ES2257587T3 - Aleno oxido sintasa y divinil eter sintasa de la familia de enzimas cyp74 aisladas de physcomitrella patens, secuencias de nucleotidos que las codifican y procedimiento para la produccion de plantas resistentes a los patogenos. - Google Patents
Aleno oxido sintasa y divinil eter sintasa de la familia de enzimas cyp74 aisladas de physcomitrella patens, secuencias de nucleotidos que las codifican y procedimiento para la produccion de plantas resistentes a los patogenos.Info
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Abstract
Aleno óxido sintasa con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la ID SEC No 2. La presente invención tiene por objetivo poner a disposición células vegetales transgénicas, plantas transgénicas y su descendencia, que presenten una resistencia elevada a los patógenos, y también proporcionar procedimientos correspondientemente mejorados para su producción. Este objetivo se resuelve mediante una aleno óxido sintasa con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la ID SEC No 2 y/o una divinil éter sintasa con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la ID SEC No 4. Las dos enzimas arriba mencionadas pertenecen a la familia de las enzimas CYP74. Un aumento de la actividad específica de estas enzimas CYP74, individualmente o en combinación, con respecto a la actividad específica de estas enzimas presente de forma endógena en una célula vegetal, conduce a un aumento de la resistencia de una célula vegetal frente a agentes patógenos. En este contexto, una actividad específica de las enzimasCYP aumentada según la invención comparada con la actividad específica presente de forma endógena en células vegetales o plantas produce un aumento de la resistencia de las células vegetales o las plantas frente a agentes patógenos de un 20-90%, preferentemente de un 30-80% y en especial de un 40-70%. La resistencia de la planta se determina a través de la disminución de la frecuencia de penetración. De acuerdo con la invención, por ¿frecuencia de penetración¿ se ha de entender la cantidad de puntos de infección en células epidérmicas con éxito, dividida por la cantidad total de lugares de infección.
Description
Aleno óxido sintasa y divinil éter sintasa de la
familia de enzimas CYP74 aisladas de Physcomitrella patens,
secuencias de nucleótidos que las codifican y procedimiento para la
producción de plantas resistentes a los patógenos.
La presente invención se refiere a enzimas del
tipo citocromo-P450 y al aislamiento de las
secuencias de nucleótidos codificadoras correspondientes, y también
a su utilización en un procedimiento para producir células
vegetales y descendientes de las mismas resistentes a los
patógenos.
El tipo de enzimas citocromo-P450
incluye enzimas aleno óxido sintasa (AOS), hidroperóxido liasa
(HPL) y divinil éter sintasa (DES). Éstas constituyen una subfamilia
propia con el nombre CYP74. Debido a la gran cantidad de
enzimas citocromo-P450, se ha desarrollado una
nomenclatura que asigna a cada proteína de esta clase una familia y
subfamilia específica en función de su estructura primaria. Así,
todas las AOS constituyen la subfamilia propia CYP74A, la
subfamilia CYP74B incluye las 13-HLP,
CYP74C incluye las 9/13-HPL y CYP74D
las 9-DES (Feussner y col., 2001, Trends Plant
Sci. 6, 268-273). Las proteínas de la misma
subfamilia se numeran correlativamente de forma cronológica.
Las enzimas CYP74 son monooxigenasas con una
molécula hemo como grupo prostético. Aunque también portan como
grupo prostético un grupo protoporfirina IX (hemo b), sólo poseen
una muy reducida afinidad por CO (Matsui, 1998, Belgian Journal
of Botany. 131, 50-62).
Son enzimas importantes en el metabolismo de
ácidos grasos poliénicos, la denominada vía de reacción de
lipoxigenasa (LOX) (Feussner y Wastemack, 1998, Fett/Lipid.
100, 146-152).
Las LOXs son dioxigenasas en las que el hierro
está unido a cadenas laterales de aminoácidos en el centro
catalítico (Brash, 1999, J. Biol. Chem. 274,
23679-23682). Catalizan la incorporación de oxígeno
molecular al sistema (1Z,4Z)-pentadieno de múltiples
ácidos grasos insaturados. En las plantas se trata principalmente
de ácido linoleico y ácido \alpha-linolénico.
Dependiendo de la regioselectividad de las LOX utilizadas, como
productos se pueden formar dos hidroperóxidos isómeros de posición
diferentes: (9S)-isómeros o
(13S)-isómeros. Por ejemplo, a partir de
ácido \alpha-linolénico se forma ácido
(13S,9Z,11E,15Z)-13-hidroperoxi-9,11,15-octadecatrienoico
(13S-HPOTE) y a partir de ácido linoleico se forma
ácido
(13S,9Z,11E)-13-hidroperoxi-9,11-octadecadienoico
(13S-HPODE).
En las plantas, la transformación de estos
hidroperóxidos continúa rápidamente gracias a numerosas enzimas.
Actualmente, en el reino vegetal se conocen siete familias
diferentes de enzimas que transforman hidroperóxidos y, en
consecuencia, compiten por productos LOX: la reacción de aleno óxido
sintasa (AOS), la reacción de hidroperóxido liasa (HPL), la
reacción de divinil éter sintasa (DES), la reacción de reductasa,
la reacción de peroxigenasa, la reacción de epoxi alcohol sintasa
(EAS) y la propia reacción de LOX (Feussner y col., 2001, Trends
Plant Sci. 6, 268-273). En la reacción de
13-HPOTE en presencia de la enzima aleno óxido
sintasa (AOC) se observa la ciclización a ácido
12-oxofitodienoico
(12-oxo-PDA) (Ziegler y col., 2000,
J. Biol. chem. 275, 19132-8), que es a su vez
precursor del ácido jasmónico, que forma parte de las hormonas
vegetales.
La AOS (EC4.2.1.92; CYP74A) es la primera enzima
CYP74 descrita y se aisló por vez primera del lino como
proteína homogénea (Song y Brash, 1991, Science. 253,
781-784). Cataliza la transformación en un óxido de
aleno inestable, que se puede descomponer en los
\alpha-cetoles y \gamma-cetoles
correspondientes en presencia de agua. La AOS interviene en la
biosíntesis del ácido jasmónico (Vick y Zimmerman, 1983, Biochem.
Biophys. Res. Commun. 111, 470-7). El propio
ácido jasmónico interviene en la inducción de la transcripción de
ARNm y la regulación de la traducción de proteínas inducidas por
jasmonato (JIP), como LOX, AOS e inhibidores de proteinasa. Esto
hace que el ácido jasmónico sea una importante sustancia señal en la
respuesta de estrés vegetal (Wastemack y Parthier, 1997, Trends
Plant Sci. 2, 302-307). También está en
discusión su intervención en procesos de regulación del crecimiento
y de aceleración de la senescencia (Sembdner y Parthier, 1993,
Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 44,
569-589).
Ya se han clonado numerosas AOS y expresado
funcionalmente en E. coli, entre ellas las AOS de
Arabidopsis thaliana, Lycopersicon esculentum,
Linum usitatissimum y Hordeum vulgare. Aparte de la
AOS de la cebada, todas las AOS clonadas hasta ahora poseen una
especificidad de sustrato por
(13S)-hidroperóxidos (Maucher y col., 2000,
Plant J., 199-213).
La HPL (CYP74B y C) disocia los
hidroperóxidos en (3Z)-aldehídos y ácido
\omega-oxo (Matsui, 1998, Belgian Journal of
Botany, 131, 50-62). Antes de que fuera
descubierta la propia enzima, los productos de reacción de la HPL
ya se conocían como "aldehídos foliares", que son
corresponsables del olor característico de plantas y frutos
(Hatanaka, 1996, Food Rev. Int. 12, 303-350).
