胞において、ポリヌクレオチド配列の発現に好適な少なくとも１つの調節配列と作動可能に連結した、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。一部の追加の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。一部のさらなる実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。本発明は、本明細書において提供されるベクターを含む宿主細胞も提供する。

本発明は、少なくとも１つの組換えシトクロムＰ４５０−ＢＭ３バリアントを生成するための方法であって、本明細書において提供される宿主細胞を、本明細書において提供される組換えシトクロムＰ４５０−ＢＭ３バリアントの少なくとも１つが、宿主細胞によって生成されるような条件下で、培養するステップを含む方法も提供する。一部の追加の実施形態では、方法は、少なくとも１つの組換えシトクロムＰ４５０バリアントを回収するステップをさらに含む。

図１は、本明細書において記述されているスクリーニング法において使用した基質の構造を提供する。ジクロフェナクは、有益な多様性を検出する／等級付けするためのＨＴＰスクリーニングに使用した。残りの基質は、進化したＢＭ３バリアントが、ＨＴＰスクリーニングに使用されなかった基質に対して活性であることを検証するために使用した。

図２は、ＭＣＹＰ−１．２−Ａ１２系統について取得された結果のグラフ概要を提供する。

図３は、ＭＣＹＰ−１．２．−Ａ０５系統について取得された結果のグラフ概要を提供する。

本発明は、改善された活性を持つ改善されたＰ４５０−ＢＭ３バリアントを提供する。一部の実施形態では、Ｐ４５０−ＢＭ３バリアントは、広範囲の基質にわたって改善された活性を呈する。Ｐ４５０−ＢＭ３酵素は、融合したレダクターゼドメインおよびヘムドメインの間の効率的な電子移動により、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの中で最高の触媒速度を呈する（例えば、Nobleら、Biochem. J.、３３９巻：３７１〜３７９頁［１９９９年］；およびMunroら、Eur. J. Biochem.、２３９巻：４０３〜４０９頁［２００９年］を参照）。故に、Ｐ４５０−ＢＭ３は、生物工学的プロセスの操作のために非常に望ましい酵素である（例えば、Sawayamaら、Chem.、１５巻：１１７２３〜１１７２９頁［２００９年］；Oteyら、Biotechnol. Bioeng.、９３巻：４９４〜４９９頁［２００６年］；Damstenら、Biol. Interact.、１７１巻：９６〜１０７頁［２００８年］；ならびにDi NardoおよびGilardi、Int. J. Mol. Sci.、１３巻：１５９０１〜１５９２４頁を参照）。しかしながら、当技術分野においては、広範囲の基質にわたって活性を呈するＰ４５０酵素が依然として必要である。本発明は、親のＰ４５０−ＢＭ３配列（すなわち、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および／または１６）と比較して、広範囲の基質にわたって改善された酵素活性を有するＰ４５０−ＢＭ３バリアントを提供する。

一部の実施形態では、本発明は、複数の有機基質の酸化のために改善された総パーセント変換／ターンオーバー数を提供するＰ４５０−ＢＭ３バリアントを提供する（例えば、図１を参照）。特に、本発明の開発中に、有益な多様性が同定され、ＨＴＰスクリーニング結果に基づいて組み換えられた。
略語および定義：

別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、概して、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。概して、本明細書において使用される命名法、ならびに後述する細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学および核酸化学の実験室手順は、当技術分野において周知であり、一般に用いられるものである。そのような技術は周知であり、当業者に周知の多数の教科書および参考資料において記述されている。標準的な技術またはその修正は、化学合成および化学分析に使用される。本明細書において言及されているすべての特許、特許出願、論文および刊行物は、上記および下記の両方が、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。

本明細書において記述されているものと同様のまたは同等の任意の好適な方法および材料が本発明の実践における使用を見出しているが、一部の方法および材料が本明細書において記述されている。本発明は、記述されている特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されず、それは、これらが当業者によって使用される文脈に応じて変動し得るからであることを理解されたい。したがって、すぐ下で定義する用語は、全体として本出願を参照することにより、より詳しく説明される。本明細書において言及されているすべての特許、特許出願、論文および刊行物は、上記および下記の両方が、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。

また、本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の指示がある場合を除き、複数の参照物を含む。

数値範囲は、範囲を定義している数字を含む。故に、本明細書において開示されているすべての数値範囲は、そのようなより広い数値範囲内に収まるすべてのより狭い数値範囲を、そのようなより狭い数値範囲がすべて本明細書において明示的に書かれているかの如く、包含することが意図されている。本明細書において開示されているすべての最大（または最小）数値限定は、すべてのより低い（またはより高い）数値限定を、そのようなより低い（またはより高い）数値限定が本明細書において明示的に書かれているかの如く、含むことも意図されている。

用語「約」は、特定の値についての許容誤差を意味する。一部の事例では、「約」は、所与の値範囲の０．０５％、０．５％、１．０％または２．０％以内を意味する。一部の事例では、「約」は、所与の値の１、２、３または４標準偏差以内を意味する。

さらに、本明細書において提供される見出しは、全体として本出願を参照することにより有することができる本発明の種々の態様または実施形態についての限定ではない。したがって、すぐ下で定義する用語は、全体として本出願を参照することにより、より詳しく定義される。それでもなお、本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下で定義する。

別段の指示がない限り、核酸は、５’から３’方向で左から右に書かれ、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向で左から右にそれぞれ書かれる。

本明細書において使用される場合、用語「含む（comprising）」およびその同語源語は、それらの包括的な意味で使用される（すなわち、用語「含む（including）」およびその対応する同語源語と同等である）。

「ＥＣ」番号は、国際生化学・分子生物学連合の命名法委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法を指す。ＩＵＢＭＢ生化学的分類は、酵素についての、それらが触媒する化学反応に基づく数値分類システムである。

「ＡＴＣＣ」は、アメリカ培養細胞系統保存機関を指し、そのバイオレポジトリーコレクションは、遺伝子および株を含む。

「ＮＣＢＩ」は、国立生物学情報センター（National Center for Biological Information）およびその中で提供される配列データベースを指す。

本明細書において使用される場合、「シトクロムＰ４５０−ＢＭ３」および「Ｐ４５０−ＢＭ３」は、長鎖脂肪酸、アルコールおよびアミドのＮＡＤＰＨ依存性ヒドロキシル化、ならびに不飽和脂肪酸のエポキシ化を触媒する、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍから取得されたシトクロムＰ４５０酵素を指す。

「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）にかかわらず、アミド結合によって共有結合している少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを表すために、本明細書において交換可能に使用される。

「アミノ酸」は、本明細書において、それらの一般に公知の三文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会により推奨される一文字記号のいずれかによって言及される。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般に許容される一文字コードによって言及され得る。

用語「改変（engineered）」、「組換え」、「非自然発生」および「バリアント」は、細胞、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関連して使用される場合、そうでなければ自然界には存在しない様式で修飾された、または、それと同一であるが、合成材料からおよび／もしくは組換え技術を使用する操作によって生成もしくは得られた、材料またはその材料の自然もしくは天然形態に対応する材料を指す。

本明細書において使用される場合、「野生型」および「自然発生の」は、自然界で見出される形態を指す。例えば、野生型ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、自然界の供給源から単離することができ、ヒトの操作によって意図的に修飾されていない、生物において存在する配列である。

「コーディング配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の部分を指す。

用語「パーセント（％）配列同一性」は、本明細書において、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの中での比較を指すために使用され、２つの最適にアラインされた配列を比較ウィンドウにわたって比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適アラインメントについての参照配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列において存在する位置の数を決定して、マッチする位置の数を得て、マッチする位置の数を比較のウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出され得る。代替として、パーセンテージは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両方の配列において存在するか、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップとアラインされるかのいずれかの位置の数を決定して、マッチする位置の数を得て、マッチする位置の数を比較のウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出され得る。当業者ならば、２つの配列をアラインするために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムがあることが分かる。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（SmithおよびWaterman、Adv. Appl. Math.、２巻：４８２頁［１９８１年］）によって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol.、４８巻：４４３頁［１９７０年］）によって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索法（PearsonおよびLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５巻：２４４４頁［１９８８年］）によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装（例えば、ＧＣＧウィスコンシンソフトウェアパッケージ内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または当技術分野において公知の通りの目視検査（visual inspection）によって行うことができる。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌらによって記述されているＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを含むがこれらに限定されない（Altschulら、J. Mol. Biol.、２１５巻：４０３〜４１０頁［１９９０年］；およびAltschulら、１９７７年、Nucl. Acids Res.、３３８９〜３４０２頁［１９７７年］をそれぞれ参照）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトを介して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインされた場合に、一部の正の値の閾値スコアＴとマッチするかまたはそれを満たすかのいずれかの、クエリー配列中の長さＷのショートワードを同定することによって、高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを伴う。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Altschulら、上記を参照）。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして作用する。次いで、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（マッチする残基の対に対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティースコア；常に＜０）を使用して算出される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを算出する。各方向へのワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から分量Ｘだけ下降した場合、１つもしくは複数の負のスコアリングの残基アラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロもしくはそれ未満になった場合、またはいずれかの配列の末端に到達した場合に、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両ストランドの比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスをデフォルトとして使用する（HenikoffおよびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９巻：１０９１５頁［１９８９年］を参照）。配列アラインメントおよび％配列同一性の例示的な決定には、提供されているデフォルトパラメーターを使用する、ＧＣＧウィスコンシンソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）内のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを用いることができる。

