CN1612929A

CN1612929A - 分离自展叶剑叶藓的 c y p 7 4酶家族之丙二烯氧化物合酶和二乙烯基醚合酶和编码这些合酶的核苷酸序列以及产生病原体抗性植物的方法

Info

Publication number: CN1612929A
Application number: CNA028139836A
Authority: CN
Inventors: I·福伊斯纳; M·施通佩
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2001-07-12
Filing date: 2002-07-06
Publication date: 2005-05-04
Anticipated expiration: 2022-07-06
Also published as: JP2004533849A; EP1409662A1; EP1409662B1; CA2453218A1; CA2453218C; ES2257587T3; CN1304570C; WO2003006647A1; ATE317006T1; US7321025B2; DE50205768D1; WO2003006647A9; US20050223437A1

Abstract

本发明涉及来自细胞色素P450家族的酶和编码它们的核苷酸序列，还涉及它们在产生病原体抗性植物的方法中的用途。

Description

分离自展叶剑叶藓的CYP74酶家族之丙二烯氧化物合酶和二乙烯基醚合酶和编码这些合酶的核苷酸序列以及产生病原体抗性植物的方法

本发明涉及来源于细胞色素P450类的酶，涉及相应的编码核苷酸序列的分离和它们的用途——用于产生具病原体抗性的植物细胞和它们的子代的方法。

细胞色素P450酶类包括丙二烯氧化物合酶(AOS)、氢过氧化物裂合酶(HPL)和二乙烯基醚合酶(DES)。它们形成一个单独的称作CYP74的亚族。由于细胞色素P450酶的多样性，命名法根据每种蛋白的一级结构，将该酶类的每种蛋白划归到特定的族和亚族中。这样，所有AOS形成它们自己的亚族CYP74A，而CYP74B包含13-HPL，CYP74C包含9/13-HPL，CYP74D包含9-DES(Feussner等；2001，Trends Plant Sci.6，268-273)。来自相同亚族的蛋白按时间顺序编号。

CYP74为具有血色分子(hemamolecule)辅基的单加氧酶。尽管它们也与作为辅基的原卟啉IX基团(hem b)相连，但是它们对CO的亲和力微弱(Matsui，1998，Belgian Journal of Botany.131，50-62)。它们组成了多烯脂肪酸代谢中重要的酶，该代谢叫做脂肪氧合酶(LOX)途径(Feussner和Wasternack，1998，Fett/Lipid. 100，146-152)。

LOX为双加氧酶，其中催化中心的铁和氨基酸侧链结合(Brash，1999，J.Biol.Chem.274，23679-23682)。它们催化分子氧掺入到多不饱和脂肪酸的(1Z，4Z)-戊二烯系统中。在植物中，这些脂肪酸主要是亚油酸和α-亚麻酸。根据所用的LOX的区域选择性，所得产物为氢过氧化物的两种不同的位置异构体：即(9S)异构体或(13S)异构体。例如，从α-亚麻酸得到(13S，9Z，11E，15Z)-13-过氧羟基-9，11，15-十八碳三烯酸(13S-HPOTE)，从亚油酸得到(13S，9Z，11E)-13-过氧羟基-9，11-十八碳二烯酸(13S-HPODE)。

植物中，这些氢过氧化物很快进一步被各种酶反应。现今，已知在植物领域中有7种不同的酶家族，它们转化氢过氧化物从而竞争LOX产物，这些反应是：丙二烯氧化物合酶(AOS)反应、氢过氧化物裂合酶(HPL)反应、二乙烯基醚合酶(DES)反应、还原酶反应、peroxygenase反应、环氧醇合酶(EAS)反应和LOX反应本身(Feussner等；2001，Trends Plant Sci.6，268-273)。当在丙二烯氧化物环化酶(AOC)存在下13-HPOTE反应时，发生环化反应得到12-氧代Phytodienoic acid(12-氧代-PDA)(Ziegler等；2000，J.Biol.Chem.275，19132-8)，12-氧代Phytodienoic acid为茉莉酮酸的前体，这里认为茉莉酮酸是一种植物激素。

AOS(EC4.2.1.92；CYP74A)是被首先描述的CYP74酶；首先从亚麻中分离出了均一的蛋白(Song和Brash，1991，Science.253，781-784)。AOS催化的反应得到不稳定的丙二烯氧化物，其在水的存在下能分解成相应的α-和γ-乙酮醇。AOS参与茉莉酮酸的生物合成(Vick和Zimmerman，1983，Biochem，Biophys.Res.Commun.111，470-7)。茉莉酮酸本身参与诱导特定mRNA的转录和调节茉莉酮酸酯诱导的蛋白(JIP)(如LOX、AOS和蛋白酶抑制剂)的翻译。这使得茉莉酮酸是植物胁迫应答中一种重要的信号物质(Wasternack和Parthier，1997，Trends Plant Sci.2，302-307)。此外，描述了其参与调节生长和促进老化(Sembdner和Parthier，1993，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.44，569-589)。已经克隆并在大肠杆菌中功能性表达了许多AOS，包括拟南芥(Arabidopsis thaliana)、番茄(Lycopersiconesculentum)、亚麻(Linum usitatissimum)和大麦(Hordeum vulgare)AOS。除了大麦AOS，到现今为止克隆的所有AOS都表现出对(13S)-氢过氧化物的底物专一性(Maucher等；2000，Plant J.21，199-213)。

HPL(CYP74B和C)将氢过氧化物切割成(3Z)-醛和ω-含氧酸(Matsui，1998，Belgian Journal of Botany.131，50-62)。甚至在该酶发现前，HPL反应产物就被称作“叶醛”，其使得植物和水果具有特征性气味(Hatanaka，1996，Food Rev.Int.12，303-350)。对于13-HPOTE作为底物，形成(3Z)-己烯醛和(9Z)-12-氧代-9-十二碳烯酸，后者异构化得到(10E)-12-氧代-10-十二碳烯酸(愈伤素)，其作为创伤激素被讨论。还讨论了其作为植物信使物质的功能(Bate和Rothstein，1998，Plant J.16，561-569)。愈伤素还可进一步氧化得到愈伤酸，其似乎同样参与植物创伤应答(Zimmerman和Vick，1970，Plant Physiol.46，445-453)。克隆并在大肠杆菌中表达为活性蛋白的HPL有例如拟南芥、黄瓜(Cucumis sativus)、紫花苜蓿(Medicago sativus)和番茄的HPL。这些酶的大多数也具有对(13S)-氢过氧化物的底物专一性。只有来源于黄瓜的一种HPL和来源于甜瓜的一种HPL没有底物专一性，因此称作9/13-HPL(McIntyre等；1999，J.Biol.Chem.274，25189-25192；Matsui等；2000，FEBS Lett.481，183-188)。对两种序列与其他CYP74家族成员关系的研究揭示了这两种序列与AOS的同源性比与13-HPL的同源性高。这是为什么这些酶被归类为单独的CYP74C亚族的原因(Matsui等；2000，FEBS Lett.481，183-188)。已经阐明拟南芥属HPL被创伤所诱导。

DES(CYP74D)催化具有杀真菌活性的二乙烯基醚的形成(Weber等1999)。还讨论了二乙烯基醚类似于HPL的产物醛参与抵抗病原真菌和细菌(Weber等；1999，Plant Cell.11，485-493；Gbel等；2001，J.Biol.Chem.276，6267-6273)。在2001年Itoh和Howe克隆了第一个番茄DES。其与AOS和HPL在序列上具有高度同源性；因此也认为它属于细胞色素P450类，CYP74D亚族。而且，DES在CYP74组中是独特的，因为它是对9S-氢过氧化物具有高度专一性的唯一一种酶(Itoh和Howe，2001，J.Biol.Chem.276，3620-3627)。

自然中，P450酶通过多种途径参与许多内源性物质的生物合成和代谢。它们在异生素解毒中的参与尤其重要。而且，植物P450酶参与创伤信号(茉莉酮酸、水杨酸、愈伤素)和激素(赤霉素、油菜素类固醇)的生物合成。可以以许多形式产生引发植物中创伤信号和随后的信号转导级联的物质。它们可以被植物的损害或伤害引发，还可以被外部的化学化合物(人工地)诱导。然而，植物疾病的发生率和主要地植物对这些病原体的防御反应的提高才尤其具有农业经济学上的极大的相关性。相对于植物对创伤胁迫的自身防御，植物对病原体的应答可能涉及十分不同的途径。由例如病毒、细菌或真菌引起的植物疾病的发生通常导致植物受到极大的伤害或者实际上整株植物的死亡，连带造成作物的数量和质量的急剧下降。

如果要将产量损失限制在经济上可接受的程度，必须采取植物保护措施。尤其，希望提高植物对病原体和/或有害生物的防御反应而不使用化学药品，这些化学药品会对土壤、地下水和使用者造成额外的污染。

因此，本发明的一个目的是提供显示出对病原体具有增强的抗性的转基因植物细胞、植物和它们的子代，以及生产它们的改良的方法。

该目的通过氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的丙二烯氧化物合酶或者其同工酶和/或氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的二乙烯基醚合酶或其同工酶来完成。