En el caso de 13-HPOTE como sustrato se forma
(3Z)-hexenal y ácido
(9Z)-12-oxododecenoico. Éste
se isomeriza formando ácido
(10E)-12-oxo-10-dodecenoico
(traumatina), que se está estudiando como hormona de las heridas.
También está en discusión su función como mensajero vegetal (Bate y
Rothstein, 1998, Plant J. 16, 561-569). La
traumatina también se puede oxidar formando ácido traumático, que
también parece intervenir en la respuesta de cicatrización de las
plantas (Zimmerman y Vick, 1970, Plant Physiol. 46,
445-453). Ya se han clonado y expresado en E.
coli como proteína activa, entre otras, las HPL de A.
thaliana, Cucumis sativus, Medicago sativus y L.
esculentum. También en este caso, la mayoría de las enzimas
muestran una especificidad de sustrato por
(13S)-hidroperóxidos. Únicamente una HPL de pepino
y otra de melón carecen de especificidad de sustrato y por ello se
designan como 9/13-HPL (McIntyre y col., 1999,
J. Biol. Chem. 274, 25189-25192; Matsui y
col., 2000, FEBS Left. 481, 183-188). Si se
analizan las dos secuencias en cuanto a su afinidad con respecto a
otros miembros de la familia CYP74, se observa un mayor
grado de homología con la AOS que con la 13-HPL. Por
ello, estas enzimas se clasifican en una subfamilia propia,
CYP74C (Matsui y col., 2000, FEBS Lett. 481,
183-188). En el caso de la HPL de
Arabidopsis se pudo demostrar que ésta es inducida por
heridas.
La DES (CYP74D) cataliza la formación de
divinil éteres, que muestran efecto fungicida (Weber y col. 1999).
También está en discusión si los divinil éteres, al igual que los
aldehídos en el caso de los productos de HPL, desempeñan un papel
en la defensa contra hongos y bacterias patógenos (Weber y col.,
1999, Plant Cell. 11, 485-493; Göbel y col.,
2001, J. Biol. Chem. 276, 6267-6273). La
primera DES de L. esculentum fue clonada en 2001 por Itoh y
Howe. En este contexto se observó que posee una gran homología de
secuencia con respecto a la AOS y la HPL, por lo que también se
incluye en la clase citocromo P450, subfamilia CYP74D.
Además, dentro del grupo de las CYP74, la DES tiene la
singularidad de ser la única altamente específica para el
9S-hidroperóxido (Itoh y Howe, 2001, J. Biol. Chem.
276, 3620-3627).
En la naturaleza, las enzimas P450 intervienen
con frecuencia en la biosíntesis y el metabolismo de numerosas
sustancias endógenas. Una de las principales funciones consiste en
su intervención en la destoxificación de xenobióticos. Las enzimas
P450 vegetales también intervienen en la biosíntesis de señales de
cicatrización (ácido jasmónico, ácido salicílico, traumatina) y
hormonas (giberelina, brasinoesteroides).
Los desencadenantes de señales de cicatrización
en plantas y las cascadas de transducción de señales subsiguientes
son multiformes. Se pueden desencadenar por deterioro o heridas de
la planta, pero también se pueden inducir (artificialmente)
mediante compuestos químicos aportados desde el exterior.
Pero principalmente la aparición de enfermedades
vegetales y sobre todo el aumento de la defensa de las plantas
contra estos agentes patógenos tiene una enorme relevancia para la
economía agrícola. La respuesta de una planta a un agente patógeno
puede desarrollarse por una vía completamente diferente a la defensa
de estrés por herida. La aparición de enfermedades vegetales,
provocadas por ejemplo por virus, bacterias u hongos, conduce
generalmente a daños considerables o incluso a la pérdida de toda la
planta, junto con una reducción drástica de la cantidad o la
calidad de la cosecha.
Para limitar las pérdidas de rendimiento a un
nivel económicamente razonable es indispensable aplicar medidas de
protección a las plantas. Sería particularmente deseable mejorar la
defensa de las plantas frente a agentes patógenos y/o parásitos sin
utilizar sustancias químicas, que representan una carga adicional
para el suelo y las aguas subterráneas, y también para los
usuarios.
Por ello, la presente invención tiene por
objetivo poner a disposición células vegetales transgénicas,
plantas transgénicas y su descendencia, que presenten una
resistencia elevada a los patógenos, y también proporcionar
procedimientos correspondientemente mejorados para su
producción.
Este objetivo se resuelve mediante una aleno
óxido sintasa con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la ID
SEC No 2 y/o una divinil éter sintasa con una secuencia de
aminoácidos de acuerdo con la ID SEC No 4.
Las dos enzimas arriba mencionadas pertenecen a
la familia de las enzimas CYP74. Un aumento de la actividad
específica de estas enzimas CYP74, individualmente o en combinación,
con respecto a la actividad específica de estas enzimas presente de
forma endógena en una célula vegetal, conduce a un aumento de la
resistencia de una célula vegetal frente a agentes patógenos.
En este contexto, una actividad específica de las
enzimas CYP aumentada según la invención comparada con la actividad
específica presente de forma endógena en células vegetales o plantas
produce un aumento de la resistencia de las células vegetales o las
plantas frente a agentes patógenos de un 20-90%,
preferentemente de un 30-80% y en especial de un
40-70%. La resistencia de la planta se determina a
través de la disminución de la frecuencia de penetración.
De acuerdo con la invención, por "frecuencia de
penetración" se ha de entender la cantidad de puntos de infección
en células epidérmicas con éxito, dividida por la cantidad total de
lugares de infección.
Las enzimas CYP74 según la invención,
individualmente o en combinación, producen ventajosamente un
aumento de la resistencia de las plantas frente a agentes patógenos,
por ejemplo hongos biotrofos. Preferentemente, un aumento de la
concentración (aumento de la actividad específica) de la o las
proteínas CYP74 según la invención produce un aumento de la
resistencia frente a hongos oidio, de forma especialmente
preferente Blumeria graminis f. sp. hordei o f. sp.
triciti. No obstante, esto no excluye un aumento de la
resistencia frente a otros patógenos vegetales.
Otros ejemplos de estos patógenos vegetales son
Pythium spec., Albugo spec., Rhizoctonia solani, Peronospora
parasitica, Erysiphe crucifearum, E. cichoreacearum, Alternaria
brassicicola, Botrytis cinerea, Sclerotium rolfsii, Sclerotinia
sclerotium, Fusarium oxysporum, F. culmorum, F. graminearum, F.
nivale, Phytophtora infestans o Pseudomonas
syringae.
Una característica digna de atención consiste en
que las enzimas CYP74 según la invención anteriormente mencionadas
presentan un espectro de sustrato mucho más amplio que el de las
enzimas CYP de esta clase conocidas hasta ahora. Las enzimas CTP74
según la invención pueden transformar como sustrato tanto
9-HPOD/TE como 13-HPOD/TE.
De acuerdo con la invención, las presentes
enzimas CYP74 proceden de musgos o de plantas superiores.
Preferentemente, las enzimas CYP74 según la invención proceden de
Physcomitrella patens.
Otro objeto de la presente invención consiste en
una secuencia de nucleótidos aislada que codifica una aleno óxido
sintasa del tipo arriba mencionado, que interviene en la biosíntesis
de ácidos grasos insaturados de forma múltiple para aumentar la
resistencia de células vegetales o plantas frente a agentes
patógenos, seleccionada entre
- a)
- una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la ID SEC No 1,
- b)
- una secuencia de nucleótidos que presenta como mínimo un 70% de identidad con la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC No 1,
- c)
- una secuencia de nucleótidos complementaria a a) o b).