「参照配列」は、配列比較の基礎として使用される、定義された配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、完全長遺伝子配列またはポリペプチド配列のセグメントであってよい。概して、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチドもしくはアミノ酸残基長、少なくとも２５残基長、少なくとも５０残基長、少なくとも１００残基長、または核酸もしくはポリペプチドの完全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ（１）２つの配列の間に同様の配列（すなわち、完全な配列の一部）を含み得、（２）２つの配列の間に分岐する配列をさらに含み得るため、２つ（またはそれ超）のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較は、典型的には、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を「比較ウィンドウ」にわたって比較して、配列類似性の局所領域を同定し比較することによって実施される。一部の実施形態では、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づくものであってよく、ここで、参照配列は、一次配列中に１つまたは複数の変更を有し得る配列である。「比較ウィンドウ」は、配列を、少なくとも２０の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、比較ウィンドウ中の配列の一部は、２つの配列の最適アラインメントのための参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して２０パーセントまたはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る、少なくとも約２０の連続したヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的なセグメントを指す。比較ウィンドウは、２０よりも長い連続した残基であってよく、任意選択で、３０、４０、５０、１００、またはそれより長いウィンドウを含む。

「に対応する」、「を参照する」または「と比べた」は、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈で使用される場合、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較される場合の指定された参照配列の残基の番号付けを指す。換言すれば、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値位置によってよりも参照配列に対して指定される。例えば、改変Ｐ４５０−ＢＭ３のもの等の所与のアミノ酸配列は、ギャップを導入して２つの配列の間の残基マッチを最適化することにより、参照配列とアラインされ得る。これらの場合において、ギャップは存在するが、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列中における残基の番号付けは、それがアラインされた参照配列に対して為される。

「アミノ酸差」または「残基差」は、参照配列中の対応する位置におけるアミノ酸残基と比べた、ポリペプチド配列の位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。アミノ酸差の位置は、概して、本明細書において、「Ｘｎ」と称され、ここで、ｎは、残基差が基づいている参照配列における対応する位置を指す。例えば、「配列番号２と比較したＸ９３位における残基差」は、配列番号２の９３位に対応するポリペプチド位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。故に、配列番号２の参照ポリペプチドが９３位にセリンを有するならば、「配列番号２と比較したＸ９３位における残基差」は、配列番号２の９３位に対応するポリペプチドの位置におけるセリン以外の任意の残基のアミノ酸置換。本明細書におけるほとんどの事例では、ある位置における具体的なアミノ酸残基差（specific amino acid residue difference）は、「ＸｎＹ」として示され、ここで、「Ｘｎ」は、上述した通りの対応する位置を指定したものであり、「Ｙ」は、改変ポリペプチドにおいて見出されるアミノ酸の一文字識別子（すなわち、参照ポリペプチド中とは異なる残基）である。一部の事例では（例えば、表２〜９中）、本開示は、従来の表記法「ＡｎＢ」によって表される具体的なアミノ酸差も提供し、ここで、Ａは、参照配列中の残基の一文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列中の残基位置の数であり、Ｂは、改変ポリペプチドの配列中の残基置換の一文字識別子である。一部の事例では、本開示のポリペプチドは、参照配列と比べた残基差が存在する指定された位置のリストによって示される、参照配列と比べた１つまたは複数のアミノ酸残基差を含み得る。一部の実施形態では、１つ超のアミノ酸がポリペプチドの具体的な残基位置において使用され得る場合、使用され得る種々のアミノ酸残基は、「／」によって分離される（例えば、Ｘ３０７Ｈ／Ｘ３０７ＰまたはＸ３０７Ｈ／Ｐ）。本出願は、保存的および非保存的アミノ酸置換のいずれか／または両方を含む１つまたは複数のアミノ酸差を含む、改変ポリペプチド配列を含む。

「保存的アミノ酸置換」は、同様の側鎖を有する異なる残基による、残基の置換を指し、故に、典型的には、アミノ酸の同じまたは同様の定義クラス内のアミノ酸による、ポリペプチド中のアミノ酸の置換を伴う。限定ではなく例として、脂肪族側鎖を持つアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）で置換されてよく；ヒドロキシル側鎖を持つアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を持つ別のアミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）で置換され；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジン）で置換され；塩基性側鎖を持つアミノ酸は、塩基性（basis）側鎖を持つ別のアミノ酸（例えば、リシンおよびアルギニン）で置換され；酸性側鎖を持つアミノ酸は、酸性側鎖を持つ別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置換され；かつ／または、疎水性アミノ酸もしくは親水性アミノ酸は、別の疎水性アミノ酸もしくは親水性アミノ酸でそれぞれ置き換えらる。

「非保存的置換」は、有意に異なる側鎖特性を持つアミノ酸による、ポリペプチド中のアミノ酸の置換を指す。非保存的置換は、定義された基内というよりそれらの間のアミノ酸を使用してよく、（ａ）置換領域におけるペプチド骨格の構造（例えば、グリシンについてはプロリン）（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさに影響を及ぼす。限定ではなく例として、例示的な非保存的置換は、塩基性アミノ酸または脂肪族アミノ酸で置換されている酸性アミノ酸；小さいアミノ酸で置換されている芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸で置換されている親水性アミノ酸であってよい。

「欠失」は、参照ポリペプチドからの１つまたは複数のアミノ酸の除去による、ポリペプチドへの修飾を指す。欠失は、酵素活性を保持し、かつ／または改変Ｐ４５０−ＢＭ３酵素の改善された特性を保持しながら、１もしくはそれ超のアミノ酸、２もしくはそれ超のアミノ酸、５もしくはそれ超のアミノ酸、１０もしくはそれ超のアミノ酸、１５もしくはそれ超のアミノ酸、または２０もしくはそれ超のアミノ酸、アミノ酸の総数の最大１０％、または参照酵素を構成するアミノ酸の総数の最大２０％の除去を含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分に向けられてよい。種々の実施形態では、欠失は、連続セグメントを含んでもよいし、または不連続であってよい。

「挿入」は、参照ポリペプチドからの１つまたは複数のアミノ酸の付加による、ポリペプチドへの修飾を指す。挿入は、ポリペプチドの内部部分における、またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端へのものであってよい。挿入は、本明細書において使用される場合、当技術分野において公知のような融合タンパク質を含む。挿入は、アミノ酸の連続したセグメントであってもよいし、または自然発生ポリペプチド中のアミノ酸の１つもしくは複数によって分離されてもよい。

本明細書において交換可能に使用される「機能的断片」または「生物学的に活性な断片」は、アミノ末端および／もしくはカルボキシ末端の欠失（複数可）ならびに／または内部欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が、それと比較されている配列中の対応する位置（例えば、本発明の完全長の改変Ｐ４５０−ＢＭ３）と同一であり、完全長ポリペプチドの活性の実質的にすべてを保持する、ポリペプチドを指す。

「単離されたポリペプチド」は、それに自然に付随する他の夾雑物質、例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチドから実質的に分離されているポリペプチドを指す。該用語は、それらの自然発生環境または発現系（例えば、宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成）から除去または精製されたポリペプチドを包含する。組換えＰ４５０−ＢＭ３ポリペプチドは、細胞内に存在するか、細胞培地中に存在するか、または溶解物もしくは単離された調製物等の種々の形態で調製されてよい。そのため、一部の実施形態では、組換えＰ４５０−ＢＭ３ポリペプチドは、単離されたポリペプチドであってよい。

「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が、存在する優勢種である組成物を指し（すなわち、モル濃度基準または重量基準で、組成物中のあらゆる他の個々の高分子種よりも豊富である）、対象種が、モルまたは重量％で、存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを含む場合、概して実質的に精製された組成物である。しかしながら、一部の実施形態では、Ｐ４５０−ＢＭ３を含む組成物は、５０％未満（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％）純粋である（this）Ｐ４５０−ＢＭ３を含む。概して、実質的に純粋なＰ４５０−ＢＭ３組成物は、モルまたは重量％で、組成物中に存在するすべての高分子種の、約６０％またはそれ超、約７０％またはそれ超、約８０％またはそれ超、約９０％またはそれ超、約９５％またはそれ超、および約９８％またはそれ超を含む。一部の実施形態では、対象種は、精製されて本質的な均質性となり（すなわち、夾雑物質種は、従来の検出方法によって組成物中で検出できない）、ここで、組成物は、単一の高分子種から本質的になる。溶媒種、小分子（５００ダルトン未満）、および元素イオン種は、高分子種とはみなされない。一部の実施形態では、単離された組換えＰ４５０−ＢＭ３ポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。

「改善された酵素特性」は、参照Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドおよび／もしくは野生型Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドまたは別の改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドと比較して、任意の酵素特性における改善を呈する、改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドを指す。改善された特性は、タンパク質発現増加、熱活性増加、熱安定性増加、ｐＨ活性増加、安定性増加、酵素活性増加、基質特異性または親和性増加、比活性増加、基質または最終生成物阻害に対する抵抗性増加、化学的安定性増加、改善された化学選択性、改善された溶媒安定性、酸性ｐＨに対する耐性増加、タンパク質分解活性に対する耐性増加（すなわち、タンパク質分解に対する感受性低減）、凝集低減、溶解度増加、および温度プロファイル変更等の特性を含むがこれらに限定されない。