上面提到的两种酶属于CYP74酶家族。相对于植物细胞中这些酶的内源性比活，这些CYP74酶的增加的比活可以单独地或者组合地导致植物细胞对病原体的抗性增加。这里，与植物细胞或植物中内源性比活相比，根据本发明增加的CYP酶比活使得植物细胞或植物对病原体的抗性增加20-90％，优选30-80％，特别优选40-70％。植物的抗性通过侵入频率的下降来确定。为了本发明的目的，侵入频率指成功侵入表皮细胞的感染位点数除以感染位点总数所得的值。

根据本发明的CYP74酶单独或组合地有利地带来了植物中对病原体(例如活体营养真菌)的增强的抗性。根据本发明的CYP74蛋白的增加的浓度(增加的比活)优选带来对白粉菌，特别优选地对禾本科布氏白粉菌大麦专化型(Blumeria graminis f.sp.Hordei)或小麦专化型(f.sp.tritici.)的增强的抗性。然而，这不排除对其他植物病原体增强的抗性。这些植物病原体的其他例子是腐霉属(Pythium spec.)，白锈属(Albugo spec.)，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、寄生霜霉(Peronospora parasitica)、Erysiphecrucifearum，二孢白粉菌(E.cichoreacearum)、芸蔓生链格孢(Alternariabrassicicola)，灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)、核盘菌(Sclerotinia sclerotium)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、大刀镰孢(F.culmorum)、禾本科镰孢(F.graminearum)、雪腐镰孢(F.nivale)、致病疫霉(phytophtora infestans)或丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)。

必须说明的是上面提到的根据本发明的CYP74酶显示出比以前已知的该类CYP酶有更广的底物谱。根据本发明的CYP74酶不仅能够转化9-HPOD/TE，而且能够将13-HPOD/TE作为底物。

根据本发明，该CYP74酶起源于藓类或高等植物。优选地，根据本发明的CYP74酶起源于展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)。

本发明还涉及分离的核苷酸序列，其编码参与多不饱和脂肪酸生物合成的上述类型的丙二烯氧化物合酶，可以用于增加植物细胞或植物对病原体的抗性，该核苷酸序列选自：

a)如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，

b)与如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列至少有70％同一性的核苷酸序列，

c)与a)或b)互补的核苷酸序列。

本发明还包括与a)或b)杂交的核苷酸序列。

同样地，本发明包括分离的核苷酸序列，其编码参与多不饱和脂肪酸生物合成的上述类型的二乙烯基醚合酶，可以用于增加植物细胞或植物对病原体的抗性，该核苷酸序列选自：

a)如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，

b)与如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列至少有70％同一性的核苷酸序列，

c)与a)或b)互补的核苷酸序列。

本发明还包括与a)或b)杂交的核苷酸序列。

根据本发明，分离的核酸或者分离的核酸片段指单链或双链的并且可以任选含有天然的、化学合成的、修饰的或人工的核苷酸的RNA或DNA聚合物。在该上下文中，术语DNA聚合物还包括基因组DNA、cDNA或它们的混合物。

为了本发明目的，杂交的核苷酸序列指在标准杂交条件下和根据本发明的编码CYP74酶的相应核苷酸序列结合的寡或多核苷酸。术语“标准杂交条件”应该从广义上理解，指严紧或不那么严紧的杂交条件。例如，Sambrook等(1989，分子克隆(Molecular Cloning)，第二版，冷泉港实验室出版社)描述了这些条件。根据本发明，术语“杂交的序列”包括来自DNA或RNA类群的基本类似的核苷酸序列，这些序列在本身已知的标准杂交条件下和根据本发明的核苷酸序列特异性相互作用(结合)。这些杂交的序列还包括长度为例如10到30，优选12到15个核苷酸的短核苷酸序列。根据本发明，这些杂交序列还包括引物或探针等。

根据本发明，互补的核苷酸序列指根据碱基配对原则构成正讨论的起始序列的转录物的DNA或RNA(mRNA)序列。

根据本发明，等位基因指功能上等价的核苷酸序列，即具有基本上相同类型的作用的核苷酸序列。功能上等价的序列指核苷酸序列发生改变(例如，由于遗传密码的简并性)但是保留了期望功能的那些序列。这样，功能等价物包括此处描述的这些序列的天然发生的变体以及人工核苷酸序列，例如通过化学合成得到的和(如果适当)适应宿主生物的密码子选择进行了修饰的核苷酸序列。此外，功能等价序列包括那些具有修饰核苷酸序列的序列，该修饰核苷酸序列使该蛋白例如对抑制剂丧失敏感性或者产生抗性。

功能等价物还尤其指最初分离的序列的天然或人工突变体，这些突变体保留了期望的功能。突变包括替代、加入、缺失、互换或者插入一个或多个核苷酸残基。此处还包括所谓的有义突变，其在蛋白水平可以，例如导致保守氨基酸的替代，但不导致该蛋白功能的根本改变，即突变是功能中性的。这还包括核苷酸序列的修饰，该修饰在蛋白水平上和蛋白的N或C末端相关，但不会对该蛋白的功能造成实质上的不利影响。实际上，这些修饰可以对蛋白结构有稳定作用。功能等价物还指那些和最初的基因或基因片段相比活力变弱或增强的变体。

人工DNA序列也是本发明的主题，只要它们赋予上述的期望性质。可通过例如反向翻译利用分子建模得到的蛋白质或者通过体外选择确定这些人工DNA序列。特别合适的DNA序列是根据宿主-生物的特定密码子选择反向翻译多肽序列得到的编码DNA序列。熟悉分子遗传学方法的技术人员可通过计算机评估所要转化的生物的其他已知基因容易地确定特定密码子选择。术语“功能等价物”还指由正讨论的核苷酸序列编码的蛋白。这时，术语“功能等价物”描述和参考蛋白(这种情况下指CYP74酶)在氨基酸序列上具有一定百分数的同源性的蛋白。该百分数至少为75％，优选80％，特别优选90-95％，尤其是99.9％。

此外，本发明还包括例如那些通过修饰核苷酸序列而得到的核苷酸序列，这就导致相应的衍生物。这种修饰的目的可以是例如进一步限定(deliminate)其中的编码序列或者例如插入其它的限制性酶切割位点。

根据本发明的核苷酸序列还可通过它们起源自藓类或高等植物这一事实来区别。优选地，它们起源自展叶剑叶藓。

为了阐明术语，应该指出由SEQ ID No.1编码的蛋白为一类CYP74A细胞色素P450酶(丙二烯氧化物合酶；AOS)。由于底物专一性等原因，由SEQ ID No.3编码的酶归为CYP74E类(二乙烯基醚合酶；DES)。

本发明还涉及含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和/或如SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列以及与之可操作连接的核苷酸调节序列的基因构建体。根据本发明的基因构建体还包括含有如SEQ ID No.1和/或SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列的衍生物、等位基因或部分的那些构建体。在该上下文中，这些编码区单独或组合地(即共同地)受到相同调节序列或者多个单独的调节序列的控制。

可操作连接指例如启动子、编码序列、终止子和(如果合适)其他调节元件的顺序排列，这种排列方式使得当编码序列表达时，每个调节元件都能够完成其预期功能。这些核苷酸调节序列可以是天然来源的或者可以通过化学合成得到。合适的启动子原则上是能调节正讨论的宿主生物中的基因表达的任何启动子。根据本发明，这种启动子也可以是天然的或者合成产生的化学可诱导的启动子，通过该启动子，由其控制的基因的表达可以在宿主细胞中于特定时间点发生。这些启动子还包括组织特异性启动子。用例如在T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆：实验指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1989)中所描述的常用重组和克隆技术，通过将合适的启动子融合到至少一个根据本发明的核苷酸序列上，可以产生基因结构。为了将DNA片段连接起来，可向片段添加接头或衔接子。

根据本发明还可以包括编码区之前的序列区(结构基因；5’或上游序列区)和/或之后的序列区(3’或下游序列区)。尤其还可以包括具有调节功能的序列区。它们能够影响转录、RNA稳定性或RNA的加工和翻译。调节序列的例子为启动子、增强子、操纵基因、终止子或翻译增强子等。

本发明还包括一种载体，该载体含有如SEQ ID No.1所示的分离的核苷酸序列、其等位基因、衍生物或部分和/或如SEQ ID No.3所示的分离的核苷酸序列、其等位基因、衍生物或部分和/或上述类型的基因构建体和用于宿主细胞筛选和/或宿主细胞中的复制和/或向宿主细胞基因组中的整合的额外核苷酸序列。

通常，根据本发明，合适的宿主细胞可以是高等植物的细胞。优选的细胞为有用的植物的细胞，优选单子叶有用植物的细胞，特别优选谷类，尤其是大麦和/或小麦的细胞。优选的双子叶有用植物的细胞是来自茄科(Solanaceae)的细胞。

这样，本发明还包括至少一种转基因植物细胞、完整的植株和/或它们的子代，它们含有可复制形式的如SEQ ID No.1所示的分离的核苷酸序列、其等位基因、衍生物或部分和/或如SEQ ID No.3所示的分离的核苷酸序列、其等位基因、衍生物或部分和/或上述类型的基因构建体和/或上述类型的载体；和内源性基因表达(即例如在未转化的植物或植物细胞中发现的天然基因表达)相比，该转基因植物细胞、完整的植株和/或它们的子代显示出编码丙二烯氧化物合酶的核苷酸序列和/或编码二乙烯基醚合酶的核苷酸序列的增强的表达，这使得植物对病原体的抗性增强。