De acuerdo con la invención también está incluida
una secuencia de nucleótidos aislada que codifica una divinil éter
sintasa del tipo arriba mencionado, que interviene en la biosíntesis
de ácidos grasos insaturados de forma múltiple para aumentar la
resistencia de células vegetales o plantas frente a agentes
patógenos, seleccionada entre
- a)
- una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la ID SEC No 3,
- b)
- una secuencia de nucleótidos que presenta como mínimo un 70% de identidad con la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC No 3,
- c)
- una secuencia de nucleótidos complementaria a a) o b).
De acuerdo con la invención, por "ácido
nucleico aislado" se ha de entender un polímero de ARN o ADN que
puede ser monocatenario o bicatenario y opcionalmente puede contener
nucleótidos naturales, sintetizados químicamente, modificados o
artificiales. La expresión "polímeros de ADN" también incluye
ADN genómico, ADNc o mezclas de éstos.
De acuerdo con la invención, por "secuencias de
nucleótidos complementarias" se han de entender secuencias de
ADN o ARN (ARNm) que representan una copia de la secuencia de
partida correspondiente de acuerdo con las reglas de apareamiento
de bases.
Las secuencias de nucleótidos según la invención
también se caracterizan porque proceden de musgos o plantas
superiores. Preferentemente proceden de Physcomitrella
patens.
Para aclarar conceptos se ha de señalar que la
proteína codificada por la ID SEC No 1 es una enzima citocromo P450
de la clase CYP74A (aleno óxido sintasa; AOS). La enzima codificada
por la ID SEC No 3 se asigna a la clase CYP74E (divinil éter
sintasa; DES), entre otras razones a causa de su especificidad de
sustrato.
Otro objeto de la presente invención consiste en
un constructo génico que incluye una secuencia de nucleótidos de
acuerdo con la ID SEC No 1 y/o una secuencia de nucleótidos de
acuerdo con la ID SEC No 3, y también secuencias de nucleótidos
reguladoras enlazadas operativamente a ellas.
Las regiones codificadoras pueden estar
individualmente o en combinación (es decir, conjuntamente) bajo el
control de las mismas secuencias reguladoras o de diferentes
secuencias reguladoras independientes.
Por la expresión "enlace operativo" se
entiende la disposición secuencial, por ejemplo promotor, secuencia
codificadora, terminador, y en caso dado otros elementos
reguladores, de tal modo que cada uno de los elementos reguladores
pueda desempeñar su función prescrita en la expresión de la
secuencia codificadora. Estas secuencias de nucleótidos reguladoras
pueden ser de origen natural o se pueden obtener mediante síntesis
química. Como promotor es adecuado, en principio, cualquier promotor
que pueda controlar la expresión génica en el organismo huésped
correspondiente. De acuerdo con la invención también se puede
tratar de un promotor natural o sintético inducible químicamente,
con el que se pueda controlar en un momento determinado la
expresión del gen sujeto al mismo en la célula huésped. Éstos
también incluyen promotores específicos de tejido. La producción de
una estructura génica tiene lugar mediante la fusión de un promotor
adecuado con como mínimo una secuencia de nucleótidos según la
invención de acuerdo con técnicas de recombinación y clonación de
uso habitual, tales como las descritas por T. Maniatis, E.F. Fritsch
y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989). Para la unión de
los fragmentos de ADN entre sí se pueden añadir adaptadores o
engarces a los fragmentos.
De acuerdo con la invención, también están
incluidas las regiones de secuencia que preceden (5'- o upstream)
y/o siguen (3'-downstream) a las regiones
codificadoras. En particular están incluidas regiones de secuencia
con función reguladora. Éstas pueden influir en la transcripción, la
estabilidad de ARN o el procesamiento de ARN, y también en la
traducción. Como ejemplos de secuencias reguladoras se mencionan,
entre otros, promotores, potenciadores, operadores, terminadores o
intensificadores de traducción.
La presente invención incluye además un vector
que contiene una secuencia de nucleótidos aislada de acuerdo con la
ID SEC No 1 y/o una secuencia de nucleótidos aislada de acuerdo con
la ID SEC No 3 y/o un constructo génico del tipo anteriormente
mencionado, y también secuencias de nucleótidos adicionales para la
selección y/o replicación en una célula huésped y/o para la
integración en el genoma de una célula huésped.
Las células huésped adecuadas según la invención
en general son células de plantas superiores. Preferentemente se
trata de células de plantas útiles, preferiblemente de plantas
útiles monocotiledóneas, en especial de cereales y en particular de
cebada y/o trigo. Las células preferentes de plantas útiles
dicotiledóneas son las de la familia de las solanáceas.
Por consiguiente, la presente invención también
incluye como mínimo una célula vegetal transgénica, una planta
completa transgénica y/o su descendencia, que contienen de forma
replicable una secuencia de nucleótidos aislada de acuerdo con la
ID SEC No 1 y/o una secuencia de nucleótidos aislada de acuerdo con
la ID SEC No 3 y/o un constructo génico del tipo anteriormente
mencionado y/o un vector del tipo anteriormente mencionado,
presentando la célula vegetal transgénica, planta completa
transgénica y/o su descendencia un aumento de la expresión de la
secuencia de nucleótidos codificadora de una aleno óxido sintasa
y/o de la secuencia de nucleótidos codificadora de una divinil éter
sintasa en comparación con la expresión génica existente de forma
endógena (es decir, la expresión génica presente de forma natural,
tal como la existente por ejemplo en una planta o célula vegetal no
transformada), que conduce a un aumento de la resistencia de las
plantas frente a agentes patógenos.
Un aumento de la expresión génica puede estar
basado en un aumento del número de copias de la secuencia de
nucleótidos correspondiente, o puede ser consecuencia, por ejemplo,
de que la región codificadora de una secuencia de nucleótidos esté
enlazada operativamente con una o más secuencias reguladoras que
producen una intensificación de la iniciación de la expresión
génica. Esto se puede conseguir, por ejemplo, mediante un promotor
y/o potenciador fuerte y/o inducible y/u otras secuencias
reguladoras.
En lo que respecta al número de copias, en una
variante de la presente invención, una o las dos secuencias de
nucleótidos arriba mencionadas pueden estar presentes en
2-100, preferentemente 5-50 y en
especial en 2-15 copias.
En las células vegetales transgénicas, plantas
transgénicas y/o su descendencia según la invención anteriormente
mencionadas, las secuencias de nucleótidos (individualmente o en
combinación) y/o los constructos génicos y/o los vectores según la
invención del tipo anteriormente mencionado se pueden encontrar en
una localización extracromosómica y/o estar integrados de forma
estable en el genoma vegetal.
Los procedimientos y medios auxiliares
correspondientes, por ejemplo constructos génicos o vectores y
organismos auxiliares para la integración de la secuencia de
nucleótidos en el genoma vegetal, son conocidos por los
especialistas y no se explican aquí más detalladamente.
La presente invención también incluye la célula
vegetal transgénica, planta completa transgénica y/o su
descendencia, las cuales presenta una aleno óxido sintasa de acuerdo
con la ID SEC No 2 y/o una divinil éter sintasa de acuerdo con la
ID SEC No 4, siendo mayor la actividad específica correspondiente
de la enzima en los sistemas huésped transgénicos que la actividad
enzimática endógena correspondiente (por ejemplo en las células de
tipo salvaje).
De acuerdo con la invención, la célula vegetal
transgénica, planta completa transgénica y/o su descendencia
anteriormente mencionadas consisten en una planta útil o en sus
células, preferentemente de la familia de las solanáceas o los
cereales, en especial patata, cebada o trigo.