「酵素活性増加」または「触媒活性強化」は、参照Ｐ４５０−ＢＭ３酵素と比較した、比活性の増加（例えば、生成される生成物／時間／重量タンパク質）または基質から生成物へのパーセント変換の増加（例えば、指定された量のＰ４５０−ＢＭ３を使用する、指定された期間での出発量の基質から生成物へのパーセント変換）によって代表され得る、改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドの改善された特性を指す。酵素活性を決定するための例示的な方法は、実施例において提供される。Ｋ_ｍ、Ｖ_ｍａｘまたはｋ_ｃａｔの古典的な酵素特性を含む酵素活性に関する任意の特性が影響され得、これらの変化は、酵素活性増加をもたらし得る。酵素活性における改善は、Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドが得られた自然発生のＰ４５０−ＢＭ３または別の改変Ｐ４５０−ＢＭ３に比べて、対応する野生型酵素の約１．１倍の酵素活性から、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍またはそれ超もの酵素活性であってよい。

「変換」は、基質（複数可）から対応する生成物（複数可）への酵素的変換（または生体内変化）を指す。「パーセント変換」は、指定された条件下で期間内に生成物に変換される基質のパーセントを指す。故に、Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、特定の期間での基質から生成物への「パーセント変換」として表現され得る。

「ゼネラリスト（generalist）特性」を持つ酵素（または「ゼネラリスト酵素」）は、親配列と比較して、広範囲の基質について改善された活性を呈する酵素を指す。ゼネラリスト酵素は、考えられるすべての基質について改善された活性を必ずしも実証するものではない。特に、本発明は、親の遺伝子と比べて、広範囲の立体的および電子的に多様な基質について同様のまたは改善された活性を実証するという点で、ゼネラリスト特性を持つＰ４５０−ＢＭ３バリアントを提供する。加えて、本明細書において提供されるゼネラリスト酵素は、広範囲の多様なＡＰＩ様分子にわたって、代謝産物／生成物の生成を増加させるために、改善されるように改変した。

「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける、洗浄条件等のハイブリダイゼーション条件に関する。概して、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で実施され、続いて、可変であるがより高いストリンジェンシーの洗浄が実施される。用語「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、標的ポリヌクレオチドとの約９０％の同一性よりも大きい、標的ＤＮＡとの約６０％の同一性、好ましくは約７５％の同一性、約８５％の同一性を有する相補的核酸に標的ＤＮＡが結合することを可能にする条件を指す。例示的な中程度にストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、４２℃で洗浄することと同等の条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、概して、定義されたポリヌクレオチド配列のための溶液条件下で決定された通り、熱融解温度Ｔ_ｍから約１０℃またはそれ未満である条件を指す。一部の実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中、６５℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列だけのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（すなわち、ハイブリッドが、０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中、６５℃で安定でない場合、本明細書において企図されている通り、高ストリンジェンシー条件下で安定でない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２℃と同等の条件でのハイブリダイゼーション、続いて、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳ中、６５℃で洗浄することによって提供され得る。別の高ストリンジェンシー条件は、０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ中、６５℃でハイブリダイズさせること、および０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ中、６５℃で洗浄することと同等の条件で、ハイブリダイズさせることである。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、および中程度にストリンジェントな条件は、上記で引用した参考文献において記述されている。

「コドン最適化」は、目的の生物においてコードされたタンパク質がより効率的に発現されるような、特定の生物において優先的に使用されるものにタンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンにおける変更を指す。遺伝コードは、ほとんどのアミノ酸が「同義語」または「同義」コドンと呼ばれるいくつかのコドンによって代表されるという点で縮重しているが、特定の生物によるコドン使用は非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏っていることが周知である。このコドン使用バイアスは、所与の遺伝子、共通の機能または祖先起源の遺伝子、高度に発現されたタンパク質対低コピー数のタンパク質、および生物のゲノムの凝集タンパク質コーディング領域に関して、より高い可能性がある。一部の実施形態では、Ｐ４５０−ＢＭ３酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの最適な生成のためにコドン最適化され得る。

「制御配列」は、本明細書において、本出願のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要または有利である、すべての成分を含むことを指す。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとって、天然であっても外来性であってもよい。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列および転写ターミネーターを含むがこれらに限定されない。最低でも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。制御配列には、ポリペプチドをコードする核酸配列のコーディング領域との制御配列のライゲーションを容易にする特異的制限部位を導入することを目的として、リンカーが設けられていてよい。

「作動可能に連結した」は、本明細書において、制御配列が目的のポリヌクレオチドと相対的な位置に適切に置かれており（すなわち、機能的な関係で）、それにより、制御配列が、目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を導くまたは調節する配置（configuration）として定義されている。

「プロモーター配列」は、コーディング配列等、目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異体、短縮およびハイブリッドプロモーターを含む選択された宿主細胞における転写活性を示す任意の核酸配列であってよく、宿主細胞と同種または異種のいずれかである細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から取得されてよい。

「好適な反応条件」は、本出願のＰ４５０−ＢＭ３ポリペプチドが基質を所望の生成物化合物に変換することができる、酵素的変換反応溶液中の条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒等の範囲）を指す。例示的な「好適な反応条件」は、本出願において提供されており、実施例によって例証される。「化合物負荷」または「酵素負荷」におけるもののような「負荷」は、反応の開始時における反応混合物中の成分の濃度または量を指す。酵素的変換反応プロセスの文脈における「基質」は、Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドによって作用される化合物または分子を指す。酵素的変換プロセスの文脈における「生成物」は、基質に対するＰ４５０−ＢＭ３ポリペプチドの作用によって生じる化合物または分子を指す。

本明細書において使用される場合、用語「培養すること」は、任意の好適な条件（例えば、液体培地、ゲル培地または固体培地を使用すること）下における微生物細胞の集団の増殖を指す。

組換えポリペプチドは、当技術分野において公知である任意の好適な方法を使用して生成することができる。目的の野生型ポリペプチドをコードする遺伝子は、プラスミド等のベクター中でクローニングされ、Ｅ．ｃｏｌｉ等のような所望の宿主において発現され得る。組換えポリペプチドのバリアントは、当技術分野において公知である種々の方法によって産生することができる。実際に、当業者に周知の多種多様な異なる変異誘発技術がある。加えて、変異誘発キットも多くの商業的分子生物学サプライヤーから入手可能である。方法は、定義されたアミノ酸における特異的置換（部位特異的）、遺伝子の局所領域における特異的もしくはランダム変異（位置特異的）、または遺伝子全体にわたるランダム変異誘発（例えば、飽和変異誘発）を行うのに利用可能である。ＰＣＲを使用する一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、遺伝子合成、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、および化学的飽和変異誘発、または当技術分野において公知である任意の他の好適な方法を含むがこれらに限定されない、酵素バリアントを産生するための多数の好適な方法が、当業者に公知である。ＤＮＡおよびタンパク質工学に使用される方法の非限定的な例は、下記の特許：米国特許第６，１１７，６７９号、米国特許第６，４２０，１７５号、米国特許第６，３７６，２４６号、米国特許第６，５８６，１８２号、米国特許第７，７４７，３９１号、米国特許第７，７４７，３９３号、米国特許第７，７８３，４２８号および米国特許第８，３８３，３４６号において提供されている。バリアントが生成された後、これらを任意の所望の特性（例えば、高いもしくは増加した活性、または低いもしくは低減した活性、増加した熱的活性、増加した熱的安定性、および／または酸性ｐＨ安定性等）についてスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、「組換えＰ４５０−ＢＭ３ポリペプチド」（本明細書においては、「改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチド」、「バリアントＰ４５０−ＢＭ３酵素」および「Ｐ４５０−ＢＭ３バリアント」とも称される）が使用を見出している。

本明細書において使用される場合、「ベクター」は、ＤＮＡ配列を細胞に導入するためのＤＮＡ構築物である。一部の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ配列中でコードされるポリペプチドの好適な宿主における発現を実現することができる好適な制御配列に作動可能に連結した発現ベクターである。一部の実施形態では、「発現ベクター」は、宿主細胞において発現を駆動するために、ＤＮＡ配列（例えば、導入遺伝子）に作動可能に連結したプロモーター配列を有し、一部の実施形態では、転写ターミネーター配列も含む。

本明細書において使用される場合、用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの生成に関与する任意のステップを含む。一部の実施形態では、該用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。

本明細書において使用される場合、用語「生成する」は、細胞によるタンパク質および／または他の化合物の生成を指す。該用語は、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾を含むがこれらに限定されないポリペプチドの生成に関与する任意のステップを包含することが意図されている。一部の実施形態では、該用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。

本明細書において使用される場合、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列等）は、２つの配列が自然界では会合していない場合、それが作動可能に連結した別の配列と「異種」である。

本明細書において使用される場合、用語「宿主細胞」および「宿主株」は、本明細書において提供されるＤＮＡを含む発現ベクター（例えば、Ｐ４５０−ＢＭ３バリアントをコードするポリヌクレオチド）に好適な宿主を指す。一部の実施形態では、宿主細胞は、当技術分野において公知の組換えＤＮＡ技術を使用して構築されたベクターを用いて形質転換された、またはそれをトランスフェクトした、原核細胞または真核細胞である。

用語「類似体」は、参照ポリペプチドと、７０％超の配列同一性であるが１００％未満の配列同一性（例えば、７５％、７８％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超の配列同一性）を有するポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、類似体は、ホモアルギニン、オルニチンおよびノルバリンを含むがこれらに限定されない１つまたは複数の非自然発生アミノ酸残基、ならびに自然発生アミノ酸を含有するポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、類似体は、２つまたはそれ超のアミノ酸残基の間に１つまたは複数のＤ−アミノ酸残基および非ペプチド連結も含む。