增强的基因表达可以由所讨论的核苷酸序列的拷贝数增加导致。备选地，该增加可以基于例如这样的事实：核苷酸序列的编码区可操作连接到一个或多个调节序列上，而此调节序列可以导致基因表达起始的增强。这可以例如通过强的和/或可诱导的启动子和/或增强子和/或其他调节序列来实现。

至于拷贝数，在本发明的一个变体中上面提到的核苷酸序列之一或两者存在的拷贝数可以是2-100，优选5-50，特别优选2-15个。

在上面提到的根据本发明的转基因植物细胞、植株和/或它们的子代中，根据本发明的核苷酸序列(单独地或组合地)、其等位基因、衍生物或部分和/或上述类型的基因构建体和/或载体可以存在于染色体外和/或稳定整合到植物基因组中。

将核苷酸序列整合到植物基因组中的合适的方法和辅助手段(如基因构建体或载体)和合适的辅助生物是本领域技术人员已知的，将不再详述。

本发明同样包括这样的转基因植物细胞、完整的植株和/或它们的子代，它们具有如SEQ ID No.2所示的丙二烯氧化物合酶和/或如SEQ ID No.4所示的二乙烯基醚合酶和/或其相应同工酶、衍生物和/或其部分，与相关内源性酶活力(例如在野生型细胞中)相比，在该转基因宿主系统中，所述酶的相关比活得到增加。

同工酶应理解为指具有相同或相似的底物专一性和作用专一性但是具有不同一级结构的酶。

根据本发明，衍生物指在序列中具有修饰(例如，在该多肽的N和/或C末端或者在保守氨基酸区域)但是该修饰对酶的功能没有不利影响的酶。可通过本身已知的方法以氨基酸替代的形式进行这些修饰。

本发明的一个特定实施方案包括根据本发明的酶的变体，和所讨论的起始蛋白相比，由于氨基酸替代，该变体的活力降低了或增强了。这同样适用于在那些细胞中或多或少对例如蛋白酶的降解敏感的根据本发明的酶的稳定性。

此外，本发明涉及具有丙二烯氧化物合酶或二乙烯基醚合酶功能的酶，该酶的氨基酸序列被修饰使得这些酶对于调节化合物，例如调节它们活力的代谢物(对反馈作用脱敏)丧失敏感性。

根据本发明，上面提到的转基因植物细胞，完整的植株和/或它们的子代为有用植物或其细胞的形式，优选来自茄科或谷类，特别优选来自马铃薯、大麦或小麦。

本发明还包括增加植物细胞或植物对病原体的抗性的方法，其中将如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列和/或上面详述类型的基因构建体和/或载体以可复制的形式转移到植物细胞中，并且从由此转化的植物细胞再生全株。

产生根据本发明的这些转基因植物的方法是标准的实验室操作。在本发明有利的变体方案中，通过所谓的“微粒轰击”和/或农杆菌介导的转化将核苷酸序列和/或基因构建体和/或载体转移到植物或植物的部分或细胞中。

根据本发明得到的转基因植物和其子代的一个特别的优点是：至少一种根据本发明的核苷酸序列的拷贝数增加或者类似地，至少一种相应编码的蛋白质的浓度增加导致实质上增强的疾病抗性。这意味着根据本发明的基因和/或编码的蛋白是产生对病原有害生物的抗性的原因。病原有害生物的例子是禾本科布氏白粉菌大麦专化型或小麦专化型，腐霉属、白锈属、立枯丝核菌、寄生霜霉、Erysiphe cruciferarum、二孢白粉菌、芸蔓生链格孢、灰葡萄孢、齐整小核菌、核盘菌、尖镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、雪腐镰孢、致病疫霉或丁香假单胞菌。

在一个根据本发明的方法的优选变体方案中，所用的植物细胞为有用植物的细胞，优选来自茄科或谷类，特别优选马铃薯、大麦或小麦。

本发明还涉及如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和/或SEQ ID No.3所示的核苷酸序列和/或它们的等位基因、衍生物和/或其部分的用途，用于增加转基因植物细胞、完整的植株和/或它们的子代对病原体的抗性。

本发明还涉及至少一种如SEQ ID No.2所示的和/或如SEQ ID No.3所示的多肽和/或其同工酶和/或衍生物在增加转基因植物细胞、完整的植株和/或它们的子代对病原体的抗性中的用途。

根据本发明，还包括至少一种上面提到的酶的用途，其中和相应的内源性酶比活相比，此至少一种酶的比活的增加导致植物细胞或植物对病原体的抗性增加20-90％，优选30-80％，特别优选40-70％。

在该上下文中，至少一种根据本发明的酶的使用使得例如对白粉菌，优选禾本科布氏白粉菌大麦专化型或小麦专化型和/或致病疫霉的抗性增强。

下面的实施例旨在阐明本发明而不是对本发明进行限定。

一般方法：

一般的DNA和克隆技术、凝胶电泳、测序、PCR、Northern印迹、重组蛋白的表达和纯化、Western印迹、HPLC和GC分析和微生物的培养都是常规的实验室方法，参见如Sambrook等(分子克隆.实验指南(1989)冷泉港实验室出版社)所述。藓类和植物材料的处理同样是惯用的实验室操作，参见如Gelvin等(植物分子生物学手册(Plant Molecular BiologyManual)，1995，Dovdrecht/Holland，Kluwer Academic Publ.)所述。

通过PCR克隆编码CYP74酶的基因

可得到两个展叶剑叶藓λZapII cDNA文库(一个来自原丝体组织，一个来自配子体组织)以进行RACE-PCR。T7-lang引物(5’-GTA ATA CGACTC ACT ATA GGG CGA ATT GGG-3’)用作载体引物以进行5’RACE-PCR。使用标准方法。

对于嵌套的RACE-PCR，用M13rev引物(5’-GGA AAC AGC TATGAC CAT G-3’)和RACE引物进行第一次PCR。该混合物作为模板进行第二次PCR，其中使用T7-lang引物和一个(基因特异性)嵌套-RACE引物，其选自：

PP291AOS5R：5’-TCA CCT CAT CCG ATA CGC TAG TC-3’

PP364AOS5R：5’-GTC GAT GTC GTC TCA ATG TTC C-3’

PP364AOS5R2：5’-CCA TTC GTG ATT GCC AGA ACT GC-3’

为了克隆完整片段，后者用Expand^TMPCR系统进行扩增。除了Taq聚合酶，该系统还含有一种具有校读活性的Pwo聚合酶。这第二种酶的目的是保持较低的阅读出错率以便在所要克隆的DNA中出现尽可能少的突变。下面的cDNA文库用作模板：原丝体展叶剑叶藓cDNAλZapII和配子体展叶剑叶藓cDNAλZapII。使用下面的引物：

PP291/5’SphI

5’-AAA GCA TGC ATG GCA GTC CCT TCA TCC AAG C-3’

PP291/3’PstI

5’-AAA CTG CAG TCA CTT TTT GAG ATC GGA AAA GAA AAC CTT

GGT CGC-3’

PP364/5’BamHI

5’-GGA TCC CGT ACG GTT GTA GCC AGT CTT GGG-3’

PP364/3’HindIII

5’-AAG CTT TCA ATC TGA TCG CGG CGT CAG TG-3’

为了检查RACE克隆期间的克隆和完整cDNA，用Tf1聚合酶进行称作“集落”PCR的方法，因为此时出错率并不重要。保留引物并用标准设置进行该过程。

CYP74酶的分离

从两个展叶剑叶藓λZapII cDNA文库中分离了两个编码CYP74酶的基因。

克隆Pp291

分离的克隆Pp291具有322个氨基酸的可读框。该蛋白与灰白银胶菊(Parthenium argentatum)AOS有48％的同一性(Pan等；1995，J.Biol.Chem.270，8487-8494)。然而，将其核苷酸序列与其他已知的AOS相比较发现，在5’末端仍然缺了约500到650bp。这就是用来自原丝体组织的λZapIIcDNA文库和来自配子体组织的λZapII cDNA文库进行5’-RACE-PCR的原因。用RACE引物PP291AOS5R(见上面的)及退火温度60℃，从原丝体文库中成功的扩增出了3个不同长度的片段。通过和琼脂糖凝胶中的分子大小标准比较可以估计片段的长度。片段的长度是600bp，700bp和800bp。将两个较长的片段克隆到载体pGEM-T中并测序。所得两个序列都为起始克隆的5’末端的延伸。在两个序列中，终止密码子都位于第一个起始密码子(ATG)上游的15bp处。为了克隆完整cDNA，从RACE-PCR的cDNA序列衍生出具有SphI和PstI限制性切割位点的表达引物(PP291/5’SphI和PP291/3’PstI，见上面)。所得完整cDNA序列如SEQ IDNo.1所示并编码具有475个氨基酸的蛋白(SEQ ID No.2)。

克隆Pp364

此第二个cDNA克隆含有编码489个氨基酸的蛋白的可读框。在氨基酸水平上，该蛋白和拟南芥AOS(Laudert等；1996，Plant Mol.Biol.31，323-335)具有42％的同一性，和亚麻AOS具有41％同一性。尽管该克隆较长，但是其没有包含起始密码子。具有BamHI和HindIII限制性切割位点的表达引物PP364/5’BamHI和PP364/3’HindIII都衍生自此已知的克隆序列。完整cDNA序列通过RACE-PCR和反向PCR得到。完整的cDNA序列如SEQ ID No.3所示并且编码具有532个氨基酸的蛋白(SEQ ID No.4)。