La presente invención también incluye un
procedimiento para aumentar la resistencia de células vegetales o
plantas frente a agentes patógenos, procedimiento en el que una
secuencia de nucleótidos de acuerdo con la ID SEC No 1 y/o una
secuencia de nucleótidos de acuerdo con la ID SEC No 3 y/o un
constructo génico y/o un vector del tipo anteriormente descrito se
transfieren de forma replicable a células vegetales y, a partir de
las células vegetales así transformadas, se regeneran plantas
completas.
Los procedimientos para producir estas plantas
transgénicas según la invención forman parte de la práctica de
laboratorio habitual. En una variante ventajosa de la presente
invención, la secuencia de nucleótidos y/o los constructos génicos
y/o los vectores se transfieren a la planta, o a partes de planta o
a células, mediante el llamado "bombardeo de partículas", y/o
transformación por agrobacterias.
Una ventaja especial de la planta transgénica y
su descendencia obtenidas según la invención consiste en que un
aumento de la cantidad de copias de como mínimo una de las
secuencias de nucleótidos según la invención, o análogamente la
presencia de una mayor concentración de como mínimo una proteína
correspondientemente codificada, conduce a un aumento esencial de
la resistencia a las enfermedades. Es decir, el o los genes según
la invención, o la o las proteínas codificadas, tienen una
intervención causal en el desarrollo de la resistencia frente a
parásitos patógenos.
Algunos ejemplos de parásitos patógenos son,
entre otros: Blumeria graminis f. sp. hordei o f. sp.
triciti, Pythium spec., Albugo spec.,
Rhizoctonia solani, Peronospora parasitica, Erysiphe crucifearum,
E. cichoreacearum, Alternaria brassicicola, Botrytis cinerea,
Sclerotium rolfsii, Sclerotinia sclerotium, Fusarium oxysporum, F.
culmorum, F. graminearum, F. nivale, Phytophtora infestans o
Pseudomonas syringae.
En una variante preferente del procedimiento
según la invención, como células vegetales se utilizan células de
plantas útiles, preferentemente de la familia de las solanáceas o
los cereales, en especial de patata, cebada o trigo.
Otro objeto de la presente invención consiste en
la utilización de una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la ID
SEC No 1 y/o una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la ID SEC
No 3 para aumentar la resistencia de células vegetales
transgénicas, plantas completas transgénicas y/o su descendencia
frente a agentes patógenos.
La presente invención también incluye la
utilización de como mínimo un polipéptido de acuerdo con la ID SEC
No 2 y/o un polipéptido de acuerdo con la ID SEC No 3 para aumentar
la resistencia de células vegetales transgénicas, plantas completas
transgénicas y/o su descendencia frente a agentes patógenos.
La invención también incluye la utilización de
como mínimo una de las enzimas anteriormente mencionadas, en la que
un aumento de la actividad específica de como mínimo una enzima con
respecto a la actividad enzimática específica endógena
correspondiente produce un aumento de la resistencia de las células
vegetales o las plantas frente a agentes patógenos de un
20-90%, preferentemente de un 30-80%
y, en especial, de un 40-70%.
La utilización de como mínimo una de las enzimas
según la invención produce por ejemplo un aumento de la resistencia
frente a hongos oidio, preferentemente Blumeria graminis f
sp. hordei o f. sp. triciti y/o Phytophtera
infestans.
Los siguientes ejemplos sirven para explicar más
detalladamente la invención sin limitarla.
Las técnicas generales de ADN y clonación,
electroforesis en gel, secuenciación, PCR,
Northern-Blots, expresión y purificación de
proteínas recombinantes, Western-Blots, análisis por
HPLC y GC y el cultivo de microorganismos son métodos de
laboratorio habituales y han sido descritas, entre otros, por
Sambrook y col. (Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold
Spring Harbour Laboratory Press).
La manipulación de materiales de musgo y plantas
también forma parte de la práctica de laboratorio habitual y ha
sido descrita, entre otros, por Gelvin y col. (Plant Molecular
Biology Manual, 1995, Dovdrecht/Holanda, Kluwer Academic
Publ.).
Para la RACE-PCR se utilizaron
dos bancos de ADNc Lambda ZapII de Physcomitrella patens,
uno de tejido de protonema y otro de tejido de gametofitos. Como
cebador de vector para la
5'-RACE-PCR se utilizó el cebador
T7-lang (5'-GTA ATA CGA CTC ACT ATA
GGG CGA ATT GGG-3'). La realización tuvo lugar de
acuerdo con métodos estándar.
Para la RACE-PCR anidada primero
se llevó a cabo una PCR con cebador M13rev (5'-GGA
AAC AGC TAT GAC CAT G-3') y un cebador RACE. Esta
carga se utilizó como molde para una segunda PCR con cebador
T7-lang y un cebador RACE anidado (específico de
gen) seleccionado entre:
\vskip1.000000\baselineskip
- PP291AOS5R: 5'-TCA CCT CAT CCG ATA CGC TAG TC-3'
- PP364AOS5R: 5'-GTC GAT GTC GTC TCA ATG TTC C-3'
- PP364AOS5R2: 5'-CCA TTC GTG ATT GCC AGA ACT GC-3'
\vskip1.000000\baselineskip
Para clonar los fragmentos completos, éstos se
amplificaron con ayuda del sistema PCR Expand^{TM}. Además de la
Taq-polimerasa, este sistema contiene una
Pwo-polimerasa con una actividad de corrección de pruebas.
Ésta sirve para mantener una tasa baja de errores de lectura con el
fin de obtener la menor cantidad posible de mutaciones en el ADN a
clonar. Como molde se utilizaron los siguientes bancos de ADNc:
P. patens-ADNc-Lambda ZapII de protonema y
P. patens-ADNc-Lambda ZapII de gametofitos.
Se utilizaron los siguientes cebadores:
- PP291/5'SphI
- 5'-AAA GCA TGC ATG GCA GTC CCT TCA TCC AAG C-3'
\vskip1.000000\baselineskip
- PP291/3'PstI
- 5'-AAA CTG CAG TCA CTT TTT GAG ATC GGA AAA GAA AAC CTT GGT CGC-3'
\vskip1.000000\baselineskip
- PP364/5'BamHI
- 5'-GGA TCC CGT ACG GTT GTA GCC AGT CTT GGG-3'
\vskip1.000000\baselineskip
- PP364/3'HindIII
- 5'-AAG CTT TCA ATC TGA TCG CGG CGT CAG TG-3'
Para controlar los clones durante la clonación de
ADNc-RACE y ADNc completo se llevó a cabo una, así
llamada, PCR de "colonia" con la
Tfl-polimerasa, ya que en este caso la tasa de
fallos no tenía importancia. Se mantuvieron los cebadores y el
programa se realizó de acuerdo con las directrices estándar.
A partir de dos bancos de ADNc Lambda ZapII de
Physcomitrella patens se aislaron dos genes codificadores de
enzima CYP74.
El clon Pp291 aislado tenía un marco de lectura
abierto para 322 aminoácidos. Esta proteína presentaba un 48% de
identidad con una AOS de Parthenium argentatum (Pan y col.,
J. Biol. Chem. 270, 8487-8494). Sin embargo,
la comparación de su secuencia de nucleótidos con otras AOS
conocidas mostraba que todavía faltaban aproximadamente 500 a 650
pb en el extremo 5'. Por ello se llevó a cabo una
5'-RACE-PCR con un banco de ADNc
Lambda ZapII de tejido de protonema y un banco de ADNc Lambda ZapII
de tejido de gametofito. Con el cebador RACE PP291AOS5R (véase más
arriba) y una temperatura de reasociación de 60ºC, a partir del
banco de protonema se pudieron amplificar tres fragmentos de
longitudes diferentes. Las longitudes de los fragmentos se
estimaron en comparación con el patrón de magnitud incluido en el
gel de agarosa. El resultado fue de 600 pbp 700 pb y 800 pb. Los
dos fragmentos más largos se clonaron y secuenciaron en el vector
pGEM-T. Las dos secuencias obtenidas constituían una
prolongación del extremo 5' del clon de partida. Las dos secuencias
presentaban un codón de terminación 15 pb por encima del primer
codón de iniciación (ATG). Para la clonación del ADNc completo,
partiendo de la secuencia de ADNc de la RACE-PCR se
derivaron los cebadores de expresión (PP291/5'SphI y PP291/3'PstI,
véase más arriba) con sitios de restricción para SphI y PstI. La
secuencia de ADNc completa obtenida está representada en la ID SEC
No 1 y codifica una proteína de 475 aminoácidos (ID SEC No 2).