用語「有効量」は、所望の結果をもたらすのに十分な量を意味する。当業者ならば、日常的な実験を使用することにより、有効量を決定することができる。

用語「単離された」および「精製された」は、それが自然に会合している少なくとも１つの他の成分から除去される、分子（例えば、単離された核酸、ポリペプチド等）または他の成分を指すために使用される。用語「精製された」は、絶対純度を必要とせず、むしろ相対的定義として意図されている。
改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチド：

一部の実施形態では、改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドは、改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチド（複数可）を生成するために助けとなる条件下、少なくとも１つの改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む微生物を培養することによって生成される。一部の実施形態では、改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドは、得られた培養培地および／または細胞から回収される。

本発明は、Ｐ４５０−ＢＭ３活性を有する例示的な改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチド（すなわち、Ｐ４５０−ＢＭ３バリアント）を提供する。実施例は、具体的なアミノ酸配列特色（specific amino acid sequence feature）を、改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドの機能活性と相関させる配列構造情報を示す表を提供する。この構造−機能相関情報は、実施例において示される通り、参照改変ポリペプチドと比べた具体的なアミノ酸残基差の形態で提供される。実施例は、例示的な改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドについての実験的に決定された活性データをさらに提供する。

一部の実施形態では、Ｐ４５０−ＢＭ３活性を有する本発明の改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドは、ａ）参照配列 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および／または１６と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；ｂ）１つまたは複数のアミノ酸位置において配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および／または１６と比較したアミノ酸残基差；ならびにｃ）参照配列と比較して、ｉ）触媒活性強化、ｉｉ）タンパク質分解感受性低減、ｉｉｉ）酸性ｐＨに対する耐性増加、ｉｖ）凝集低減、ｖ）ある範囲の基質に対する活性増加（すなわち、広い基質範囲を持つ酵素）、またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）もしくはｉｖ）のいずれかの組合せから選択される改善された特性を呈するものを含む。

一部の実施形態では、改善された特性を呈する改変Ｐ４５０−ＢＭ３は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および／または１６と、少なくとも約８５％、少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％のアミノ酸配列同一性、ならびに、１つまたは複数のアミノ酸位置において、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および／または１６と比較したアミノ酸残基差を有する（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および／もしくは１６と比較した、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、２０もしくはそれ超のアミノ酸位置、または、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および／もしくは１６と、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれ超のアミノ酸配列同一性を有する配列におけるもの等）。一部の実施形態では、１つまたは複数の位置における、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および／または１６と比較した残基差は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ超の保存的アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドは、表２〜９のいずれかに収載されているポリペプチドである。

一部の実施形態では、改善された特性を呈する改変Ｐ４５０−ＢＭ３は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および／または１６と、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。

一部の実施形態では、改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドは、本発明によって包含される改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドの機能的断片を含む。機能的断片は、それが由来する（from which is was derived）改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチド（すなわち、親の改変Ｐ４５０−ＢＭ３）の活性の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を有する。機能的断片は、改変Ｐ４５０−ＢＭ３の親配列の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％およびさらには９９％を含む。一部の実施形態では、機能的断片は、５未満、１０未満、１５未満、１０未満、２５未満、３０未満、３５未満、４０未満、４５未満、および５０未満のアミノ酸だけ短縮されている。
改善された活性を持つバリアント：

一部の実施形態では、Ｐ４５０−ＢＭ３活性を有する本発明の改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドは、ａ）参照配列 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および／もしくは１６と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはその断片；ｂ）１つまたは複数のアミノ酸位置において配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および／または１６と比較したアミノ酸残基差；ならびにｃ）配列番号２と比較して改善された活性を呈するものを含む。

一部の実施形態では、改善された活性を呈する改変Ｐ４５０−ＢＭ３は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および／または１６と、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ超のアミノ酸配列同一性、ならびに、１つまたは複数のアミノ酸位置において、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および／または１６と比較したアミノ酸残基差を有する（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および／もしくは１６と比較した、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、２０もしくはそれ超のアミノ酸位置、または、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および／もしくは１６と、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれ超のアミノ酸配列同一性を有する配列におけるもの等）。

一部の実施形態では、他のすべてのアッセイ条件が本質的に同じである場合、改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドは、参照Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドと比較して、改善された活性を有する。一部の実施形態では、この活性は、酵素の最大活性（例えば、ｋ_ｃａｔ）を評価するための任意の好適なアッセイシステムを使用して酵素活性をモニターする条件下で測定することができる。他の実施形態では、この活性は、基質濃度下で測定して、最大活性の２分の１、５分の１、１０分の１またはそれ未満をもたらすことができる。いずれかの分析方法下、改変ポリペプチドは、参照Ｐ４５０−ＢＭ３の酵素活性の、約１．０倍、１．５倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍またはそれ超の改善された活性レベルを有する。一部の実施形態では、改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドは、実施例において記述されているアッセイを含むがこれらに限定されない任意の標準的なアッセイによって測定した場合、参照Ｐ４５０−ＢＭ３と比較して改善された活性を有する。

本明細書において提供される指針を考慮して、例示的な改変ポリペプチドのいずれかを、例えば、本明細書において記述されている他のポリペプチドおよび他の残基位置からの種々のアミノ酸差の新たな組合せを付加することによる進化のその後の段階によって、他の改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドを合成するための出発アミノ酸配列として使用できることがさらに企図される。進化の初期段階を通して不変のまま維持された残基位置におけるアミノ酸差を含むことにより、さらなる改善を生じさせ得る。
改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞：

本発明は、本明細書において記述されている改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作成するように遺伝子発現を制御する１つまたは複数の異種調節配列に作用的に（operatively）連結している。改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、対応するＰ４５０−ＢＭ３ポリペプチドを発現することができる。

当業者には明らかであるように、タンパク質配列の利用可能性および種々のアミノ酸に対応するコドンの知識は、主題のポリペプチドをコードすることができるすべてのポリヌクレオチドの説明を提供する。遺伝コードの縮重は、同じアミノ酸が代替または同義コドンによってコードされる場合、極めて多数の核酸を作製させ、そのすべてが、改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドをコードする。故に、特定のアミノ酸配列の知識を有して、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変更しない手法で１つまたは複数のコドンの配列を単に修飾することにより、任意の数の異なる核酸を作製し得る。これに関して、本発明は、考えられるコドン選択に基づいて組合せを選択することにより、本明細書において記述されているポリペプチドをコードさせることができるポリヌクレオチドのありとあらゆる考えられる変形形態を具体的に企図しており、すべてのそのような変形形態は、表２〜９において提供されるバリアント、ならびに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および／または１６を含む本明細書において記述されている任意のポリペプチドについて、具体的に開示されているとみなすべきである。

種々の実施形態では、コドンは、好ましくは、タンパク質が生成されている宿主細胞に適合するように選択される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは、細菌において発現のために使用される。結果として、改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、好ましいコドンを、完全長コーディング領域のコドン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％超で含有する。

一部の実施形態では、上述した通り、ポリヌクレオチドは、本明細書において開示されている特性を持つＰ４５０−ＢＭ３活性を有する改変ポリペプチドをコードし、ここで、ポリペプチドは、参照配列（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および／または１６）と、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ超の同一性を有するアミノ酸配列、または、表２〜９のいずれかにおいて開示されている通りの任意のバリアントのアミノ酸配列、ならびに、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および／もしくは１６の参照ポリペプチド、または、表２〜９のいずれかにおいて開示されている通りの任意のバリアントのアミノ酸配列と比較した１つまたは複数の残基差（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ超のアミノ酸残基位置）を含む。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および／または１６から選択される。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３および／もしくは１５から選択される参照ポリヌクレオチド配列またはその相補体、あるいは本明細書において提供されるバリアントＰ４５０−ＢＭ３ポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる。一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および／または１６と比較して１つまたは複数の残基差を有するアミノ酸配列を含むＰ４５０−ＢＭ３ポリペプチドをコードする。

一部の実施形態では、本明細書において提供される改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を提供する多様な手法で操作される。一部の実施形態では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターとして提供され、ここで、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を調節するために１つまたは複数の制御配列が存在する。単離されたポリヌクレオチドの、ベクターへのその挿入前の操作は、発現ベクターに応じて、望ましいまたは必要なものとなり得る。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾するための技術は、当技術分野において周知である。

一部の実施形態では、制御配列は、数ある配列の中でも、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターを含む。当技術分野において公知の通り、好適なプロモーターは、使用される宿主細胞に基づいて選択することができる。細菌宿主細胞について、本出願の核酸構築物の転写を導くための好適なプロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉラクトースオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子ならびに原核生物のベータ−ラクタマーゼ遺伝子から取得されるプロモーター（例えば、Villa-Kamaroffら、Proc. Natl Acad. Sci. USA ７５巻：３７２７〜３７３１頁［１９７８年］を参照）、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、DeBoerら、Proc. Natl Acad. Sci. USA ８０巻：２１〜２５頁［１９８３年］を参照）を含むがこれらに限定されない。糸状菌宿主細胞のための例示的なプロモーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ酸安定性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から取得されるプロモーター（例えば、ＷＯ９６／００７８７を参照）、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、ならびにそれらの変異体、短縮およびハイブリッドプロモーターを含む。例示的な酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子由来のものであってよい（can be from the genes can be from the genes）。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、当技術分野において公知である（例えば、Romanosら、Yeast ８巻：４２３〜４８８頁［１９９２年］を参照）。