重组蛋白的表达和纯化

为了表达分离的cDNA，必须将它们连接到表达载体中。使用载体pQE30(Qiagen，Hilden)以表达具有N末端His6-标签的蛋白。用T4-DNA连接酶进行预先切割的pQE30和供体DNA(约3∶1的比例)之间的连接。重组蛋白在大肠杆菌菌株SG13009(Gottesmann等；1981，J.Bacteriol.148，265-73)中表达。首先，将表达克隆在LB培养基(含有羧苄青霉素和卡那霉素)中于37℃孵育直到OD600达到0.6-0.8。用IPTG(终浓度为1mM)诱导后，在10℃下细菌继续生长2-3天。

尽可能将纯化在冰上进行，而离心步骤在4℃下进行。4000×g下离心15分钟以沉淀细胞。细胞沉淀物重新完全悬浮于pH8的50mM磷酸钠溶液中，并以50％强度和50％脉冲超声处理(Sonopuls GM 70，Bandelin，柏林)5次，每次1分钟。4000×g离心15分钟除去细胞残渣，并且进一步离心(100000×g，1小时)从上清液沉淀细胞膜。

对于两种克隆Pp291和Pp364，通过亲和层析纯化重组产生的蛋白。然后用pH梯度(图1A)或者咪唑梯度(图1B)洗脱。在所有洗涤和洗脱步骤中得到相同的体积(1ml)并加载至凝胶。从图1A中我们可以看出，在pH4时从柱中洗脱出纯的Pp291蛋白。对于咪唑梯度，在咪唑浓度为100mM和100mM以上时洗脱出相对较纯的蛋白。比较两种方法，没有发现差异。这是下面只用pH梯度纯化蛋白的原因。

活力测定

由于序列对比(align)不能得到关于催化活力的结论，所以用光度活力测定法和HPLC以及GC分析来分析酶催化时形成的产物，所有的测定都用标准方法进行。

在光度活力测定中，在234nm测量光吸收的下降。下降基于和Cyp74酶反应时氢过氧化物的共轭双烯体系的破坏。为此，将各底物溶解(为了纯粹的活力测定，通常终浓度为20μM 13-HPOTE或9-HPODE)于磷酸盐缓冲液(pH依赖于酶的最适pH)并加入酶开始反应。通过234nm的光吸收监测底物的浓度。摩尔吸光系数(λ_234nm)为25000M^-1cm^-1。

用克隆Pp291编码的酶和克隆Pp364编码的酶转化两种底物(13-HPOTE和9-HPODE)。图解表示如图2。

氢过氧化物和DES的反应得到二乙烯基醚，其在酸性环境中水解得到醛。这些醛是挥发性的。为了鉴定形成的这些醛，可以将它们用DNPH衍生(Kohlmann等；1999，Eur.J.Biochem.260，885-895)。这样所形成的腙不再是挥发的并且可以用HPLC分析通过它们的存留时间(retentiontime)来鉴定。如图3所示，当用衍生试剂处理时，二乙烯基醚也可以分解成醛，其然后可以以DNPH衍生物的形式检测。使用该方法，可以显示出在克隆Pp364编码的酶和底物13-HPOTE和9-HPODE的反应混合物中形成了醛(图4)。这些醛通过它们的存留时间被鉴定为(2E)-己烯醛和(2E)-壬烯醛。它们还具有典型的醛-DNPH衍生物的紫外光谱。对于Pp291没有检测到醛类(没有列出数据)。

在对非挥发性化合物进行HPLC分析时，进行1-¹⁴C标记的氢过氧化物的反应。所形成的标记产物可以用放射检测器而不用紫外检测器观察到。用这种方法，即使没有典型的紫外最大吸收的物质也可以通过它们的存留时间来鉴定。另一个优点是这种类型的检测比紫外检测更灵敏。如果将1-¹⁴C-13-HPOTE用作酶反应中的底物，图5中的层析谱揭示了Pp291和用作参比的大麦9/13-AOS1(Maucher等；2000，Plant J.21，199-213)具有相同的洗脱图。对于其他AOS，已经阐明在没有丙二烯氧化物环化酶时主要反应产物是α-乙酮醇。Pp364的表达和随后的转化的层析谱表明在约30分钟时有一个信号(图6)。该信号在黄瓜9/13-HPL和大麦9/13-AOS1中都不存在。在和黄瓜9/13-HPL产物相同的存留时间上Pp364还显示有其他信号。因在放射HPLC中，在柱洗出物中加入液体闪烁剂，故用未标记的底物进行同样的HPLC以收集产物并进一步对它们进行分析。由于α-乙酮醇没有典型的紫外最大吸收，此时在210nm进行检测(Gardner，1997，Advances in Lipid Methodology-four(Christie，W.W.，ed.)1-43页，The OilyPress，Dundee)。

对于Pp291，收集和标准——针对从13-HPOTE形成的α-乙酮醇的标准——具有相同存留时间的物质，将其衍生并进行GC/MS研究。所得层析谱如图7。质谱和相应的α-乙酮醇标准的相同。

酶特征的确定

最适pH值

用光度法测量克隆Pp291的最适pH值。为此，将13-HPOTE用作底物(溶于适当pH的50mM磷酸钠溶液中，约25μM)。在5.0-6.0的pH范围内酶具有最高活力。如图8所示。

酶的动力学参数

研究Pp291对底物，特别是花生四烯酸(HPETE)的氢过氧化物的专一性，因为花生四烯酸是该生物中主要的脂肪酸(Girke等；1998，Plant J.15，39-48)。转化速度的比率如图9所示。在本发明研究的氢过氧化物中，8-HPETE是转化最快的底物。接着是13-HPOTE、9-HPODE和11-HPETE，比率是8-HPETE∶13-HPOTE∶9-HPODE∶11-HPETE为100∶70∶60∶57。

过表达以产生增强的病原体抗性

为了将Pp291和Pp364 cDNA克隆到二元载体中，将它们用BamHI和NotI限制性切割并转移到BamHI-和NotI-切割的pCRScript载体中。然后用SalI将它们从该载体中切除并连接到SalI适当切割的pBinAR载体。通过用BamHI控制切割和测序确定基因为有义取向的那些克隆。

转化到拟南芥：

用含有有义取向的Pp291和Pp364 cDNA的pBinAR载体转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(C58C1 pMP90)。其后，根据Clough和Bent(Clough S.和Bent A.，Plant J 1998，16(6)：735-43)和Bechtold等(Bechtold，N.等CRAcad Sci Paris 1993，1144(2)：204-212)的真空渗入方法的改良方法用各转化的根癌农杆菌菌株转化野生型拟南芥植株(cv.Columbia)。根据卡那霉素抗性通过将种子种植于含有卡那霉素的MS平板(MS培养基(Sigma)补加40mg/l卡那霉素，10mg/l苯菌灵(benomyl)和100mg/l特美汀(timentin))以筛选初级转化体的种子。2周后，将卡那霉素抗性幼苗转移到土壤；当它们完全发育成植株时将它们用于表型和分子分析。

在用有义取向的Pp291和Pp364转化的转基因植物中，选择没有观察到共抑制效果的植株。为此，从植物中分离总RNA，并且用实时PCR(Perkin-Elmer)检测此信使RNA的存在。然后由此鉴定的转基因植物用各种病原体感染。这些病原体包括禾本科布氏白粉菌大麦专化型和小麦专化型、腐霉菌、白锈菌、立枯丝核菌、寄生霜霉、Erysiphe crucifearum、二孢白粉菌、芸蔓生链格孢、灰葡萄孢、齐整小核菌、核盘菌、尖镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、雪腐镰孢或丁香假单胞菌。

用荧光和光学显微镜等方法分析结果，即植物对病原真菌或细菌的抗性的宏观程度。发现和野生型相比，Pp291-和Pp364-转基因拟南芥植物表现出对上面提到的病原体的增强的抗性。

转化入大麦

将大麦(cv.Pallas)叶块用存在于GFP(绿色荧光蛋白)表达载体中的Pp291或Pp364的cDNA转化。然后用病原真菌禾本科布氏白粉菌大麦专化型(大麦白粉菌)接种叶子，48小时后用光学显微镜和荧光显微镜分析结果。通过检测活细胞中的吸器和评估正好处于那些细胞中的真菌的发育来评价对GFP表达细胞的侵入。在所有的6个实验中，和用外来对照cDNA(人甲状腺激素受体dsRNA，TR)轰击的细胞相比，用Pp291或Pp364cDNA对大麦cv.Pallas的轰击使得被禾本科布氏白粉菌大麦专化型(大麦白粉菌)成功侵入的细胞数减少。Pp291和Pp364 cDNA的抗性诱导作用导致禾本科布氏白粉菌大麦专化型的侵入效率平均减少44％。