El segundo clon de ADNc incluía un marco de
lectura abierto que codificaba 489 aminoácidos. Éste presentaba en
los aminoácidos un 42% de identidad con la AOS de Arabidopsis
thaliana (Laudert y col., 1996, Plant Mol. Biol. 31,
323-335) y un 41% de identidad con la AOS de L.
usitatissimum. A pesar de su longitud, este clon no contenía
ningún codón de iniciación. Los cebadores de expresión PP364/5'BamHI
y PP364/3'HindIII con los sitios de restricción para BamHI y
HindIII se derivaron de la secuencia de clon conocida. La secuencia
de ADNc completa se obtuvo mediante RACE-PCR y PCR
inversa. La secuencia de ADNc completa está representada en la ID
SEC No 3 y codifica una proteína de 532 aminoácidos (ID SEC No
4).
Para la expresión hubo que ligar los ADNc
aislados en un vector de expresión. Aquí se utilizó el vector pQE30
(Quiagen, Hilden) para expresar las proteínas con
His_{6}-Tag N-terminal. La
ligación entre pQE30 precortado y ADN donante (en una proporción de
aproximadamente 3:1) se llevó a cabo con T4-ADN
ligasa.
La expresión de las proteínas recombinantes se
llevó a cabo en E. coli cepa SG13009 (Gottesmann y col.,
1981, J. Bacteriol. 148, 265-73). Los clones
de expresión se incubaron primero hasta una OD_{600} de 0,6 - 0,8
en medio LB (con carbenicilina y canamicina) a 37ºC. Después de la
inducción con IPTG (concentración final: 1 mM), las bacterias se
incubaron durante otros 2-3 días a 10ºC.
La purificación se llevó a cabo hasta el mayor
nivel posible en hielo, los pasos de centrifugación se realizaron a
4ºC. Las células se sedimentaron mediante centrifugación a 4.000 x g
durante 15 minutos.
Este sedimento celular se resuspendió por
completo en Na-fosfato 50 mM, pH 8, y se descompuso
con ultrasonido (Sonoplus GM 70, Bandelin, Berlín) durante 5 x 1
min con una potencia de un 50% y un impulso de un 50%. Los residuos
se separaron por centrifugación a 4.000 x g y a partir del
sobrenadante se sedimentaron las membranas celulares mediante otra
centrifugación (1 h a 100.000 x g).
La purificación de las proteínas producidas por
recombinación se llevó a cabo mediante cromatografía de afinidad en
los dos clones Pp291 y Pp364. A continuación se realizó una elución
con un gradiente de pH (Figura 1A) y alternativamente con un
gradiente de imidazol (Figura 1B). Se precipitaron volúmenes
iguales (1 ml) de todos los pasos de lavado y elución, y se
aplicaron sobre el gel.
Como se puede observar en la Figura 1A, una
proteína Pp291 limpia se separó de la columna por elución con un pH
4. En el gradiente de imidazol, la proteína se separaba
relativamente limpia por elución a partir de una concentración de
imidazol de 100 mM. Al comparar los dos métodos no se pudo detectar
ninguna diferencia. Por este motivo, en lo sucesivo la proteína
sólo se purificó con el gradiente de pH.
Dado que las comparaciones de secuencias no
permiten sacar ninguna conclusión sobre la actividad catalítica,
los productos formados con la catálisis de las enzimas se analizaron
mediante una prueba de actividad fotométrica y también mediante
análisis HPLC y GC, que se realizaron de acuerdo con métodos
estándar.
En la prueba de actividad fotométrica se mide la
disminución de la extinción a 234 nm. Ésta se basa en la
degradación del sistema dieno conjugado de los hidróperóxidos en la
transformación con enzimas Cyp74. Para ello, el sustrato
correspondiente (para la prueba de actividad pura, por regla
general, a una concentración final 20 \muM de
13-HPOTE o 9-HPODE) se disolvió en
tampón fosfato (pH de acuerdo con el pH óptimo de la enzima) y la
reacción se inició mediante adición de la enzima. La concentración
de sustrato se controló fotométricamente a través de la extinción a
234 nm. El coeficiente de extinción molar (\lambda_{234} nm) es
igual a 25.000 M^{-1}cm^{-1}.
Tanto la enzima codificada por el clon Pp291 como
la enzima codificada por el clon Pp364 transformaron los dos
sustratos (13-HPOTE y 9-HPODE). La
Figura 2 muestra una representación gráfica.
En la reacción de hidróperóxidos con DES se
forman divinil éteres, que se hidrolizan en medio ácido para formar
aldehídos. Éstos son volátiles. Para identificar estos aldehídos
formados existe la posibilidad de derivarlos con DNPH (Kohlmann y
col., 1999, Eur. J. Biochem. 260, 885-895).
Las hidrazonas así formadas ya no son volátiles y se pueden
identificar a través de su tiempo de retención con ayuda de un
análisis HPLC. Tal como se muestra en la Figura 3, durante el
tratamiento con el reactivo de derivación también se pueden
descomponer divinil éteres formando aldehídos, que se pueden
detectar después como derivados DNPH.
Con este método se pudo demostrar que en la carga
de reacción de la enzima codificada por el clon Pp364 con los
sustratos 13-HPOTE y 9-HPODE se
forman aldehídos (Figura 4). Éstos se identificaron como
(2E)-hexenal y (2E)-nonenal
de acuerdo con sus tiempos de retención. También mostraban un
espectro UV típico de los derivados de
aldehído-DNPH. En el caso del Pp291 no se detectó
ningún aldehído (datos no mostrados).
En el análisis HPLC de los compuestos no
volátiles se someten a reacción hidroperóxidos con una marca
1-^{14}C. Se forman productos marcados que se
pueden hacer visibles con ayuda de un radiodetector en lugar de un
detector UV. De este modo también se pueden identificar a través de
su tiempo de retención las sustancias que no poseen ningún máximo
UV típico. Otra ventaja consiste en la alta sensibilidad de esta
detección en comparación con la detección UV. Si en la reacción
enzimática se utiliza
[1-^{14}C]-13-HPOTE
como sustrato, en el cromatograma representado en la Figura 5 se
observa para Pp291 el mismo perfil de elución que en el caso de las
9/13AOS1 de cebada (Maucher y col., 2000, Plant J. 21,
199-213), que se utilizó como referencia. En otras
AOS ya se había demostrado que el producto principal de la reacción
en ausencia de aleno óxido ciclasa es un
\alpha-cetol.
El cromatograma de la expresión y la
transformación subsiguiente de Pp364 mostraba una señal a
aproximadamente 30 minutos (Figura 6). Esta señal no se encontró ni
en las 9/13-HPL de pepino ni en las
9/13-APS1 de cebada. El Pp364 mostraba además
señales con el mismo tiempo de retención que los productos de las
9/13-HPL de pepino.