一部の実施形態では、制御配列は、転写を終了させるために宿主細胞によって認識される配列である、好適な転写ターミネーター配列である。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結している。選択された宿主細胞において機能的である任意のターミネーターは、本発明における使用を見出している。例えば、糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から取得することができる。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシトクロムＣ（ＣＹＣ１）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から取得することができる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、当技術分野において公知である（例えば、Romanosら、上記を参照）。

一部の実施形態では、制御配列は、宿主細胞による翻訳のために重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である、好適なリーダー配列である。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結している。選択された宿主細胞において機能的である任意のリーダー配列が使用され得る。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から取得される。酵母宿主細胞のための好適なリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から取得されるものを含むがこれらに限定されない。

制御配列は、核酸配列の３’末端に作動可能に連結しており、転写されると、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして宿主細胞によって認識される配列である、ポリアデニル化配列であってもよい。選択された宿主細胞において機能的である任意のポリアデニル化配列が本発明において使用され得る。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼの遺伝子由来のものを含むがこれらに限定されない。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列も、当技術分野において公知である（例えば、GuoおよびSherman、Mol. Cell. Bio.、１５巻：５９８３〜５９９０頁［１９９５年］を参照）。

一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結したアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に導く、シグナルペプチドコーディング領域である。核酸配列のコーディング配列の５’末端は、分泌されたポリペプチドをコードするコーディング領域のセグメントと翻訳リーディングフレーム中で自然に連結したシグナルペプチドコーディング領域を本質的に含有し得る。代替として、コーディング配列の５’末端は、コーディング配列にとって外来性のシグナルペプチドコーディング領域を含有し得る。発現したポリペプチドを選択された宿主細胞の分泌経路に導く任意のシグナルペプチドコーディング領域は、本明細書において提供される改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドの発現のための使用を見出している。細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコーディング領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＮＣｌＢ １１８３７マルトジェニックアミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルファ−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓベータ−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｒｓＡの遺伝子から取得されるシグナルペプチドコーディング領域を含むがこれらに限定されない。さらなるシグナルペプチドは、当技術分野において公知である（例えば、SimonenおよびPalva、Microbiol. Rev.、５７巻：１０９〜１３７頁［１９９３年］を参照）。糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコーディング領域は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼおよびＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から取得されるシグナルペプチドコーディング領域を含むがこれらに限定されない。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子由来のものを含むがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置付けられたアミノ酸配列をコードするプロペプチドコーディング領域である。結果として得られたポリペプチドは、一部の場合において、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」または「チモーゲン」と称される。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断によって、成熟活性ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコーディング領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼおよびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼの遺伝子を含むがこれらに限定されない（例えば、ＷＯ９５／３３８３６を参照）。シグナルペプチド領域およびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の隣に位置付けられ、シグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置付けられる。

一部の実施形態では、調節配列も利用される。これらの配列は、宿主細胞の増殖と関係してポリペプチドの発現の調節を容易にする。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応答して、遺伝子の発現をオンまたはオフにするものである。原核生物宿主細胞において、好適な調節配列は、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーター系を含むがこれらに限定されない。酵母宿主細胞において、好適な調節系は、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系を含むがこれらに限定されない。糸状菌において、好適な調節配列は、ＴＡＫＡアルファ−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーターおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターを含むがこれらに限定されない。

別の態様では、本発明は、改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに、それらが導入される宿主の種類に応じて、プロモーターおよびターミネーター等の１つまたは複数の発現調節領域、複製起点等を含む、組換え発現ベクターも提供する。一部の実施形態では、上述した種々の核酸および制御配列を一緒に結合させて、１つまたは複数の好都合な制限部位を含み、そのような部位においてバリアントＰ４５０−ＢＭ３ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にする、組換え発現ベクターを生成する。代替として、本発明のポリヌクレオチド配列（複数可）は、ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物を、発現のための適切なベクターに挿入することによって発現される。発現ベクターを作成する際、コーディング配列は、コーディング配列が発現のための適切な制御配列と作動可能に連結するようにベクター中に置く。

組換え発現ベクターは、任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であってよく、これは、好都合なことに組換えＤＮＡ手順に供することができ、バリアントＰ４５０−ＢＭ３ポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる。ベクターの選択は、典型的には、ベクターと該ベクターが導入される宿主細胞との適合性によって決まる。ベクターは、線状プラスミドまたは閉環状プラスミドであってよい。

一部の実施形態では、発現ベクターは、自律複製ベクター（すなわち、その複製が染色体の複製とは無関係である、プラスミド、染色体外エレメント、微小染色体または人工染色体等の、染色体外エンティティとして存在するベクター）である。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有し得る。一部の代替的な実施形態では、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）と一緒に複製されるものであってよい。さらに、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを一緒に含有する単一のベクターもしくはプラスミドまたは２つもしくはそれ超のベクターもしくはプラスミド、あるいはトランスポゾンが使用され得る。

一部の実施形態では、発現ベクターは、好ましくは、１つまたは複数の選択可能マーカーを含有し、これは、形質転換細胞の簡単な選択を可能にする。「選択可能マーカー」は、その生成物が、殺生物剤またはウイルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、栄養要求株への原栄養性等を提供する遺伝子である。細菌選択可能マーカーの例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、または、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン抵抗性等の抗生物質抵抗性を付与するマーカーを含むがこれらに限定されない。酵母宿主細胞のための好適なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３を含むがこれらに限定されない。糸状菌宿主細胞において使用するための選択可能マーカーは、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニリルトランスフェラーゼ（sulfate adenyltransferase））およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにそれらの同等物を含むがこれらに限定されない。別の態様では、本発明は、本出願の少なくとも１つの改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、該ポリヌクレオチドが、該宿主細胞中における改変Ｐ４５０−ＢＭ３酵素（複数可）の発現のために１つまたは複数の制御配列に作用的に連結している、宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによってコードされるポリペプチドを発現するのに使用するための宿主細胞は、当技術分野において周知であり、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞等の細菌細胞；酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ［ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８］）等の真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞等の昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞等の動物細胞；ならびに植物細胞を含むがこれらに限定されない。例示的な宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株（Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）およびＢＬ２１等）である。

したがって、別の態様では、本発明は、改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドを生成するための方法であって、改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を、ポリペプチドの発現に好適な条件下で、培養するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、本明細書において記述されている通りのＰ４５０−ＢＭ３ポリペプチドを単離するおよび／または精製するステップをさらに含む。

上述した宿主細胞のための適切な培養培地および増殖条件は、当技術分野において周知である。Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドの発現のためのポリヌクレオチドは、当技術分野において公知である種々の方法によって細胞に導入され得る。技術は、数ある中でも、エレクトロポレーション、パーティクルガン法（biolistic particle bombardment）、リポソーム媒介性トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクションおよびプロトプラスト融合を含む。

本明細書において開示されている特性を持つ改変Ｐ４５０−ＢＭ３は、自然発生または改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当技術分野において公知であり、本明細書において記述されている通りの、変異誘発および／または指向性進化法に供することによって取得することができる。例示的な指向性進化技術は、変異誘発および／またはＤＮＡシャッフリングである（例えば、Stemmer、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９１巻：１０７４７〜１０７５１頁［１９９４年］；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号を参照）。使用され得る他の指向性進化手順は、数ある中でも、互い違い伸長プロセス（staggered extension process）（ＳｔＥＰ）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え（例えば、Zhaoら、Nat. Biotechnol.、１６巻：２５８〜２６１頁［１９９８年］を参照）、変異誘発性ＰＣＲ（例えば、Caldwellら、PCR Methods Appl.、３巻：Ｓ１３６〜Ｓ１４０頁［１９９４年］を参照）、およびカセット変異誘発（例えば、Blackら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９３巻：３５２５〜３５２９頁［１９９６年］を参照）を含む。