用已经描述的将cDNA通过生物轰击导入大麦叶子的表皮细胞的方法(Schweizer P等；(1999)Mol Plant Microbe Interact 12：647-54；Schweizer P等(2000)Plant J 2000 24：895-903)进行大麦的瞬时转化。将直径1.1mm的钨微粒(微粒密度25mg/ml)用cDNA和作为转化标记的载体pGFP(GFP处于CaMV 35S启动子控制下)的质粒DNA包裹。为此，每次轰击用下面的量的cDNA和报道质粒进行包裹：1mg pGFP和2mg cDNA。为了制备微载体，将55mg钨微粒(M17，直径1.1mm；Bio-Rad，Munich)用1ml高压灭菌的蒸馏水洗两次并用1ml无水乙醇洗1次，干燥并置于1ml浓度为50％的甘油中(约50mg/ml储存液)。将溶液用浓度为50％的甘油稀释到25mg/ml，使用前彻底混合并于超声浴中悬浮。为了包裹微载体，每次轰击将1mg质粒、2mg cDNA(1mL)、12.5ml钨微粒悬浮液(25mg/ml)、12.5ml 1M的Ca(NO₃)₂溶液(pH 10)在持继混合情况下逐滴混合，室温静置10分钟后短暂离心，除去20ml上清液。将含有钨微粒的剩余物重新悬浮(超声浴)并用于实验。

使用约4cm长的大麦初生叶段。组织置于培养皿(直径6.5cm)中的添加有20mg/ml苯并咪唑的0.5％Phytagar(GibcoBRLt Life Technologiest，Karsruhe)上；临在微粒轰击前，将边缘用具有2.2cm×2.3cm大小的长方形缝的蜡纸(stencil)覆盖。将培养皿相继置于真空室的底部(Schweizer P等(1999)Mol Plant Microbe Interact 12：647-54)，之上将尼龙网(网孔大小0.2mm，Millipore，Eschborn)插在有孔板(高于底部5cm，低于宏载体11cm，见下文)上作为扩散器以使微粒聚集物散开和减慢微粒流。对于每次轰击，将结合在室顶部的宏载体(塑料无菌过滤器支架(filter holder)13mm，Gelman Sciences，Swinney，UK)装入5.8ml DNA包裹的钨微粒(微载体，见下文)。用膜真空泵(Vacuubrand，Wertheim)将室内气压降低0.9巴，在9巴的氦气压下用钨微粒轰击植物组织的表面。此后立即将室充气。

为了标记转化的细胞，用质粒(pGFP；基于pUC18的载体，具有插入的GFP基因的CaMV 35S启动子/终止子盒；Schweizer P等(1999)Mol PlantMicrobe Interact 12：647-54；由P.Schweizer博士提供，Schweizer P，Institute of Plant Genetics IPK，Gatersleben，德国)轰击叶子。在用另一个质粒轰击之前，每次用水彻底清洗宏载体。轰击后，将培养皿微微打开，日光下在室温将叶子孵育4小时，此后给它们接种100个分生孢子/mm的大麦白粉菌真菌(race A6)并在相同条件下继续孵育40到48小时。

利用微粒注入枪(particle inflow gun)用包裹的微粒轰击叶块。每次轰击使用312mg钨微粒。在轰击后4小时用禾本科布氏白粉菌(race A6)接种叶子，再过40小时后评估感染症状。用荧光和光学显微镜分析结果(例如侵入效率，定义为形成成熟吸器和次级延伸菌丝的受攻击的细胞的百分比；计算：见下文)。用100个分生孢子/mm2接种得到的攻击频率为转化细胞的约50％。对每次单独实验最少估计100个相互作用位点。在蓝光的激发下鉴定转化的(表达GFP)细胞。区分出三类不同的转化细胞：

1.含有易于识别的吸器的被侵入细胞。具有多于1个吸器的细胞被认为是1个细胞。

2.尽管被真菌附着器攻击但不含有吸器的细胞。被禾本科布氏白粉菌大麦专化型重复攻击但不含有吸器的细胞被认为是1个细胞。

3.不被禾本科布氏白粉菌大麦专化型攻击的细胞。

评估中不包括气孔细胞和副卫细胞。通过光学显微镜方法和对真菌用0.1％Calcofluor(w/v，溶于水)进行荧光染色30秒以分析禾本科布氏白粉菌大麦专化型的表面结构。用Calcofluor染色后可容易地用荧光显微镜估计真菌的发育。尽管在Pp291-或Pp364-dsRNA转化的细胞中真菌形成了初级和附着芽管，但没有发生吸器的生长。吸器的形成是形成次级菌丝的条件。

相对侵入效率(RPE)计算为转化的细胞(用Pp291或Pp364 cDNA转化)中的侵入效率与未转化的细胞中的侵入效率(这里：平均侵入效率为57％)的差异。RPE的百分数(％RPE)计算为RPE减去1后乘以100所得的值。

％RPE＝100×(RPE-1)

％RPE值(相对于对照的平均侵入效率的偏差数)用于确定用Pp291或Pp364 cDNA转化的细胞的易感性。

在5个独立的实验中，对照cDNA揭示了对于禾本科布氏白粉菌大麦专化型的侵入效率，用对照cDNA和水转染两者间没有差别。为了排除cDNA对于转化率和受攻击细胞的存活率的影响，比较了对照和Pp291或Pp364 cDNA实验之间的表达GFP细胞的数目。Pp291和Pp364 cDNA对于总数和受攻击的GFP表达细胞的数目没有影响。

Pp291和Pp364的转染率导致禾本科布氏白粉菌大麦专化型的侵入频率急剧下降(平均％RPE值＝-30％)。

附图说明

图1：亲和纯化克隆Pp291(A)；用pH梯度洗脱：M＝分子标记；1＝空白载体pQE30(未诱导)；2＝pQE30(IPTG诱导的)；3＝未诱导的Pp291；4＝诱导的Pp291；5＝超离心1后的上清液；6＝超离心2后的上清液；7＝洗脱物；8，9，10＝洗涤步骤pH 8，pH 7，pH 6；11，12＝洗脱步骤pH 5，pH 4；(B)用咪唑梯度洗脱：M＝分子标记；1到11增加咪唑浓度(mM)：0，20，40，60，80，100，125，150，200，250，300。

图2：光度活力测定：所示为加入克隆Pp291的细胞裂解液(C)、该细胞裂解液的1∶50稀释物(B)和空白载体pQE30(A)后氢过氧化物溶液在234nm的吸收下降。

图3：在氢过氧化物和二乙烯基醚合酶的反应中形成的挥发性醛的衍生物腙的HPLC分析的洗脱图：用醛衍生试剂处理colneleic(一种二乙烯基醚)后检测到(2E)-壬烯醛。

图4：由克隆Pp364编码的DES酶催化底物13-HPOTE和9-HPODE形成的产物(醛类)的HPLC分析的洗脱图。基于它们的存留时间鉴定它们为(2E)-己烯醛和(2E)-壬烯醛。

图5：由克隆Pp291编码的AOS酶转化氢过氧化物形成的非挥发性产物的HPLC分析的洗脱图。

图6：由克隆Pp364编码的DES酶转化氢过氧化物形成的非挥发性产物的HPLC分析的洗脱图。

a＝细胞裂解液；b＝纯化的酶。

图7：通过克隆Pp291编码的CYP74酶的催化作用形成的产物的GC/MS层析谱。在18.2分钟时的信号具有窗口中所示的质谱。

图8：克隆Pp291编码的酶的相对酶活力的pH函数。

图9：克隆Pp291编码的CYP74酶对各种底物的相对转化率(底物专一性)；每种情况下底物浓度为20μM；用光度法测量；n.d.＝未能检测到。

序列表

<110>巴斯福植物科学有限公司(BASF Plant Schience GmbH)

<120>分离自展叶剑叶藓的CYP74酶家族之丙二烯氧化物合酶和二乙烯基醚合酶和编码这些合酶的核苷酸

序列以及产生病原体抗性植物的方法

<130>1

<160>13

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1428

<212>DNA

<213>展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1428)