Dado que en la radio-HPLC se
añade un centelleador líquido al producto de elución de la columna,
el mismo proceso HPLC se realizó con sustrato no marcado, para
recoger los productos y continuar su análisis. Dado que los
\alpha-cetoles no tienen ningún máximo UV, la
detección se realizó a 210 nm (Gardner, 1997, Advances in Lipid
Methodology - four (Christie, W. W., ed) pp.
1-43, The Olily Press, Dundee).
En el caso del Pp291 se recogió una sustancia con
el mismo tiempo de retención como el estándar para el
\alpha-cetol, que procede de
13-HPOTE, y se derivó y analizó con ayuda de GC/MS.
Se obtuvo el cromatograma representado en la Figura 7. El espectro
de masa es idéntico al del estándar \alpha-cetol
correspondiente.
El pH óptimo se determinó para el clon Pp291 en
un fotómetro. Para ello se utilizó 13-HPOTE como
sustrato (aproximadamente 25 \muM en 50 mM de fosfato sódico al
valor pH correspondiente). La enzima muestra la mayor actividad en
un intervalo de pH de 5,0 a 6,0, tal como se muestra en la Figura
8.
El Pp291 se analizó en cuanto a su especificidad
de sustrato, sobre todo frente a hidroperóxidos de ácido
araquidónico (HPETE), dado que éste es el ácido graso dominante de
este organismo (Girke y col., 1998, Plant J. 15,
39-48). En este proceso se observó la relación de
las velocidades de transformación representada en la Figura 9. Por
consiguiente, el 8-HPETE es el más rápido en ser
transformado por los hidroperóxidos aquí analizados. Después siguen
13-HPOTE, 9-HPODE y
11-HPETE en una proporción 8-HPETE
: 13-HPOTE : 9-HPODE :
11-HPETE igual a 100 : 70 : 60 : 57.
Para la clonación en vectores binarios se
restringen los ADNc de Pp291 y Pp364 con BamHI y NotI y se
transfieren a un vector pCRScript cortado con BamHI y NotI. A
continuación se recortan de este vector con SalI y se ligan en un
vector pBinAR cortado con SalI. Mediante cortes de control con BamHI
y secuenciación se determinan los clones en los que los genes se
encuentran en orientación sentido.
Utilizando estos vectores pBinAR, que contienen
en cada caso un ADNc de Pp291 y Pp364 en orientación sentido, se
transforma Agrobacterium tumefaciens (C58C1 pMP90). A
continuación se transforman plantas Arabidopsis thaliana de
tipo salvaje (cv. Columbia) con la cepa de Agrobacterium
tumefaciens transformada correspondiente sobre la base de una
modificación del método de infiltración en vacío según Clough y Bent
(Clough, S. y Bent A., Plant J 1998,
16(6):735-43) y según Bechtold y col.
(Bechtold, N. y col., CRAcad Sci Paris 1993,
1144(2):204-212).
Las semillas de los transformantes primarios se
rastrean en cuanto a la resistencia a la canamicina disponiendo la
simiente sobre placas MS que contienen canamicina
(MS-Medium (Sigma) con 40 mg/l canamicina, 10 mg/l
benomilo y 100 mg/l timentina). Dos semanas después, los brotes
resistentes a la canamicina se trasplantan a tierra y se utilizan
como plantas completamente desarrolladas para el análisis
fenotípico y molecular.
Entre las plantas transgénicas transformadas con
Pp291 y Pp364 en orientación sentido se eligen aquellas en las que
no se ha producido ningún efecto de cosupresión. Para ello se aísla
ARN total de las plantas y la presencia del mensajero se determina
mediante PCR Real-Time
(Perkin-Elmer). Las plantas transgénicas así
identificadas se infectaron con diferentes patógenos, incluyendo
Blumeria graminis f. sp. hordei y f. sp.
triciti, Pythium spec., Albugo spec.,
Rhizoctonia solani, Peronospora parasitica, Erysiphe
crucifearum, E. cichoreacearum, Alternaria brassicicola, Botrytis
cinerea, Sclerotium rolfsii, Sclerotinia sclerotium, Fusarium
oxysporum, F. culmorum, F. graminearum, F. nivale o
Pseudomonas syringae.
El resultado, es decir, el nivel de resistencia
macroscópico de la planta frente al hongo o bacteria patógeno, se
analizó mediante microscopía de fluorescencia y microscopía óptica,
entre otros métodos. Este análisis demostró que las plantas
Arabidopsis transgénicas por Pp291 y Pp364 presentaban una
mayor resistencia frente a los patógenos arriba mencionados que las
de tipo salvaje.
Unos segmentos de hoja de cebada cv. Pallas se
transformaron con un ADNc de Pp291 o Pp364, que se encontraban en
el vector de expresión de GFP (Green Fluorescence Protein - proteína
de fluorescencia verde). A continuación, las hojas se inocularon
con el hongo patógeno Blumeria graminis f. sp. hordei
(oidio de cebada natural) y el resultado se analizó 48 h después
mediante microscopía óptica y microscopía de fluorescencia. La
penetración en células que expresaban GFP se valoró mediante
detección de haustorios en células vivas y mediante evaluación del
desarrollo de hongos precisamente en esas células. En los seis
experimentos, el bombardeo de cebada cv. Pallas con ADNc de Pp291 o
Pp364 condujo a una menor cantidad de células penetradas con éxito
por Blumeria graminis f. sp. hordei (oidio de cebada
natural) en comparación con células que habían sido bombardeadas
con un ADNc de control extraño (ARNds receptor de hormona tioridea
humana, TR). El efecto inductor de resistencia del ADNc de Pp291 o
Pp364 provoca una reducción media de la eficacia de penetración por
Blumeria graminis f. sp. hordei de alrededor de un
44%.
Para la transformación transitoria de cebada se
utilizó un procedimiento que ya había sido descrito para la
incorporación biolística de ADNc en células epidérmicas de hojas de
cebada (Schweizer P. y col. (1999) Mol Plant Microbe Interact
12:647-54; Schweizer P. y col. (2000) Plant J 2000
24: 895-903). Partículas de wolframio con un
diámetro de 1,1 mm (densidad de partículas 25 mg/ml) se revistieron
con ADNc junto con ADN plásmido del vector pGFP (GFP bajo el control
del promotor CaMV 35S) como marcador de transformación. Por cada
disparo se emplearon las siguientes cantidades de ADNc o plásmido
informador para el revestimiento: 1 mg pGFP y 2 mg ADNc. Para la
preparación de microportadores, 55 mg de partículas de wolframio (M
17, diámetro 1,1 mm; Bio-Rad, Munich) se lavaron dos
veces con 1 ml de agua destilada en autoclave y una vez con 1 ml de
etanol absoluto, se secaron y se recogieron en 1 ml de glicerina al
50% (aproximadamente 50 mg/ml solución madre). La solución se
diluyó a 25 mg/ml con glicerina al 50% y antes de su uso se mezcló
bien y se suspendió en un baño de ultrasonidos. Para el
revestimiento de microportadores se juntaron gota a gota y bajo
mezcla continua 1 mg de plásmido, 2 mg de ADNc (1 ml), 12,5 ml de
suspensión de partículas de wolframio (25 mg/ml) y 12,5 ml de
solución de Ca(NO_{3})_{2} 12,5 M (pH 10), la
mezcla se dejó reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente,
se sometió a una centrifugación breve y se recogieron 20 ml del
sobrenadante. El resto con las partículas de wolframio se
resuspendió (baño de ultrasonidos) y se utilizó en el
experimento.