例えば、変異誘発および指向性進化法は、発現し、スクリーニングし、アッセイすることができるバリアントライブラリーを作成するために、ポリヌクレオチドに容易に適用することができる。変異誘発および指向性進化法は、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８３０，７２１号、同第６，１３２，９７０号、同第６，４２０，１７５号、同第６，２７７，６３８号、同第６，３６５，４０８号、同第６，６０２，９８６号、同第７，２８８，３７５号、同第６，２８７，８６１号、同第６，２９７，０５３号、同第６，５７６，４６７号、同第６，４４４，４６８号、同第５，８１１２３８号、同第６，１１７，６７９号、同第６，１６５，７９３号、同第６，１８０，４０６号、同第６，２９１，２４２号、同第６，９９５，０１７号、同第６，３９５，５４７号、同第６，５０６，６０２号、同第６，５１９，０６５号、同第６，５０６，６０３号、同第６，４１３，７７４号、同第６，５７３，０９８号、同第６，３２３，０３０号、同第６，３４４，３５６号、同第６，３７２，４９７号、同第７，８６８，１３８号、同第５，８３４，２５２号、同第５，９２８，９０５号、同第６，４８９，１４６号、同第６，０９６，５４８号、同第６，３８７，７０２号、同第６，３９１，５５２号、同第６，３５８，７４２号、同第６，４８２，６４７号、同第６，３３５，１６０号、同第６，６５３，０７２号、同第６，３５５，４８４号、同第６，３０３，３４４号、同第６，３１９，７１３号、同第６，６１３，５１４号、同第６，４５５，２５３号、同第６，５７９，６７８号、同第６，５８６，１８２号、同第６，４０６，８５５号、同第６，９４６，２９６号、同第７，５３４，５６４号、同第７，７７６，５９８号、同第５，８３７，４５８号、同第６，３９１，６４０号、同第６，３０９，８８３号、同第７，１０５，２９７号、同第７，７９５，０３０号、同第６，３２６，２０４号、同第６，２５１，６７４号、同第６，７１６，６３１号、同第６，５２８，３１１号、同第６，２８７，８６２号、同第６，３３５，１９８号、同第６，３５２，８５９号、同第６，３７９，９６４号、同第７，１４８，０５４号、同第７，６２９，１７０号、同第７，６２０，５００号、同第６，３６５，３７７号、同第６，３５８，７４０号、同第６，４０６，９１０号、同第６，４１３，７４５号、同第６，４３６，６７５号、同第６，９６１，６６４号、同第７，４３０，４７７号、同第７，８７３，４９９号、同第７，７０２，４６４号、同第７，７８３，４２８号、同第７，７４７，３９１号、同第７，７４７，３９３号、同第７，７５１，９８６号、同第６，３７６，２４６号、同第６，４２６，２２４号、同第６，４２３，５４２号、同第６，４７９，６５２号、同第６，３１９，７１４号、同第６，５２１，４５３号、同第６，３６８，８６１号、同第７，４２１，３４７号、同第７，０５８，５１５号、同第７，０２４，３１２号、同第７，６２０，５０２号、同第７，８５３，４１０号、同第７，９５７，９１２号、同第７，９０４，２４９号およびすべての関連する米国以外の対応物；Lingら、Anal. Biochem.、２５４巻：１５７〜７８頁［１９９７年］；Daleら、Meth. Mol. Biol.、５７巻：３６９〜７４頁［１９９６年］；Smith、Ann. Rev. Genet.、１９巻：４２３〜４６２頁［１９８５年］；Botsteinら、Science、２２９巻：１１９３〜１２０１頁［１９８５年］；Carter、Biochem. J.、２３７巻：１〜７頁［１９８６年］；Kramerら、Cell、３８巻：８７９〜８８７頁［１９８４年］；Wellsら、Gene、３４巻：３１５〜３２３頁［１９８５年］；Minshullら、Curr. Op. Chem. Biol.、３巻：２８４〜２９０頁［１９９９年］；Christiansら、Nat. Biotechnol.、１７巻：２５９〜２６４頁［１９９９年］；Crameriら、Nature、３９１巻：２８８〜２９１頁［１９９８年］；Crameriら、Nat. Biotechnol.、１５巻：４３６〜４３８頁［１９９７年］；Zhangら、Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.、９４巻：４５０４〜４５０９頁［１９９７年］；Crameriら、Nat. Biotechnol.、１４巻：３１５〜３１９頁［１９９６年］；Stemmer、Nature、３７０巻：３８９〜３９１頁［１９９４年］；Stemmer、Proc. Nat. Acad. Sci. USA、９１巻：１０７４７〜１０７５１頁［１９９４年］；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７；ＷＯ２００９／１５２３３６ならびに米国特許第６，５３７，７４６号を参照されたく、これらはいずれも、参照により本明細書に組み込まれる）。

一部の実施形態では、変異誘発処理の後に取得された酵素クローンは、酵素を定義された温度（または、広範囲の基質にわたって酵素の活性を試験すること等の他のアッセイ条件）に供し、熱処理または他のアッセイ条件後に残った酵素活性の量を測定することによってスクリーニングする。次いで、Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンの配列を決定して、ヌクレオチド配列の変更（もしあれば）を同定し、宿主細胞において酵素を発現するために使用する。発現ライブラリーから酵素活性を測定することは、当技術分野において公知である任意の好適な方法（例えば、ＨＰＬＣ分析等の標準的な生化学技術）を使用して実施され得る。

公知の配列の改変ポリペプチドについて、酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知の合成法に従う標準的な固相法によって調製され得る。一部の実施形態では、最大約１００塩基の断片を個々に合成し、次いで結合させて（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション法、またはポリメラーゼ媒介性方法によって）、任意の所望の連続配列を形成することができる。例えば、本明細書において開示されているポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、典型的には自動化された合成法において実践されるような、古典的なホスホラミダイト法を使用する化学合成によって調製することができる（例えば、Beaucageら、Tetra. Lett.、２２巻：１８５９〜６９頁［１９８１年］；およびMatthesら、EMBO J.、３巻：８０１〜０５頁［１９８４年］参照）。ホスホラミダイト法に従って、オリゴヌクレオチドを合成し（例えば、自動ＤＮＡ合成装置で）、精製し、アニーリングし、ライゲーションし、適切なベクター中でクローニングする。

したがって、一部の実施形態では、改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）表２〜９のいずれかにおいて提供される任意のバリアントのアミノ酸配列、ならびに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および／または１６から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされるＰ４５０−ＢＭ３ポリペプチドを発現するステップとを含み得る。方法の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列は、１つまたはいくつか（例えば、最大３、４、５、または最大１０）のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を任意選択で有し得る。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択で、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、または１〜５０のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、または５０のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を有する。一部の実施形態では、置換は、保存的置換または非保存的置換であってよい。

発現された改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドを、任意の所望の改善された特性（例えば、活性、選択性、安定性、酸耐性、プロテアーゼ感受性等）について、本明細書において記述されているアッセイおよび条件を含むがこれらに限定されない当技術分野において公知である任意の好適なアッセイを使用して、測定することができる。

一部の実施形態では、宿主細胞において発現する改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドのいずれかを、細胞および／または培養培地から、数ある中でも、リゾチーム処理、音波処理、濾過、塩析、超遠心分離およびクロマトグラフィーを含むタンパク質精製のための周知の技術の任意の１つまたは複数を使用して回収する。

Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィ技術は、数ある中でも、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動および親和性クロマトグラフィーを含む。特定の酵素を精製するための条件は、部分的に、正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状等の要因等によって決まり、当業者には明らかである。一部の実施形態では、親和性技術は、改善されたバリアントＰ４５０−ＢＭ３酵素を単離するために使用され得る。親和性クロマトグラフィー精製を利用する一部の実施形態では、バリアントＰ４５０−ＢＭ３ポリペプチドを特異的に結合する任意の抗体が使用を見出している。抗体の生成のために、ウサギ、マウス、ラット等を含むがこれらに限定されない種々の宿主動物を、Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチド（例えば、Ｐ４５０−ＢＭ３バリアント）またはその断片の注射によって免疫する。一部の実施形態では、Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドまたは断片は、側鎖官能基、または側鎖官能基に結合しているリンカーを利用して、ＢＳＡ等の好適なキャリアに結合させる。

一部の実施形態では、改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドは、宿主細胞において、本明細書において記述されている通りの改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株）を、改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で培養するステップと、細胞および／または培養培地から改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドを回収するステップとを含む方法によって、生成させる。

一部の実施形態では、改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドは、組換え宿主細胞または細胞培養物から回収され、当技術分野において公知である任意の好適な方法（複数可）によってさらに精製される。一部の追加の実施形態では、精製されたＰ４５０−ＢＭ３ポリペプチドを他の原料（ingredient）および化合物と組み合わせて、異なる用途および使用に適切な改変Ｐ４５０−ＢＭ３ポリペプチドを含む組成物および製剤（例えば、医薬組成物）を提供する。

本発明の前述および他の態様は、下記の非限定的な例との関連で、よりよく理解され得る。例は、例証のみを目的として提供され、本発明の範囲をいかようにも限定することは意図されていない。
実験

実験および達成された結果を含む下記の実施例は、例証のみを目的として提供され、本発明を限定するものとして解釈すべきではない。

以下の実験の開示では、下記の略語が適用される：ｐｐｍ（百万分率）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈおよびｈｒ（時間）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（毎分回転数）；℃（摂氏温度）；ＣＤＳ（コーディング配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＮＡ（核酸；ポリヌクレオチド）；ＡＡ（アミノ酸；ポリペプチド）；Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（一般に使用される実験室Ｅ．ｃｏｌｉ株、Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ［ＣＧＳＣ］、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴから入手可能）；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）；ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）；ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）；ＩＰＴＧ（イソプロピルベータ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）；ＰＭＢＳ（硫酸ポリミキシンＢ）；ＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）；ＧＤＨ（グルコースデヒドロゲナーゼ）；ＴＯＮ（ターンオーバー数）；ＦＩＯＰＣ（陽性対照に対する改善倍率（fold improvement over positive control））；ＴＯＮ（ターンオーバー数）；ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）；ＬＢ（ルリアブロス）；ＴＢ（テリフィックブロス）；ＭｅＯＨ（メタノール）；Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｔｈｅｎｓ、ＧＡ）；ＰｒｏＳｐｅｃ（ＰｒｏＳｐｅｃ Ｔａｎｙ Ｔｅｃｈｎｏｇｅｎｅ、Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；Ｒａｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒａｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｙｏｎｋｅｒｓ、ＮＹ）；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．（Ｐａｌｌ，Ｃｏｒｐ．、Ｐｔ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ ＭＡ）；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＬＬＣ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）；Ｋｕｈｎｅｒ（Ａｄｏｌｆ Ｋｕｈｎｅｒ、ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．の一部、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；Ｆｉｓｈｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）；Ｗａｔｅｒｓ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）；Ｐｉｅｒｃｅ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（現在はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）；Ｏｐｔｉｍａｌ（Ｏｐｔｉｍａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ、Ｂｅｌｍｏｎｔ、ＣＡ）；ならびにＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）。