<223>Pp291丙二烯氧化物合酶

<400>1

atg gca gtc cct tca tcc aag ctg ccg ttg aag gcg att cct gga gac 48

Met Ala Val Pro Ser Ser Lys Leu Pro Leu Lys Ala Ile Pro Gly Asp

1 5 10 15

tat gga gtc ccc tac ttc ggt gcc ata aag gat cga cta gac tac ttt 96

Tyr Gly Val Pro Tyr Phe Gly Ala Ile Lys Asp Arg Leu Asp Tyr Phe

20 25 30

tgg ttg cag ggg gag gag cag ttt tac cga agc cgg atg gcc aag tac 144

Trp Leu Gln Gly Glu Glu Gln Phe Tyr Arg Ser Arg Met Ala Lys Tyr

35 40 45

aat agc acg gtg ttt cgt gtc aac atg ccg cct ggc cct cca att tcc 192

Asn Ser Thr Val Phe Arg Val Asn Met Pro Pro Gly Pro Pro Ile Ser

50 55 60

gaa cac cct caa gtc atc tgc ctc ttg gat cag aaa agc ttt cca att 240

Glu His Pro Gln Val Ile Cys Leu Leu Asp Gln Lys Ser Phe Pro Ile

65 70 75 80

ctg ttc gac gtt agc aag gtt gag aaa aag gac gtg ttc aca gga aca 288

Leu Phe Asp Val Ser Lys Val Glu Lys Lys Asp Val Phe Thr Gly Thr

85 90 95

tac atg ccg agt gtg agc ttc acc agc ggg tac cgc gtt tgc tcc tac 336

Tyr Met Pro Ser Val Ser Phe Thr Ser Gly Tyr Arg Val Cys Ser Tyr

100 105 110

ttg gat ccc tct gag gaa cgc cac acg aag ctc aag caa tgg tgc ttt 384

Leu Asp Pro Ser Glu Glu Arg His Thr Lys Leu Lys Gln Trp Cys Phe

115 120 125

gaa gtc att gcg atg aac ggg cgg aac ttt ctt ccc gag ttt cac aag 432

Glu Val Ile Ala Met Asn Gly Arg Asn Phe Leu Pro Glu Phe His Lys

130 135 140

tcg att gaa gag tcg atg gtg ctc tgg gag acg agt ctg gcc aag ggc 480

Ser Ile Glu Glu Ser Met Val Leu Trp Glu Thr Ser Leu Ala Lys Gly

145 150 155 160

gag aag act agc gta tcg gat gag gtg aaa cag ttc gcg ttt aat ttc 528

Glu Lys Thr Ser Val Ser Asp Glu Val Lys Gln Phe Ala Phe Asn Phe

165 170 175

ctg atg cgc gct gta tgc cat cac gac ccc gct gcg cct gga gaa tac 576

Leu Met Arg Ala Val Cys His His Asp Pro Ala Ala Pro Gly Glu Tyr

180 185 190

agc tta ggg cgt aat ggt ggc ccg tat gca acc gcc tgg gca aat ccc 624

Ser Leu Gly Arg Asn Gly Gly Pro Tyr Ala Thr Ala Trp Ala Asn Pro

195 200 205

cag ctc gct ccg att gca gga cag acg ggt ctc ccc cat gtc gtg gag 672

Gln Leu Ala Pro Ile Ala Gly Gln Thr Gly Leu Pro His Val Val Glu

210 215 220

gag ctc gtg tta cac acc gtc cca ctc ccc tct gcc ctg gtc aag aag 720

Glu Leu Val Leu His Thr Val Pro Leu Pro Ser Ala Leu Val Lys Lys

225 230 235 240

aac tac gat gcc ctc tac aat ttc atc aaa aac tac gcc acc gag gcg 768

Asn Tyr Asp Ala Leu Tyr Asn Phe Ile Lys Asn Tyr Ala Thr Glu Ala

245 250 255

ctg gat agg gct gaa gct atg ggc atc gag cgc aat gac gcc act gcc 816

Leu Asp Arg Ala Glu Ala Met Gly Ile Glu Arg Asn Asp Ala Thr Ala

260 265 270

aac ctg ctg ttc ttc ctt tgc ttt aac gcc tac ggc gga ttc agc atc 864

Asn Leu Leu Phe Phe Leu Cys Phe Asn Ala Tyr Gly Gly Phe Ser Ile

275 280 285

ttc ttc ccc ctc atc act atc ctc att tct tca tgc ggt ccg gag ctc 912

Phe Phe Pro Leu Ile Thr Ile Leu Ile Ser Ser Cys Gly Pro Glu Leu

290 295 300

atg cac gat ctc cac gac gaa gtc acc aag gcc gtc gcc gcc aca gat 960

Met His Asp Leu His Asp Glu Val Thr Lys Ala Val Ala Ala Thr Asp

305 310 315 320

ggg aaa gtc act ctt caa tcc atc gag aac atg cca ttg gtg aag tcc 1008

Gly Lys Val Thr Leu Gln Ser Ile Glu Asn Met Pro Leu Val Lys Ser

325 330 335

gtc gtc tac gaa gct ttc cga ttc aag ccc cca gtg cca tac caa tac 1056

Val Val Tyr Glu Ala Phe Arg Phe Lys Pro Pro Val Pro Tyr Gln Tyr

340 345 350

ggc aag gcc aag ttc gac ttc acc ata gag aac cac gaa aac tcc ttc 1104

Gly Lys Ala Lys Phe Asp Phe Thr Ile Glu Asn His Glu Asr Ser Phe

355 360 365

gag gtc aag aag gga gaa atg ctg tat ggt tat caa cct atc gtg atg 1152

Glu Val Lys Lys Gly Glu Met Leu Tyr Gly Tyr Gln Pro Ile Val Met

370 375 380

cac gac ccc aag gtc ttc tcg gac cca gat cag ttt cta cct cga cga 1200

His Asp Pro Lys Val Phe Ser Asp Pro Asp Gln Phe Leu Pro Arg Arg

385 390 395 400

ttc atg ggc ccc gac ggc gag aag ctc atc aaa tac atc ttc tgg tcc 1248

Phe Met Gly Pro Asp Gly Glu Lys Leu Ile Lys Tyr Ile Phe Trp Ser

405 410 415

aat ggt tac gag act gac gag ccg act acc gca aac aag cag tgc gcc 1296

Asn Gly Tyr Glu Thr Asp Glu Pro Thr Thr Ala Asn Lys Gln Cys Ala

420 425 430

gga aag gac ttg gtg gtc aca atg gcg cga gca ttc gtc gca gaa atg 1344

Gly Lys Asp Leu Val Val Thr Met Ala Arg Ala Phe Val Ala Glu Met

435 440 445

ttc ttg aga tat aaa gag tat acc ctg acc atg gag ggc gca gga aat 1392

Phe Leu Arg Tyr Lys Glu Tyr Thr Leu Thr Met Glu Gly Ala Gly Asn

450 455 460

gcg acc aag gtt ttc ttt tcc gat ctc aaa aag tga 1428

Ala Thr Lys Val Phe Phe Ser Asp Leu Lys Lys

465 470 475

<210>2

<211>475

<212>PRT

<213>展叶剑叶藓

<400>2

Met Ala Val Pro Ser Ser Lys Leu Pro Leu Lys Ala Ile Pro Gly Asp

1 5 10 15

Tyr Gly Val Pro Tyr Phe Gly Ala Ile Lys Asp Arg Leu Asp Tyr Phe

20 25 30

Trp Leu Gln Gly Glu Glu Gln Phe Tyr Arg Ser Arg Met Ala Lys Tyr

35 40 45

Asn Ser Thr Val Phe Arg Val Asn Met Pro Pro Gly Pro Pro Ile Ser

50 55 60

Glu His Pro Gln Val Ile Cys Leu Leu Asp Gln Lys Ser Phe Pro Ile

65 70 75 80

Leu Phe Asp Val Ser Lys Val Glu Lys Lys Asp Val Phe Thr Gly Thr

85 90 95

Tyr Met Pro Ser Val Ser Phe Thr Ser Gly Tyr Arg Val Cys Ser Tyr

100 105 110

Leu Asp Pro Ser Glu Glu Arg His Thr Lys Leu Lys Gln Trp Cys Phe

115 120 125

Glu Val Ile Ala Met Asn Gly Arg Asn Phe Leu Pro Glu Phe His Lys

130 135 140

Ser Ile Glu Glu Ser Met Val Leu Trp Glu Thr Ser Leu Ala Lys Gly

145 150 155 160

Glu Lys Thr Ser Val Ser Asp Glu Val Lys Gln Phe Ala Phe Asn Phe

165 170 175

Leu Met Arg Ala Val Cys His His Asp Pro Ala Ala Pro Gly Glu Tyr

180 185 190

Ser Leu Gly Arg Asn Gly Gly Pro Tyr Ala Thr Ala Trp Ala Asn Pro

195 200 205

Gln Leu Ala Pro Ile Ala Gly Gln Thr Gly Leu Pro His Val Val Glu

210 215 220

Glu Leu Val Leu His Thr Val Pro Leu Pro Ser Ala Leu Val Lys Lys

225 230 235 240

Asn Tyr Asp Ala Leu Tyr Asn Phe Ile Lys Asn Tyr Ala Thr Glu Ala

245 250 255

Leu Asp Arg Ala Glu Ala Met Gly Ile Glu Arg Asn Asp Ala Thr Ala

260 265 270

Asn Leu Leu Phe Phe Leu Cys Phe Asn Ala Tyr Gly Gly Phe Ser Ile

275 280 285

Phe Phe Pro Leu Ile Thr Ile Leu Ile Ser Ser Cys Gly Pro Glu Leu

290 295 300

Met His Asp Leu His Asp Glu Val Thr Lys Ala Val Ala Ala Thr Asp

305 310 315 320

Gly Lys Val Thr Leu Gln Ser Ile Glu Asn Met Pro Leu Val Lys Ser

325 330 335

Val Val Tyr Glu Ala Phe Arg Phe Lys Pro Pro Val Pro Tyr Gln Tyr

340 345 350

Gly Lys Ala Lys Phe Asp Phe Thr Ile Glu Asn His Glu Asn Ser Phe

355 360 365

Glu Val Lys Lys Gly Glu Met Leu Tyr Gly Tyr Gln Pro Ile Val Met

370 375 380

His Asp Pro Lys Val Phe Ser Asp Pro Asp Gln Phe Leu Pro Arg Arg

385 390 395 400

Phe Met Gly Pro Asp Gly Glu Lys Leu Ile Lys Tyr Ile Phe Trp Ser

405 410 415

Asn Gly Tyr Glu Thr Asp Glu Pro Thr Thr Ala Asn Lys Gln Cys Ala

420 425 430

Gly Lys Asp Leu Val Val Thr Met Ala Arg Ala Phe Val Ala Glu Met

435 440 445

Phe Leu Arg Tyr Lys Glu Tyr Thr Leu Thr Met Glu Gly Ala Gly Asn

450 455 460

Ala Thr Lys Val Phe Phe Ser Asp Leu Lys Lys

465 470 475

<210>3

<211>1821

<212>DNA

<213>展叶剑叶藓

<220>

<221>CDS

<222>(25)..(1623)