Se utilizaron segmentos de aproximadamente 4 cm
de longitud de hojas primerizas de cebada. Los tejidos se
dispusieron sobre Phytagar (GibcoBRLt Life Technologiest, Karlsruhe)
con 20 mg/l de bencimidazol en placas Petri (6,5 cm de diámetro) y
directamente antes del bombardeo con partículas se cubrieron por los
bordes con una plantilla con una escotadura de 2,2 cm x 2,3 cm. Las
placas se dispusieron sucesivamente en el suelo de la cámara de
vacío (Schweizer P. y col. (1999) Mol Plant Microbe Interact
12:647-54), sobre la que se había encajado una red
de nylon (abertura de malla 0,2 mm, Millipore, Eschbom) como difusor
sobre una placa perforada (5 cm sobre el suelo, 11 cm por debajo
del macroportador, véase más abajo), para dispersar aglomerados de
partículas y frenar la corriente de partículas. El macroportador
dispuesto en la parte superior de la cámara (soporte de filtro
estéril de plástico, 13 mm, Gelman Sciences, Swinney, UK) se cargó
para cada disparo con 5,8 ml de partículas de wolframio revestidas
con ADN (microportadores, véase más abajo). La presión de la cámara
se redujo 0,9 bar con una bomba de vacío de membrana (Vacuubrand,
Wertheim) y las partículas de wolframio se dispararon sobre la
superficie del tejido vegetal con 9 bar de presión de gas de helio.
Inmediatamente después se ventiló la cámara.
Para marcar las células transformadas, las hojas
se bombardearon con el plásmido (pGFP; vector basado en pUC18,
cassette de promotor CaMV 35S/terminador con gen de GFP insertado;
Schweizer P. y col. (1999) Mol Plant Microbe Interact
12:647-54; facilitado por el Dr. P. Schweizer
Schweizer P., Institut für Pflanzengenetik IPK, Gatersleben,
Alemania). Antes de cada bombardeo con un nuevo plásmido, el
macroportador se lavó a fondo con agua. Después de cuatro horas de
incubación tras el bombardeo en placas Petri ligeramente abiertas,
temperatura ambiente y luz natural, las hojas se inocularon con 100
conidios/mm del hongo de oidio de cebada natural (raza A6) y se
incubaron durante otras 40 a 48 horas bajo las mismas
condiciones.
Algunos segmentos de hoja se bombardearon con las
partículas revestidas utilizando un "particle inflow gun"
(pistola de flujo inducido de partículas). Para cada disparo se
utilizaron 312 mg de partículas de wolframio. Cuatro horas después
del bombardeo se realizó una inoculación con oidio Blumeria
graminis (raza A6) y tras otras 40 horas se llevó a cabo una
evaluación con respecto a las señales de infección. El resultado
(por ejemplo la eficacia de penetración, definida como la
proporción porcentual de células atacadas que desarrollan un
haustorio maduro y una hifa secundaria ("secondary elongating
hyphae"); cálculo: véase más abajo) se analizó mediante
microscopía de fluorescencia y microscopía óptica. Una inoculación
con 100 conidios/mm^{2} da como resultado una frecuencia de
ataque de aproximadamente un 50% de las células transformadas. Para
cada experimento individual se evaluó una cantidad mínima de 100
sitios de interacción. Las células transformadas (que expresan GFP)
se identificaron mediante excitación con luz azul. Se distinguieron
tres categorías diferentes de células transformadas:
- 1.
- Células penetradas que incluyen un haustorio ligeramente reconocible. Una célula con más de un haustorio se evaluaba como una célula.
- 2.
- Células que, si bien han sido atacadas por un apresorio de hongo, no incluyen ningún haustorio. Una célula atacada de forma múltiple por Blumeria graminis ssp. hordeum pero que no incluye ningún haustorio se evaluaba como una célula.
- 3.
- Células no atacadas por Blumeria graminis ssp. hordeum.
Las células de estoma y células auxiliares de
estoma se excluyeron de la evaluación. Las estructuras
superficiales de Blumeria graminis ssp. hordeum se
analizaron mediante microscopía óptica y tinción fluorescente del
hongo con 0,1% Calcofluor (p/v en agua) durante 30 segundos. El
desarrollo del hongo se puede evaluar fácilmente mediante
microscopía de fluorescencia después de la tinción con Calcofluor.
En células transformadas con ARNds Pp291 o Pp364, aunque el hongo
desarrolla un "tubo germinal" primario y otro apresorial, no
desarrolla ningún haustorio. El desarrollo de haustorios es una
condición previa para la formación de una hifa secundaria.
La eficacia de penetración relativa (RPE) se
calcula como la diferencia de la eficacia de penetración en células
transformadas (transformación con ADNc de Pp291 o Pp364) y la
eficacia de penetración en células no transformadas (en este caso:
eficacia de penetración media del 57%). La RPE porcentual (%-RPE)
se calcula a partir de la RPE menos 1 y multiplicada por 100.
- RPE =
- [PE en células transformadas]
- \quad
- [PE en células no transformadas]
%-RPE = 100 \
x \
(RPE-1)
El valor %-RPE (desviación con respecto a la
eficacia de penetración media del control) sirve para determinar la
susceptibilidad de células transfectadas con ADNc de Pp291 o
Pp364.
En el caso del ADNc de control, en cinco ensayos
independientes no se observó ninguna diferencia entre la
transfección con el ADNc de control y agua en lo que respecta a la
eficacia de penetración de Blumeria graminis ssp.
hordeum. Para descartar la posibilidad de una influencia del
ADNc en la tasa de transformación o la tasa de supervivencia de las
células atacadas, se comparó la cantidad de las células que
expresaban GFP entre los experimentos con el ADNc de control y con
el ADNc de Pp291 o Pp364. El ADNc de Pp291 o de Pp364 no tenía
ninguna influencia en la cantidad total o en la cantidad de las
células atacadas que expresaban GFP.
La tasa de transfección con Pp291 y Pp364 condujo
a una disminución drástica de la frecuencia de penetración de
Blumeria graminis f. sp. hordei (valor %-RPE medio =
-30%).
Figura 1: Purificación por afinidad del
clon Pp291; (A) elución con gradiente de pH: M = marcador; 1 =
vector vacío pQE30 (no inducido); 2 = pQE30 (inducido con IPTG); 3 =
Pp291 no inducido; 4 = Pp291 inducido; 5 = sobrenadante después de
primera ultracentrifugación; 6 = sobrenadante después de segunda
ultracentrifugación; 7 = caudal; 8, 9, 10 = pasos de lavado pH 8,
pH 7, pH 6; 11, 12 = pasos de elución pH 5, pH 4; (B) elución con
gradiente imidazol: M = marcador; 1 a 11 = concentración creciente
de imidazol (mM): 0, 20, 40, 60, 80, 100, 125, 150, 200, 250,
300.
Figura 2: Prueba de actividad fotométrica:
en la figura está representada la disminución de la absorción a 234
nm de una solución de hidroperóxido después de añadir un lisado
celular del clon Pp291 (C), una dilución 1:50 de este lisado
celular (B) o el vector vacío pQE30 (A).
Figura 3: Perfil de elución de los
análisis por HPLC de hidrazonas como derivados de aldehídos
volátiles formados en la reacción de hidroperóxidos con divinil
éter sintasa: determinación de (2E)-nonenal después
de tratamiento con ácido Colnel (un divinil éter) con el reactivo de
derivación para aldehídos.
Figura 4: Perfil de elución de los
análisis por HPLC de productos de catálisis (aldehídos) de la enzima
DES codificada por el clon Pp364 con los sustratos
13-HPOTE y 9-HPODE. Éstos se
identificaron como (2E)-hexanal y
(2E)-nonenal de acuerdo con sus tiempos de
retención.
Figura 5: Perfil de elución de los
análisis HPLC de productos no volátiles de la reacción de
hidroperóxidos por la enzima AOS codificada por el clon Pp291.