（実施例１）
Ｐ４５０−ＢＭ３進化および発現ベクターの構築
Ｐ４５０−ＢＭ３バリアントのライブラリーは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および１６の８つの親配列に基づき、当技術分野において公知の標準的な方法を使用して生成した。これらの親株は、有益な多様性を組み換えることによってコンビナトリアルライブラリーを作成するために使用した。これらの親骨格株（parental backbone strain）およびそれらの配列ＩＤを以下の表１に収載し、最初にポリヌクレオチド配列を、続いてポリペプチド配列を収載する。

これらのバリアントを、ＩＰＴＧ誘導ベクター中にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１に形質転換し、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）を補充したＬＢ寒天プレートに蒔いた。プレートを３７℃で１６時間にわたって増殖させた後、単一のクローンを採取し、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）を補充したＬＢ培地（２５０μＬ／ウェル）を含有する９６ウェルＡｘｙｇｅｎ（登録商標）プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に添加した。プレートを、２５０ｒｐｍ、３０℃および８５％湿度で２０〜２４時間にわたって振とうして、培養物を飽和まで増殖させた後、アリコート（５０μＬ）を使用して、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）、微量元素溶液（７４０ｕｇ／Ｌのモリブデン酸アンモニウム四水和物、５．８ｍｇｓ／Ｌの硫酸亜鉛七水和物、６２０ｕｇ／Ｌの無水ホウ酸、１ｍｇ／Ｌの硫酸銅五水和物および４ｍｇｓ／Ｌの塩化マンガン四水和物）、および０．０５ｇ／Ｌのクエン酸アンモニウム鉄（ＩＩＩ）を補充したＴＢ培地（９００μＬ）を含有する２ｍＬの９６ウェルＣｏｓｔａｒ（登録商標）ディーププレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に接種した。２５０ｒｐｍ、３０℃および８５％湿度で０．８〜１．２のＯＤ_６００まで振とうした後、ＩＰＴＧ（５００ｕＭ）およびヘム前駆体５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）を５００ｕＭの最終濃度まで添加することにより、Ｐ４５０発現を誘導した。培養物を、２５０ｒｐｍ、２６℃、８５％湿度で２４時間にわたって振とうした後、細胞を遠心分離し、−８０℃で貯蔵した。

細胞溶解は、リン酸カリウム、ｐＨ８．０（１００ｍＭ）、ＭｇＳＯ_４（１０ｍＭ）、ＤＴＴ（１ｍＭ）、リゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ）、ＰＭＢＳ（０．５ｍｇ／ｍＬ）およびＤＮＡｓｅＩ（３μｇ／ｍＬ）を含有する溶解緩衝液（３００μＬ／ウェル）を加えた９６ウェルＣｏｓｔａｒ（登録商標）プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、細胞ペレットを再懸濁することによって遂行した。テーブルトップシェーカー（設定８〜１０）を使用して、溶解反応物を室温で１．２５時間にわたって振とうした。溶解反応物を遠心分離してペレット細胞破片とし、上清を、実施例２に記述されている活性アッセイにおいて使用した。

凍結乾燥タンパク質粉末の生成のために、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）を補充したＬＢ寒天プレートに、ＩＰＴＧ誘導ベクター中、所望のＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ｐ４５０−ＢＭ３バリアントを含有するＥ．ｃｏｌｉを画線した。プレートを３７℃で１６時間にわたって増殖させた後、単一のクローンを選択して、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）を補充したＴＢ培地（３ｍＬ）を含有する１５ｍＬのＦａｌｃｏｎ（商標）チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ）に接種した。チューブを、２００ｒｐｍ、３０℃および８５％湿度で２０〜２４時間にわたって振とうして、培養物を飽和まで増殖させた。次いで、２．５ｍＬの終夜培養物を使用して、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）、微量元素溶液（上述した通り）および０．０５ｇ／Ｌのクエン酸アンモニウム鉄（ＩＩＩ）を補充したＴＢ培地（２５０ｍＬ）を含有する滅菌１Ｌフラスコに接種した。２５０ｒｐｍ、３０℃および８５％湿度で０．８〜１．２のＯＤ_６００まで振とうした後、ＩＰＴＧ（５００ｕＭ）およびヘム前駆体５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）を５００ｕＭの最終濃度まで添加することにより、Ｐ４５０発現を誘導した。培養物を、追加の２０〜２４時間にわたって増殖させ、予め秤量した２５０ｍＬの遠心分離ボトル中、４０００ｒｐｍ、４℃で２０分間にわたって遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを含有する遠心分離ボトルを秤量した。ペレットを、２ｍＭのＤＴＴを加えた５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８．０（細胞ペレット１グラム当たり５ｍＬの緩衝液）に再懸濁した。マイクロフルイダイザーホモジナイザーを使用して細胞を溶解させ、細胞の懸濁物および溶解物を滅菌５０ｍＬ遠心分離チューブ中に収集した。試料を、１０，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間にわたって遠心分離した。澄んだ溶解物をプラスチックペトリ皿に収集し、凍結乾燥前に−８０℃で冷凍した。当技術分野において公知の標準的な方法を使用して、酵素含有溶解物を凍結乾燥した。
（実施例２）
アッセイシステムおよび結果

この実施例において、活性およびゼネラリスト特性（すなわち、広い基質範囲にわたる活性）を評価するために使用した試験システムを記述する。
Ｉ．酵素活性についての活性ベースのハイスループットスクリーニング（ＨＴＰ）：

ジクロフェナク（図１を参照）は、改善された活性を持つバリアントを検出するためのハイスループット（ＨＴＰ）スクリーニングアッセイ用の基質として使用した。酵素活性スクリーニングは、６０μＬの溶解物および１２０μＬの反応混合物を、９６ウェル（２ｍＬ）プレートの各ウェルに添加することによって開始した。反応混合物は、再利用システム（１２０ｍＭのリン酸カリウム、１．２ｍＭのＮＡＤＰ＋、３０ｍＭのグルコースおよび０．６ｍｇ／ｍＬのグルコースデヒドロゲナーゼ）、共溶媒（７．５％ＤＭＳＯ）、および基質（３ｍＭのジクロフェナク）を含有していた。反応物を、２５０ｒｐｍ、３０℃、８５％湿度で４〜２４時間にわたって振とうした。各ウェルへのアセトニトリル（４００μＬから１ｍｌ）の添加によって、反応物をクエンチした。クエンチされた反応物を遠心分離して、沈殿したタンパク質を除去した後、後述する通り、ＨＰＬＣおよびＬＣＭＳで分析した。
ＩＩ．ゼネラリスト特性の検証：

酵素ストック（約１２μＭ）は、約２０ｍｇの各酵素を、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０（１ｍＬ）に溶解することによって調製した。各酵素ストック溶液の濃度をＵＶ可視吸収分光法によって決定し（微粒子を除去するための遠心分離後）、希釈して１２μＭのヘムタンパク質で標準化した。基質溶液は、各基質をＤＭＳＯに、２０ｍＭまたは４０ｍＭの最終濃度に到達するまで溶解することによって調製した。反応混合物（２３５μＬ）、続いて酵素溶液（５０μＬ）をプレートに添加した。基質ストック溶液を酵素溶液（２つの異なる濃度で１５μＬ）に添加した。各反応物は、１００ｍＭのリン酸カリウム、１．０ｍＭのＮＡＤＰ＋、２５ｍＭのグルコース、０．５ｍｇ／ｍＬのグルコースデヒドロゲナーゼ、５％ＤＭＳＯおよび１または２ｍＭの基質を含有していた。改善されたＢＭ３バリアントを検証するための基質としてジクロフェナクに加えて、ロラタジン、イマチニブおよびゲフィチニブ（図１を参照）を選択した。反応物を、４５０ｒｐｍ、３０℃で２４時間かけて振とうした。すべての反応物を、アセトニトリルで０．５ｍＭの基質の最終濃度に希釈した。次いで、プレートを、３，０００ｇ、２０℃で１時間にわたって遠心分離した。上清をアセトニトリルで１：１に希釈し、０．４ミクロンフィルターを使用して濾過し、ＵＰＬＣ−ＭＳによって分析した。
ＩＩＩ．ＨＰＬＣ、ＬＣＭＳおよびＵＰＬＣ−ＭＳ分析：