<223>Pp364二乙烯基醚合酶

<400>3

gcggaaaact ccgctccgat caat atg gat cgc act tta gtt ctg act tgc 51

Met Asp Arg Thr Leu Val Leu Thr Cys

1 5

act acg act tgc agc cac tcc gca ttc cgc cag tct gca ttg cct agc 99

Thr Thr Thr Cys Ser His Ser Ala Phe Arg Gln Ser Ala Leu Pro Ser

10 15 20 25

aac acc agc ata tct gtg agg tta gga aca tgt agc gtt cgc aca cag 147

Asn Thr Ser Ile Ser Val Arg Leu Gly Thr Cys Ser Val Arg Thr Gln

30 35 40

aag cgc cgt acg gtt gta gcc agt ctt ggg aac att gag acg aca tcg 195

Lys Arg Arg Thr Val Val Ala Ser Leu Gly Asn Ile Glu Thr Thr Ser

45 50 55

aca tcg acc gtg ggg caa gag agc aat ctg ccc ctc cgt gaa atc ccc 243

Thr Ser Thr Val Gly Gln Glu Ser Asn Leu Pro Leu Arg Glu Ile Pro

60 65 70

gga agc tac gga atc cct tat ttg tcg caa ttg ctc gac aga tgg acc 291

Gly Ser Tyr Gly Ile Pro Tyr Leu Ser Gln Leu Leu Asp Arg Trp Thr

75 80 85

ttt ttt tac agg gaa ggc gaa ccg cag ttc tgg caa tca cga atg gcg 339

Phe Phe Tyr Arg Glu Gly Glu Pro Gln Phe Trp Gln Ser Arg Met Ala

90 95 100 105

aag tat ggg agc acc gtg att cga tcc aac atg ccg cct ggt tgg ttt 3 87

Lys Tyr Gly Ser Thr Val Ile Arg Ser Asn Met Pro Pro Gly Trp Phe

110 115 120

tgg acc gac tcc cgc tgc att atg ctt ctt gac cag aag agc tac ccc 435

Trp Thr Asp Ser Arg Cys Ile Met Leu Leu Asp Gln Lys Ser Tyr Pro

125 130 135

acc gtc ttt gat tac gat aag gtg gat aag tac aaa gcc ttt gct ggg 483

Thr Val Phe Asp Tyr Asp Lys Val Asp Lys Tyr Lys Ala Phe Ala Gly

140 145 150

acc atc atg cca agc acc gaa tac aat ggc ggg tat gag gtg tgt gcg 531

Thr Ile Met Pro Ser Thr Glu Tyr Asn Gly Gly Tyr Glu Val Cys Ala

155 160 165

tac ctc gac gct tct gac aag aag cat gag cag ctc aaa ggc tat tgc 579

Tyr Leu Asp Ala Ser Asp Lys Lys His Glu Gln Leu Lys Gly Tyr Cys

170 175 180 185

ttc gag ctt ctc aaa ttt tcc tcg tcg aaa tgg gca cgg gag ttt cac 627

Phe Glu Leu Leu Lys Phe Ser Ser Ser Lys Trp Ala Arg Glu Phe His

190 195 200

acg gcc atc tca gag aca ttc aat cag tgg gaa ggc aaa ctt gca caa 675

Thr Ala Ile Ser Glu Thr Phe Asn Gln Trp Glu Gly Lys Leu Ala Gln

205 210 215

aag acg cct gca tta att aac ccg acg ctt cct gaa tcg ctc ttt agt 723

Lys Thr Pro Ala Leu Ile Asn Pro Thr Leu Pro Glu Ser Leu Phe Ser

220 225 230

ttt gtg atc aat gca ctg act acc gct aga ttc gac gac agt agc ata 771

Phe Val Ile Asn Ala Leu Thr Thr Ala Arg Phe Asp Asp Ser Ser Ile

235 240 245

ccc gat gca gag aag cca gtc tgc ggg gat ttg caa aaa tgg gcg gga 819

Pro Asp Ala Glu Lys Pro Val Cys Gly Asp Leu Gln Lys Trp Ala Gly

250 255 260 265

ttc cag ctg atg ccc gta atc aga acc ggg gca cct atc tac att gaa 867

Phe Gln Leu Met Pro Val Ile Arg Thr Gly Ala Pro Ile Tyr Ile Glu

270 275 280

gag atg ctc cac gtt gct ccc atc cct gca agc cta act aaa ggg ggc 915

Glu Met Leu His Val Ala Pro Ile Pro Ala Ser Leu Thr Lys Gly Gly

285 290 295

tat gac aaa atg gtg gtg ttt ctt caa aag tat gcg gct gaa acg cta 963

Tyr Asp Lys Met Val Val Phe Leu Gln Lys Tyr Ala Ala Glu Thr Leu

300 305 310

tcc atc gca gag aag ttt ggg ttg tct cag gac gag gcg gtt cac aac 1011

Ser Ile Ala Glu Lys Phe Gly Leu Ser Gln Asp Glu Ala Val His Asn

315 320 325

ttg atc ttc ttc cta atc ttg aac gct cat ggc gga ttc tgc cgg ttc 1059

Leu Ile Phe Phe Leu Ile Leu Asn Ala His Gly Gly Phe Cys Arg Phe

330 335 340 345

ctt cca gtg atc ctt cgg gaa gta gcc aag aat ggc caa ctg caa gct 1107

Leu Pro Val Ile Leu Arg Glu Val Ala Lys Asn Gly Gln Leu Gln Ala

350 355 360

gat ttg cga gag gaa gtg cgg gcc gca gtg aaa gcc agc gga tcg gac 1155

Asp Leu Arg Glu Glu Val Arg Ala Ala Val Lys Ala Ser Gly Ser Asp

365 370 375

caa gtg acc atg aag gcc gtg atg aat gac atg cct ctg gtg gca tcg 1203

Gln Val Thr Met Lys Ala Val Met Asn Asp Met Pro Leu Val Ala Ser

380 385 390

aca gta ttc gag gcg ctc cgc ttc gac ccc ccg gtg cca ttt cag tac 1251

Thr Val Phe Glu Ala Leu Arg Phe Asp Pro Pro Val Pro Phe Gln Tyr

395 400 405

gcc aga gcg aag aag gac ttc atc atc gaa tcc cac gac gcg aga tac 1299

Ala Arg Ala Lys Lys Asp Phe Ile Ile Glu Ser His Asp Ala Arg Tyr

410 415 420 425

caa ata aaa acc ggc gac ttc ctc ggc ggc gtg aac tac atg gtc tcc 1347

Gln Ile Lys Thr Gly Asp Phe Leu Gly Gly Val Asn Tyr Met Val Ser

430 435 440

cgc gac ccg aag gtg ttc acc gac agg ccc aac gag ttc aac gcg cgg 1395

Arg Asp Pro Lys Val Phe Thr Asp Arg Pro Asn Glu Phe Asn Ala Arg

445 450 455

cgg ttc atg gga ccg gag ggg gac aag ctg ctt gca cat ttg gtg tgg 1443

Arg Phe Met Gly Pro Glu Gly Asp Lys Leu Leu Ala His Leu Val Trp

460 465 470

tcg aac ggc cgg caa act gat gaa acc acg gtg tac aca aag cag tgt 1491

Ser Asn Gly Arg Gln Thr Asp Glu Thr Thr Val Tyr Thr Lys Gln Cys

475 480 485

gcg ggg aag gag att gtg ccg ctc aca ggg cgc ctt ctt ctg gcg gag 1539

Ala Gly Lys Glu Ile Val Pro Leu Thr Gly Arg Leu Leu Leu Ala Glu

490 495 500 505

ctt ttc atg cgc ttc gat tcc ttc aac atc gaa ggc ctc gaa atg gag 1587

Leu Phe Met Arg Phe Asp Ser Phe Asn Ile Glu Gly Leu Glu Met Glu

510 515 520

gca acc ttc act tca ctg acg ccg cga tca gat tga agctatagct 1633

Ala Thr Phe Thr Ser Leu Thr Pro Arg Ser Asp

525 530

tgtaaaacac ccaccccacg ttgtgagatt attagtacca cgtacatcag tagttcacga 1693

gactcatatt ctgatccatc atcgcctgga tgtcgaaact gactatatgt agtatactcg 1753

actttgtatg ccaaaaacac attttcaatt tgtctaatcg gccctgtttc cacttcaaaa 1813

aaaaaaaa 1821

<210>4

<211>532

<212>PRT

<213>展叶剑叶藓

<400>4

Met Asp Arg Thr Leu Val Leu Thr Cys Thr Thr Thr Cys Ser His Ser

1 5 10 15

Ala Phe Arg Gln Ser Ala Leu Pro Ser Asn Thr Ser Ile Ser Val Arg

20 25 30

Leu Gly Thr Cys Ser Val Arg Thr Gln Lys Arg Arg Thr Val Val Ala

35 40 45

Ser Leu Gly Asn Ile Glu Thr Thr Ser Thr Ser Thr Val Gly Gln Glu

50 55 60

Ser Asn Leu Pro Leu Arg Glu Ile Pro Gly Ser Tyr Gly Ile Pro Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Gln Leu Leu Asp Arg Trp Thr Phe Phe Tyr Arg Glu Gly Glu