Figura 6: Perfil de elución de los
análisis HPLC de productos no volátiles de la reacción de
hidroperóxidos por la enzima DES codificada por el clon Pp364.
a = lisado celular; b = Enzima purificada
Figura 7: Cromatograma GC/MS del producto
formado por catálisis de la enzima CYP74 codificada por el clon
Pp291. La señal a 18,2 minutos tiene el especto de masa representado
en la ventana.
Figura 8: Actividad enzimática relativa de
la enzima codificada por el clon Pp291 en función del valor pH.
Figura 9: Velocidades de transformación
relativas de diferentes sustratos mediante la enzima CYP74
codificada por el clon Pp291 (especificidad de substrato);
concentración de sustrato 20 \muM en cada caso; la determinación
se realizó en el fotómetro; n. m. = no mensurable.
<110> BASF Plant Science GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Enzimas CYP74 y las secuencias de
nucleótidos que las codifican, y también procedimientos para
producir células vegetales y su descendencia resistentes a
patógenos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1428
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (1428)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Pp291 aleno óxido sintasa
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<400> 1
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<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 475
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens
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<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1821
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(1623)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> divinil éter sintasa Pp364
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 532
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens
\newpage
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<400> 4
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\newpage
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<210> 5
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> artificial
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<220>
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<221> T7lang, cebador RACE
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<222> (1).. (30)
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<223>
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipgtaatacgac tcactatagg gcgaattggg
\hfill30
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<210> 6
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> M13rev; cebador RACE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (19)
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<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaaacagct atgaccatg
\hfill19
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<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PP291AOS5R; cebador RACE específico
de gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcacctcatc cgatacgcta gtc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 8
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<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Pp364AOS5R; cebador RACE específico
de gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskipgtcgatgtcg tctcaatgtt cc
\hfill22
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<210> 9
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Pp364AOS5R2; cebador RACE específico
de gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccattcgtga ttgccagaac tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Pp291/5'-SphI;
cebador de expresión
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagcatgca tggcagtccc ttcatccaag c
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Pp291/3' PstI; cebador de
expresión
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (45)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaactgcagt cactttttga gatcggaaaa gaaaaccttg gtcgc
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Pp364/5'BamHI; cebador de
expresión
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatcccgta cggttgtagc cagtcttggg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> pp364/3'HindIII; cebador de
expresión
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagctttcaa tctgatcgcg gcgtcagtg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (19)
1. Aleno óxido sintasa con una secuencia
de aminoácidos de acuerdo con la ID SEC No 2.
2. Divinil éter sintasa con una secuencia
de aminoácidos de acuerdo con la ID SEC No 4.
3. Enzimas según una de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizadas porque transforman
tanto 9-HPOD/TE como 13-HPOD/TE
como sustratos.
4. Secuencia de nucleótidos aislada
codificadora de una aleno óxido sintasa según la reivindicación 1,
que interviene en la biosíntesis de ácidos grasos insaturados de
forma múltiple, seleccionada entre
- a)
- una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la ID SEC No 1,
- b)
- una secuencia de nucleótidos que presenta como mínimo un 70% de identidad con la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC No 1,
- c)
- una secuencia de nucleótidos complementaria a a) o b).
5. Secuencia de nucleótidos aislada
codificadora de una divinil éter sintasa según la reivindicación 2,
que interviene en la biosíntesis de ácidos grasos insaturados de
forma múltiple, seleccionada entre
- a)
- una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la ID SEC No 3,
- b)
- una secuencia de nucleótidos que presenta como mínimo un 70% de identidad con la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC No 3,
- c)
- una secuencia de nucleótidos complementaria a a) o b).
6. Secuencia de nucleótidos aislada según
una de las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizada porque
procede de musgo o de plantas superiores.
7. Secuencia de nucleótidos aislada según
una de las reivindicaciones 4-6,
caracterizada porque procede de Physcomitrella
patens.
8. Constructo génico que incluye como
mínimo una secuencia de nucleótidos según una de las
reivindicaciones 4-7, y también secuencias de
nucleótidos reguladoras enlazadas operativamente con la misma.
9. Vector que contiene una secuencia de
nucleótidos aislada según una de las reivindicaciones
4-7 y/o un constructo génico según la
reivindicación 8, y también secuencias de nucleótidos adicionales
para la selección y/o replicación en una célula huésped y/o para la
integración en el genoma de una célula huésped.
10. Célula vegetal transgénica, planta
completa transgénica y/o su descendencia, que contiene de forma
replicable como mínimo una secuencia de nucleótidos aislada según
una de las reivindicaciones 4-7 y/o un constructo
génico según la reivindicación 8 y/o un vector según la
reivindicación 9, caracterizada porque presenta un aumento
de la expresión de la secuencia de nucleótidos codificadora de una
aleno óxido sintasa y/o de la secuencia de nucleótidos codificadora
de una divinil éter sintasa en comparación con la expresión génica
existente de forma endógena, que conduce a un aumento de la
resistencia de las plantas frente a agentes patógenos.
11. Célula vegetal transgénica, planta
completa transgénica y/o su descendencia según la reivindicación
10, caracterizada porque como mínimo una secuencia de
nucleótidos según una de las reivindicaciones 4-7
y/o un constructo génico según la reivindicación 8 y/o un vector
según la reivindicación 9 se encuentra en una localización
extracromosómica y/o está integrado establemente en el genoma
vegetal.
12. Célula vegetal transgénica, planta
completa transgénica y/o su descendencia según una de las
reivindicaciones 10 u 11, que presenta una aleno óxido sintasa
según la reivindicación 1 y/o una divinil éter sintasa según la
reivindicación 2 con una actividad específica mayor que la actividad
enzimática específica endógena correspondiente en una célula
vegetal.
13. Célula vegetal transgénica, planta
completa transgénica y/o su descendencia según una de las
reivindicaciones 10-12, caracterizada porque
es una planta útil o sus células, preferentemente de la familia de
las solanáceas o los cereales, de forma especialmente preferente
patata, cebada o trigo.
14. Procedimiento para aumentar la
resistencia de células vegetales o plantas frente a agentes
patógenos, caracterizado porque una secuencia de nucleótidos
según una de las reivindicaciones 4-7,
individualmente o en combinación, y/o un constructo génico según la
reivindicación 8 y/o un vector según la reivindicación 9 se
transfieren de forma replicable a células vegetales, y a partir de
las células vegetales así transformadas se regeneran plantas
completas.
15. Procedimiento según la reivindicación
14, caracterizado porque como células vegetales se utilizan
células de plantas útiles, preferentemente de la familia de las
solanáceas o los cereales, de forma especialmente preferente
patata, cebada o trigo.
16. Utilización de como mínimo una secuencia
de nucleótidos según una de las reivindicaciones 4-7
para aumentar la resistencia de células vegetales, plantas
completas y/o su descendencia frente a agentes patógenos.
17. Utilización de como mínimo una enzima
según una de las reivindicaciones 1-6 para aumentar
la resistencia de células vegetales, plantas completas y/o su
descendencia frente a agentes patógenos.
18. Utilización según la reivindicación 17,
en la que una actividad específica de como mínimo una enzima
aumentada con respecto a la actividad enzimática específica endógena
correspondiente produce un aumento de la resistencia de las células
vegetales o las plantas frente a agentes patógenos de un
20-90%, preferentemente de un
30-80% y en especial de un
40-70%.
19. Utilización según una de las
reivindicaciones 17 ó 18, en la que como mínimo una enzima provoca
un aumento de la resistencia frente a hongos oidio, preferentemente
Blumeria graminis f. sp. hordei o f. sp.
triciti y/o Phytophtora infestans.
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