ＨＰＬＣおよびＬＣＭＳ分析のために、１５０μＬの各クエンチされた反応試料を、オートサンプラーを備えたＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２００シリーズでのＨＰＬＣによる分析のため９６ウェル丸底プレートに移した。１０μＬのクエンチされた試料を、Ｏｎｙｘ Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ Ｃ１８カラム（２×５０ｍｍ）に注入した。カラムを０．５ｍＬ／分の一定流速で溶離し；反応の生成物を溶離するために使用した溶媒Ａ（０．１％ギ酸ｖ／ｖ、Ｈ_２Ｏ中）および溶媒Ｂ（０．１％ギ酸ｖ／ｖ、アセトニトリル中）を用いる条件は：０〜１分、Ａ／Ｂ ９０：１０；１〜２分、Ａ／Ｂ ８０：２０；２〜４分、Ａ／Ｂ ７０：３０；４〜４．５分、Ａ／Ｂ ６０：４０；４．５〜４．９分、Ａ／Ｂ １０：９０、および４．９〜５．３分、Ａ／Ｂ ９０：１０であった。カラム溶離液を、２７０ｎｍのＵＶによってモニターした。代替として、一部の基質について、ＬＣ−ＵＶ−ＭＳによる分析を、試料分離のためのＳｕｒｖｅｙｏｒ Ｐｌｕｓ ＬＣ−ＰＤＡシステムを使用するＴｈｅｒｍｏ ＬＸＱイオントラップシステムで、実施した。クエンチされた試料（０．０１ｍｌ）を、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（３×５０ｍｍ、５μ）に注入した。カラムを０．５ｍＬ分の一定流速で溶離し；反応の生成物を溶離するために使用した溶媒Ａ（０．１％ギ酸ｖ／ｖ、Ｈ_２Ｏ中）および溶媒Ｂ（０．１％ギ酸ｖ／ｖ、アセトニトリル中）を用いる条件は：０〜１．５分、Ａ／Ｂ ９０：１０；１．５〜５．５分、Ａ／Ｂ ２０：８０；５．５〜６．０分、Ａ／Ｂ １：９９；６．０〜６．２５分、Ａ／Ｂ ９０：１０；６．２５〜７．５分、Ａ／Ｂ ９０：１０であった。カラム溶離液を、ＰＤＡ（２００〜６００ｎｍ）によってモニターした後、ポジティブＥＳＩモード（キャピラリー温度３５０℃、５ｋＶスプレー電圧）でＭＳ分析した。カラム溶離液は、ランの最初の１．５分間にわたって廃棄物とした。ＬＣランの残りについて、ＭＳ（ｍ／ｚ１２５〜１０００走査範囲）およびＭＳ／ＭＳの両方を収集した。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、データ依存性様式で、ｎ番目の最も強いイオンについて、５回目の出現後に優勢（dominate）イオンの動的排除を用い、３０秒の排除期間で獲得した。データは、基質および生成物ベースピークのためのＸｃａｌｉｂｕｒソフトウェアならびにＭＳ／ＭＳ遷移を使用して分析した。

ＵＰＬＣ−ＭＳ分析のために、クエンチおよび濾過された反応物を、オートサンプラーを備えたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＨクラスシステムでのＵＰＬＣによる分析のため９６ウェルＨＴＰプレートに移した。１ｕＬのクエンチされた試料を、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３カラム、１００Å（１．８ｕｍ；２．１×１００ｍｍ）に注入した。カラムを０．６ｍＬ分の一定流速で溶離し；反応の生成物を溶離するために使用した溶媒Ａ（０．０５％トリフルオロ酢酸ｖ／ｖ、Ｈ_２Ｏ中）および溶媒Ｂ（０．０５％トリフルオロ酢酸ｖ／ｖ、アセトニトリル中）を用いる条件は：０〜２分、Ａ／Ｂ ９５：５；２〜２．９分、Ａ／Ｂ ５：９５；２．９〜３分、Ａ／Ｂ ９５：５；３〜３．５分、Ａ／Ｂ ９５：５であった。カラム溶離液を、ＰＤＡ（２００〜６００ｎｍ）によってモニターした後、ポジティブＥＳＩモード（脱溶媒和温度３５０℃、３．２５ｋＶスプレー電圧、コーン電圧２５Ｖ）でＭＳ分析した。カラム溶離液は、ランの最初の０．７分間にわたって廃棄物とした。ＬＣランの残りについて、ＭＳ（ｍ／ｚ９５〜６００走査範囲）およびＭＳ／ＭＳの両方を収集した。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、データ依存性様式で、ｎ番目の最も強いイオンについて、５回目の出現後に優勢イオンの動的排除を用い、３０秒の排除期間で獲得した。データは、基質および生成物ベースピークのためのＭａｓｓＬｙｎｘおよびＶｉｒｓｃｉｄｉａｎソフトウェアならびにＭＳ／ＭＳ遷移を使用して分析した。
ＩＶ．結果：

広範囲の基質について改善された活性を有する酵素を産生する能力は、基質結合および律速電子移動の両方を最適化する進化アプローチを必要とする。両方のパラメーターを概して最適化する、以前に同定されている１８の変異（例えば、米国特許出願公開第２０１６／００１００６５号を参照されたく、その内容は、参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる）は、９６ウェルの市販のＭＣＹＰパネル（ＭＣＹＰ−０３４３；Ｃｏｄｅｘｉｓ）から、表１−１に収載されている８つの代替的な骨格を使用して組み換えられた。このアプローチの目的は、改善されたバリアントを同定し選択するためのスクリーニング基質としてジクロフェナクを使用して、代替的な骨格上に築かれた各系統からのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることであった。最も改善されたバリアントの凍結乾燥粉末を、一連の化合物に対してスクリーニングして、複数の基質について改善の大きさを決定した（例えば、ゼネラリスト特性）。このアプローチは、「ゼネラリスト多様性の移動性（transferability）」と称されてきた。バリアント、スクリーニングされる基質、および変異を、表２から９にまとめる。図２は、ＭＣＹＰ−１．２−Ａ１２系統（表２〜９においてまとめられている８つの系統の１つ）についてのグラフ概要である。図２では、スクリーニングされた各基質についてのパーセント変換が、スクリーニングされた各酵素の関数としてプロットされている。この図では、２つの進化したＰ４５０（バリアント１６および１７）の性能（１ｍＭ基質負荷における％変換）が、親骨格、ＭＣＹＰ−１．２−Ａ１２と比較されている。図２に示され、表４にまとめられている通り、親骨格（ＭＣＹＰ−１．２−Ａ１２）は、スクリーニングされた各基質について低活性を呈した。進化したバリアント（バリアント１６および１７）は、スクリーニングされた４つの基質のうちの３つについて、改善された有意な活性を有する。残りの系統について、同様の傾向が観察された。バリアント１４および１５の性能（１ｍＭ基質負荷における％変換）を、それらの親骨格、ＭＣＹＰ−１．２−Ａ０７と比較した。親骨格（ＭＣＹＰ−１．２−Ａ０７）の性能（１ｍＭ基質負荷における％変換）は、表３にまとめられており、イマチニブおよびゲフィチニブについては低活性、ジクロフェナクおよびロラタジンについては中程度の活性を呈する。進化したバリアントは、４つすべての基質について、中程度の活性を呈する。各系統について、進化したバリアントは、対応する親骨格が活性をほとんどから全く示さなかった少なくとも１つの基質について活性を呈し、かつ／または親骨格が活性を呈する少なくとも１つの基質について改善された性能（１ｍＭ基質負荷における％変換）を呈する。

ＭＣＹＰ−１．２−Ａ０５はキメラであるが、ＭＣＹＰ−１．２−Ａ０５系統について、同じ傾向が観察される（図３を参照）。Ｐ４５０ドメインは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｐ４５０と８６％同一である。これらの結果は、類似の変異／位置の組合せが、他の生物由来のＰ４５０酵素において改善を付与するはずであることを示す。

表２〜９において、^ａＴＯＮは（［基質］^＊％変換／［Ｐ４５０］）として算出され、^ｂＦＩＯＰＣはＴＯＮ（バリアント）／ＴＯＮ（親）または％変換（バリアント）／％変換（親）のいずれかとして算出される。下記の表は、残りの項目への手引きを提供するものである。

本発明について具体的な実施形態を参照して記述してきたが、特許請求の範囲から逸脱することなく、種々の変更が為され得、特定の状況、材料、材料の組成、プロセス、プロセスステップ（１つまたは複数）に適応するように同等物で代用して、それにより、本発明の利益を達成することができる。

アメリカ合衆国においてあらゆる目的のために、本開示で引用されているありとあらゆる刊行物および特許文書は、各そのような刊行物または文書が、参照により本明細書に組み込まれることが具体的にかつ個々に示されているかの如く、参照により本明細書に組み込まれる。刊行物および特許文書の引用は、任意のそのような文書が関連のある先行技術であることを示すものとして意図されてもいないし、その内容または日付について認可を構成するものでもない。

Claims (13)

1. 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に記載されている配列を含むポリペプチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、組換えシトクロムＰ４５０−ＢＭ３バリアント。
2. 少なくとも３つの有機基質を酸化する、請求項１に記載の組換えシトクロムＰ４５０−ＢＭ３バリアント。
3. 前記有機基質が、ロラタジン、イマチニブ、ゲフィチニブおよびジクロフェナクから選択される、請求項２に記載の組換えシトクロムＰ４５０−ＢＭ３バリアント。
4. 請求項１に記載の組換えシトクロムＰ４５０−ＢＭ３バリアントをコードする、組換えポリヌクレオチド配列。
5. 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１５を含む、請求項４に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
6. 請求項４または５に記載のポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
7. 前記ポリヌクレオチド配列が、好適な宿主細胞において、該ポリヌクレオチド配列の発現に好適な調節配列と作動可能に連結した、請求項６に記載のベクター。
8. 前記宿主細胞が、原核細胞または真核細胞である、請求項６および／または７に記載のベクター。
9. 前記宿主細胞が、原核細胞である、請求項８に記載のベクター。
10. 前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項８および／または９に記載のベクター。
11. 請求項６および／または７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
12. 少なくとも１つの組換えシトクロムＰ４５０−ＢＭ３バリアントを生成するための方法であって、請求項１１に記載の宿主細胞を、請求項１から３のいずれかに記載の組換えシトクロムＰ４５０−ＢＭ３バリアントが該宿主細胞によって生成されるような条件下で、培養するステップを含む、方法。
13. 前記少なくとも１つの組換えシトクロムＰ４５０バリアントを回収するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。

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