85 90 95

Pro Gln Phe Trp Gln Ser Arg Met Ala Lys Tyr Gly Ser Thr Val Ile

100 105 110

Arg Ser Asn Met Pro Pro Gly Trp Phe Trp Thr Asp Ser Arg Cys Ile

115 120 125

Met Leu Leu Asp Gln Lys Ser Tyr Pro Thr Val Phe Asp Tyr Asp Lys

130 135 140

Val Asp Lys Tyr Lys Ala Phe Ala Gly Thr Ile Met Pro Ser Thr Glu

145 150 155 160

Tyr Asn Gly Gly Tyr Glu Val Cys Ala Tyr Leu Asp Ala Ser Asp Lys

165 170 175

Lys His Glu Gln Leu Lys Gly Tyr Cys Phe Glu Leu Leu Lys Phe Ser

180 185 190

Ser Ser Lys Trp Ala Arg Glu Phe His Thr Ala Ile Ser Glu Thr Phe

195 200 205

Asn Gln Trp Glu Gly Lys Leu Ala Gln Lys Thr Pro Ala Leu Ile Asn

210 215 220

Pro Thr Leu Pro Glu Ser Leu Phe Ser Phe Val Ile Asn Ala Leu Thr

225 230 235 240

Thr Ala Arg Phe Asp Asp Ser Ser Ile Pro Asp Ala Glu Lys Pro Val

245 250 255

Cys Gly Asp Leu Gln Lys Trp Ala Gly Phe Gln Leu Met Pro Val Ile

260 265 270

Arg Thr Gly Ala Pro Ile Tyr Ile Glu Glu Met Leu His Val Ala Pro

275 280 285

Ile Pro Ala Ser Leu Thr Lys Gly Gly Tyr Asp Lys Met Val Val Phe

290 295 300

Leu Gln Lys Tyr Ala Ala Glu Thr Leu Ser Ile Ala Glu Lys Phe Gly

305 310 315 320

Leu Ser Gln Asp Glu Ala Val His Asn Leu Ile Phe Phe Leu Ile Leu

325 330 335

Asn Ala His Gly Gly Phe Cys Arg Phe Leu Pro Val Ile Leu Arg Glu

340 345 350

Val Ala Lys Asn Gly Gln Leu Gln Ala Asp Leu Arg Glu Glu Val Arg

355 360 365

Ala Ala Val Lys Ala Ser Gly Ser Asp Gln Val Thr Met Lys Ala Val

370 375 380

Met Asn Asp Met Pro Leu Val Ala Ser Thr Val Phe Glu Ala Leu Arg

385 390 395 400

Phe Asp Pro Pro Val Pro Phe Gln Tyr Ala Arg Ala Lys Lys Asp Phe

405 410 415

Ile Ile Glu Ser His Asp Ala Arg Tyr Gln Ile Lys Thr Gly Asp Phe

420 425 430

Leu Gly Gly Val Asn Tyr Met Val Ser Arg Asp Pro Lys Val Phe Thr

435 440 445

Asp Arg Pro Asn Glu Phe Asn Ala Arg Arg Phe Met Gly Pro Glu Gly

450 455 460

Asp Lys Leu Leu Ala His Leu Val Trp Ser Asn Gly Arg Gln Thr Asp

465 470 475 480

Glu Thr Thr Val Tyr Thr Lys Gln Cys Ala Gly Lys Glu Ile Val Pro

485 490 495

Leu Thr Gly Arg Leu Leu Leu Ala Glu Leu Phe Met Arg Phe Asp Ser

500 505 510

Phe Asn Ile Glu Gly Leu Glu Met Glu Ala Thr Phe Thr Ser Leu Thr

515 520 525

Pro Arg Ser Asp

530

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>T7lang，RACE-引物

<222>(1)..(30)

<223>

<400>5

gtaatacgac tcactatagg gcgaattggg 30

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>M13rev；RACE-引物

<222>(1)..(19)

<223>

<400>6

ggaaacagct atgaccatg 19

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>PP291AOS5R；基因特异性RACE-引物

<222>(1)..(23)

<223>

<400>7

tcacctcatc cgatacgcta gtc 23

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>Pp364AOS5R；基因特异性RACE-引物

<222>(1)..(22)

<223>

<400>8

gtcgatgtcg tctcaatgtt cc 22

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>Pp364AOS5R2；基因特异性RACE-引物

<222>(1)..(23)

<223>

<400>9

ccattcgtga ttgccagaac tgc 23

<210>10

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>Pp291/5′-sphI；表达引物

<222>(1)..(31)

<223>

<400>10

aaagcatgca tggcagtccc ttcatccaag c 31

<210>11

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>Pp291/3′PstI；表达引物

<222>(1)..(45)

<223>

<400>11

aaactgcagt cactttttga gatcggaaaa gaaaaccttg gtcgc 45

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>Pp364/5′BamHI；表达引物

<222>(1)..(30)

<223>

<400>12

ggatcccgta cggttgtagc cagtcttggg 30

<210>13

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>Pp364/3′HindIII；表达引物

<222>(1)..(29)

<223>

<400>13

aagctttcaa tctgatcgcg gcgtcagtg 29

Claims

1.一种具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的丙二烯氧化物合酶或其同工酶。

2.一种具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列的二乙烯基醚合酶或其同工酶。

3.一种如权利要求1或2所述的酶，其转化作为底物的9-HPOD/TE和13-HPOD/TE。

4.一种如权利要求1-3之任一项所述的酶，其源自藓类或高等植物。

5.一种如权利要求1-4之任一项所述的酶，其源自展叶剑叶藓。

6.一种编码如权利要求1所述的丙二烯氧化物合酶的分离的核苷酸序列，其中所述酶参与多不饱和脂肪酸的生物合成，该核苷酸序列选自：

a)如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，

b)与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列至少有70％同一性的核苷酸序列，

c)与a)或b)互补的核苷酸序列。

7.一种编码如权利要求2所述的二乙烯基醚合酶的分离的核苷酸序列，其中所述酶参与多不饱和脂肪酸的生物合成，该核苷酸序列选自：

a)如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，

b)与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列至少有70％同一性的核苷酸序列，

c)与a)或b)互补的核苷酸序列。

8.一种如权利要求6或7所述的分离的核苷酸序列，其源自藓类或高等植物。

9.一种如权利要求6-8任一项所述的分离的核苷酸序列，其源自展叶剑叶藓。

10.一种基因构建体，其含有至少一种如权利要求6-9任一项所述的核苷酸序列、该序列的等位基因、衍生物或部分以及与之可操作地连接的核苷酸调节序列。

11.一种载体，其含有至少一种如权利要求6-9任一项所述的分离核苷酸序列、它的等位基因、衍生物和/或部分和/或如权利要求10所述的基因构建体以及额外的核苷酸序列，所述额外序列用于筛选和/或在宿主细胞中的复制和/或向宿主细胞基因组的整合。

12.一种转基因植物细胞、完整的植株和/或它们的子代，其含有可复制形式的至少一种如权利要求6-9任一项所述的分离的核苷酸序列、它的等位基因、衍生物和/或部分和/或如权利要求10所述的基因构建体和/或如权利要求11所述的载体，并且与内源性基因表达相比，其显示出编码丙二烯氧化物合酶的核苷酸序列和/或编码二乙烯基醚合酶的核苷酸序列的表达的增加，这使得植物对病原体的抗性增强。

13.一种如权利要求12所述的转基因植物细胞、完整的植株和/或它们的子代，其中至少一种如权利要求6-9任一项所述的核苷酸序列、它的等位基因、衍生物和/或部分和/或如权利要求10所述的基因构建体和/或如权利要求11所述的载体以染色体外形式存在和/或稳定整合到植物基因组中。

14.一种如权利要求12或13所述的转基因植物细胞、完整的植株和/或它们的子代，其具有和植物细胞中相应的内源性酶比活相比比活增加的如权利要求1所述的丙二烯氧化物合酶、它的同工酶、衍生物和/或部分和/或如权利要求2所述的二乙烯基醚合酶、它的同工酶、衍生物和/或部分。

15.一种如权利要求12-14任一项所述的转基因植物细胞、完整的植株和/或它们的子代，其为有用植物或它的细胞，优选来自茄科或谷类，特别优选马铃薯、大麦或小麦。

16.一种增加植物对病原体的抗性的方法，其包括向植物细胞中转移可复制形式的单独或组合的如权利要求6-9任一项所述的核苷酸序列和/或如权利要求10所述的基因构建体和/或如权利要求11所述的载体，和从由此转化的植物细胞再生完整植株。

17.如权利要求16所述的方法，其中所使用的植物细胞为来自有用植物的细胞，优选来自茄科或谷类，特别优选马铃薯、大麦或小麦。

18.至少一种如权利要求6-9任一项所述的核苷酸序列在增加植物细胞、完整的植株和/或它们的子代对病原体的抗性中的用途。

19.至少一种如权利要求1-8任一项所述的酶在增加植物细胞、完整的植株和/或它们的子代对病原体的抗性中的用途。

20.如权利要求19所述的用途，其中和相应的内源性酶比活相比，至少一种酶的增加的比活使得植物细胞或植物对病原体的抗性增加20-90％，优选30-80％，特别优选40-70％。

21.权利要求19或20所述的用途，其中至少一种酶使得对霉菌，优选禾本科布氏白粉菌大麦专化型或小麦专化型和/或致病疫霉的抗性增加。